Tổng hợp các đặc điểm hình thái khuẩn lạc và một số đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn phân lập được .... Hiện nay, hầu hết các sản phẩm vi sinh vật đều được sản xuất từ một loại v
TỔNG QUAN VỀ BACILLUS MEGATERIUM
ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA BACILLUS MEGATERIUM
Bacillus megaterium là một loại vi khuẩn Gram dương, hiếu khí, chủ yếu tồn tại dưới dạng bào tử và phổ biến trong môi trường Với chiều dài tế bào lên tới 4 micromet và đường kính 1,5 micromet, B megaterium được coi là một trong những vi khuẩn lớn nhất được biết đến Các tế bào thường xuất hiện theo cặp và chuỗi, được kết nối với nhau bằng các polysaccharide trên thành tế bào.
Vào những năm 1960, B megaterium đã trở thành sinh vật mẫu chính trong nghiên cứu vi khuẩn gram dương, đặc biệt trong lĩnh vực sinh hóa và bào tử Hiện nay, Bacillus megaterium được ứng dụng rộng rãi trong công nghệ sinh học, nổi bật với khả năng sản xuất protein tái tổ hợp và làm phân bón.
ĐẶC ĐIỂM PHÂN LOẠI
Giới: Bacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli
ĐẶC ĐIỂM
B megaterium phát triển ở nhiệt độ từ 3°C đến 45°C, với mức tối ƣu khoảng 37°C Một số phân lập từ một hồ địa nhiệt ở Nam Cực đã đƣợc tìm thấy phát triển ở nhiệt độ lên tới 63°C
B megaterium đã đƣợc công nhận là một endophyte và là một tác nhân tiềm năng cho việc kiểm soát sinh học các bệnh thực vật Sự cố định đạm đã đƣợc chứng minh ở một số chủng B megaterium
B megaterium là một sinh vật công nghiệp quan trọng trong nhiều thập kỷ Nó sản xuất penicillin amidase đƣợc sử dụng để sản xuất penicillin tổng hợp, các loại amylase khác nhau đƣợc sử dụng trong ngành làm bánh và glucose dehydrogenase đƣợc sử dụng trong xét nghiệm glucose máu Hơn nữa, nó đƣợc sử dụng để sản xuất pyruvate, vitamin B12, các loại thuốc có đặc tính diệt nấm và kháng vi-rút, Nó tạo ra các enzyme để điều chỉnh corticosteroid, cũng nhƣ một số axit amin dehydrogenase
B megaterium đƣợc biết là sản xuất axit poly-glutamic Sự tích lũy của polymer được tăng lên rất nhiều trong môi trường nước muối (2 xăng10% NaCl ), trong đó polymer bao gồm phần lớn L-glutamate (hàm lƣợng đồng phân L lên tới 95%) Ít nhất một chủng B megaterium có thể đƣợc coi là halophile , vì sự tăng trưởng của NaCl lên đến 15% đã được quan sát thấy
Hình 1.2: Bacillus megaterium nhuộm màu
Dựa trên phân tích 16S rRNA, B megaterium có mối liên hệ chặt chẽ với B flexus, loài này đã được phân biệt cách đây một thế kỷ nhưng chỉ mới được công nhận là một loài riêng biệt B megaterium chia sẻ một số đặc điểm hình thái và phát sinh gen với các mầm bệnh như B anthracis và B cereus, mặc dù bản thân nó tương đối vô hại.
LỊCH NGHIÊN CỨU VỀ VI KHUẨN BACILLUS MEGATERIUM
Loài này được mô tả bởi de Bary vào năm 1884 với tên gọi Bacillus megaterium, nhưng không có nguồn gốc rõ ràng Một số tác giả sau đó đã gọi nó là B megatherium, cho rằng tên này là một lỗi chính tả Xu hướng này vẫn tiếp tục khi nhiều nhà khoa học, chủ yếu từ các nước đang phát triển, vẫn sử dụng tên B megatherium, gây ra sự nhầm lẫn trong cộng đồng khoa học.
Tên B megaterium xuất phát từ tiếng Hy Lạp "mega", có nghĩa là "lớn", chỉ ra rằng vi khuẩn này có kích thước lớn hơn so với các vi khuẩn khác trong chi Bacillus.
Lỗi chính tả không chủ ý xảy ra khi de Bary và học sinh của mình liên tục sử dụng biệt danh "megaterium" thay vì "megatherium" Từ "megatherium" được hình thành từ "therion" (θηρίον), có nghĩa là "con quái vật".
TIỀM NĂNG ỨNG DỤNG
B megaterium là một loại vi khuẩn hoại sinh rất thường có trong đất Chu trình hoại sinh chất hữu cơ có trong đất là quá trình phân hủy, giáng hóa chất
B megaterium là một trong những vi sinh vật có khả năng phân hủy các hợp chất hữu cơ thành các hợp chất đơn giản hơn, nhờ vào việc sử dụng chất dinh dưỡng từ vật liệu hữu cơ chết Trong môi trường đất, vi khuẩn này tồn tại ở dạng sinh dưỡng khi có đủ nguồn dinh dưỡng và chuyển sang dạng bào tử khi nguồn dinh dưỡng cạn kiệt, giúp chúng tồn tại trong điều kiện khắc nghiệt Ngoài B megaterium, còn có nhiều loại vi sinh vật khác như nấm sợi và xạ khuẩn, đóng vai trò quan trọng trong việc sản xuất kháng sinh và tham gia vào chu trình sinh học của carbon và nitrogen Nhờ vào khả năng phân hủy các polymer sinh học như protein, tinh bột và pectin, B megaterium hiện đang được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực xử lý môi trường.
