VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu
- Vật liệu thực vật: mẫu Đậu cô ve (Phaseolus vulgaris) L.T1 do Trung tâm Giống và Công nghệ sinh học- Trường Đại học Lâm Nghiệp cung cấp
- Vật liệu vi khuẩn: chủng vi khuẩn E.coli DH5α do hãng Invitrogen cung cấp
- Vector tách dòng pBT do phòng Công nghệ tế bào thực vật- Viện Công nghệ sinh học cung cấp
2.1.2 Hóa chất, máy móc, thiết bị
Các loại hóa chất cần thiết cho phản ứng PCR và môi trường nuôi cấy vi khuẩn bao gồm LB đặc, LB lỏng, SOC, bộ hóa chất đọc trình tự BigDye R Terminator bv3.1 Cycle Sequencing, cùng với các hóa chất khác như kháng sinh Amp, Agarose, và Ethidium bromide Những sản phẩm này được cung cấp bởi các hãng nổi tiếng như Merck, Sigma, Amersham, và Fermentas.
Máy PCR System 9800 (Applied Biosystem, Mỹ), máy điện di Powerpac
Trung tâm Giống và Công nghệ sinh học Trường đại học Lâm Nghiệp sở hữu nhiều thiết bị hiện đại như máy chụp ảnh gel Bio-Rad 300, máy ly tâm, máy vortex, và máy đo OD, cùng với các trang thiết bị khác phục vụ cho nghiên cứu và phát triển trong lĩnh vực sinh học.
Phương pháp nghiên cứu
Mồi đóng vai trò quan trọng trong thành công của phản ứng PCR Để nhân promoter GRP 1.8, cặp mồi (mồi xuôi và mồi ngược) được thiết kế nhằm bám vào hai đầu của promoter này.
Dựa vào trình tự nucleotid của promoter GRP 1.8 tách từ cây Đậu cô ve được công bố trên ngân hàng gen Quốc tế với số hiệu đăng ký AF250148.1
Sử dụng phần mềm DNA star để xác định vị trí cắt của enzym giới hạn, so
Để thiết kế mồi hiệu quả, cần thực hiện 24 sánh trình tự nhằm xác định vùng bảo thủ và các thông số kỹ thuật quan trọng của mồi, bao gồm nhiệt độ nóng chảy, chiều dài và tỷ lệ %GC.
Sau khi thiết kế được mồi, việc quan trọng là kiểm tra hiệu quả của mồi thông qua phản ứng khuếch đại
2.2.2 Tách chiết DNA tổng số Đối tượng chúng tôi sử dụng để thu nhận promoter GRP 1.8 là Đậu cô ve (Phaseolus vulgaris) được tách chiết theo phương pháp sau:
1 Cân 0,3 g mẫu lá Đậu cô ve đã được rửa sạch sau đó dùng chày, cối sứ đã khử trùng nghiền trong nitơ lỏng rồi cho ngay mẫu vừa nghiền được vào ống eppendorf 1,5 ml
2 Bổ sung thờm 150 àl dung dịch A, 450 àl dung dịch B, 50 àl SDS vào trong ống eppendorf Vortex ống và ủ ở 65 o C trong 10 phút
3 Chuyển ống sang đỏ và thờm 200 àl CH 3 COOK rồi đảo ngược ống nhẹ nhàng và để ống vào đá thêm 3 phút
4 Li tâm ống 13000 rpm trong 15 phút, ở 4 o C
5 Chuyển dịch nổi sang ống mới, thờm 450 àl cồn tuyệt đối, ủ trong đỏ
6 Li tâm 10000 rpm trong 10 phút, ở 4 o C loại dịch nổi và rửa tủa bằng
500 àl cồn 70 o sau đú làm khụ tự nhiờn bằng giấy thấm
7 Thờm vào ống 300 àl TE, 30 àl CH 3 COONa 3M, pH 5,2 và 200 àl cồn tuyệt đối, ủ trong đá 20 phút
9 Thờm 50 àl TE, bảo quản ở - 20 o C
Bảng 2.1: Thành phần dung dịch A và B Dung dịch
2% CTAB 100mM Tris pH 8,0 20mM EDTA (0,5M stock) 1,4M NaCl
4% PVP 0,1% acid ascorbic 10mM β-mercapto ethanol
100mM Tris HCl pH 8,0 (1M stock) 50mM EDTA (0,5M stock)
Sau khi tách chiết DNA tổng số từ mẫu Đậu cô ve, chúng tôi tiến hành điện di để kiểm tra kết quả tách chiết và xác định sự hiện diện của promoter GRP 1.8 trong DNA tổng số Phương pháp PCR được sử dụng, và sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose Các bước thực hiện được tiến hành như sau:
1 Pha gel agarose 0,8 % Để gel nguội tới 50 o C tiến hành đổ gel vào khuôn có lược cà sẵn Gel phải được để nguội và ổn định trong khoảng 1 giờ
2 Cho gel vào bể điện di, đổ đệm TAE, rút lược ra khỏi gel
3 Sản phẩm PCR được trộn đều trong loading dye 6X (LD) với tỷ lệ 3 àl LD: 10 àl sản phẩm PCR
4 Cho maker và mẫu đã được trộn đều ở bước 3 vào các giếng tương ứng Tốt nhất nên để giếng 1 là thang DNA chuẩn 1 kb để tiện cho việc tiến hành so sánh và đối chiếu kết quả
5 Chạy điện di với điện thế 100V, trong khoảng thời gian từ 50- 60 phút
6 Nhuộm gel bằng EtBr 10 mg/l lắc nhẹ khoảng 70- 100 rpm từ 15- 20 phút, sau đó rửa gel bằng nước cất có lắc nhẹ trong vài phút
7 Soi gel trên máy Powerpac 300 với OD 260
PCR sản phẩm DNA tổng số với cặp mồi đặc hiệu đã được thiết kế nhằm tạo ra một lượng lớn bản sao của promoter GRP 1.8 trong thời gian ngắn.
