Với nhiều ứng dụng như vậy nhưng ở Việt Nam, các công trình khoa học nghiên cứu nhằm khai thác, tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp dextran cao còn rất ít.. Vì vậy
TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
Giới thiệu chung về dextran
Dextran là một polymer sinh học chủ yếu được tổng hợp từ vi khuẩn lactic, với các monomer là các gốc glucose được liên kết với nhau thông qua liên kết 1,6-glucoside.
Các vi sinh vật khác nhau sản sinh ra các loại dextran với trọng lượng phân tử và sự phân bố nhánh khác nhau Cấu trúc của dextran còn phụ thuộc vào điều kiện nuôi cấy của các vi sinh vật này.
Dextran chỉ được tổng hợp từ sucrose và không thể được tạo ra từ glucose hay bất kỳ loại đường nào khác Các loại đường khác trong môi trường lên men chỉ đóng vai trò là nguồn cacbon cho sự phát triển của vi khuẩn.
1.1.2 Công thức cấu tạo dextran
Dextran là một polysaccharide tương tự amylopectin, với mạch chính được hình thành từ liên kết α-1,6 glucoside, trong khi các nhánh bên được kết nối bằng liên kết α-1,3 hoặc α-1,4 glucoside.
Hình 1.1: Hình ảnh công thức cấu tạo dextran
1.1.3 Cơ chế hình thành dextran Đa số các polysaccharide ngoại bào từ vi sinh vật đều là sản phẩm của sự chuyển hóa nội bào cơ chất thành các sản phẩm trung gian, và cuối cùng thành polymer Dextran khác các polysaccharide này, cơ chất không thâm nhập vào tế bào vi sinh vật mà nó đƣợc chuyển hóa bên ngoài tế bào thành α-D-glucan phân nhánh, tức là dextran Chỉ có sucrose đƣợc dùng làm cơ chất cho phản ứng này, các loại đường khác thúc đẩy tăng trưởng của vi khuẩn nhưng không sản xuất enzyme dextransucrase – là enzyme tham gia trực tiếp vào quá trình chuyển hóa sucrose thành dextran [21]
Polysaccharide có thể được sản xuất từ các tế bào nguyên vẹn trong môi trường nuôi hoặc từ các chế phẩm phi tế bào chứa enzyme dextransaccharase Enzyme này có khả năng giải phóng fructose và chuyển gốc glucose lên một gốc nhận đã được liên kết với enzyme.
Hình 1.2: Hình ảnh cơ chế hoạt động của enzyme dextransaccharase
Enzyme giải phóng fructose từ saccharose và tạo phức với gốc glucose Nhóm C6 - OH của một gốc phức khác kết hợp với C1, giải phóng X, dẫn đến việc hai gốc glucose liên kết qua liên kết α-1,6-glucoside Trong quá trình polymer hóa, chuỗi dextran kéo dài và vẫn liên kết chặt chẽ với enzyme, mức độ polymer hóa tăng cho đến khi phân tử chất nhận giải phóng chuỗi polymer khỏi enzyme.
Năng lượng tự do của liên kết glucoside trong phân tử disaccharide khoảng 23 kJ, trong khi năng lượng tự do của liên kết glucoside trong dextran thấp hơn (12-17 kJ) Do đó, phản ứng diễn ra theo chiều từ trái sang phải với sự giảm năng lượng tự do Fructose có thể chuyển thành acid lactic, acid acetic và ethanol Đặc biệt, trong chuỗi phản ứng, có sự tham gia của hai nhóm imidazolium (C3H4N2) của histidine, rất cần thiết cho quá trình tổng hợp dextran.
Các loại đường khác ngoài sucrose có thể tham gia vào phản ứng tạo thành oligosaccharide thay vì dextran cao phân tử Trong quá trình tổng hợp dextran, các gốc glucosyl còn sót lại chuyển thành các gốc tự do, ảnh hưởng lớn đến phản ứng Maltose và isomaltose được xem là hai chất nhận có tác động mạnh nhất, tương tác với phức enzyme-glucosyl hoặc enzyme-dextranosyl để giải phóng glucose hoặc mạch dextran ra khỏi enzyme, đồng thời tạo liên kết với glucose hoặc dextran tại vị trí của enzyme.
Hình 1.3: Cơ chế ngƣng phản ứng tổng hợp dextran của chất nhận
Bằng cách điều chỉnh quá trình thủy phân dextran, người ta có thể kiểm soát độ dài của mạch dextran trong sản xuất, từ đó tạo ra các chất nhận mong muốn.