B megaterium đƣợc coi là vi khuẩn không gây bệnh nhƣng V đóng vai trò lớn trong việc tạp nhiễm các môi trường vô khẩn thông qua việc tiếp xúc trực tiếp hay thông qua các hạt bụi, và chúng có thể là tác nhân gây nên hiện tƣợng phân hủy và thối rữa[30]
Vi khuẩn B megaterium, với kích thước lớn, đã trở thành đối tượng nghiên cứu quan trọng trong công nghệ sinh học, đặc biệt trong các nghiên cứu về protein và màng tế bào Chủng đơn này được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực sinh lý bào tử và cấu trúc màng tế bào Các ứng dụng của B megaterium bao gồm xử lý môi trường và công nghiệp, như sản xuất enzyme glucose dehydrogenase, penicillin aminidase, và b-amylase, cũng như trong sản xuất vitamin B12, Oxetanocin, P450 cytocrome, cùng nhiều ứng dụng khác trong công nghệ gen và tái tổ hợp.
TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ BACILLUS MEGATERIUM
B megaterium thường được sử dụng trong phòng thí nghiệm và được sử dụng nhƣ một sinh vật công nghiệp có khả năng sản xuất nhiều loại protein và nguồn sinh học Bacillus megaterium là một nguồn protein công nghiệp tốt vì nó vừa là vật chủ nhân bản vừa mong muốn và tạo ra một biến thể lớn của các enzyme Loài này là vật chủ nhân bản tốt vì có thể chứa nhiều vectơ plasmid, sử dụng Bacillus megaterium nhà khoa học đã phát triển nhiều loại protein thường đƣợc sử dụng trong lĩnh vực y tế và nông nghiệp Ví dụ, nhiều penicillin tổng hợp đã đƣợc tạo ra bằng cách sử dụng penicillin amidase trong vi khuẩn; glucose dehydrogenase thu hoạch đƣợc sử dụng trong xét nghiệm glucose mỏu; ò-Amylase thường được sử dụng trong ngành cụng nghiệp bỏnh mì; và protease trung tính đƣợc sử dụng bởi ngành công nghiệp da Một số chủng đã đƣợc chứng minh là vật chủ tốt cho biểu hiện gen Một chủng, QM B1551, vẫn đƣợc sử dụng để tạo kháng nguyên cho Bộ chẩn đoán HIV Nghiên cứu công nghệ sinh học của Bacillus megaterium cung cấp rất nhiều protein khác nhau mà họ có thể sử dụng trong các tiến bộ y tế, khoa học và công nghiệp quan trọng [19]
Phạm Minh Triết (2013) đã tiến hành phân lập được từ đất và nước 18 dòng vi khuẩn có khả năng phân giải keratin Trong đó có dòng vi khuẩn
Bacillus megaterium cho kết quả cao và khác biệt có ý nghĩa so với các dòng còn lại với tỷ lệ phân hủy lông lên đến 40,48% [21]
Nhóm nấm đối kháng Trichoderma đang được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất phân hữu cơ sinh học tại Việt Nam Phân hữu cơ sinh học có chứa nấm Trichoderma có hiệu quả cao trong việc phòng trừ bệnh vàng lá chết nhanh do nấm Phytophthora palmirova gây ra, cũng như các bệnh vàng héo rũ do các nấm như Furasium solari, Pythium sp, và Sclerotium rolfosii gây ra.
Các sản phẩm phân hữu cơ sinh học chất lượng cao và uy tín hiện có trên thị trường phía Nam, nổi bật là nhóm sản phẩm phân hữu cơ Cugasa của Công ty.
Ty Anh Việt, phân VK của Công ty Viễn Khang, phân hữu cơ Phaga, Trimix của Công ty Phaga……
Nhóm phân hữu cơ sinh học, hay còn gọi là phân hữu cơ vi sinh, được chế biến bằng cách bổ sung vi sinh vật có ích sau khi nhiệt độ đống ủ đạt 30°C Các vi sinh vật này bao gồm vi khuẩn cố định nitơ tự do như Azotobacter, vi khuẩn và nấm sợi phân giải photphát khó tan như Bacillus polymyxa, Bacillus megaterium, Pseudomonas striata, và Aspergillus awamori, cùng với xạ khuẩn Streptomyces Hiện nay, nhiều loại phân hữu cơ vi sinh và phân lân vi sinh đang được sử dụng rộng rãi trong sản xuất tại Việt Nam.
Phân gà, phân heo và phân bò từ các trại chăn nuôi là nguồn nguyên liệu giàu dinh dưỡng, với hàm lượng đạm vượt quá 2% Tuy nhiên, do độ ẩm cao, khoảng 70-80%, phân này dễ phát sinh mùi Để giảm độ ẩm và mùi hôi, quá trình ủ phân cần được thực hiện bằng cách phơi hoặc trộn với các giá thể khác.
- Hàm lƣợng hữu cơ trong phân gà (hoặc phân heo, phân bò) cao, rất dễ gây ngộ độc hữu cơ cho cây trồng nếu chƣa qua quá trình ủ hoai
Phân gà, cùng với phân heo và phân bò, chứa nhiều vi sinh vật gây bệnh, đặc biệt là vi khuẩn Salmonella và E coli, có thể gây ra các bệnh đường ruột ở người Do đó, việc ủ hoai phân trước khi sử dụng làm phân bón trong nông nghiệp là rất cần thiết.
MỤC TIÊU – NỘI DUNG - NGUYÊN LIỆU
VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Chủng vi khuẩn Bacillus megaterium được phân lập có khả năng cố định Nitơ và sản sinh một số enzyme ngoại bào Nghiên cứu cũng xác định một số đặc điểm sinh lý và sinh hóa của vi khuẩn này.
NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Phân lập, tuyển chọn các chủng Bacillus megaterium có khả năng cố định Nitơ từ ba mẫu đất ruộng
- Xác định hình thái khuẩn lạc, hình dạnh tế bào của Bacillus megaterium các chủng vi khuẩn đã phân lập
- Xác định một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các chủng vi khuẩn đã phân lập
+ hả năng cố định Nitơ
+ hả năng đồng hóa các nguồn carbon khác nhau
+ hả năng sinh trưởng trong điều kiện kỵ khí
- Xác định hoạt tính loại enzyme (amylase, protease, cellulase) ngoại bào của các chủng vi khuẩn Bacillus megaterium đã phân lập
Xác định khả năng chống chịu của các chủng vi khuẩn đối với những yếu tố bất lợi của môi trường, bao gồm khả năng chịu nhiệt độ cao và nồng độ NaCl cao, là rất quan trọng trong nghiên cứu vi sinh vật.