Bảng 2.2: Thành phần phản ứng PCR
STT Thành phần Thể tớch (àl)
Theo lý thuyết, cặp mồi được thiết kế sẽ có nhiệt độ gắn mồi như đã nêu ở mục 1.2.1 Tuy nhiên, trong quá trình nghiên cứu, chúng tôi đã thử nghiệm với các nhiệt độ gắn mồi khác nhau và nhận được những kết quả phản ứng đa dạng.
Hiệu quả phản ứng lai thường thấp và khó thành công do tạp chất trong sản phẩm PCR Sau khi xác định đúng kích thước của promoter qua PCR, chúng tôi đã thực hiện phản ứng thôi gel để thu được lượng promoter GRP 1.8 cao nhất với độ sạch tối ưu.
Các bước được thực hiện như sau:
1 Điện di 40 àl sản phẩm PCR trờn gel agarose 1,4%
2 Nhuộm, soi và chụp ảnh trên máy soi gel nhanh
3 Cắt phần gel chứa đoạn promoter GRP 1.8 mong muốn (càng nhỏ càng tốt)
4 Xác định lượng gel đã lấy, cho vào ống eppendorf khoảng 300 mg (1g~ 1ml)
5 Thờm 900 àl bind buffer, ủ ở 55 o C trong 5 phỳt
6 Thờm 10 àl silica power, ủ ở nhiệt độ 55 o C trong 5 phỳt (vortex 2 phút/lần để giữ cho silica power hoà tan)
7 Li tâm hỗn hợp Silica power/ DNA ở 12000 rpm trong 1 phút Loại bỏ dịch nổi
8 Thờm 500 àl wash buffer lạnh, vortex và ly tõm 12000 rpm trong 1 phút Loại bỏ dịch nổi Lặp lại bước này 3 lần
9 Sau khi dịch nổi ở lần cuối bị loại bỏ đi, ly tâm 12000 rpm trong 1 phút, 1 lần rửa và loại bỏ dịch nổi còn sót lại bằng pipet Nếu cần thì để khô trong không khí trong khoảng 10- 15 phút
10 Hoà tan tủa vào H 2 O khử trùng, đề ion (hoặc TE) hoà tan cặn trong
H 2 O khử trùng, đề ion và ủ ở 55 o C trong 5 phút (vortex cho tan)
11 Ly tâm và thu lại dịch nổi vào ống khác
12 Điện di kiểm tra sản phẩm thôi gel
13 Bảo quản sản phẩm thôi gel ở - 20 o C hoặc sử dụng cho thí nghiệm ngay Tốt nhất nên thực hiện phản ứng nối ngay sau khi thôi gel
2.2.6 Kỹ thuật dòng hoá (cloning)
Dòng hoá (cloning) là quá trình đưa đoạn DNA sản phẩm của PCR vào hệ gen của plasmid, một vòng DNA đã được thiết kế trước Plasmid chứa DNA ngoại lai này được chuyển nạp vào tế bào chủ thích ứng để nuôi cấy, nhằm thu được lượng bản sao lớn và tách DNA plasmid chứa đoạn PCR Quá trình này, gọi là tái tổ hợp, giúp thu được lượng lớn bản sao DNA một cách chính xác Để thực hiện dòng hoá, cần có các thành phần như DNA ngoại lai.
(DNA của PCR nhân vùng gen mong muốn), vector dẫn truyền (hay còn gọi là plasmid mang), và dòng tế bào chủ thích ứng
2.2.6.1 Tạo vector tái tổ hợp
Sau khi thôi gel, sản phẩm PCR cần ngay lập tức tiến hành phản ứng nối do đầu A của sản phẩm dễ bị đứt gãy Sản phẩm này được gắn vào vector pBT để tạo plasmid tái tổ hợp mang promoter GRP 1.8 Đối với sản phẩm PCR có chiều dài đoạn DNA cần ghép nối từ 400-700 bp, tỷ lệ vector: DNA chèn tối ưu cho hiệu quả phản ứng cao là 1:1.
