Nghiên cứu khảo sát các điều kiện nuôi cấy sinh tổng hợp enzyme laccase từ chủng nấm aspergillus niger phân lập được từ rừng núi luốt đại học lâm nghiệp

Trong đó Laccase đặc biệt được quan tâm bởi enzyme này nằm trong hệ enzyme lignolytic và là một polyphenol oxydase, do đó có khả năng oxy hóa diphenol và các hợp chất có liên quan, do đó

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp, em xin bày tỏ long biết ơn sau sắc nhất đến TS Nguyễn Như Ngọc người đã dành nhiều thời gian hướng dẫn tận tình, cung cấp nhiều kiến thức quý báu, tạo mọi điều kện thuận lợi và tốt nhất cho em trong quá trình thực hiện đề tài khóa luận

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô cán bộ phòng Vi Sinh Hóa Sinh Viện Công Nghệ Sinh Học là những người đã giúp đỡ tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em học tập và trong quá trình làm khóa luận tốt nghiệp

Tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã động viên giúp đỡ và tạo điều kiện để hoàn thành đề tài này

Một lần nữa, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến tất cả mọi người!

SINH VIÊN THỰC HIỆN

Nguyễn Thị Minh Hiền

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

DANH MỤC VIẾT TẮT

DANH MỤC HÌNH

DANH MỤC SƠ ĐỒ

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 3

1.1 Enzyme Laccase 3

1.1.1 Giới thiệu về enzyme Laccase 3

1.1.2 Tính chất hóa sinh của Laccase 5

1.1.3 Cơ chế hoạt động của enzyme 8

1.1.4 Ứng dụng của enzyme Laccase 8

1.2 Hệ vi sinh vật có khả năng sinh Laccase 10

1.2.1 Nấm và thực vật 10

1.2.2 Vi khuẩn và xạ khuẩn 11

1.2.3 Côn trùng 11

1.3 Tổng quan vể chủng nấm Aspergillus niger 11

1.4 Tình hình nghiên cứu về enzyme Laccase 12

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 12

1.4.2 Tính hình nghiên cứu trong nước 13

CHƯƠNG 2: MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Mục tiêu nghiên cứu 14

2.2 Nội dung nghiên cứu 14

2.3 Vật liệu nghiên cứu 14

2.3.1 Thiết bị, dụng cụ 14

2.3.1.Hóa chất và môi trường sử dụng 15

2.4 Phương pháp nghiên cứu 19

2.4.1 Xác định hoạt tính enzyme Laccase của chủng Aspergillus niger 19

2.4.2 Phương pháp nghiên cứu khảo sát các điều kiện nuôi cấy các chủng sinh enzyme Laccase 20

2.4.3 Thử hoạt tính enzyme Laccase 23

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25

3.1 Kết quả xác định hoạt tính của enzyme laccase của chủng nấm Aspergillus niger 25

3.2 Kết quả xác định, chọn lọc môi trường nuôi cấy thích hợp cho chủng Aspergillus niger sinh tổng hợp enzyme Laccase 25

3.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng pH đến khả năng sinh tổng hợp Laccase 27

3.4 Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh enzyme Laccase 29

3.5 Kết quả ảnh hưởng của tốc độ lắc đến khả năng sinh tổng hợp Laccase 30

3.6 Kết quả ảnh hưởng của các nguồn đường đến khả năng sinh tổng hợp Laccase 32

3.7 Kết quả ảnh hưởng của nguồn nitrogen đến khả năng sinh tổng hợp enzyme của chủng Aspergillus niger 33

PHẦN 4:KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36

4.1 Kết luận 36

4.2 Kiến nghị 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO

ABTS 2, 2 '-azinobis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonate

ETDA Ethylendiamin Tetraacetic Acid

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hình ảnh cấu trúc phân tử Laccase 4 Hình 1.2: Hình ảnh cụm xúc tác của Laccase 8 hình 3.1: Hình thái của chủng nấm mốc Aspergillus niger trên môi trường PDA 25 Hình 3.2: Hình ảnh thử hoạt tính trên cơ chất acid tannic của chủng nấm mốc Aspergillus niger 25 Hình 3.3: Ảnh vòng phản ứng màu của Laccase trên môi trường chứa cơ chất acid tannic sau 96 giờ 26 Hình 3.4: Ảnh vòng phản ứng màu của Laccase nuôi ở pH 3 đến pH 7 của sau