- Xác định hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các chủng Bacillus megaterium đã phân lập.
NGUYÊN LIỆU
NGUỒN VI SINH VẬT
- Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Bacillus megaterium từ một số mẫu đất thu thập ở ruộng lúa của tỉnh Cao Bằng
HÓA CHẤT
Chemical substances such as peptone, yeast extract, NaCl, K\(_2\)HPO\(_4\), MgSO\(_4\)·7H\(_2\)O, (NH\(_4\))\(_2\)SO\(_4\), CaCO\(_3\), mannitol, glucose, lactose, glycerol, maltose, sucrose, and fructose are produced in countries including China, Vietnam, the United States, and Germany.
THIẾT BỊ SỬ DỤNG
Các máy móc, dụng cụ đƣợc sử dụng có tại Viện Công nghệ sinh học Lâm Nghiệp bao gồm:
- Máy đo pH HANA HI 2211 PH/ORP Meter – Ý, Nồi khử trùng HVE
Nhật Bản cung cấp máy ly tâm lạnh và tủ lạnh với các mức nhiệt độ 4ºC, -20ºC, và -80ºC Mỹ nổi bật với máy lắc ổn nhiệt và cân phân tích OHAUS PA 213 Thụy Sĩ có tủ ấm Memmert, trong khi kính hiển vi quang học và tủ cấy (Box laminar PII) cũng được sản xuất tại đây Ngoài ra, micropipet và máy ảnh Sony Lens 14.1 megaPixels từ Nhật Bản cùng với lò vi sóng 20 lít và 30 lít từ liên doanh cũng là những sản phẩm đáng chú ý.
MÔI TRƯỜNG NGHIÊN CỨU
Bảng 2.1: Công thức Môi trường Ashby không chứa Nitơ để phân lập vi khu n Bacillus megaterium
- Môi trường LB nuôi cấy các chủng Bacillus
Bảng 2.2: Công thức môi trường LB
- Môi trường ISP4 xác định khả năng đồng hóa nguồn cacbon
Bảng 2.3: Môi trường xác định khả năng đồng hóa nguồn Cacbon
(NH4)2SO4 2 pH = 7 + Nguồn cacbon: Bổ sung một số loại đường Glucose, Lactose, Glyxerol, Maltose, Sucrose, Fructose và Mannitol
- Môi trường xác định hoạt tính enzyme ngoại bào của vi khuẩn
Bảng 2.4: Công thức môi trường thử hoạt tính enzyme
Môi trường định tính enzyme
Thành phần, hàm lƣợng Thuốc thử
Amylase 2% Agar + 1% Tinh bột Lugol 1%
Protease 2% Agar + 1% Casein Thuốc thử Comassi blue
Ghi chú: Các môi trường trên được hấp khử trùng ở 121ºC, 20 phút trước khi sử dụng.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
PHÂN LẬP, GIỮ CHỦNG VI SINH VẬT TỪ CHẾ PHẨM
Để pha loãng mẫu, cân 1g đất và cho vào 9ml nước cất vô trùng trong ống falcon, tạo ra mẫu pha loãng với nồng độ 10^{-1} Lắc đều và gia nhiệt ở 80ºC trong 20 phút Sau đó, hút 1ml dịch từ mẫu pha loãng 10^{-1} và cho vào ống falcon chứa 9ml nước cất vô trùng mới, tạo ra mẫu pha loãng với nồng độ 10^{-2} Tiếp tục thực hiện quy trình tương tự để pha loãng mẫu đến nồng độ 10^{-3}.
Cấy phỏng lập là quá trình pha loãng 50 mẫu vào môi trường Ashby agar Sử dụng que cấy vô trùng, dịch được trải đều lên bề mặt thạch Các đĩa được ủ ở nhiệt độ 37ºC và sau 48 giờ, quan sát sự hình thành khuẩn lạc của vi khuẩn.
Giữ giống vi khuẩn trong glycerol là phương pháp hiệu quả, trong đó dịch vi khuẩn nuôi lỏng được bổ sung khoảng 70% glycerol và làm lạnh nhanh trong nitơ lỏng, sau đó bảo quản ở -80ºC Phương pháp này giúp bảo quản vi khuẩn trong nhiều năm và cho phép vi khuẩn được hoạt hóa trước khi nhân giống.
XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH LÝ, SINH HÓA CỦA
Chủng vi sinh vật được quan sát trên môi trường Ashby-agar thông qua cả mắt thường và kính hiển vi quang học Các đặc điểm nuôi cấy và hình thái được xác định dựa trên các chỉ số như khả năng phát triển, hình thái, màu sắc, bề mặt và màu sắc của khuẩn lạc.
2.4.2.1 Phương pháp quan sát đặc điểm khuẩn lạc
Quan sát một số chỉ tiêu của các chủng trên môi trường LB-agar: khả năng phát triển của khuẩn lạc, bề mặt khuẩn lạc, màu sắc khuẩn lạc
Nhuộm Gram là một phương pháp quan trọng trong việc phân loại vi khuẩn Quá trình này bắt đầu bằng việc xử lý tế bào với tím kết tinh và iot, tạo thành phức chất tím kết tinh iot bên trong tế bào Khi vi khuẩn Gram âm bị tẩy cồn, lipit trong lớp màng ngoài bị hòa tan, làm tăng tính thấm của màng và dẫn đến việc rửa trôi phức chất tím – iot, khiến vi khuẩn mất màu Khi nhuộm bổ sung, vi khuẩn sẽ bắt màu với các thuốc nhuộm như Safranin (màu vàng) hoặc Fuchsin (màu đỏ tía).
14 dương cồn làm cho các lỗ trong peptidoglycan co lại do đó phức chất tím – iot bị giữ lại bên trong tế bào
Để tiến hành, bạn cần làm vết bôi vi khuẩn phẩm trên một lá kính sạch Sau đó, để vết bôi khô tự nhiên và cố định bằng cách hơ nóng qua ngọn lửa đèn cồn Cuối cùng, nhỏ vài giọt Crystal Violet (tím kết tinh) lên bề mặt vết nhuộm và để yên trong một khoảng thời gian nhất định.
