Riva và cộng sự 2016 đã nghiên cứu quy trình tái sinh và nhân nhanh in vitro của Dendrobium bensoniae được kết luận như sau: Tái sinh trên môi trường MS có bổ sung 2 mg/l BAP là tốt nhấ
TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
Giới thiệu về Phi điệp tím Hòa Bình (Dendrobium anosmum Lindl.)
Phi Điệp tím Hòa Bình (Dendrobium anosmum Lindl.) thuộc:
Nguồn: https://www.pinterest.com
Hình 1.1 Ảnh lan Phi điệp tím Hòa Bình
Phi điệp tím Hòa Bình là loại cây có thân thòng, dài tới 2 m và mọc thành từng cụm, thuộc nhóm đa thân với giả hành chứa diệp lục, giúp dự trữ nước và dinh dưỡng Thân cây chia thành nhiều đốt, mỗi đốt có một mắt ngủ, độ dài đốt phụ thuộc vào tuổi cây và môi trường Màu sắc thân rất đa dạng, từ xanh, chấm tím đến tím, với đường kính có thể đạt 1,5 cm trong mùa nghỉ Thân già thường khô teo, có màu nâu tím hoặc vàng như rơm.
Lá: Lá đơn mọc cách, xếp so le, mọng nước, dài 10 -15 cm, rộng từ 3 -4 cm Mép lá nguyên, hệ gân song song, đầu lá nhon [17]
Rễ: Phi điệp tím Hòa Bình thuộc loại rễ bì sinh, đường kính nhỏ khoảng 1,5 – 2 mm, có hình trụ Rễ rất dài, chóp rễ có màu xanh [17]
Hoa Phi đệp tím không chỉ nở trên các giả hành mới mà còn trên những giả hành cũ Thời gian nở hoa thường vào cuối xuân đến đầu hè (tháng 4 – 6 dương lịch), với kích thước hoa lên tới 10 cm, mọc từ 1 – 3 bông ở các đốt đã rụng lá Cánh hoa được phủ lông mịn và có ánh kim, trong khi lưỡi hoa thường có hai mắt tím đậm Hoa có hương thơm ngào ngạt và lâu tàn, kéo dài từ 2 – 3 tuần Một cây khỏe mạnh có thể cho ra từ 50 – 70 bông hoa.
Quả của Hoàng thảo Phi điệp tím Hòa Bình là loại quả nang, nở ra theo 3 – 6 đường nứt dọc Khi chín, quả nở ra với các mảnh vỏ còn dính lại ở phía đỉnh và gốc, bên trong chứa nhiều hạt màu vàng Hạt có cấu tạo từ phôi chưa phân hóa, chứa đầy không khí, rất nhỏ và nhẹ, tổng trọng lượng của toàn bộ hạt trong một quả chỉ bằng một phần mười mg, giúp chúng dễ dàng phát tán nhờ gió.
1.1.3 Đặc điểm sinh học của Phi điệp tím
Cây đa thân là loại cây có thân giả hoặc giả hành, chứa diệp lục và đóng vai trò là cơ quan dự trữ nước cùng các chất dinh dưỡng, giúp duy trì sự sống lâu hơn so với loài đơn thân.
Giả hành được cấu tạo từ nhiều mô mềm chứa dịch nhầy, bên ngoài có lớp biểu bì dày và nhẵn bóng giúp bảo vệ khỏi sự mất nước do ánh nắng mặt trời Củ giả hành có màu xanh bóng và cùng với lá, chúng thực hiện chức năng quang hợp.
Lá: Là cơ quan cung cấp dinh dưỡng bằng quang hợp Lá thường rụng vào mùa thu, đông khi cây đã thắt ngon và bước vào mùa nghỉ [17]
Rễ Phi Điệp Tím Hòa Bình là loại rễ bì sinh, được bao bọc bởi lớp mô xốp giúp cây dễ dàng hấp thụ nước và muối khoáng, đồng thời ngăn chặn ánh sáng mặt trời gay gắt Chóp rễ có màu xanh lá cây, và các sắc lạp trong phần rễ không bị ngăn cản bởi mô xốp, cho phép cây thực hiện quá trình quang hợp hiệu quả.