96 giờ 28 Hình 3.5: Ảnh vòng phản ứng màu của Laccase ở nhiệt độ từ 4oC đến 40o

C sau khi thu dịch ở 96 giờ 29 Hình 3.6: Ảnh đường kính vòng phản ứng màu của Laccase với cơ chất aacid tannic ở tốc độ lắc từ 50 – 200 vòng/phút 31 Hình 3.7: Ảnh vòng phản ứng màu của Laccase ở các nguồn cacbon sau 96 giờ nuôi cấy 32 Hình 3.8: Hình ảnh vòng phản ứng màu của chủng Aspergillus niger ở các nguồn nitơ khác nhau sau 96 giờ 34

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Biểu đồ 3.1: Ảnh hưởng của môi trường đến khả năng sinh enzyme Laccase sau

96 giờ nuôi cấy 26 Biểu đồ 3.2: Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh enzyme Laccase ở 96h 27 Biểu đồ 3.3:Đồ thị ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh tổng hợp enzyme Laccase 29 Hình 3.4: Biểu đồ ảnh hưởng của tốc độ lắc đến khă năng sinh tổng hợp enzyme Laccase 31 Biểu đồ 3.5: Ảnh hưởng của các nguồn cacbon đến khả năng sinh tổng hợp enzyme Laccase 32 Biều đồ 3.6: Ảnh hưởng của nguồn nitrogen đến khả năng sinh enzyme Laccase 34

MỞ ĐẦU

Việt Nam là một trong những nước mà tình trạng ô nhiễm môi trường đang trở nên báo động, trong đó có tình trạng ô nhiễm bởi nguồn thuốc nhuộm công nghiệp và chế biến bột giấy, công nghiệp sản xuất, bảo quản thực phẩm vải, không được xử lý tốt Đa số nước thải từ các khu công nghiệp nhà máy được xử

lý chủ yếu bằng các phương pháp hóa học và vật lý như hấp phụ, keo tụ tạo bông, trao đối ion, oxy hóa và điện hóa Tuy nhiên, những phương pháp này có một số hạn chế như tạo ra bùn thải, chi phí cao và sử dụng một lượng lớn hóa chất Do đó, xử lý nước thải bằng phương pháp sinh học có vai trò quan trọng do giá thành rẻ, xử lý triệt để, không tạo sản phẩm thứ cấp

Xu hướng ứng dụng enzyme ngoại bào như: Laccase, mangan peroxidase (MnP), lignin peroxidase (LiP), có khả năng xúc tác các phản ứng oxy hóa khử được xem là biện pháp hiệu quả và có tiềm năng ứng dụng cao trong việc phân giải các hợp chất hữu cơ, vô cơ như: Dichloro - Trichloroethane Diphenyl, lignin (nước thải nhà máy giấy), hydrocarbon vòng thơm (biphenol,benzidine, )

có trong nước ô nhiễm bởi dầu mỏ, Trong đó Laccase đặc biệt được quan tâm bởi enzyme này nằm trong hệ enzyme lignolytic và là một polyphenol oxydase, do đó có khả năng oxy hóa diphenol và các hợp chất có liên quan, do

đó loại enzyme này có thể xử lý nước thải của các nghành công nghiệp như: dệt nhuộm , tổng hợp hữu cơ, thực phẩm , dược phẩm v.v

Mặt khác hiện nay các chủng tổng hợp Laccase trong tự nhiên thường có hoạt tính thấp và đòi hỏi các chất cảm ứng tạo enzym với giá thành cao Trên thị trường enzyme Laccase đã được thương mại hóa nhưng chưa được sử dụng phổ biến tuy nhu cầu sử dụng của con người vẫn cao nhưng người ta thường hướng tới các chế phẩm sinh học hoặc hóa học vẫn có thể xử lý chất độc trong nước thải mà giá thành rẻ hơn

Trong vài năm gần đây các nghiên cứu nhằm phân lập các chủng mới hoặc đột biến các chủng vi sinh vật có khả năng sinh Laccase ngày càng nhiều Cùng

với đó là rất nhiều nghiên cứu về khảo sát các điều kiện nuôi cấy của các chuẩn

đã phân lập tuyển chọn được đó để sinh enzyme nhằm mục đích đưa ra môi trường thích hợp cho các chủng đó tiết enzyme là cao nhất có thể để tạo ra nhiều chế phẩm enzyme Laccase hoạt tính tốt giá thành giảm đi để phục vụ cho nhu cầu sử dụng của con người Để đáp ứng nhu cầu nguồn sử dụng enzyme tôi đã

thực hiện đề tài: “Nghiên cứu khảo sát các điều kiện nuôi cấy sinh tổng hợp

enzyme Laccase từ chủng nấm Aspergillus niger phân lập được từ rừng núi Luốt Đại Học Lâm Nghiệp”