Rửa nhanh bằng nước trong 1 phút, sau đó nhỏ vài giọt Lugol lên bề mặt vết nhuộm và để yên trong 1 phút Tiếp theo, nghiêng lamen và nhỏ từ từ ancol lên vết nhuộm, ngừng khi giọt ancol không còn màu tím Rửa nhanh bằng nước, sau đó nhỏ vài giọt safranine lên bề mặt vết nhuộm và để yên trong 1 phút Cuối cùng, rửa nhanh bằng nước, thấm khô vết nhuộm và quan sát dưới kính hiển vi với vật kính x100.
Khi đọc kết quả, VK Gram âm sẽ hiển thị màu hồng, trong khi V Gram dương sẽ có màu tím Cần quan sát hình dạng của vi khuẩn như cầu khuẩn, trực khuẩn và cách sắp xếp của chúng, bao gồm chuỗi, chùm hoặc rời rạc.
2.4.2.3 Phương pháp xác định khả năng sinh nội bào tử của vi khuẩn
Bào tử vi khuẩn được hình thành tự nhiên để tồn tại lâu dài trong điều kiện khắc nghiệt, nơi mà vi khuẩn trưởng thành không thể sống sót Quá trình tạo bào tử phụ thuộc vào sự suy giảm dinh dưỡng và các yếu tố môi trường khắc nghiệt Để xác định khả năng sinh bào tử, có thể tạo ra điều kiện khắc nghiệt thông qua sốc nhiệt.
Để tiến hành theo phương pháp gia nhiệt, lấy một khuẩn lạc đơn từ đĩa petri và cấy vào môi trường LB lỏng (pH=7) Sau đó, nuôi ở nhiệt độ 37ºC với tốc độ lắc 150 vòng/phút trong 24 giờ để thu được huyền phù vi khuẩn.
Tiến hành pha loãng dịch huyền phù vào các ống Eppendorf đã được khử trùng và đun cách thủy ở 80ºC trong 10 phút Sau đó, sử dụng micropipet hút 100 µl dịch cấy trải trên môi trường LB-agar và đặt vào tủ ấm ở 30ºC Sau 24 giờ, nếu trên đĩa thạch xuất hiện khuẩn lạc, có thể kết luận rằng chủng có khả năng hình thành bào tử.
Xác định khả năng hình thành nội bào tử của vi khuẩn theo phương pháp của Schaeffer–Fulton cải tiến
Phương pháp nhuộm màu theo Schaeffer–Fulton cải tiến bắt đầu bằng việc vô trùng lam kính bằng cồn 70% và trải sinh khối vi khuẩn lên lam kính, sau đó cố định bằng nhiệt Giấy lọc được phủ lên vết bôi để lọc cặn dung dịch xanh methylene, giúp mẫu vi khuẩn sạch và dễ quan sát Trong quá trình nhỏ dung dịch xanh methylene lên giấy lọc, lam kính được đun nhẹ trên đèn cồn để tránh khô Sau 5 phút nhuộm, lam kính được rửa bằng nước cất cho đến khi nước rửa không còn màu xanh, sau đó hong khô và nhuộm lại với thuốc nhuộm fuchsin trong một phút Cuối cùng, mẫu được rửa và quan sát dưới kính hiển vi quang học với vật kính x100, cho thấy bào tử vi khuẩn bắt màu xanh của xanh methylene và tế bào chất bắt màu hồng của thuốc nhuộm fuchsin.
2.4.2.4 Phương pháp xác định khả năng sinh catalase
Catalase là enzyme có mặt ở các vi sinh vật (VSV) hiếu khí và kị khí tùy ý, có chức năng thủy phân hydrogen peroxide (H₂O₂) thành nước (H₂O) và oxy (O₂), giúp ngăn chặn sự tích tụ của phân tử độc hại này trong tế bào Quá trình thủy phân H₂O₂ sẽ giải phóng oxy, được quan sát qua hiện tượng sủi bọt khí Thí nghiệm này thường được sử dụng để phân biệt giữa các VSV hiếu khí và kị khí, chẳng hạn như Bacillus và Clostridium.
- Cách tiến hành: Nhỏ một giọt dung dịch H2O2 30% lên trên khuẩn lạc
Bacillus, hoặc chuyển một lƣợng VSV lên lamen rồi thử bằng dung dịch
H 2 O 2 30% Ghi nhận hiện tƣợng sủi bọt nếu có
- Đọc kết quả: Thử nghiệm là (+) khi có hiện tƣợng sủi bọt khí do O2 đƣợc tạo ra, ngƣợc lại là (-) khi không có sủi bọt khí
2.4.2.5 Xác định khả năng cố định Nitơ
Để tiến hành thí nghiệm, lấy một khuẩn lạc đơn từ đĩa petri và cấy vào môi trường Ashby (pH=7) Sau đó, nuôi cấy ở nhiệt độ 37°C trong 24 giờ Kết quả sẽ được đánh giá dựa trên hình dạng khuẩn lạc mọc trên môi trường.
2.4.2.6 Xác định khả đồng hóa nguồn cacbon
Để tiến hành thí nghiệm, lấy một khuẩn lạc đơn của chủng đã chọn và cấy vào môi trường ISP4 lỏng với nồng độ nguồn carbon 1%, bao gồm các loại đường như Glucose, Lactose, Glycerol, Maltose, Sucrose, Fructose và Mannitol Sau đó, ủ ở 37ºC trong 24 giờ Kết quả sẽ được đánh giá dựa trên sự đổi màu của môi trường với các loại đường khác nhau, từ đó xác định khả năng đồng hóa nguồn carbon của chủng được tuyển chọn.