Dextran cao phân tử hoạt động như một chất nhận, trong đó C3 của dextran kết hợp với C1 của phức glucosyl – enzyme hoặc dextranosyl – enzyme Quá trình này giải phóng glucose hoặc dextran, đồng thời hình thành một liên kết nhánh giữa dextran chất nhận và glucose hoặc dextran được giải phóng tại vị trí của enzyme.
Phản ứng này tạo ra liên kết nhánh cho mạch dextran, chủ yếu là dạng α(1,3)-glucosyl, trong khi liên kết nhánh dạng α(1,2)-glucosyl rất hiếm gặp trong cấu trúc dextran.
Dextran là polysaccharide đƣợc ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau Hiện nay, các ứng dụng này đang ngày càng đƣợc mở rộng
Dextran có tác dụng chống huyết khối hiệu quả bằng cách giảm sự kết dính của hồng cầu và tiểu cầu, nhờ vào khả năng tăng điện tích âm Các thuốc chứa dextran giúp làm thay đổi cấu trúc của cục máu đông, khiến chúng dễ bị dung giải hơn Bên cạnh đó, dextran ức chế antiplasmin alpha-2 và hoạt động như một chất kích hoạt plasminogen, mang lại tính năng thrombolytic Với kích thước lớn, dextran không thoát ra khỏi mạch máu, làm cho nó trở thành một tác nhân thẩm thấu mạnh mẽ, được sử dụng trong điều trị giảm bạch cầu.
Dextran được sử dụng trong các chất lỏng truyền tĩnh mạch như một chất bôi trơn trong thuốc nhỏ mắt và trong một số dịch truyền để hòa tan các yếu tố khác Nó có thể thay thế máu bị mất trong các tình huống khẩn cấp khi không có máu thay thế, nhưng cần sử dụng thận trọng do không cung cấp chất điện giải và có thể gây ra giảm natri hoặc các rối loạn điện giải khác.
Dung dịch chứa dextran có khả năng chống đông máu và làm tăng nhanh thể tích tuần hoàn Nhờ vào áp suất thẩm thấu cao hơn huyết tương, dịch từ khoang gian bào sẽ di chuyển vào trong nội mạch, giúp duy trì thể tích trong khoảng 3 - 4 giờ.
Vi sinh vật sinh tổng hợp dextran
Vi sinh vật chủ yếu được sử dụng để lên men dextran là vi khuẩn axit lactic, bao gồm các chủng như Leuconostoc mesenteroides, Leuconostoc dextranicum, Leuconostoc citrovorus, Saccharomyces cerevisiae, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus sanfrancisco, Streptobacterium dextranicum và Streptococcus mutans Hiện nay, các chủng Leuconostoc có khả năng sinh tổng hợp dextran cao thường được áp dụng trong sản xuất quy mô công nghiệp Đồng thời, nghiên cứu cũng đang được tiến hành về các chủng Streptococcus để phát triển vaccine chống sâu răng.
Leuconostoc là vi khuẩn kị khí không bắt buộc, phổ biến trong môi trường tự nhiên và có vai trò quan trọng trong quá trình lên men thực phẩm cũng như công nghiệp Chúng phát triển ở nhiệt độ từ 5°C đến 30°C, với nhiệt độ tối ưu là từ 25°C đến 30°C Hầu hết các giống vi khuẩn này có hình dạng cầu, thường xuất hiện đơn lẻ hoặc tạo thành cặp, chuỗi ngắn, nhưng hình thái có thể thay đổi tùy theo điều kiện sinh trưởng Là vi khuẩn Gram (+), không sinh bào tử và không di chuyển, Leuconostoc có khả năng sinh acid lactic, giúp chúng chịu đựng được môi trường có pH thấp.
Một số vi khuẩn Leuconostoc có khả năng tiết ra enzyme ngoại bào dextransucrase, enzyme này xúc tác cho phản ứng chuyển nhóm glucosyl từ phân tử sucrose ngoại bào, tạo thành dextran và giải phóng fructose.
Nghiên cứu về chủng Leuconostoc trong việc sinh tổng hợp dextran đã được thực hiện trên toàn thế giới, với Leuconostoc mesenteroides là chủng nổi bật Trong điều kiện môi trường chứa sucrose, nhiệt độ từ 25-30 độ C và pH ban đầu là 7, L mesenteroides có khả năng sản xuất enzyme tối đa.