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1 Enzyme Laccase

1.1.1 Giới thiệu về enzyme Laccase

Laccase là một enzyme nằm trong hệ enzyme lignolytic có khả năng oxy hóa mạnh các hợp chất phenol, diamine, amine thơm, benzenethiol, lignin, dioxin, và các hợp chất có liên quan ngoài ra chũng còn phân giải các hợp chất

vô cơ như iot[17] Laccases đóng một vai trò quan trọng trong sự hình thành lignin bằng cách thúc đẩy sự liên kết oxi hóa monolignols, một họ phenol xảy ra

tự nhiên [1,12]

Ở dạng dimer hoặc trimer thì enzyme lacase có hoạt tính chúng có thể oxy hóa phân giải các chất độc hại trong nước thải ô nhiễm Mà quá trình phân giải chất độc hại trong nước thải thì các chủng vi sinh vật chỉ cần lấy oxy từ không khí để sinh trưởng phát triển để sinh enzyme Laccase và sản phẩm phụ duy nhất tạo thành sau phản ứng là nước [4]

Năm 1896, Laccase đã được chứng minh là có mặt trong nấm lần đầu tiên bởi cả Bertrand và Laborde Kể từ đó hầu hết các Laccases đã được phân lập là từ nguồn gốc nấm đặc biệt là từ nấm thối trắng thuộc các lớp khác nhau

như Ascomycetes, Basidiomycete và Deuteromycetes [10]

Năm 1996, Orly Ardon và cộng sự nghiên cứu thân cây bông đã được

tìm thấy là một chất nền tuyệt vời cho việc canh tác Pleurotus, chiết xuất cuống

bông đã được nghiên cứu cho thấy kích thích sự phát triển của nấm trong các môi trường bề mặt và hoạt động Laccase ngoại bào trong các môi trường lỏng Cảm ứng của hoạt động Laccase phụ thuộc vào nồng độ của chiết xuất bổ sung Sự kích thích của Laccase được quan sát sớm nhất là 3 giờ sau khi sửa đổi CSE Chất nhuộm hoạt tính Laccase sau khi tách bằng điện di gel cho thấy hai dải chính trong cả điều khiển và các môi trường có chiết xuất cuống bông gây

ra

Tất cả Laccase đều giống nhau về cấu trúc trung tâm xúc tác với

4 nguyên tử đồng Những nguyên tử đồng này được chia thành ba nhóm: Loại 1

(T1), loại 2 (T2) và loại 3 (T3), chúng khác nhau về tính chất hấp thụ ánh sáng

và thế điện Các nguyên tử đồng T1 và T2 có tính chất hấp thụ điện tử tạo thành phổ điện tử mạnh, trong khi cặp nguyên tử đồng T3 không tạo phổ điện từ hấp phụ điện tử và có thể hoạt hóa khi liên kết với anion mạnh [6]

Hình 1.1 Hình ảnh cấu trúc phân tử Laccase

Trái ngƣợc với hầu hết các enzym, Laccase hoạt động trên nhiều loại chất nền nhƣ diphenol, polyphenol, amin thơm, benzenethiols và thậm chí một

số hợp chất vô cơ nhƣ iốt Mặc dù, hầu hết các chất nền Laccases là nhiều hợp chất phenolic , độ đặc hiệu của chúng có thể đƣợc mở rộng bằng các chất trung

gian nhƣ: ABTS và 1-hydroxybenzotriazole [10]

Với tính chất phản ứng với nhiều chất nền enzyme Laccases đƣợc ứng dụng trong nhiều nghành công nghiệp khác nhau nhƣ: tẩy thuốc nhuộm, tẩy trắng bột giấy và xử lý sinh học Vì vậy, cần tìm hiểu, nghiên cứu về Laccases

vi sinh từ nhiều nguồn khác nhau và nghiên cứu thêm nhiều đặc tính khác để

mở rộng tiềm năng và ứng dụng của hệ enzyme Laccase với sinh thái

1.1.2 Tính chất hóa sinh của Laccase

1.1.2.1 Ảnh hưởng của pH đến enzyme Laccase

pH là yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh tổng hợp Laccase , mỗi chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzyme Laccase sẽ có một ngưỡng pH thích hợp để sinh tổng hợp và hoạt hóa enzyme Nếu pH không phù hợp sẽ làm giảm hoạt tính enzyme hoặc làm cho các chủng vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme Laccase thấp