2.4.2.7 Xác định khả năng sinh trưởng, phát triển trong điều kiện kỵ khí
Để tiến hành thí nghiệm, sử dụng que cấy đầu nhọn đã được khử trùng để lấy một khuẩn lạc vi khuẩn từ môi trường đĩa thạch Cấy vi khuẩn bằng cách ấn que cấy vào môi trường LB-agar trong ống nghiệm có nắp đậy, sau đó đổ thêm một lớp môi trường LB ở nhiệt độ 45ºC đến sát thành ống nghiệm và đậy nắp lại Ủ ống nghiệm ở 37ºC trong 5-7 ngày Kết quả hình thành sinh khối dọc theo vết cấy sẽ giúp đánh giá khả năng sinh trưởng trong điều kiện kỵ khí của các chủng vi khuẩn.
XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME NGOẠI BÀO
Để tiến hành thí nghiệm, nuôi vi khuẩn trong môi trường LB-lỏng trong 24 giờ, sau đó ly tâm ở 12000 vòng/phút trong 10 phút để thu phần dịch nổi (enzyme thô) Chuẩn bị môi trường thử hoạt tính với tinh bột 1%, CMC 1% và casein 1% Sử dụng khoan nút chai (đường kính d=0,7cm) để khoan lỗ ở giữa đĩa thạch Hút 0,05ml dịch enzyme thô cho vào lỗ thạch và ủ ở 4ºC trong 2 giờ, sau đó ủ tiếp ở 37ºC trong 24 giờ Kiểm tra hoạt tính amylase và cellulase bằng thuốc thử lugol, protease bằng Comasi blue Nếu vi khuẩn có sinh trưởng, sẽ tạo vòng trong suốt quanh lỗ khoan, trong khi vùng tinh bột chưa bị phân giải sẽ có màu tím đậm.
Đánh giá khả năng sinh amylase, protease và cellulase được thực hiện bằng cách đo đường kính vòng phân giải (D-d) tính bằng cm Trong đó, D là đường kính vòng phân giải và d là đường kính lỗ thạch Nếu D-d ≥ 2,5 cm, thì hoạt tính sinh enzyme được coi là có.
17 ngoại bào rất mạnh, D-d ≥ 2,0 cm: hoạt tính sinh enzyme ngoại bào mạnh, D-d ≥ 1,5 cm: trung bình và D-d < 1,0 cm: hoạt tính sinh enzyme ngoại bào yếu
XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG CHỐNG CHỊU MỘT SỐ YẾU TỐ BẤT LỢI CỦA MÔI TRƯỜNG
- Cỏch 1: Hỳt 30àl dịch khuẩn được nuụi lắc ở mụi trường LB-lỏng trong
24 giờ vào môi trường LB-lỏng Ủ ở 40ºC, 45ºC, 50ºC và 60ºC , trong 24 giờ Đo OD 600nn rồi kết luận khả năng chịu nhiệt của các chủng đƣợc tuyển chọn
Để đánh giá khả năng chịu nhiệt của các chủng vi khuẩn, lấy một khuẩn lạc đơn của chủng đã chọn và cấy ria trên môi trường LB-agar Sau đó, ủ ở các nhiệt độ 40ºC, 45ºC, 50ºC và 60ºC trong 24 giờ Kết quả hình thành khuẩn lạc ở các nhiệt độ khác nhau sẽ giúp rút ra kết luận về khả năng chịu nhiệt của các chủng được tuyển chọn.
2.4.42 Xác định khả năng chịu NaCl
Các chủng Bacillus có khả năng sinh trưởng trong môi trường có nồng độ muối cao, điều này khác biệt so với nhiều loài vi khuẩn khác Trong bối cảnh tình hình nhiễm mặn ngày càng gia tăng, việc thí nghiệm để xác định khả năng chịu mặn của các chủng Bacillus trở nên cần thiết Điều này đóng vai trò quan trọng trong việc phát triển chế phẩm probiotic cho nuôi thủy sản và xử lý ao hồ.
Để tiến hành thí nghiệm, hủy 30ml dịch khuẩn nuôi lắc trong môi trường LB-lỏng trong 24 giờ, sau đó chuyển vào môi trường LB-lỏng với các nồng độ muối 1,5%; 2%; 3% và 5% Ủ ở 37ºC trong 24 giờ và đo OD600 nm để đánh giá khả năng chịu mặn của các chủng được tuyển chọn.
KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN
Khảo sát khả năng kháng khuẩn của các vi sinh vật thử nghiệm được thực hiện đối với một số vi khuẩn gây bệnh như E Coli, Salmonella, Bacillus cereus, Shighella và nấm men, theo phương pháp của Aslim và cộng sự (2005).
Nguyên tắc: Thực hiện theo nguyên tắc khuếch tán trên đĩa thạch, nguyên tắc này dựa trên khả năng kháng các vi sinh vật chỉ thị của 2 sản phẩm
Môi trường thử hoạt tính kháng khuẩn được đổ trên đĩa Petri chứa vi khuẩn kiểm định, sau khi đông cứng, tiến hành đục lỗ thạch Dịch nuôi cấy đã được li tâm ở 4000 vòng/phút trong 10 phút được nhỏ vào các lỗ đã đục và để ở 4ºC trong 6 giờ, sau đó chuyển các đĩa thạch đến 37ºC Sau 24 giờ, quan sát vòng kháng khuẩn hình thành Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng vi sinh vật được tính bằng đường kính vòng kháng khuẩn ∆D, với công thức ∆D = D - d (mm), trong đó D là đường kính vòng vô khuẩn và d là đường kính lỗ thạch.