Bên trong hoa, cột nhị nhụy nằm ở giữa, với phần đực ở trên và phần cái ở phía trước Nhị bao gồm hai phần: bao phấn và hốc phấn Bao phấn nằm trên cột nhị nhụy, trong khi hốc phấn lõm lại và chứa khối phấn, thường song song với bao phấn Khối phấn là tập hợp các hạt phấn dính lại với nhau, có độ cứng cao.
Phi điệp tím có xuất xứ ở nhiều nơi đặc biệt là Đông Nam Á nhƣ: Lào, Campuchia, Thái Lan [17]
Phi điệp tím, một loài hoa đặc trưng của Việt Nam, xuất hiện ở nhiều tỉnh như Cao Bằng, Hòa Bình, Phú Thọ, Thanh Hóa và Tây Ninh Mỗi vùng miền mang đến những đặc điểm riêng cho loài hoa này Đặc biệt, phi điệp tím Hòa Bình nổi bật với hình dạng, màu sắc, hương thơm và vẻ đẹp độc đáo, với cánh hoa to hơn và hương thơm đặc biệt so với các loại phi điệp khác.
1.1.5 Một số điều kiện sinh thái
Phi điệp tím là cây ưa sáng, nên cần trồng ở nơi có nhiều ánh sáng, nhưng tránh ánh nắng gắt cả ngày để không bị cháy lá non Tốt nhất nên sử dụng lưới che để bảo vệ cây, giúp cây hấp thụ đủ ánh sáng cần thiết Nếu trồng ở nơi quá râm, cây sẽ phát triển kém, lá xanh sẫm và thân còi cọc Đặc biệt vào mùa đông, thiếu ánh sáng sẽ khiến cây khó ra hoa.
Lan Phi điệp tím có khả năng chịu nhiệt tốt, với khả năng sống trong điều kiện nhiệt độ lên đến 38 độ C vào mùa hè Trong khi đó, vào mùa đông, cây có thể chịu được nhiệt độ thấp tới 3,3 độ C Tuy nhiên, nếu nhiệt độ không giảm xuống dưới 15-16 độ C trong khoảng 4-6 tuần, cây sẽ gặp khó khăn trong việc ra nụ.
1.1.5.3 Độ ẩm và độ thông thoáng
Phi điệp tím cần độ ẩm cao từ 60 – 70% trong giai đoạn phát triển thân non Loài này ưa thích môi trường thoáng gió, vì vậy việc ghép vào dớn bảng hoặc ghép gỗ là rất phù hợp Cây có dáng thòng xuống, hoa buông đẹp mắt, đồng thời giúp giảm nguy cơ úng nước và nấm bệnh.
Nước là yếu tố quan trọng cho sự phát triển của lan, và việc tưới nước đúng cách giúp cây sinh trưởng ổn định và ra hoa đều Vào mùa hè, khi lan phát triển mạnh, cần tưới 2-3 lần mỗi tuần Mùa thu, khi cây ngừng tăng trưởng, chỉ cần tưới 1 lần mỗi tuần để tránh thân cây bị teo Mùa đông, khi lan chuẩn bị ra hoa, nên ngừng tưới nước hoàn toàn, nhưng nếu độ ẩm quá thấp, có thể phun sương 1-2 lần mỗi tháng.
Phi điệp tím cần một lượng dinh dưỡng nhất định để phát triển, bao gồm các thành phần N – P – K cùng với các nguyên tố trung và vi lượng Để cung cấp dinh dưỡng, nên sử dụng phân NPK với tỷ lệ 10-30-20, nồng độ 3g/l, định kỳ 1 tuần một lần Khoảng 2 tháng trước khi hoa nở, phun NPK 15-20-25 với nồng độ 2g/l, 1 tuần một lần, và ngừng bón phân khi hoa tàn.
Lan Phi điệp tím Hòa Bình được coi là món trang sức tuyệt đẹp mà thiên nhiên ban tặng cho con người Hoa có màu sắc quyến rũ, cánh phủ lông mịn và ánh kim, với lưỡi hoa thường có hai mặt tím đậm và hương thơm ngào ngạt kéo dài từ 2 đến 3 tuần Thân cây cao khỏe và rất siêng hoa, một giả hành có thể cho ra nhiều phát hoa cùng lúc Chính vì vậy, Phi điệp tím Hòa Bình thường được sử dụng để thưởng lãm, trang trí và làm đẹp không gian sống.