Laccase hoạt động tối thích trong khoảng pH 4 – 6 đối với cơ chất phenolic Khi tăng pH xang vùng trung tính hoặc cùng kiềm thì hoạtt tính của Laccase bị giảm do các anion hydroxide đa ức chế hoạt động của Laccase Đối với các cơ chất không phải phenolic nhờ ABTS thì các phản ứng oxy hóa không liên quan đến sự vận chuyển các ion và do đó pH tối thích nằm trong khoảng 2 –

3 Laccase bền trong pH kiềm nằm trong khoảng 8 – 9 [6]

Theo nghiên cứu của Trần Thị Thu Hiền và cộng sự (năm 2016) chủng nấm FBD154 được phân lập từ vườn quốc gia Bidoup - Núi Bà, Làm Đồng, Việt

Nam có khả năng sinh tông hợp Laccase với hoạt tính cao Chủng Polyporus sp

FBD154 có khả năng sinh tổng hợp Laccase ở pH rất rộng từ pH 2- pH 9 và sinh trưởng tốt nhất ở môi trường acid có pH4 đạt hoạt tính cao nhất là 18727 u/l Ở

pH 3 và pH 5 chủng nấm này cũng cho hoạt tính khá cao, lần lượt là 12835 u/l

và 8344 u/l, trong khi đó tại pH từ 10 -12 hoạt tính enzyme đo được rất thấp, chỉ

từ 28 đến 74 u/l và tốc độ sinh trưởng cua nấm cũng rất kém Như vậy, pH 4 phù hợp nhất cho sự sinh trưởng và sinh tổng hợp Laccase ở chủng FBD154 [8]

1.1.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh enzyme Laccase

Nhiệt độ bền của Laccase giao động đáng kể, phụ thuộc vào nguồn gốc của vi sinh vật mà enzyme Laccase có có nhiệt độ bền khác nhau, nhìn chung enzyme Laccase bền trong khoảng 30oC – 50oC và nhanh chóng mất hoạt tính ở

60oC Enzyme bền nhiệt thường được phân lập chủ yếu ở prokaryote, ví dụ: thời

gian phân hủy của Laccase được tổng hợp từ Streptomyces lavendulae là 100

phút ở 70oC và protein cotA từ chủng Bacillus subtilis là 112phút ở 80oC Thời

gian bán hủy của các enzyme có nguồn gốc từ nấm thường nhỏ hơn 1 giờ ở 70o

C chứa 200 mg/l chất pyrene Với hoạt tính Laccase cao nhất là 1496 U/l [20]

Ngoài ra Laccase chiết xuất từ Stereumostrea cho thấy hoạt tính cao

nhất ở nhiệt độ 30oC và 40 ° C Khi nấm được trồng trong môi trường có độ pH 5.0, Laccase sẽ tạo ra quá nhiều nhưng hầu hết các nghiên cứu cho thấy pH giữa 4,5 và 6,0 thích hợp cho sản xuất enzyme [14,16,17]

1.1.2.3 Ảnh hưởng của các chất cảm ứng

Laccase có thể bị ức chế bởi các ion nhỏ như: azide, halogenua, xyanua

và florua, axit amin , axit béo các ion này liên kết với đồng loại 2 và loại 3 và

phá vỡ việc chuyển electron qua các trung tâm đồng, do đó làm giảm hoạt động Các ion kim loại, axit béo, hydroxyglycine cũng có thể ức chế Laccase bằng cách làm thay đổi dư lượng axit amin, thay đổi cấu trúc hoặc sự thải trừ đồng

Kết quả nghiên cứu của D‘Souza-Ticlo và cộng sự (2009) cho thấy isozyme của Laccase bị ức chế hoạt động với sự có mặt của natri azit, SDS và mercaptoethanol Khoảng 56% và 48% hoạt động của Laccase bị ức chế với sự hiện diện của Crom Đối với các chất khác Ag và Hg thì sự ức chế chỉ là 32-37% Các ion kim loại khác không cho thấy sự ức chế đáng kể [15]

Năm 2010 kết quả nghiên cứu của Nguyễn Nguyên quang cho thấy các chất cảm ứng như ứng 4-hydroxylbenzoic axit, ABTS, ferulic axit và vanillin làm tăng hoạt tính Laccase của chủng FBH11 Hoạt tính bổ khi sung các chất cảm ứng trên lần lượt là 6940 U/l, 5469 U/l, 4691 U/l, 4511 U/l [2]

1.1.2.4 Ảnh hưởng của nguồn cacbon và nitơ

Vi sinh vật phát triển trên môi trường đều cần có nguồn nitơ (pepton, cao nấm men, ure, NH4Cl, NaNO3, ) và cacbon (glucose, mantose, fructose, CO2, )