QUẢ VÀ THẢO LUẬN
PHÂN LẬP VÀ SÀNG LỌC SƠ BỘ CÁC CHỦNG BACILLUS
Từ 3 mẫu đất thu thập đƣợc ở ruộng lúa ở tỉnh Cao Bằng phân lập đƣợc các chủng Bacillus megaterium trên môi trường Ashby-agar (không chứa Nitơ) thu đƣợc 3 dạng khuẩn lạc khác nhau, đƣợc kí hiệu là B1, B2, B3 Sau 24 giờ quan sát hình dạng, màu sắc, bề mặt khuẩn lạc, làm tiêu bản nhuộm Gram và khả năng sinh nội bào tử theo quy trình đã trình bày ở trên Kết quả đƣợc trình bày tóm tắt ở Bảng 3.1 và Hình 3.1
Bảng 3.1 Tổng hợp các đặc điểm hình thái khu n lạc và một số đặc điểm sinh học của các chủng vi khu n phân lập đƣợc STT
Hình thái khu n lạc trên môi trường Ashby-agar
Khả năng sinh nội bào tử
Trắng đục ở giữa và nhạt dần ra xung quanh, đường kính
Trực khuẩn, ngắn, nhỏ, đứng riêng rẽ hoặc xếp theo cụm
Trắng, bề mặt hơi bông xốp, có tia xung quanh, đường kính 3mm
Trực khuẩn, ngắn, nhỏ, xếp thành đơn hoặc đôi
B3 Có tia, mờ, đường kính
Trực khuẩn, ngắn, nhỏ, xếp đơn hoặc đôi
Hình 3.1 A, Ba dạng khuẩn lạc đặc trưng được làm thuần trên môi trường Ashby agar
B, Hình ảnh nhuộm gram của ba khuẩn lạc
Từ kết quả đƣợc thể hiện trong Bảng 3.1 và Hình 3.1 cho thấy cả 3 chủng
VK có khả năng sinh trưởng tốt trên môi trường Ashby agar và cả ba chủng đều là gram dương, thể hiện qua việc bắt màu tím kết tinh Tất cả ba chủng đều có khả năng sinh nội bào tử, cho thấy chúng có thể phát triển khi được gia nhiệt ở nhiệt độ cao lên đến 80ºC Khi nhuộm bằng thuốc màu và quan sát dưới kính hiển vi với vật kính ×100, bào tử hiện rõ hình thái và bắt màu thuốc nhuộm xanh methylen.
Hình 3.1.A,B cho thấy khuẩn lạc B3 có hình dạng lớn hơn so với chủng B1 và B2, với khả năng sinh nội bào tử khi chịu nhiệt độ cao lên đến 80ºC trong 20 phút Vi khuẩn này phát triển tốt nhất trên môi trường Asbhy, tương tự như mô tả của Bacillus megaterium trong khóa phân loại của Bergey (1884) Do đó, B3 có khả năng cao là vi khuẩn Bacillus megaterium.
XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG ĐỒNG HÓA NGUỒN CARBON
Từ phương pháp xác định khả năng đồng hóa được nêu trên ta thu được kết quả nhƣ Bảng 3.2:
Bảng 3.2 Khả năng đồng hóa nguồn cacbon của các chủng vi khu n
Khả năng đồng hóa Của chủng B1
Khả năng đồng hóa của chủng B2
Khả năng đồng hóa của chủng B3
Ghi chú: - : Không có khả năng đồng hóa
+ : Có khả năng đồng hóa
Hai chủng B1 và B2 có khả năng đồng hóa tất cả các loại đường, trong khi chủng B3 chỉ đồng hóa được Glucose, Lactose, Glycerol, Maltose, Sucrose, Fructose và Mannitol, nhưng không đồng hóa được Xylose Đặc điểm sinh lý sinh hóa cho thấy vi khuẩn B3 là Bacillus megaterium, xác nhận khả năng đồng hóa nguồn carbon của chủng này.
22 loại bergey (2004) và có khả năng là vi khuẩn Bacillus megaterium, tuy nhiên để khẳng định chính xác hơn cần định dạng bằng sinh học phân tử.
XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH LÝ, SINH HÓA CỦA BACILLUS
Một số đặc điểm của chủng vi khuẩn đã được xác định, bao gồm khả năng sinh trưởng và phát triển trên môi trường Ashby không chứa Nitơ, cũng như khả năng sinh trưởng trong điều kiện kỵ khí Kết quả về khả năng sinh catalase được trình bày trong Bảng 3.3 và Hình ảnh 3.3.
Bảng 3.3: Xác định đặc tính sinh lý, sinh hóa của Bacillus
STT Ký hiệu chủng vi khuẩn
Khả năng sinh trưởng, phát triển trên môi trường Ashby không chứa Nitơ
Khả năng sinh trưởng, phát triển trên môi trường kỵ khí
Ghi chú: -: Không có khả năng sinh trưởng, phát triển trên môi trường kỵ khí +: Có khả năng sinh catalase
++: Sinh trưởng và tạo lượng sinh khối trung bình trên môi trường Ashby
+++: Sinh trưởng và tạo nhiều sinh khối trên môi trường Ashby không chứa Nitơ
Hình 3.2: A, Hình ảnh vi khu n B2 và B3 trên môi trường cố định Nitơ
B, Hình ảnh các chủng vi khu n có khả năng sinh catalase
Kết quả từ Bảng 3.3 cho thấy ba chủng vi khuẩn được cấy trên môi trường Ashby agar và chuyển sang môi trường Ashby-lỏng, trong đó B3 thể hiện khả năng sinh trưởng hiếu khí tốt nhất trên môi trường không có Nitơ Đặc biệt, Bacillus megaterium là chủng duy nhất sinh trưởng tốt nhất trong điều kiện này, phù hợp với công bố của Bergey (1884) Bảng 3.2 và Hình 3.2 cũng xác nhận rằng cả ba chủng đều thuộc nhóm vi khuẩn hiếu khí và có khả năng sinh trưởng trên môi trường.
Ashby agar và môi trường Ashby lỏng trong đó, đáng chú ý là về khả năng cố định Nitơ của chủng B3.
XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG SINH ENZYME NGOẠI BÀO
Thức ăn chăn nuôi chủ yếu bao gồm protein, xơ thô và tinh bột Tuy nhiên, sự tiết enzyme tiêu hóa ở dạ dày và ruột non vẫn còn thấp.
Khả năng tiêu hóa thức ăn của động vật còn hạn chế, do đó, việc sinh ra các enzyme ngoại bào như amylase, protease và cellulase từ các chủng vi khuẩn là rất quan trọng Những enzyme này hỗ trợ tiêu hóa thức ăn, chuyển hóa các chất khó tiêu thành chất dễ tiêu, giúp động vật hấp thu dinh dưỡng tốt hơn Vì lý do này, ba chủng Bacillus đã được chọn lọc và khảo sát khả năng sinh các enzyme ngoại bào.