Phi điệp tím Hòa Bình nổi bật với vẻ đẹp độc đáo, mang lại giá trị kinh tế cao hơn so với các dòng lan phi điệp khác Loài hoa này đã trở thành lựa chọn phổ biến trong các sự kiện như hội nghị, đám cưới, bàn tiệc và trang trí cô dâu.
MỤC TIÊU, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Mục tiêu
- Xác định đƣợc công thức khử trùng thích hợp đối với chồi lan
- Xác định được môi trường và ánh sáng thích hợp cho tái sinh chồi từ lát cắt mỏng
- Xác định được môi trường thích hợp cho nhân nhanh chồi.
Nội dung
2.2.1 Nghiên cứu kỹ thuật tạo mẫu sạch in vitro
Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2 0,1% đến khả năng tạo mẫu sạch in vitro
2.2.2 Nghiên cứu khả năng tái sinh chồi lan Phi điệp tím từ lát mỏng
- Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tái sinh chồi từ lát cắt mỏng
- Ảnh hưởng của ánh sáng đến khả năng tái sinh chồi từ lát cắt mỏng
2.2.3 Nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh chồi lan Phi điệp tím Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi Phi điệp tím Hòa Bình.
Vật liệu nghiên cứu, địa điểm và điều kiện bố trí thí nghiệm
Các đoạn chồi lan Phi điệp tím mới tái sinh có kích thước từ 0,5-0,7 cm được thu thập tại vườn lan Xung Hà - Hòa Sơn - Lương Sơn - Hòa Bình
2.3.2 Địa điểm và điều kiện bố trí thí nghiệm:
- Địa điểm nghiên cứu: Phòng TN bảo tồn nguồn gen thực vật, Viện công nghệ sinh học Lâm Nghiệp
- Điều kiện bố trí thí nghiệm:
+ Cường độ ánh sáng: 2000 - 3000 lux
Thí nghiệm lặp lại 3 lần
Phương pháp nghiên cứu
2.4.1 Phương pháp tạo mẫu sạch lan Phi điệp tím Hòa Bình
Đoạn chồi lan Phi điệp tím khỏe mạnh, không bị sâu bệnh, được khử trùng sơ bộ bằng cồn 70 độ Sau đó, chúng được chuyển vào tủ cấy vô trùng và rửa bằng nước cất vô trùng 1-2 lần trước khi khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong khoảng thời gian 2, 4 hoặc 6 phút Cuối cùng, mẫu vật được rửa lại bằng nước cất vô trùng 4-5 lần để loại bỏ HgCl2 Mẫu vật đã được khử trùng bằng hóa chất được cắt thành đoạn có chứa 1 mắt ngủ và cấy vào môi trường mẫu.
Môi trường vào mẫu là môi trường cơ bản MS, được bổ sung 6g/l agar, 20g/l sucrose và 0,5 mg/l BAP Sau 8 tuần, mẫu vật được theo dõi và đánh giá dựa trên tỷ lệ mẫu sạch và tỷ lệ mẫu sạch tái sinh chồi Kết quả được thống kê và ghi chép vào bảng 2.1.
Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm và thống kê kết quả nghiên cứu
CTTN Thời gian khử trùng (phút) Số mẫu NC Số mẫu sạch Số mẫu tái sinh chồi
2.4.2 Phương pháp tái sinh chồi từ lát cắt mỏng a Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tái sinh chồi từ lát cắt mỏng
Chồi mới tái sinh từ môi trường có chiều dài 1,5-2,0 cm được cắt thành những lát mỏng Thân lan Phi điệp tím Hòa Bình được cắt ngang thành lát mỏng kích thước 0,5-0,7 mm, loại bỏ lá và phần đỉnh, cũng như lớp màng bao quanh thân Sau đó, các lát cắt được đặt vào môi trường tái sinh MS với 20 g/l sucrose, 5,5 g/l agar và các chất điều hòa sinh trưởng BAP (0,5-1 mg/l) kết hợp với NAA (0,2-0,5 mg/l) Sau 8 tuần nuôi cấy, khả năng tái sinh chồi hoặc thể chồi của lát cắt được đánh giá, với số chồi trung bình/lát cắt được thể hiện trong bảng số 2.2.