để sinh trưởng và phát triển Nếu trên môi trường dư thừa hoặc thiếu lượng nitơ

và cacbon thì cũng sẽ làm giảm khả nằn sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp các enzyme, vitamin, của vi sinh vật

Theo kết quả nghiên cứu của Wang và cộng sự năm 2006 một số công

bố trên thế giới, hoạt tính Laccase của chủng Polyporus arcularius A08 tăng đến

1.480 u/l khi bổ sung nguồn carbon hỗn hợp chứa cám gạo và hemicelluloses

trong môi trường với tỷ lệ C/N cao Chủng Monotospora sp sinh trưởng trên

nguồn cacbon là 2 g/l maltose đã tạo Laccase với hoạt tính 13.550 U /Ị tăng 4 lần so với môi trường cơ sở

Kết quả nghiêm cứu của Sathishkum và cộng sự năm 2010 chủng

Pleurotus diyinus IBB 903 sinh tổng hợp Laccase và cho hoạt tính 6.025 u/l sau

10 ngày nuôi cậy khi sử dụng nguồn nitrogen là (NH4)2SO4 với nông độ là 10mM [2]

Ở Việt Nam, chủng nấm Trichoderma sp FCP3 phân lập từ gô mục ở

rừng Quốc gia Cúc Phương được biết là sinh tổng hợp Laccase và cho hoạt tính

là 132 U/l khi bổ sung NaNO3, và KNO3 (tỷ lệ 3:7) với nồng độ 3 g/1 [8]

1.1.2.5 Ảnh hưởng của ion kim loại đến khả năng sinh Laccase

Ảnh hưởng của các ion kim loại có thể ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme các ion kim loại này có thể làm tăng hoặc giảm hoạt tính của enzyme

Năm 2014 Ngụy Thị Mai Thảo và cộng sự khảo sát được ảnh hưởng của ion Cu2+ bổ sung Cu2+ hoạt tính enzyme cao nhất đạt được là 1.333 U/ml và 1.407 U/ml sau 7 ngày nuôi cấy khi Cu2+

được bổ sung lần lượt ở ngày thứ 3 và

4 và hoạt tính đạt 1.332 U/ml sau 14 ngày nuôi cấy nếu Cu2+

được bổ sung sau 5 ngày nuôi Nếu bổ sung Cu2+

vào những ngày nuôi cấy muộn hơn, ngày thứ 6 và

7, hoạt tính thấp hơn, đạt xấp xỉ 1.000 U/ml sau 11 ngày nuôi cấy [7]

Các ion kim loại nặng hóa trị 2 khác như Co2+,

Cd2+,Hg2+, Mn2+ lại là nguyên nhân gây ức chế hoạt động enzyme Laccase

Ngoài ra còn có các yếu tố như tốc độ lắc, nồng độ các chất vi lượng, cũng ảnh hưởng đến khả năng sinh enzyme và hoạt động của enzyme

1.1.3 Cơ chế hoạt động của enzyme

Loại 1(T1), (T1) đồng tạo màu xanh điển hình cho protein và là nơi xảy

ra quá trình oxy hóa chất nền Màu xanh nước biển điển hình cho protein trong phân tử Laccase được tạo thành do liên kết giữa nguyên tử đồng T1 với nguyên

tử lưu huỳnh của cystein là liên kết đồng hóa trị bền và hấp thụ ánh sáng ở bước song 600nm Đồng loại 2 (T2) và loại 3 (T3) tạo thành cụm trinuclear, là nơi làm giảm oxy hóa phân tử và giải phóng nước diễn ra [20,21]

Hình 1.2: Hình ảnh cụm xúc tác của Laccase

Ngoài ra các chất trung gian tổng hợp phổ biến nhất là 1-hydroxy benzotriazole (HOBT), N-hydroxyphthalimide (NHPI), 2,2'-azinobis- (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonate) (ABTS) và acid hydroxyanthranilic 3 Trong sự

có mặt của oxy ABTS Sự hấp thụ bởi Laccase nhanh hơn HOBT [6,18]

1.1.4 Ứng dụng của enzyme Laccase

Enzyme Laccase là loại enzyme quan trọng vì nó oxy hoá cả các chất độc và không độc hại Nó được sử dụng trong công nghiệp dệt, công nghiệp chế biến thực phẩm, công nghiệp chế biến gỗ, công nghiệp dược phẩm và công nghiệp hóa chất Enzym này rất cụ thể, bền vững về sinh thái và là một chất xúc tác thông dụng