L mesenteroides CMG 713 được nuôi cấy trong môi trường chứa 20g/l sucrose ở nhiệt độ 30 °C, dẫn đến pH giảm từ 7,5 xuống 4,5 Hoạt động enzyme tối đa đạt 40 DSU/ml/giờ sau 20 giờ ủ, với độ nhớt đo được là 14,58 cp Dextran tạo ra có màu trong suốt, với khối lượng dextran tinh khiết dao động từ 0,11-0,65 g%.
+ L mesenteroides NRRL B1299: Dextran đƣợc tạo ra có đặc điểm chứa 63% liên kết α- 1,6 glucoside, 27% liên kết α- 1,2 glucoside, 8% liên kết α- 1,3 glucoside [11]
+ L mesenteroides B512F: Dextran đƣợc tạo ra có đặc điểm chứa 95% liên kết α- 1,6 glucoside, 5% liên kết α- 1,3 glucoside [11]
+ L mesenteroides AA1: Được nuôi cấy trên môi trường tối ưu chứa 2,5% sucrose, ở nhiệt độ 25 o C Hoạt độ của enzyme dextransucrase là 53 DSU/ml/giờ [3]
+ L mesenteroides T1: Được phân lập từ nước lên men trá cây, nuôi cấy trong môi trường chứa 5% sucrose thì lượng dextran được tạo ra khoảng 11,56- 18,46 g/l [19]
Streptococcus là vi khuẩn Gram dương, có hình cầu hoặc hình trứng với đường kính nhỏ hơn 1μm Chúng thường xuất hiện riêng lẻ, xếp thành đôi hoặc tạo thành các chuỗi ngắn giống như chuỗi hạt, với độ dài không đồng đều Chiều dài của các chuỗi này phụ thuộc vào điều kiện môi trường.
Các chủng Streptococcus như S mutans và S sobrinus có khả năng sinh tổng hợp dextran, giúp vi khuẩn bám vào răng và hình thành mảng bám gây sâu răng Dựa trên cơ chế này, nghiên cứu về vaccine chống sâu răng đã được tiến hành.
1.3 Tình hình nghiên cứu dextran
Dextran là một polysaccharide ngoại bào được phát hiện từ vi khuẩn vào năm 1861, khi Pasteur nhận thấy nước ép mía bị đặc quánh một cách khó hiểu.
- Dextran đƣợc sản xuất bởi nhiều loài:
+ Năm 1930: Hucker và Pederson là người đầu tiên thông báo việc sản xuất dextran từ sucrose bởi chủng Leuconostoc [20]
+ Năm 1941: Dextran đƣợc sản xuất từ chủng Streptococcus trong môi trường chứa sucrose cũng đã được báo cáo [20]
- Scheibler là người đầu tiên chứng minh dextran có trọng lượng phân tử
> 1000 Da, có CTCT gồm mạch chính đƣợc hình thành bởi liên kết α-1,6 glucoside và các nhánh bên đƣợc gắn với nhau bởi liên kết α-1,3 hoặc α-1,4 glucoside
- 1980: Seymour và knapp đã nghiên cứu đƣợc cấu trúc chính xác của từng loại dextran [21]
Dextran ngày càng trở nên phổ biến nhờ vào những ứng dụng đa dạng trong nhiều lĩnh vực Ngoài các ứng dụng y dược được phát hiện bởi Ingelman và Gronwall, nghiên cứu của Neubauer et al vào năm 2003 đã chỉ ra rằng dextran cũng có thể được ứng dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm, đặc biệt là trong các sản phẩm như đồ uống có sữa, sữa chua và kem.
Mặc dù dextran có nhiều ứng dụng, nhưng sản lượng dextran từ các chủng bản địa hiện nay không đủ để đáp ứng nhu cầu sử dụng Do đó, cần nghiên cứu các điều kiện tối ưu và thực hiện đột biến chủng để tăng cường sản xuất dextran tối đa.
Năm 2003, Behravan và các cộng sự đã phát hiện rằng đường mật, đường củ cải và cám gạo có thể được sử dụng làm nguồn cacbon chính trong quá trình sản xuất enzyme.
+ Năm 2005: UL Qader et al đã nghiên cứu tối ƣu hóa các điều kiện sản xuất dextran từ 2 chủng Leuconostoc mesenteroides PCSIR-4 và PCSIR-9 [20]
+ Năm 2008: Sarwat et al đã nghiên cứu tối ƣu hóa các điều kiện để thu đƣợc năng suất tối đa từ chủng Leuconostoc mesenteroides CMG 713 [21]
Năm 2008, Kim và các cộng sự đã phát triển một quy trình mới để sản xuất dextran lâm sàng, mang lại sự đơn giản và tiết kiệm hơn so với các phương pháp truyền thống, đồng thời chứng minh tính khả thi của nó như một phương pháp công nghiệp cho sản xuất dextran lâm sàng.