Bảng 2.3: Thành phần phản ứng lai
Thành phần Thể tớch (àl)
Sản phẩm PCR đã thôi gel 8
Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 22 o C trong 2 giờ
2.2.6.2 Biến nạp pBT/promoter GRP 1.8 vào tế bào khả biến E.coli
Trong quá trình biến nạp, chỉ một phần rất nhỏ plasmid được biến nạp, nhưng kỹ thuật này vẫn quan trọng vì có thể tạo ra tới 10^9 tế bào biến nạp khi đưa 1 µg DNA vào thí nghiệm Thông thường, 1 µg DNA tạo ra khoảng 10^6 đến 10^7 tế bào biến nạp Hiệu quả biến nạp phụ thuộc vào loại tế bào chủ, kích thước vector tái tổ hợp và kỹ thuật biến nạp phù hợp Nghiên cứu này sử dụng tế bào chủ E.coli DH5α, được thiết kế để tiếp nhận plasmid tái tổ hợp, đảm bảo điều kiện cần thiết cho sự nhân lên trong phòng thí nghiệm.
29 a Chuẩn bị dòng tế bào vi khuẩn khả biến:
1 Chủng vi khuẩn E.coli DH5α được cấy lên môi trường LB đặc sau đó nuôi qua đêm ở 37 o C
2 Cấy một khuẩn lạc trong 5 ml môi trường LB lỏng, lắc qua đêm ở
3 Chuyển 0,5 ml dịch nuôi trên sang 50 ml môi trường LB lỏng, lắc trong
3 giờ, đo OD 600 = 0,6 thì chuyển dịch nuôi sang ống ly tâm 50 ml được giữ trong đá
4 Ly tâm dịch khuẩn ở 4000 rpm trong 10 phút, sau đó thu cặn
5 Hoà tan cặn tế bào nhẹ nhàng trong 20-30 ml CaCl2, giữ trong đá 45 phút, ly tâm 4000 rpm ở 0 o C trong 10 phút, thu cặn và hoà tan cặn trong 1.5 ml CaCl2 0,1M và 0,5 ml glycerol
6 Chia 50 ml khuẩn vào mỗi ống eppendorf 1,5 ml, làm đông lạnh nhanh bằng nitơ lỏng và giữ ở tủ lạnh -85 o C
7 Cấy trải khuẩn lên môi trường LB đặc có và không có kháng sinh để kiểm tra b Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E coli DH5α
1 Chuẩn bị mụi trường chọn lọc chứa 25 ml LB đặc cú bổ sung 100àl ampicillin nồng độ 50 àg/ml, 100 àl IPTG nồng độ 500 àg/ml và 100 àl X-gal nồng độ
Bảng 2.4: Thành phần môi trường LB đặc (pH= 7)
Thành phần Trọng lƣợng (gam)
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
Thiết kế mồi
Mồi bám vào phân tử DNA mạch đơn theo nguyên tắc bổ sung và nó đóng vai trò khởi đầu cho quá trình tổng hợp [29]
Dựa vào trình tự nucleotid của promoter GRP 1.8 trên Ngân hàng gen Quốc tế (NCBI), chúng tôi đã thiết kế cặp mồi đặc hiệu để nhân promoter GRP 1.8 với số lượng lớn Cần đảm bảo rằng nhiệt độ gắn mồi giữa mồi xuôi và mồi ngược không chênh lệch quá 5 o C, và các mồi không được bắt cặp với nhau.
Bảng 3.1: Trình tự và các thông số cần thiết của hai mồi
Mồi Trình tự Đặc điểm
Theo tính toán lý thuyết, nhiệt độ gắn mồi của hai mồi nghiên cứu GRP 1.8F và GRP 1.8R có sự chênh lệch đáng kể, lần lượt là 58°C và 61°C Trong quá trình phản ứng khuếch đại để tạo ra lượng lớn promoter GRP 1.8, chúng tôi đã tiến hành thử nghiệm với các nhiệt độ bắt mồi khác nhau nhằm tối ưu hóa hiệu quả của mồi và phản ứng PCR.
Tách chiết DNA tổng số từ cây Đậu cô ve
Hiện nay, nhiều phương pháp tách chiết DNA từ mô thực vật đã được nghiên cứu và cải tiến, tùy thuộc vào đối tượng và điều kiện nghiên cứu Mỗi gen có một trình tự promoter đặc hiệu, điều khiển quá trình phiên mã của gen.
Promoter GRP 1.8 tham gia vào quá trình mã hoá biểu hiện gen đặc hiệu ở tầng xylem
Hình 3.1: Kết quả điện di sản phẩm tách chiết DNA tổng số
Kết quả điện di cho thấy chúng tôi đã thu được DNA tổng số của cây Đậu cô ve Chúng tôi tiến hành PCR với cặp mồi GRP 1.8R và GRP 1.8F, được thiết kế dựa vào trình tự promoter GRP 1.8 đã được công bố trên Ngân hàng gen Quốc tế (số hiệu AF250148.1) Chất lượng DNA tổng số ảnh hưởng đến hiệu quả của phương pháp đo OD; chúng tôi tính tỷ số OD 260/OD 280, và nếu tỷ số này nằm trong khoảng 1.8-2, mẫu DNA được coi là tinh sạch Kết quả thu được là OD 260/OD 280 = 2.