1.1.4.1 Laccase trong phân giải nước thải nghành công nghiệp dệt, nhuộm

Ngành dệt chiếm 2/3 tổng thị trường thuốc nhuộm và tiêu thụ một lượng lớn nước và hóa chất để chế biến ướt hàng dệt Do cấu trúc hóa học của của thuốc nhuộm có khả năng chống phai màu khi tiếp xúc với ánh sáng, nước Hầu

hết chúng khó phân hủy do tổng hợp của chúng từ nhiều nguồn khác nhau Việc

sử dụng Laccase trong ngành công nghiệp dệt đang phát triển nhất là trong phân giải nước thải nhà máy dệt, nhuộm

Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Khởi Nghĩa phân lập được từ mẫu

gỗ đồng bằng sông cửu long được dòng nấm HG1 có khả năng loại màu thuốc nhuộm xanh cao nhất sau 8 ngày nuôi cấy, giảm 457 mg.L-1, chiếm 92% nồng

độ ban đầu (500 mg.L-1) trong khi dòng nấm TV13 có khả năng loại màu thuốc nhuộm đen tốt nhất sau 7 ngày nuôi cấy, giảm 493 mg.L-1, chiếm 99% nồng độ ban đầu [3]

1.1.4.2 Laccase trong xử lý nước thải và tẩy trắng bột giấy

Trong công nghiệp giấy và bột giấy nước thải của nhà máy trước đây thường sử dụng các chất oxy hoá hóa học chứa clo và oxy được sử dụng để tách

và phân hủy lignin cần thiết để chuẩn bị giấy ở cấp độ công nghiệp và tẩy trắng giấy Nhưng hiện nay người ta hương tới sử dụng enzyme để sử lý nước thải và tẩy trắng bột giấy trong đó Laccase là một enzyme nằm trong hệ enzyme lignolytic có khả năng oxy hóa mạnh các hợp chất lignin trong nước thải nhà máy giấy và có thể sùng để tẩy trắng bột giấy [14,19]

1.1.4.3 Ứng dụng của enzyme Laccase trong chế biến và xử lý nước thải của công nghiệp chế biến thực phẩm

Khi cho thêm enzyme Laccase được thêm vào bột và các sản phẩm nướng thì các sản phẩm đó được cải thiện về một số đặc tính như: tăng khối lượng sản phẩm, cải thiện cấu trúc crumb, làm cho các sản phẩm nướng mềm hơn Ngoài ra Laccase có thể chịu trách nhiệm cho việc tạo màu nâu, tạo sương

mù và phát triển độ đục trong nước trái cây, bia và rượu vang rõ ràng

Trong nước thải nghành công nghiệp thực phẩm enzyme Laccase loại bỏ các hợp chất phenolic không mong muốn trong bánh mì, nước trái cây, bia và rượu để ổn định và cải thiện các đặc tính cảm quan của chúng loại bỏ oxy trong thực phẩm đóng gói hoặc có nguồn gốc từ thực vật để tránh quá trình oxy hóa không mong muốn [1]

1.1.4.4 Các ứng dụng khác của Laccase

Laccases có thể được sử dụng để giải độc các loại đất có chứa các chất ô nhiễm phenolic và các chất độc do thuốc trừ sâu, do phạm vi bề mặt rộng của enzyme

Laccase cũng có thể được sử dụng để loại bỏ mùi phát ra từ những nơi như các bãi thải rác, các trang trại chăn nuôi,

Enzyme Laccases được sử dụng như một bộ cảm biến sinh học để phát hiện các hợp chất phenolic trong nước ép trái cây và nồng độ oxy trong nước thải, ngoài ra enzyme +Laccase còn được dùng để phát hiện morphine và codeine, catecholamin, flavonoid thực vật [14,19]

1.2 Hệ vi sinh vật có khả năng sinh Laccase

Laccases là các enzyme oxi hóa có chứa đồng có trong nhiều loại như

nấm, vi sinh vật, thực vật động vật

1.2.1 Nấm và thực vật

Trong thực vật, Laccase đóng một vai trò trong lignifications trong khi trong nấm nó đã được liên quan đến delignification, sporulation, sản xuất sắc tố,

hình thành cơ thể đậu quả, và bệnh sinh thực vật [15]

Các chủng nấm sinh enzyme Laccase thường được tìm thấy trong các chi

Ascomycetes, Deuteromycetes và Basidiomycetes, đặc biệt phong phú trong

nhiều loại nấm thối trắng chúng có khẳ năng chuyển hóa lignin, ở nấm khả năng tiết enzyme Laccase phân giải lignin cao hơn sơ với thực vật và vi khuẩn [20]