Năm 2012, Ahmed và Sarwat đã tiến hành nghiên cứu nhằm tối ưu hóa các thông số như pH, nhiệt độ, nồng độ NaCl và sucrose để thúc đẩy sự tăng trưởng của vi sinh vật và sản xuất dextran.
Chưa có nghiên cứu nào công bố về việc phân lập các chủng vi sinh vật có khả năng tổng hợp dextran Hiện tại, chỉ có các nghiên cứu ứng dụng dextran cho nhiều mục đích khác nhau.
MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Mục tiêu nghiên cứu
Phân lập và tuyển chọn đƣợc một số chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp dextran.
Nội dung nghiên cứu
- Phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp dextran từ các sản phẩm lên men
- Tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh tổng hợp dextran cao
- Nghiên cứu một số đặc tính sinh hóa của chủng vi khuẩn tuyển chọn.
Vật liệu và hóa chất
Nước bắp cải muối, nước kimchi, mẻ, nước mía lên men thu thập tại chợ Xuân Mai, Chương Mỹ, Hà Nội
Các hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu bao gồm các hóa chất thông dụng có sẵn tại phòng Bộ môn Công nghệ vi sinh – Hóa sinh thuộc Viện Công Nghệ Sinh Học Lâm Nghiệp Những hóa chất này được sản xuất bởi các quốc gia như Việt Nam, Trung Quốc, Đức và Mỹ, bao gồm: cao nấm men, peptone, glucose, sucrose, triammonium citrate, natri axetat, MnSO4·H2O, MgSO4·7H2O, K2HPO4, Tween 80, và bộ nhuộm gram.
Dụng cụ, thiết bị
Buồng cấy, tủ ấm, máy lắc ổn nhiệt, máy li tâm, cân điện tử, kính hiển vi quang học, nồi hấp, tủ lạnh, tủ mát, đĩa petri, bình tam giác, ống nghiệm và nhiều thiết bị khác là những công cụ quan trọng trong phòng thí nghiệm Vi sinh – Hóa sinh tại Trường Đại Học Lâm Nghiệp Việt Nam.
Các môi trường sử dụng trong nghiên cứu
Bảng 2.1: Thành phần môi trường MRS
STT Thành phần môi trường Trọng lượng (g/l)
- Môi trường mMRS: Tương tự môi trường MRS, chỉ thay glucose (20 g/l) bằng sucrose (20g/l) [16; 21]
- Môi trường thử hoạt tính sinh hóa:
Bảng 2.2: Thành phần môi trường lên men đường
STT Thành phần môi trường Trọng lượng (g/l)
Bảng 2.3: Thành phần môi trường thử phản ứng VP
STT Thành phần môi trường Trọng lượng (g/l)
Môi trường sau khi được điều chỉnh về pH phù hợp được thanh trùng ở
Địa điểm và điều kiện bố trí thí nghiệm
Phòng Vi sinh - Hóa sinh, Viện công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trường Đại Học Lâm Nghiệp Việt Nam.
Phương pháp nghiên cứu
- Tạo khuẩn lạc riêng rẽ, tách biệt nhau trên môi trường nuôi cấy thích hợp
- Cấy tách từ khuẩn lạc mọc tách biệt sang ống môi trường dinh dưỡng thạch nghiêng để thu nhận chủng vi khuẩn thuần khiết
- Pha loãng mẫu đến các nồng độ: 10 -1 , 10 -2 , 10 -3 , 10 -4 , 10 -5
Hãy nhỏ 0,1ml (100µl) dịch với nồng độ từ 10^-2 đến 10^-5 vào các đĩa petri chứa môi trường MRS Sử dụng que gạt thủy tinh để trải đều dịch mẫu trên bề mặt thạch Sau đó, nuôi cấy trong tủ ấm ở nhiệt độ 30°C trong thời gian 1-2 ngày.
Các khuẩn lạc với hình dạng và màu sắc đa dạng được tách riêng và thuần hóa trên môi trường mMRS, sau đó được bảo quản trong các ống nghiệm để phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo.