35 chúng tôi thu được một băng tương đối sắc nét chứng tỏ DNA thu được có hàm lượng cao, không bị đứt gãy
Như vậy, mẫu DNA tổng số thu được đạt tiêu chuẩn về hàm lượng và độ tinh sạch để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
Khuếch đại promoter GRP 1.8
PCR (Phản ứng chuỗi polymerase) cho phép nghiên cứu các gen một cách nhanh chóng, tiết kiệm và đơn giản, tạo ra số lượng lớn bản sao DNA ngay cả khi chất lượng mẫu DNA ban đầu không tốt, điều mà phương pháp truyền thống không thể thực hiện.
Mồi được thiết kế theo mục 3.1 sẽ được gắn vào hai đầu của promoter GRP 1.8 khi nhiệt độ giảm xuống dưới nhiệt độ nóng chảy tương ứng Để nâng cao hiệu quả của phản ứng PCR, chúng tôi đã thực hiện phản ứng theo Kit của hãng Invitrogen, đồng thời điều chỉnh lượng mẫu và nhiệt độ gắn mồi nhằm đảm bảo phản ứng đạt hiệu quả cao.
Hiệu quả của phản ứng PCR phụ thuộc vào nhiều yếu tố, bao gồm hàm lượng DNA khuôn, nhiệt độ gắn mồi, và nồng độ các thành phần như Mg²⁺, primer, và enzym Taq polymerase Tuy nhiên, do hạn chế về thời gian và điều kiện thí nghiệm, chúng tôi chỉ thử nghiệm nhiệt độ gắn mồi Nồng độ DNA tổng số của mẫu tham gia phản ứng được pha loãng 50 lần, với lượng DNA từ 50 đến 100 ng.
Hình 3.2: Kết quả điện di sản phẩm PCR promoter GRP 1.8
Chúng tôi đã tiến hành thử nghiệm với DNA chuẩn 1 kb, sử dụng các giếng với nhiệt độ gắn mồi lần lượt là 55°C, 56°C, 57°C và 58°C Đồng thời, chúng tôi thử nghiệm nồng độ DNA phù hợp cho phản ứng và nhiệt độ gắn mồi, kết hợp với các ống Eppendorf khác nhau và thực hiện trên 2 máy PCR Phương pháp này đã giúp rút ngắn đáng kể thời gian thí nghiệm.
Kết quả từ hình 3.2 cho thấy tất cả các nhiệt độ gắn mồi nghiên cứu đều tạo ra sản phẩm PCR có kích thước khoảng 600 bp Trong số 4 giếng thí nghiệm, băng của giếng thứ 2 là rõ nét và đặc hiệu nhất Do đó, nhiệt độ gắn mồi tối ưu cho phản ứng khuếch đại promoter GRP 1.8 là 56°C.
Dựa trên các kết quả thu được, chúng tôi có thể kết luận rằng đã thành công trong việc nhân promoter GRP 1.8 Điều này cũng chứng tỏ rằng cặp mồi được thiết kế nhằm nhân promoter GRP 1.8 là đặc hiệu.
Chu trình nhiệt thích hợp nhân promoter GRP 1.8 như sau:
Kết quả thôi gel
Phản ứng khuếch đại tạo ra một lượng lớn promoter GRP 1.8, nhưng sản phẩm PCR từ mẫu DNA tổng số thường chứa nhiều tạp chất Do đó, để thu được mẫu sạch phục vụ cho các bước nghiên cứu tiếp theo, việc thực hiện thôi gel sau phản ứng PCR là cần thiết.
Hình 3.3: Điện di promoter GRP 1.8
Trong đó: A là sản phẩm PCR promoter GRP 1.8 trước thôi gel
Sản phẩm PCR promoter GRP 1.8 được thu nhận sau quá trình thôi gel, thực hiện theo phương pháp cải tiến của Sambrook và cộng sự [34] để phù hợp với điều kiện phản ứng Các tạp chất như muối và protein có trong sản phẩm có ảnh hưởng lớn đến hiệu quả của phản ứng nối.
PCR có ảnh hưởng lớn đến hoạt tính của T4 DNA ligase Trước khi thực hiện thôi gel, sản phẩm PCR thu được chưa sắc nét và vẫn còn các vệt mờ Sau khi thôi gel, kết quả điện di cho thấy một băng sản phẩm sắc nét với kích thước khoảng 600 bp Chúng tôi sơ bộ kết luận rằng sản phẩm PCR đã được nhân với kích thước phù hợp với đoạn promoter GRP 1.8 đã được công bố trên NCBI mã số AF250148.1.
Trong quá trình thực hiện thôi gel, các thao tác cần được thực hiện một cách nhẹ nhàng Để đạt được kết quả mong muốn, nên tiến hành ngay phản ứng nối ngay sau khi thu được kết quả.
Tạo vector tái tổ hợp pBT/ promoter GRP 1.8 và biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn E.coli DH5α
Phản ứng nối tạo vector tái tổ hợp diễn ra theo nguyên tắc bổ sung Sau khi sản phẩm PCR được tách ra từ gel, nó sẽ được gắn với vector pBT thông qua liên kết phosphodieste giữa nucleotid loại A ở đầu 5’ của sản phẩm.
PCR promoter GRP 1.8 có nucleotide loại T ở đầu 3’ của vector tách dòng Phản ứng được thực hiện ở nhiệt độ 22 o C trong 4 giờ Vector tái tổ hợp sau đó được biến nạp vào vi khuẩn E.coli DH5α theo quy trình đã nêu trong mục 2.2.6.2.