Ngoài ra còn nhiều chủng nấm khác có khả năng sinh enzyme Laccase:

Aspergillus sp,Aspergillus niger, Aspergillus oryzca, Aspergilluss candidus, Fusarium sp, Trichoderma reesei ru, Streptomycest-c30, Kluyverromyces lactic, torulopsis spherical, Torulopsis pseudotropicalis, Saccharomyces fragilis,…

Phạm Duy Hải và cộng sự nghiên cứu ―Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng và các điều kiện nuôi cấy bề mặt tạo sinh khối chứa enzyme

phytase có hoạt lực cao từ Aspergilus niger‖ Phạm Duy Hải và cộng sự của

ông đã tối ưu hóa được thành phần trung bình và điều kiện lên men trạng thái

nửa rắn cho phytase ngoại bào bởi Aspergillus niger YD với mục tiêu tăng sản lượng để làm cho nó kinh tế như một sản phẩm thương mại đã đạt được với kết quả đạt được, trung bình Thành phần: tinh bột ngô (73%) và bột đậu tương (24,44%); và lên men nhiệt độ tối ưu như nhiệt độ là 370C, thời gian lên men là

5 ngày và tương đối độ ẩm của môi trường là 70%

1.2.2 Vi khuẩn và xạ khuẩn

Một số chủng vi khuẩn xạ khuẩn có khả năng sinh enzyme Laccase

- Vi khuẩn: Lactobacillus acidophilus, Lactobaccillus sp, Lactobaccillus lactic, Bacillus sutilis, Bacillus curculans, Streptococcus sativarius, Streptococcus thermophilus, E.coli, S.lavendulae, S.cyaneus, Marinomonas mediterranea …

- Xạ khuẩn: Streptomyces, Streptomyces sp,…

1.2.3 Côn trùng

Laccase đã được tìm thấy trong lớp biểu bì của nhiều loài côn trùng từ

nhộng tằm, lớp biểu bì của bọ cánh cứng màu đỏ, Tribolium castaneum Gần đây, một Laccase trong tuyến nước bọt của N.cincticeps [15]

1.3 Tổng quan vể chủng nấm Aspergillus niger

Nấm Aspergillus niger có khuẩn ty phân nhánh, có vách ngăn, bào tử

đính không nằm trong bọc bào tử, cuống sinh thể bình phình ra rõ rệt ở 2 đầu tạo bọng hình cầu 5-6 x 20-30mm, đôi khi 6-10 x 60-70mm Thể bình gồm 2 lớp, lớp thứ nhất hình tam giác cân ngược, lớp thứ 2 hình chai; bào tử đính xòe ra,

hình cầu xù xì, có gai nhọn, màu nâu đen đến đen than, đường kính 4-5mm [7]

Sinh trưởng được ở nhiệt độ tối thiểu 6-8 độ C, tối đa 45-47 độ C, tối ưu 25-28

độ C

- Một số loại enzyme phổ biến mà enzyme mà Aspergillus niger có thể tiết ra

+ A-amylase: Aspergillus niger có khả năng tổng hợp a-amylase ngoại

bào để thủy phân nhanh tinh bột tạo dextrin và một ít maltose và glucose

+ Protease: Aspergillus niger có khả năng tạo 2 loại protease Protease thứ nhất

phân giải protein thành polypeptid, pepton; protease thứ hai tiếp tục chuyển hóa các sản phẩm trên thành acid amin

+ Cellulase: Aspergillus niger có khả năng tạo cellulase, chủ yếu là

cellulase Cl, cellulase Cx và b-glucosidase hay cellobiase

+ Pectinase, Xylanase: Aspergillus niger có khả năng tạo pectinase,

xylanase ở

Ngoài ra, Aspergillus niger còn có khả năng tổng hợp hàng loạt enzyme

khác như: lipase, mananase, chitinase, pectinase

Trong công nghiệp sản xuất chế biến thực phẩm như: tương chao, nước mắm, nước tương;công nghiệp sản xuất một số axit hữu cơ như: acid citric, acid

glucomic

Aspergillus niger là một loại nấm và một trong những loài phổ biến nhất của các chi Aspergillus Nó gây ra một căn bệnh được gọi là nấm mốc đen trên

một số loại trái cây và rau quả như nho,

1.4 Tình hình nghiên cứu về enzyme Laccase

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Năm 2008 Dube và cộng sự quan sát thấy axít tetraacetic ethylene diamine (EDTA) (5 mM) hoàn toàn ức chế hoạt động của Laccase EDTA, SDS

và arginine có tác dụng ức chế nổi mạnh nhất đối với hoạt động của Laccase [15]