2.7.1.3 Phương pháp cấy truyền bảo quản giống trên môi trường thạch nghiêng
- Dán nhãn ghi gồm tên giống vi sinh vật và ngày cấy
- Dùng que cấy lấy khuẩn lạc đã đƣợc tách rời cấy sang ống thạch nghiêng theo đường zíc zắc
2.7.2 Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng sinh dextran cao
2.7.2.1 Xác định độ nhớt bằng nhớt kế a, Nguyên tắc: Độ nhớt của dung dịch càng lớn thì thời gian chảy của một thể tích xác định dung dịch qua ống mao quản càng dài b, Tiến hành:
- Mẫu đối chứng: Môi trường lỏng mMRS không được bổ sung vi sinh vật
- Mẫu thí nghiệm: Cấy các chủng vi khuẩn vào môi trường lỏng mMRS, nuôi lắc trong 24 giờ
- Lấy dịch canh trường sau 24 giờ của mẫu đối chứng và mẫu thí nghiệm để xác định độ nhớt của dung dịch bằng nhớt kế
- Công thức tính độ nhớt: ndd : ndm = Tdd : Tdm
Trong đó: + n dd : là độ nhớt dung dịch
+ ndm: là độ nhớt nước cất (1,002 mPa.s)
+ Tdd: là thời gian chảy của dung dịch (s)
+ Tdm: là thời gian chảy của nước cất (s) (đo được 0,86s)
2.7.2.2 Xác định hoạt độ enzyme dextransucrase bằng phương pháp DNS a, Nguyên tắc:
Phương pháp này dựa trên phản ứng tạo màu giữa đường khử và thuốc thử acid dinitrosalicylic (DNS), với cường độ màu tỷ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định Việc so màu được thực hiện ở bước sóng 540nm Hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu được tính toán dựa trên đồ thị đường chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử DNS.
Từ dung dịch tiêu chuẩn glucose 10 mg/ml, pha thành các dung dịch chuẩn 0,01; 0,02; 0,03; 0,04; 0,05; 0,06 mg/ml
- Xây dựng thang chuẩn Glucose:
Hút chính xác 1,0 ml các dung dịch chuẩn từ 0,1 – 0,6 mg/ml vào các ống nghiệm, sau đó thêm 1,0 ml dung dịch thuốc thử DNS và 2,0 ml nước cất vào mỗi ống, lắc đều Đun các ống nghiệm trong nước sôi trong 5 phút để thuốc thử DNS phản ứng với đường, tạo ra sản phẩm có màu nâu đỏ Sau đó, làm lạnh các ống nghiệm và thêm 6 ml nước cất vào mỗi ống, lắc đều.
- Sau 24 giờ nuôi vi khuẩn trong môi trường lỏng mMRS, lấy dịch trường mang đi ly tâm 7000 vòng trong 15 phút ở 4 o C, thu phần dịch nổi (dịch enzyme)
- Để xác định hoạt tính tổng hợp dextran, phản ứng đƣợc thực hiện ở 30 °
C trong đệm natri axetat 20 mM (pH 5,4) có chứa 0,05 g CaCl2 trên lít và 100 g sucrose trên lít [11; 15]
+ Mẫu đối chứng: 1ml dịch enzyme đã đƣợc bất hoạt (dịch enzyme đƣợc đun sôi 5 phút) + 1ml cơ chất
+ Mẫu phân tích: 1ml dịch enzyme + 1ml cơ chất
+ Đặt cả 2 ống nghiệm vào tủ 37 0 C trong vòng 30 phút
+ 2ml dịch sau phản ứng + 2ml DNS, đun sôi 5 phút
So màu bằng máy đo quang
+ Đo OD540nm của mẫu thí nghiệm so với mẫu đối chứng
- Xác định hàm lượng đường khử có trong mẫu sau phản ứng enzyme so với đối chứng để tính hoạt độ enzyme
Công thức tính hoạt độ enzyme:
HĐE = (C2 – C1) x n / 0,18 + HĐ E : Là hoạt độ enzyme (là lƣợng enzyme cần thiết để giải phóng ra 1 àmol cơ đường khử (glucoz) trong 1ml dịch lờn men trong 30 phỳt (U/ml)
+ C1: Nồng độ đường khử trong mẫu đối chứng (mg/ml)
+ C2: Nồng độ đường khử trong mẫu phân tích (mg/ml)
+ n: Hệ số pha loãng (nếu có)
+ 0,18: Khối lƣợng của 1 àmol glucose (mg)
2.7.2.3 Phương pháp thu nhận dextran thô