Bảng 2.2 trình bày bố trí thí nghiệm và biểu thu thập số liệu về ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đối với khả năng tái sinh chồi từ lát mỏng của lan Phi điệp tím.
CTTN chất ĐHST (mg/l) số mẫu
Số mẫu tạo thể chồi
Tỷ lệ tạo thể chồi (%) Đặc điểm thể chồi
LM7 0,5 0,2 b Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của ánh sáng đến khả năng tái sinh chồi từ lát cắt mỏng
Chồi khỏe mạnh có kích thước từ 1,5-2 cm Cắt phần thân thành những lát mỏng khoảng 0,5-0,7 mm, loại bỏ lá và phần đỉnh, cũng như lớp màng bao quanh thân Đặt vào môi trường MS với 0,7 mg/l BAP, 0,5 mg/l NAA, 20 g/l sucrose và 5,5 g/l agar Các bình mẫu được nuôi trong ba điều kiện chiếu sáng khác nhau: (1) 12 giờ/ngày trong 8 tuần; (2) tuần đầu che sáng hoàn toàn, 7 tuần sau chiếu sáng 12 giờ/ngày; (3) che sáng hoàn toàn Quan sát và ghi nhận kết quả trong 8 tuần theo mẫu bảng 2.3.
Bảng 2.3 Bố trí thí nghiệm về ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng đến khả năng tái sinh chồi Phi điệp tím
Số mẫu tái sinh chồi Số chồi TB/mẫu
2.4.3 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi
Chồi tái sinh từ các thí nghiệm trên cây khỏe mạnh, kích thước 0,5 cm, sẽ được cấy chuyển sang môi trường nhân nhanh chồi MS, với các thành phần bổ sung 1-1,5 mg/l BAP, 0-0,5 mg/l Kinetin, 0,1-0,5 mg/l NAA, 20 g/l sucrose và 5,5 g/l agar Kết quả thí nghiệm sẽ được theo dõi sau 8 tuần nuôi cấy và thống kê theo mẫu bảng 2.4.
Bảng 2.4 trình bày bố trí thí nghiệm nhằm nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi từ lát mỏng của lan Phi Điệp Tím Hòa Bình.
Chất điều hòa sinh trưởng (mg/l) Số mẫu
Số mẫu tạo đa chồi
Hệ số nhân chồi (lần)
Chiều cao chồi (cm) BAP Kinetin NAA
Phương pháp xử lý số liệu
Phương pháp thu thập số liệu:
Chỉ tiêu thu thập số liệu cho thí nghiệm tạo mẫu sạch
Tỷ lệ mẫu sạch (%) = số mẫu sạch tổng số mẫu nghiên cứu ×100
Tỷ lệ mẫu tái sinh chồi (%) = số mẫu tái sinh số mẫu nghiên cứu ×100 Chỉ tiêu thu thập số liệu cho thí nghiệm tạo thể chồi
Tỷ lệ mẫu tạo thể chồi (%) được tính bằng cách lấy số mẫu tạo thể chồi chia cho tổng số mẫu nghiên cứu và nhân với 100 Đây là chỉ tiêu quan trọng trong việc thu thập số liệu cho thí nghiệm tái sinh chồi trực tiếp từ lát cắt mỏng.
Số chồi trung bình trên mẫu = tổng số chồi tái sinh tổng số mẫu nghiên cứu
Tỷ lệ mẫu tạo thể chồi (%) = số mẫu tạo thể chồi tổng số mẫu nghiên cứu ×100
Tỷ lệ mẫu tạo đa chồi (%) = số mẫu tạo đa chồi tổng số mẫu nghiên cứu ×100
Tỷ lệ mẫu tái sinh chồi (%) được tính bằng cách lấy số mẫu tái sinh chồi chia cho tổng số mẫu nghiên cứu và nhân với 100 Chỉ tiêu thu thập cho thí nghiệm này nhằm đánh giá ảnh hưởng của việc nuôi trong các điều kiện ánh sáng khác nhau.
Tỷ lệ chồi (%) = số chồi tổng số mẫu nghiên cứu ×100
Chiều dài chồi TB = tổng chiều dài chồi tổng số chồi
Xử lý số liệu: Số liệu đƣợc thống kê và xử lý bằng phần mềm excel và spss version 20.