Năm 2017 amit kumar và cộng sự Thanh lọc dựa trên gel và nghiên cứu

sinh hóa của Isozym Laccase sản xuất từ Ganoderma sp Kết quả đạt được các isozyme Laccase từ G Lucidum đã được tìm thấy có vai trò chống oxy hóa và

do đó có khả năng trong các gốc tự do nhặt rác trong quá trình sinh bệnh Đây là nghiên cứu chi tiết đầu tiên về đặc điểm sinh hóa của tất cả các isozyme Laccase được tinh chế bằng phương pháp mới dựa trên gel

1.4.2 Tính hình nghiên cứu trong nước

Laccase là một enzyme có nhiều ứng dụng trong các nghành các công nghiệp xử lý môi trường, mà phổ phản ứng với cơ chất khá là rộng đó cũng là

lý do enzyme Laccase đang được quan tâm và nghiên cứu nhiều ở nước ta

Năm 2012, Nguyễn Thị Phương Mai và cộng sự đã tinh sạch và xác định

đặc tính của Laccase tái tổ hợp từ Aspergillus niger d15#26 lcc1 1.8b Laccase 1

từ T versicolor 06 được biểu hiện trong A niger D15#26 lcc1 1.8B, với cơ chất

cảm ứng là glucose, đạt hoạt độ cao nhất 4250 U/L sau 7 ngày nuôi ở tốc độ lắc 200v/phút, pH 6 Laccase tinh sạch có khối lượng phân tử 70 kDa, phản ứng tối

ưu ở nhiệt độ 450C và pH 4 Enzym bền trong khoảng nhiệt độ từ 30 – 35 0C và

pH 4 - 6 Các thông số động học của Laccase trong phản ứng với ABTS là Km 1,35 µM; Vmax 53,14 µM/phút-1; Kcat 10,42 × 106 s-1 và Kcat/Km 7,72 × 106

µM-1s -1 cho thấy enzyme hoạt động hiệu quả trong oxy hóa cơ chất ABTS [5]

Năm 2015 Trịnh Thu Thủy và cộng sự nghiên cứu phân lập các

chủng nấm mốc sinh tổng hợp Laccase từ gỗ kết quả nghiên cứu đã phân lập

được 5 chủng nấm mốc có kí hiệu là BN1, BN2-1, BN2-2, ĐA3-1 và BV1 có hoạt độ enzyme Laccase dao động từ 1.480 - 24.720 U/ml Trong các chủng này, chủng BV1 là chủng có hoạt tính enzyme cao nhất (24.720 U/ml ) Chủng BV1

sơ bộ được xếp vào chi Meruliporia sp [1]

CHƯƠNG 2: MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1 Mục tiêu nghiên cứu

- Xác định được các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp

Laccase của chủng nấm Aspergillus niger đã được phập lập ở rừng núi Luốt

trường Đại Học Lâm Nghiệp

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu lựa chọn môi trường lên men thích hợp sinh tổng hợp

enzyme Laccase cho chủng nấm Aspergillus niger

- Khảo sát ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng (cacbon, nito) đến khả năng

sinh tổng hợp enzyme Laccase từ chủng nấm Aspergillus niger

- Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, pH, tốc độ lắc)

đến khả năng sinh tổng hợp enzyme Laccase từ chủng nấm Aspergillus niger

2.3 Vật liệu nghiên cứu

- Chủng nấm Aspergillus niger đã được phân lập từ gỗ mục tại rừng núi

luốt Đại Học Lâm nghiệp Việt Nam

2.3.1 Thiết bị, dụng cụ

Các thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu là các loại máy móc, trang thiết bị có ở phòng thí nghiệm của Bộ môn Công nghệ Vi sinh – Hóa sinh, Viện Công nghệ sinh học, Trường Đại học Lâm Nghiệp

6 Bếp điện/ bếp từ Việt nam

2.3.2.2 Môi trường sử dụng

 Môi trường kiểm tra khả năng sinh enzyme Laccase chủng nấm CN1

 Môi trường thử hoạt tính enzyme Laccase

2 Glucose 10 + Môi trường VIS

Chú ý: Đối với môi trường bán rắn khi thu enzyme ngoại bào

dùng đệm photphat tách enzyme ngoại bào

 Các loại môi trường dùng trong khảo sát ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy và các chất dinh dưỡng

 Môi trường khảo sát pH nhiệt độ và tốc độ lắc