Dextran được kết tủa bằng ethanol theo phương pháp của S.Z Davidovic et al [19]
- Các bước kết tủa dextran:
+ Dịch nuôi cấy sau 24 giờ đƣợc lấy đem ly tâm 7000 vòng trong 15 phút ở 4 0 C nhằm loại bỏ tế bào vi khuẩn
+ Sau khi ly tâm thu lấy phần dịch nổi
+ Tiếp theo, ethanol 96% đƣợc cho vào dịch nổi với tỉ lệ ethanol:dịch nổi là 2:1 (v/v) và giữ qua đêm ở -8 0 C
+ Sau đó, các mẫu đƣợc đem ly tâm 10000 vòng trong 15 phút ở 4 0 C, thu phần kết tủa
+ Kết tủa được hòa tan trong nước cất nóng rồi lại bổ sung ethanol 96% với tỉ lệ và cách thực hiện nhƣ lần 1
+ Phần kết tủa thu đƣợc sau khi ly tâm đƣợc đem sấy đến trọng lƣợng không đổi thì ta thu đƣợc dextran thô
- Cách tính khối lƣợng dextran thô thu đƣợc:
Trong đó: + m: Khối lƣợng dextran thô thu đƣợc (g)
+ mt: Khối lượng ống eppendorf trước khi kết tủa (g)
+ m s : Khối lƣợng ống eppendorf sau khi kết tủa (g)
2.7.3 Phương pháp xác định một số dặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn tuyển chọn
2.7.3.1 Phương pháp xác định hoạt tính catalase
Nhỏ vài giọt H₂O₂ 3% lên bề mặt khuẩn lạc vi khuẩn lactic nuôi 48 giờ trong môi trường MRS ở 37°C Quan sát sự xuất hiện bọt khí bằng mắt thường; nếu có bọt khí, phản ứng là dương tính, ngược lại, không có bọt khí là phản ứng catalase âm tính.
+ Chuẩn bị vết bôi: dùng que cấy vô trùng lấy 1 ít khuẩn lạc hòa vào 1 giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khô trong không khí
+ Cố định tiêu bản vi khuẩn: hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2-3
+ Nhuộm bằng dung dịch tím kết tinh trong 1 phút Rửa nước
+ Nhuộm bằng dung dịch Lugol trong 1 phút Rửa nước
+ Để nghiêng phiến kính 45 0 , tẩy màu bằng cồn 90% khoảng 30 giây (khi giọt cuối cùng chảy ra khỏi phiến kính không còn màu)
+ Nhuộm bổ sung dung dịch Fuchsin khoảng 1 phút Rửa nước, để khô trong không khí
+ Soi kính: Sử dụng dầu soi kính và vật kính dầu để quan sát
2.7.3.3 Khả năng lên men đường a, Nguyên tắc:
Các vi sinh vật lên men đường tạo ra axit, dẫn đến sự giảm pH của môi trường Sự thay đổi này khiến chất chỉ thị màu phenol red trong môi trường chuyển từ màu đỏ sang màu vàng.
- Phân môi trường có các loại đường vào các ống nghiệm
- Hấp khử trùng ở 121 o C trong 15 phút
- Sau đó cấy 0,1ml dịch vi khuẩn vào môi trường (ống đối chứng không cấy dịch vi khuẩn), nuôi lắc ở 37 o C trong 24 giờ
- Quan sát sự đổi màu
2.7.3.4: Phản ứng VP (Voges_Proskauer) a, Nguyên tắc:
Một số vi khuẩn lên men đường tạo axit pyruvic, sau đó chuyển hóa thành acetyl metyl carbinol (ACM) Trong môi trường kiềm, ACM bị oxy hóa thành diacetyl, chất này kết hợp với nhóm guanidin trong acid amin arginin của thuốc thử α-napton, tạo thành hợp chất màu đỏ cam, cho kết quả VP dương tính.
- Phân môi trường vào các ống nghiệm
- Hấp khử trùng ở 121 o C trong 15 phút
- Sau đó cấy 0,1ml dịch vi khuẩn vào môi trường (ống đối chứng không cấy dịch vi khuẩn), nuôi lắc ở 37 o C trong 24 giờ
Nhỏ 5 giọt dung dịch α-naphtol 6% (trong cồn 90%, bảo quản ở 4°C trước khi sử dụng) và 5 giọt NaOH 16% (trong nước), sau đó lắc nhẹ Nếu dịch thể chuyển sang màu đỏ nâu, đây là phản ứng dương tính; nếu màu vàng nhạt, phản ứng là âm tính.