3.4.1 Xác định hoạt tính amylase
Bảng 3.4 Hoạt tính amylase ngoại bào của các chủng vi khu n sau các khoảng thời gian nuôi cấy khác nhau
Ký hiệu chủng vi khuẩn Đường kính vòng phân giải tinh bột 1% của Bacillus sau các khoảng thời gian nuôi cấy khác nhau D-d (cm)
Hình 3.3 Hoạt tính enzyme amylase ngoại bào của các chủng Bacillus megaterium đã phân lập
Kết quả từ Bảng 3.3 và Hình 3.3 cho thấy ba chủng vi sinh vật có khả năng phân giải tinh bột 1% rất mạnh Cụ thể, chủng B1 có hoạt tính mạnh nhất, đạt 2,40 cm sau 48 giờ và giảm xuống 2,36 cm sau 72 giờ Chủng B2 cũng có hoạt tính mạnh nhưng thấp hơn B1, với mức cao nhất là 2,00 cm trong khoảng thời gian từ 24 đến 48 giờ, sau đó giảm xuống còn 1,87 cm ở 72 giờ.
B3 có hoạt tính mạnh nhất trong ba chủng, thời gian hoạt tính mạnh nhất 48 giờ là 4,05 (cm) và giảm dần ở thời gian 72 giờ còn 3,97 (cm)
3.4.2 Xác định hoạt tính cellulase
Enzyme tương tác với cơ chất trong môi trường thạch, dẫn đến sự phân hủy và hình thành vòng trong suốt xung quanh lỗ khoan Kích thước của vùng trong suốt này phản ánh hoạt tính của enzyme, như được trình bày trong Bảng 3.5.
Bảng 3.5 Hoạt tính cellulase ngoại bào của các chủng vi khuẩn sau các khoảng thời gian nuôi cấy khác nhau
Ký hiệu chủng vi khuẩn Đường kính vòng phân giải tinh CMC 1% của Bacillus sau các khoảng thời gian nuôi cấy khác nhau D-d (cm)
Hình 3.4 Hoạt tính phân giải cellulase của các chủng Bacillus phân lập
Kết quả từ Bảng 3.4 và Hình 3.4 cho thấy ba chủng có khả năng phân giải CMC 1% rất mạnh Trong đó, chủng B1 thể hiện hoạt tính mạnh nhất với giá trị 2,50 (cm) trong 24 giờ, sau đó giảm dần ở thời gian 48 giờ.
Chủng B2 cho thấy hoạt tính mạnh nhất ở 48 giờ với kích thước 2,75 cm, trong khi ở 72 giờ, hoạt tính giảm xuống còn 1,67 cm Chủng B3 cũng có hoạt tính mạnh nhưng giảm dần trong ba ngày.
26 chủng, thời gian hoạt tính mạnh nhất 48 giờ là 2,65 (cm) và giảm dần ở thời gian
3.4.3 Xác định hoạt tính protease
Enzyme tương tác với cơ chất trong môi trường thạch, dẫn đến sự phân hủy và hình thành vòng trong suốt xung quanh lỗ khoan Kích thước của vùng trong suốt này phản ánh hoạt tính của enzyme, như được trình bày trong Bảng 3.6.
Bảng 3.6 Hoạt tính protease ngoại bào của các chủng vi khuẩn sau các khoảng thời gian nuôi cấy khác nhau
Ký hiệu chủng vi khuẩn Đường kính vòng phân giải tinh casein 1% của
Bacillus sau các khoảng thời gian nuôi cấy khác nhau
Hình 3.5 Hoạt tính phân giải protease của các chủng Bacillus phân lập
Kết quả từ Bảng 3.6 và Hình 3.5 cho thấy ba chủng vi khuẩn có khả năng phân giải casein 1% rất mạnh Cụ thể, chủng B1 có hoạt tính mạnh nhất, đạt 3,30 cm sau 48 giờ và giảm xuống 2,26 cm sau 72 giờ Chủng B2 cũng có hoạt tính mạnh, nhưng thấp hơn B1, với mức cao nhất là 2,60 cm trong khoảng thời gian 24 đến 48 giờ, sau đó giảm nhẹ xuống 1,57 cm ở 72 giờ Cuối cùng, chủng B3 cũng thể hiện hoạt tính đáng kể.
27 mạnh và nhất trong ba chủng, thời gian hoạt tính mạnh nhất 24 giờ là 5,50 (cm) và hoạt tính giữ nguyên ở thời gian 48 và 72 giờ là 5,43 (cm)
Các bước xác định enzyme ngoại bào của ba chủng phân lập cho thấy tất cả các chủng Bacillus đều có khả năng sinh enzyme ngoại bào Trong đó, chủng B3 nổi bật với hoạt tính mạnh nhất, cụ thể là hoạt tính phân giải tinh bột 1% đạt 4,05 cm, hoạt tính phân giải CMC đạt 2,65 cm và hoạt tính phân giải casein 0,8% đạt 5,50 cm Do đó, chủng B3 được chọn là Bacillus megaterium để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo.
XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG CHỐNG CHỊU MỘT SỐ YẾU TỐ BẤT LỢI CỦA MÔI TRƯỜNG
3.5.1 Xác định khả năng chịu nhiệt
Nhiệt độ là yếu tố môi trường quan trọng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của các chủng trong nuôi cấy Mỗi chủng thường có một nhiệt độ tối ưu cho quá trình này trong điều kiện phòng thí nghiệm Do đó, việc khảo sát khả năng chịu nhiệt của các chủng ở các nhiệt độ khác nhau là cần thiết, và kết quả được trình bày trong Bảng 3.7.