Tế bào khả biến sau khi được biến nạp được nuôi trong môi trường LB đặc có bổ sung X-gal, IPTG và kháng sinh Ampicillin để chọn lọc dòng biến nạp Hình 3.4 cho thấy rõ ràng quá trình này.
Khuẩn lạc xanh là các dòng khuẩn vector tự đóng vòng
Hình 3.4: Kết quả biến nạp
Khuẩn lạc trắng là các dòng vi khuẩn mang gen quan trọng, nhưng cũng có khả năng chứa đoạn DNA chèn không liên quan đến gen mà chúng ta đang nghiên cứu.
Hiệu quả biến nạp vi khuẩn thường rất thấp, vì vậy cần thử nghiệm với các thể tích khác nhau để xác định thể tích tối ưu cho kết quả mong muốn Ngoài hiệu quả của phản ứng nối và khả năng của tế bào, thời gian thực hiện phản ứng cũng đóng vai trò quan trọng Chúng tôi đã tiến hành thử nghiệm với nhiều khoảng thời gian khác nhau và xác định rằng thời gian 90 giây là phù hợp nhất cho việc biến nạp vector tái tổ hợp pBT/promoter GRP 1.8 vào vi khuẩn E.coli DH5α.
Sau khi thu được các dòng khuẩn biến nạp phát triển trên môi trường có kháng sinh chọn lọc, chúng tôi đã chọn 5 khuẩn lạc trắng, to, tròn để thực hiện colony-PCR Mẫu đối chứng dương là PCR trực tiếp từ DNA tổng số của Đậu cô ve.
Hình 3.5: Kết quả điện di colony- PCR
Giếng M : Thang DNA chuẩn 1 kb
Giếng 5 : Đối chứng (mẫu PCR trực tiếp từ DNA tổng số) Kết quả điện di trên hình 3.5 cho thấy tất cả các mẫu từ 1 đến 5 đều lên băng đặc hiệu (khoảng 600bp), hay các dòng vi khuẩn đều mang vector chứa đoạn chèn Tuy nhiên colony- PCR chỉ có ý nghĩa kiểm tra bước đầu, do vậy
40 chúng tôi tiến hành thêm các bước tiếp theo để xác nhận chính xác các kết quả thu được.
Tách chiết và tinh sạch plasmid
Trong tế bào vi khuẩn, ngoài DNA plasmid còn có DNA genom, khiến cho việc tách chiết và tinh sạch plasmid trở nên phức tạp Tuy nhiên, chúng ta có thể tách chiết DNA plasmid ra khỏi DNA genom nhờ vào những điểm khác biệt giữa hai loại DNA này.
Kích thước plasmid nhỏ hơn nhiều so với nhiễm sắc thể vi khuẩn, với plasmid lớn nhất ở E.coli chỉ chiếm khoảng 8% kích thước DNA tổng số Vì vậy, trong quá trình ly tâm, DNA tổng số sẽ lắng xuống trước plasmid.
DNA plasmid là dạng vòng tồn tại tự do trong tế bào chất vi khuẩn, trong khi DNA nhiễm sắc thể vi khuẩn cũng có dạng vòng nhưng gắn với màng tế bào ở những vị trí nhất định Trong quá trình tách chiết, khi loại bỏ màng tế bào chất, DNA genom có thể bị loại bỏ theo, dẫn đến việc DNA genom thường bị gãy thành các đoạn thẳng Do đó, phương pháp tách các phân tử vòng khỏi các phân tử thẳng được áp dụng để làm sạch DNA plasmid.
Sau khi tách chiết plasmid chúng tôi tiến hành điện di sản phẩm trên gel agarose 1,2% (hình 3.6) Kết quả thu được như trên hình 3.6
Trong các mẫu plasmid thu được, mẫu số 2 không lên băng, có thể do quá trình tách chiết plasmid không thành công Các mẫu 1, 3, 4, 5, 7 và 8 đều lên băng nhưng chạy chậm hơn một chút so với mẫu 6, là plasmid từ khuẩn lạc xanh (đối chứng âm) Điều này cho thấy có thể dự đoán các mẫu plasmid 1, 3, 4.
5, 7 và 8 đều có thể chứa đoạn chèn, cần phân tích thêm bằng cách cắt bằng enzym giới hạn
Hình 3.6: Kết quả điện di plasmid tái tổ hợp mang sản phẩm PCR của promoter GRP 1.8
Giếng M : Thang DNA chuẩn 1 kb
Giếng 6 : Khuẩn lạc xanh đối chứng
Chúng tôi đã tiến hành phản ứng cắt các plasmid bằng enzym giới hạn BamHI để kiểm tra sự hiện diện của đoạn chèn promoter GRP 1.8 Enzym BamHI được chọn vì nó có mặt trong vùng MCS nhưng không cắt tại trình tự của promoter GRP 1.8 chuẩn được công bố trên Genbank.