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Kết quả phân lập các chủng vi khuẩn
Dextran là một polysaccharide được tổng hợp chủ yếu từ vi khuẩn lactic trong môi trường chứa sucrose, thường có mặt trong các sản phẩm lên men Nghiên cứu đã chỉ ra rằng chủng L mesenteroides có thể được phân lập từ các loại rau lên men như bắp cải và cà chua Đặc biệt, vào năm 2013, chủng L mesenteroides đã được phân lập từ kim chi trong môi trường có chứa 20 g/l sucrose.
Đề tài đã tiến hành phân lập vi khuẩn sinh dextran từ các mẫu nước bắp cải muối, nước kim chi, mẻ và nước mía lên men thu thập tại chợ Xuân Mai, Chương Mỹ, Hà Nội Môi trường nuôi cấy được bổ sung 20 g/l sucrose thay cho glucose trong môi trường MRS Kết quả phân lập đã thu được 8 chủng vi khuẩn với khuẩn lạc tách biệt và thuần khiết, như thể hiện trong bảng 3.1.
Bảng 3.1: Các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc
Vật liệu Đặc điểm Hình ảnh khuẩn lạc
- Khuẩn lạc tròn, có đường kính khoảng 2- 3mm, màu trắng sữa, nhẵn bóng, mép trơn đều, lồi ít
- Khuẩn lạc tròn, có đường kính khoảng 3-5mm, màu trắng sữa, nhẵn bóng, mép trơn đều, lồi ít
- Khuẩn lạc tròn, có đường kính khoảng 1-3mm, màu trắng sữa, nhẵn bóng, mép trơn đều, lồi ít
- Khuẩn lạc tròn, có đường kính khoảng 4-5mm, màu trắng sữa, bên ngoài đƣợc bao bọc bởi một lớp nhầy, nhẵn bóng, mép trơn đều, lồi nhiều
- Khuẩn lạc tròn, có đường kính khoảng 2-3mm, màu trắng sữa, bên ngoài đƣợc bao bọc bởi một lớp màng nhầy rất mỏng, nhẵn bóng, mép trơn đều, lồi
- Khuẩn lạc tròn, có đường kính khoảng 2-4mm, màu trắng sữa, nhẵn bóng, mép trơn đều, lồi ít
- Khuẩn lạc tròn, có đường kính khoảng 1,5-3mm, màu trắng sữa, nhẵn bóng, mép trơn đều, lồi ít
- Khuẩn lạc tròn, to, đường kính khoảng 5-6mm, bề mặt hơi nhăn, lồi nhiều
Kết quả tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp dextran cao
3.2.1 Kết quả đo độ nhớt
Trong quá trình nuôi cấy enzyme dextransucrase, sucrose được sử dụng để tổng hợp dextran, một polysaccharide có tính chất nhớt Sự hình thành dextran dẫn đến sự gia tăng độ nhớt của dịch nuôi cấy.
Nghiên cứu của UL Qader et al cho thấy rằng trong điều kiện nuôi cấy giống nhau, chủng Leuconostoc mesenteroides PCSIR-4 với độ nhớt 18,72 (cp.) tạo ra lượng dextran là 3,4 (g), trong khi chủng Leuconostoc mesenteroides PCSIR-9 có độ nhớt thấp hơn 18,56 (cp.) chỉ thu được 3,12 (g) dextran Điều này cho thấy rằng độ nhớt của dịch trường có thể được sử dụng để đánh giá sự hình thành dextran.
Sau khi nuôi cấy 8 chủng đã được phân lập trong môi trường mMRS trong 24 giờ ở nhiệt độ 30 °C, chúng tôi đã thu thập dịch trường để xác định độ nhớt, và kết quả được trình bày trong bảng 3.2.
Bảng 3.2: Độ nhớt của các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc ĐC D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8
Kết quả từ bảng 3.2 cho thấy cả 8 chủng đều có khả năng tạo dextran, làm tăng độ nhớt của môi trường so với mẫu đối chứng Trong số đó, 4 chủng có độ nhớt cao nhất là D 4 (1,899 cst), D 5 (1,841 cst), D 3 (1,701 cst) và D 7 (1,561 cst) Nghiên cứu cho thấy các chủng này có độ nhớt cao hơn có thể liên quan đến chuỗi liên kết α.
(1 → 6) trong mạch chính dài hơn [11]
3.2.2 Kết quả xác định hoạt độ enzyme dextransucrase bằng phương pháp DNS
Enzyme dextransucrase chỉ sử dụng sucrose làm cơ chất duy nhất để tổng hợp dextran Vì vậy, để thu được dextran khi nuôi cấy các chủng vi sinh vật trên môi trường có nguồn cacbon duy nhất là sucrose, các chủng này cần phải có enzyme dextransucrase.