Bảng 3.7 Khả năng chịu nhiệt của chủng L3 trên môi trường LB-lỏng và agar
Nhiệt độ nuôi cấy Môi trường LB-lỏng
Hình 3.6: Hình ảnh chủng L3 nuôi ở các nhiệt độ khác nhau ở môi trường
LB-lỏng Ghi chú: A Nuôi ở nhiệt độ 40ºC; B Nuôi ở nhiệt độ 45ºC; C Nuôi ở nhiệt độ 50ºC và D Nuôi ở nhiệt độ 60ºC
Kết quả từ Bảng 3.7 và Hình 3.6 cho thấy các chủng phân lập có khả năng sinh trưởng ở nhiệt độ từ 30-50°C Đặc biệt, trong khoảng nhiệt độ 40-55°C, các chủng phát triển mạnh sau 20 giờ nuôi cấy Tuy nhiên, ở nhiệt độ 45°C, sự sinh trưởng của các chủng yếu hơn Nhiệt độ lý tưởng để nuôi các chủng Bacillus megaterium B3 là từ 37-45°C.
3.5.2 Xác định khả năng chịu NaCl
Mục đích của thí nghiệm là xác định khả năng chịu mặn của vi khuẩn Bacillus megaterium B3, vì hầu hết các chủng Bacillus đều ưa mặn Nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng trong việc đề xuất ứng dụng của vi khuẩn trong sản xuất chế phẩm sinh học như phân bón hữu cơ và xử lý môi trường, đặc biệt cho các vùng đất ven biển hoặc khu vực ô nhiễm mặn Do đó, chúng tôi đã tiến hành khảo sát khả năng chịu muối của vi khuẩn ở các nồng độ muối khác nhau, với kết quả được trình bày ở Hình 3.7a.
Ghi chú: a, A nồng độ NaCl 2%; B nồng độ NaCl 3%; C nồng độ NaCl 4% và
Hình 3.7 trình bày biểu đồ khả năng chịu muối của vi khuẩn, cho thấy khả năng sinh trưởng và phát triển của chủng B3 Bacillus megaterium khi nuôi cấy trong môi trường với các nồng độ NaCl khác nhau Cụ thể, nồng độ NaCl được thử nghiệm bao gồm 1,5% (A), 2% (B), 3% (C) và 5% (D).
Chủng B3 cho thấy khả năng chịu đựng nồng độ muối từ 2-5%, với sự sinh trưởng tốt nhất ở nồng độ 1,5% (OD 600nm đạt 2,058) và giảm rõ rệt ở nồng độ 5% (OD 600nm đạt 1,440) Điều này cho thấy chủng B3 có khả năng chịu muối cao, phù hợp với nồng độ muối trong ao nước lợ ở Việt Nam (1,5-2,5%) Nhờ vào đặc tính này, chủng B3 rất thích hợp để phát triển thành chế phẩm sinh học như phân bón sinh học và ứng dụng trong xử lý môi trường.
3.6 Xác định hoạt tính háng hu n
Khả năng đối kháng với vi khuẩn E Coli, Salmonella, Bacillus cereus, shigela và nấm men của chủng Bacillus megaterium B3 đƣợc trình bày ở Bảng 3.8
Bảng 3.8: Khả năng háng vi sinh vật kiểm định của vi khu n Bacillus megaterium B3
Hoạt tính kháng của vi sinh vật kiểm định
Ghi chú: -: Không có tính kháng vi khuẩn kiểm định
Chủng Bacillus megaterium B3 không có khả năng kháng vi khuẩn E.coli, Samonella, Shighella, B cereus và nấm men, như thể hiện trong Bảng 3.9 Đặc điểm này cho phép chủng B3 có thể phối trộn với các vi sinh vật khác khi sản xuất chế phẩm sinh học.
Chủng L3 của Bacillus đã được sàng lọc và tuyển chọn qua các bước in vitro, cho thấy tiềm năng sử dụng làm chế phẩm với nhiều ưu điểm vượt trội.
- Có khả năng sinh enzyme ngoại bào (amylase, protease, cellulase) với hoạt tính enzyme mạnh
- Có khả năng sinh trưởng, phát triển ở nhiệt độ cao (đến 60 o C)
- Có khả năng chịu muối ở nồng độ cao (NaCl 5%)
- Không đối kháng một số vi sinh vật kiểm định
Chủng Bacillus megaterium B3 đã được phân lập và cho thấy nhiều đặc điểm sinh học phù hợp, điều này khẳng định tiềm năng của nó trong việc sản xuất chế phẩm phân bón sinh học.
LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
- Đã phân lập đƣợc 3 chủng vi khuẩn có khả năng là Bacillus megaterium và cả 3 chủng đều thuộc chi Bacillus
- Xác định đƣợc hình thái khuẩn, hình dạnh tế bào của các chủng vi khuẩn
Bacillus megaterium đã phân lập
- Xác định đƣợc một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các chủng vi khuẩn
Bacillus megaterium là vi khuẩn gram dương có khả năng sinh nội bào tử và có kích thước tế bào lớn Loại vi khuẩn này có thể phát triển trong môi trường thiếu Nitơ, đồng thời có khả năng đồng hóa nguồn carbon từ đường Xylose và sản sinh catalase.
Hoạt tính enzyme ngoại bào của các chủng vi khuẩn Bacillus megaterium đã được xác định với kết quả ấn tượng: hoạt tính phân giải tinh bột 1% đạt 4,05 cm, hoạt tính phân giải CMC đạt 2,65 cm, và hoạt tính phân giải casein 0,8% đạt 5,50 cm.
Nghiên cứu khả năng chống chịu của vi khuẩn Bacillus megaterium đối với các yếu tố môi trường bất lợi cho thấy chúng có thể chịu được nhiệt độ cao lên đến 60ºC và nồng độ NaCl cao tới 5%.
- Không đối kháng một số vi sinh vật kiểm định
KIẾN NGHỊ
Do thời gian hạn chế nên nếu đƣợc tiếp tục chúng tôi sẽ tiến hành các công việc nhƣ sau:
- Tiến hành lặp lại các thí nghiệm để tăng tính chính xác
- Tạo chế phẩm probiotic kết hợp chủng B3 với các chủng vi khuẩn có lợi khác.