Hình 3.7: Kết quả cắt plasmid bằng enzym giới hạn Bam HI
Giếng M : Thang DNA chuẩn 1 kb
Giếng 6 : Khuẩn lạc xanh đối chứng
Kết quả điện di trên hình 3.7 cho thấy, khi cắt các mẫu plasmid số 1, 3, 4,
Các mẫu 5, 7 và 8 được cắt bằng enzym BamHI đều cho ra đoạn khoảng 600 bp, cho thấy chúng chứa đoạn chèn promoter GRP 1.8 Chúng tôi đã chọn hai dòng khuẩn số 5 và 7 để xác định trình tự nucleotid do hình ảnh điện di sản phẩm cắt bằng BamHI của hai dòng plasmid này sắc nét nhất.
Xác định trình tự nucleotid của promoter GRP 1.8
Sau khi lựa chọn dòng khuẩn từ mục 3.5 và 3.6, chúng tôi tiến hành xác định trình tự của hai mẫu plasmid tách từ dòng 5 và dòng 7 theo cả chiều xuôi và chiều ngược Kết quả trình tự được xử lý bằng phần mềm BioEdit.
Hình 3.8 : Phổ đọc trình tự nucleotid của promoter GRP 1.8
Trong đó: Đường màu xanh lá cây : Nucleotid loại A Đường màu đen : Nucleotid loại G Đường màu đỏ : Nucleotid loại T Đường màu xanh da trời : Nucleotid loại C
Trên hình 3.8 cho thấy phổ đọc của các nucleotid rất rõ ràng, sắc nét
Hình 3.9: So sánh trình tự promoter GRP 1.8 phân lập với trình tự promoter GRP 1.8 của P.vulgaris trên Ngân hàng gen
Query: Trình tự promoter GRP 1.8 phân lập Sbjct : Trình tự promoter GRP 1.8 trên Ngân hàng gen (số hiệu AF250148.1)
Theo nghiên cứu, độ tương đồng giữa trình tự promoter GRP 1.8 phân lập và promoter GRP 1.8 trên Ngân hàng gen Quốc tế (số hiệu AF250148.1) đạt gần 100% Tuy nhiên, có một khác biệt tại vị trí số 536, nơi nucleotid loại A được thay thế bằng nucleotid loại T, có thể do sự đa dạng di truyền giữa hai dòng cây Phaseolus vulgaris.
Chúng tôi đã xác định vị trí số 581 của hộp TATA, trùng khớp với promoter GRP 1.8 trên Ngân hàng gen (số hiệu AF250148.1) Kết quả từ hình 3.9 khẳng định rằng chúng tôi đã phân lập thành công promoter GRP 1.8 từ Phaseolus vulgaris Hai dòng khuẩn số 5 và 7 được bảo quản trong glycerol ở điều kiện -85 °C để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1.1 Thiết kế được cặp mồi GRP 1.8R và GRP 1.8F đặc hiệu nhân promoter GRP 1.8
1.2 Phân lập và xác định được trình tự nucleotid của promoter GRP 1.8 từ cây Đậu cô ve (Phaseolus vulgaris)
1.3 So sánh trình tự nucleotid của promoter GRP 1.8 phân lập được với trình tự nucleotid của promoter GRP 1.8 của cây Đậu cô ve được công bố trên Ngân hàng gen Quốc tế với số hiệu AF250148.1 có mức độ tương đồng xấp xỉ là 100% Xuất hiện 1 vị trí sai khác là vị trí số 536, nucleotid loại A được thay thế bằng nucleotid loại T.
Kiến nghị 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO
2.1 Promoter GRP 1.8 có vai trò đặc biệt quan trọng trong quá trình biểu hiện gen tăng hàm lượng lignin vì vậy cần tiến hành các nghiên cứu tiếp theo phân lập promoter GRP 1.8 trên các đối tượng cây trồng khác nhau và so sánh sự giống nhau và khác nhau giữa các trình tự đó, từ đó tìm ra trình tự có hiệu quả biểu hiện đặc hiệu xylem cao nhất
2.2 Sử dụng promoter GRP 1.8 phân lập được để thiết kế các cấu trúc vector chuyển gen biểu hiện đặc hiệu ở tầng xylem
1 Đái Duy Ban (2006), Công nghệ gen, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, trang 132
2 Hà Bích Hồng (2008), Nghiên cứu phân lập và thiết kế vector chuyển gen GA20 phục vụ tạo giống cây trồng biến đổi gen, luận án thạc sĩ, Trường Đại học Quốc gia Hà nội, trang 3, 18
3 Hồ Huỳnh Thuỳ Dương (2005), Sinh học phân tử, Nhà xuất bản
4 Hồ Sĩ Tráng (2006), Cơ sở hoá gỗ và xenluloza, Nhà xuất bản
Khoa học Kỹ thuật, trang 38
5 Hoàng Thị Sản, Phan Nguyên Hồng, Nguyễn Tề Chỉnh (1980),
Hình thái và giải phẫu thực vật, Nhà xuất bản Giáo dục, trang 70
6 Khuất Hữu Thanh (2003) Cơ sở di truyền phân tử và kỹ thuật gen Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, 2003, trang 96
7 Khuất Hữu Thanh (2006), Kỹ thuật gen nguyên lý và ứng dụng, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, 2006, trang 127, 132, 137, 154, 157
8 Lê Thị Thu Hiền, Đặng Thị Hồng Vân, Đặng Thị Thu, Nông Văn Hải (1999), Phân lập gen mã hoá lectin và protein kìm hãm α- amylase trong hạt Đậu cô ve (Phaseolus vulgaris), Nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật, trang 116, 120
9 Lê Thị Thu Hiền (2003), Tạo chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang gen kháng côn trùng để chuyển vào cây trồng, luận án tiến sĩ, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học Việt Nam, trang
10 Lê Thị Thu Hiền, Trần Thị Phương Liên, Nông Văn Hải
(2007), Promoter và ứng dụng trong công nghệ gen thực vật, Tạp chí Công nghệ sinh học, số 5, trang 1, 4
11 Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1998), Phân lập gen và chọn dòng chống chịu ngoại cảnh bất lợi ở cây lúa, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia
12 Lê Trần Bình (2003), Áp dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu tài nguyên sinh vật Việt Nam, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, trang