Sau 24 giờ nuôi cấy 8 chủng phân lập trong môi trường mMRS, dịch canh trường được thu và ly tâm ở 7000 vòng/phút trong 15 phút tại 4 độ C Phần dịch nổi thu được sẽ được sử dụng để xác định hoạt độ của enzyme dextransucrase.
- Để xác định hoạt tính của enzyme tổng hợp dextran, phản ứng đƣợc thực hiện ở 30 ° C trong đệm natri axetat 20 mM (pH 5,4) có chứa 0,05 g/l CaCl2 và 100 g/l sucrose [11; 15]
- Kết quả xây dựng đường chuẩn glucose:
Bảng 3.3: Mật độ quang của dãy dung dịch chuẩn glucose theo phương pháp DNS
Từ các kết quả trong bảng trên, dựng đường chuẩn tương quan giữa nồng độ Glucose và độ hấp thụ trong Microsoft Exel
Hình 3.1: Đường chuẩn tương quan giữa nồng độ glucose và độ hấp thụ
Dựa vào đồ thị đường chuẩn tương quan giữa glucose và giá trị OD540nm, chúng ta có thể tính toán lượng glucose được tạo ra trong quá trình enzyme dextransucrase phân giải sucrose, từ đó xác định được hoạt độ của enzyme.
- Sau khi tính đƣợc C 1 và C 2 , ta thay vào công thức: HĐ E = (C 2 – C 1 ) x n / 0,18 + Với hệ số pha loãng: n = 20
Bảng 3.4: Mật độ quang của các mẫu đối chứng (enzyme đã bị bất hoạt) theo phương pháp DNS
C(mg/ml) Đồ thị phương trình đường chuẩn Glucoes
Nghiên cứu trước đây cho thấy sản xuất dextran tỉ lệ thuận với hoạt động của enzyme Kết quả từ bảng 3.6 cho thấy hoạt độ enzyme nằm trong khoảng 3,778 – 5,556 U/ml, tương tự hoặc cao hơn một chút so với nghiên cứu đã công bố trước đó với giá trị 4,305 U/ml trong cùng môi trường chứa sucrose.
- Trong đó 4 chủng có hoạt độ enzyme mạnh nhất là D4 (5,556 U/ml), D5
3.2.3 Kết quả thu nhận dextran thô
Dextran, một polysaccharide, khi được kết tủa bằng ethanol, sẽ làm gián đoạn quá trình hydrat hóa của các polysaccharide và ion tích điện trong nước Sự tác động này giúp các phân tử polysaccharide gần nhau hơn, tương tác và hình thành khối ổn định, có thể thu được thông qua phương pháp ly tâm.
Hình 3.2: Dung dịch sau khi kết tủa với ethanol để qua đêm ở -8 0 C
Sau khi kết tủa dextran bằng ethanol 96% và để hỗn hợp qua đêm ở -20°C, chúng ta thu được ba phần kết tủa: một phần kết tủa màu trắng lắng dưới đáy ống nghiệm, một phần kết tủa màu trắng, bông xốp lơ lửng trong ống nghiệm, và một phần kết tủa màu nâu, nhớt bám trên thành ống nghiệm.
Hình 3.3: Dextran thô thu đƣợc
- Khối lƣợng dextran thô thu đƣợc sau khi kết tủa 8ml dịch nuôi lỏng được thể hiện dưới bảng sau:
Bảng 3.6: Khối lƣợng dextran thô thu đƣợc
- Từ kết quả bảng 3.6: Lƣợng dextran thô thu đƣợc nằm trong khoảng 5,3- 16,04 g/l Kết quả này tương tự với kết quả của 1 số báo cáo như: Trong tổng số
174 chủng đã đƣợc phân lập từ ngũ cốc và các sản phẩm từ sữa, trong đó chỉ có
9 loại glucans đƣợc sản xuất với năng suất trong khoảng 0,8 - 17,2 g/l Sản lƣợng dextran đƣợc sản xuất bởi L mesenteroides NRRL B-640 trong điều kiện tối ƣu là 12 g/l [19]
- Từ bảng 3.6 ta có 4 chủng có khả năng sinh dextran cao là D 4 (16,0375 g/l), D 5 (16,025 g/l), D 3 (14,3375 g/l), D 7 (14,175 g/l) Kết quả này phù hợp với kết quả hoạt độ enzyme thu đƣợc ở phần trên
Kết quả: Trong 8 chủng đã phân lập, tuyển chọn đƣợc 4 chủng có khả năng sinh tổng hợp dextran cao là D3, D4, D5, D7.