13 Lê Trần Bình (2008), Phát triển cây trồng chuyển gen ở Việt Nam, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, trang 10, 60, 62, 83
14 Nguyễn Đức Thành (2003), Chuyển gen ở thực vật, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, 2003, trang 9, 22
15 Nguyễn Mạnh Chinh, Phạm Anh Cường (2007), Trồng và chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh Đậu rau, Nhà xuất bản Nông nghiệp, trang 9
16 Nguyễn Thị Thu Hằng (2008), Thực hành công nghệ gen,
Trường Đại học Lâm Nghiệp, trang 1, 13
17 Nguyễn Văn Bắc (2008), Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi của gen mã hoá protein vỏ virus gây bệnh khảm dưa chuột (Cucumber mosaic virus- CMV) và tạo cây Thuốc lá chuyển gen, Trường Đại học Quốc gia Hà nội, trang 13
18 Nguyễn Văn Uyển (2006), Những phương pháp công nghệ sinh học, Nhà xuất bản Nông nghiệp, trang 57
19 Nhữ Văn Thụ (2006), Nghiên cứu cải tiến hệ mồi trong phản ứng PCR phù hợp để phát hiện Mycoplasma gây bệnh ở gia cầm, ứng dụng thực tiễn, luận án Tiến sĩ, Viện Thú y, trang 36
20 Trần Khắc Thi, Phạm Mỹ Linh, Nguyễn Công Hoan (2008),
Sản xuất và công nghệ bảo quản, chế biến rau an toàn, Nhà xuất bản
Văn hoá dân tộc, trang 102
21 Beat Keller, Matthew D Templeton and Christopher J Lamb
(1989), “Specific localization of a plant cell wall glycine-rich protein in protoxylem cells of the vascular system”, Botany, vol 86, pp 1529-1533
22 Beat Keller and Christine Baumgartner (1991), “Vascular- specific expression of Bean GRP 1.8 gene is negative regulated”, The Plant Cell, vol 3, pp.1052-1061
23 Becker C., Shuttow A.D., Nông Văn Hải, Senyuk, L Yung R., Horstmann C., Fitcher T., Nielsen N.C., Muntzk (1995), “Purification, cDNA cloning and characterization of proteinase B, an aparagine- specefifc endopeptidase”, European Journal of biotechemistry 258, pp.456-462
24 Bernard R Glick, Jack J Pasternak (2003), Molecular biotechnology principles and applications of recombinant DNA, Department of biotechnology, university of Waterloo, Ontario, Cananda, pp.17, 69, 90
25 Brown T.A., (1998), Gene cloning an introduction 3rd edition ed, Stanley Thrones publisher, USA
26 C A Loopstra and E.-G No (1989), Element required for xylem- specific expression are located downstream of a loblolly pine gene, Dept of
Forest Science, Texas A&M University, college station, TX 77843-2135 and TAMU Crop Biotechnology Center, pp 374-377
27 Catherine Feuillet, Virginie Lauvergeat, Christine Deswarte, Gilles Pilate, Alain Boudet and Jacqueline Grima- Pettenati (1995), “Tissue and cell specific expression of a cinnamyl alcohol dehydrogenase promoter in transgenic poplar plants”, Plant Molecular Biology 27, pp 651- 667
28 Christoph Ringli, Gunter Hauf and Beat Keller (2001),
“Hydrophobic interactions of the structural protein GRP 1.8 in the cell wall of protoxylem elements”, Plant Physiology, vol 125, pp 673- 682
29 Ewards K., Johnstone C (1991) A simple rapid method for the prepararion of plant genomic DNA for PCR, acid nucleic research 19, pp.1349
30 Hai Lu, Qiangyin Zeng, YanLingZhao, Shassheng Wang and Xiangningn Jiang (2003), “Xylem-specific expression of a GRP 1.8 promoter: 4CL gene construct in transgenic tobacco”, Plant Growth Regulation 41, pp
31 Mullins K.B., Ferre F., Gibbs R.A (1994) The polymerase chain reaction Birkhause Boston, USA
32 Murray M.G., Thompson W.F (1980), “Rapid isolation of high molecular weight plant DNA”, Acid nucleic research 8, pp.4321-4325
33 Sambrook J., Russell D W (2001) Molecular cloning: A loboratory manual Cold pring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor, New York
34 Sanger F., Nicklen, Coulson A.R (1977) DNA sequencing witch chain termination inhibitor Proceeding of the national academy of science of the USA 74, pp.5463- 5467
35 Simon Hawkins, Jozef Samaj, Virginie Lauvergeat, Alain Boudet, and Jacqueline Grinma- Pettenati (1997) “Cinnamyl alcohol dehydrogenase identification of new sites of promoter activity in transgenic poplar”, Plant Physiol 113, pp 321- 325
36 Virginie Lauvergeat, Philippe Rech, Alain Jauneau, Colette Guez, Pierre Coutos- Thevenot and Jacqueline Grima- Pettenati (2002), “The vascular expression pattern directed by the Eucalyptus gunnii EgCAD2 promoter is conserved among woody and herbaceous plant species”, Plant Molecular Biology 50, pp 497- 509
Tôi xin chân thành cảm ơn ThS Bùi Văn Thắng và CN Ngô Văn Thanh thuộc Khoa Lâm học, Trường Đại học Lâm Nghiệp, vì đã tận tâm hướng dẫn và hỗ trợ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ThS Hà Văn Huân vì sự quan tâm, dạy dỗ và chỉ bảo tận tình trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khoá luận tốt nghiệp.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong Khoa Lâm học, đặc biệt là tại Trung tâm Giống và Công nghệ sinh học, Trường Đại học Lâm Nghiệp, vì đã nhiệt tình hỗ trợ và chia sẻ những kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian thực tập và hoàn thành khoá luận của tôi.
Tôi xin chân thành cảm ơn TS Chu Hoàng Hà từ phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và công nghệ Việt Nam, vì đã hỗ trợ tôi trong quá trình thực hiện khoá luận.
Tôi xin chân thành cảm ơn ThS Hồ Văn Giảng, Giám đốc Trung tâm Giống và Công nghệ sinh học, vì đã tạo điều kiện thuận lợi và hỗ trợ tôi trong quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô giáo trong khoa Lâm học, đặc biệt là bộ môn Giống và Công nghệ sinh học, Trường Đại học Lâm Nghiệp, vì đã hướng dẫn và truyền đạt kiến thức quý báu cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình và bạn bè, những người đã luôn ủng hộ, động viên và góp ý cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khoá luận.
DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT àl Microliter
CaMV35S Cauliflower Mosaic virus 35S promoter
EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid
NCBI National center for biotechnology information NOS Nopaline synthase dNTP Deoxyribonuclotide triphosphate
TAE Tris base + glacial acetic acid + EDTA
X- gal 5- bromo- 4- cloro- 3- indolyl- β- D- galactopyranoside
DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ BẢNG
Hình 1.1: Các bước chính thực hiện khi phân lập một gen mục tiêu 5
Hình 1.2: Đậu cô ve leo (Phaseolus vulgaris ) 19
Hình 1.3: Sơ đồ cấu trúc vector pBT 21
Bảng 2.1: Thành phần dung dịch A và B 24
Bảng 2.2: Thành phần phản ứng PCR 26
Bảng 2.3: Thành phần phản ứng lai 28
Bảng 2.4: Thành phần môi trường LB đặc (pH= 7) 29
Bảng 2.5: Thành phần tách chiết plasmid 31
Bảng 3.1: Trình tự và các thông số cần thiết của hai mồi 33
Hình 3.1: Kết quả điện di sản phẩm tách chiết DNA tổng số 34
Hình 3.2: Kết quả điện di sản phẩm PCR promoter GRP 1.8 36
Hình 3.3: Điện di promoter GRP 1.8 37
Hình 3.4: Kết quả biến nạp 37
Hình 3.5: Kết quả điện di colony- PCR 39
Hình 3.6: Kết quả điện di plasmid tái tổ hợp mang sản phẩm PCR của promoter GRP 1.8 41
Hình 3.8 : Phổ đọc trình tự nucleotid của promoter GRP 1.8 43
Hình 3.7: Kết quả cắt plasmid bằng enzym giới hạn Bam HI 42
Hình 3.9: So sánh trình tự promoter GRP 1.8 phân lập với trình tự promoter GRP 1.8 của P.vulgaris trên Ngân hàng gen 44
DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC HÌNH
Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2
1.1 Ứng dụng công nghệ gen thực vật 2
1.2 Giới thiệu về phân lập gen thông qua PCR 5
1.2.2 Tách chiết DNA tổng số 8
1.2.3 Phương pháp PCR (Polymerase chain reaction) 9
1.2.4 Nguyên tắc tạo vector tái tổ hợp 9
1.2.5 Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào chủ 10
1.2.6 Kỹ thuật chọn lọc các dòng tế bào tái tổ hợp 11
1.3 Promoter và ứng dụng trong công nghệ gen thực vật 13
1.3.1 Promoter và vai trò điều khiển biểu hiện gen 13
1.3.2 Ứng dụng promoter trong công nghệ gen thực vật 16
1.4 Vật liệu sử dụng trong đề tài nghiên cứu 19
1.4.1.Đậu cô ve (Phaseolus vulgaris) 19
1.4.3.Vi khuẩn E.coli DH5α (Escherichia coli) 21
Chương II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23
2.1.2 Hóa chất, máy móc, thiết bị 23
