Nghiên cứu xác định các đoạn dna barcode cho loài áo cộc (lirodendron chinense) phục vụ giám định loài

Áo cộc là một trong mười sáu kiểu che phủ rừng, mức độ thống trị của loài này đã tạo ra sự khác biệt giữa các cộng đồng sinh thái [20], không những thế nó còn có giá trị như một nguồn m

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÂM NGHIỆP

-o0o -

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

CHO LOÀI ÁO CỘC (LIRIODENDRON CHINENSE) PHỤC

1

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành được khóa luận này, với lòng biết ơn sâu sắc nhất, tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp - Trường Đại học Lâm nghiệp đã giúp đỡ và chỉ bảo tận tình tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tại trường, đặc biệt là sự giúp đỡ của các thầy cô bên bộ môn Công nghệ gen

và Di truyền phân tử của Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp

Tôi xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Văn Phong, TS Bùi Thị Mai Hương

đã tận tình giúp đỡ và chỉ bảo tôi trong quá trình hoàn thành khóa luận Đặc biệt,

đề tài “Nghiên cứu xác định các đoạn DNA barcode cho Loài Áo cộc (Liriodendron chinense) phục vụ giám định loài” do TS Nguyễn Văn Phong làm

Chủ nhiệm Với những kiến thức và kỹ năng thầy và cô truyền dạy không chỉ giúp tôi hoàn thành khóa luận mà còn là tài sản quý báu theo giúp tôi sau này

Cảm ơn các anh chị thuộc Viện Công nghệ sinh học đã quan tâm giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận

Chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè luôn động viên và hỗ trợ tôi trong suốt thời gian qua

Mặc dù tôi đã cố gắng nhưng chắc chắn bài khóa luận vẫn không thể tránh khỏi sai sót Vì vậy, tôi rất mong nhận được những ý kiến đánh giá, góp ý để tạo tiền đề vững chắc hơn cho tôi trong công việc sau này

Xuân Mai, ngày … tháng … năm 2020

Sinh viên

Trần Phương Thảo

2

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN 1

MỤC LỤC 2

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT 4

DANH MỤC HÌNH 7

DANH MỤC BẢNG 8

ĐẶT VẤN ĐỀ 9

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN ĐỀ TÀI 11

1.1 Tổng quan về Áo cộc: 11

1.1.1 Phân loại khoa học: 11

1.1.2 Phân bố: 11

1.1.3 Đặc điểm sinh học: 12

1.1.4 Giá trị sử dụng: 14

1.1.5 Một số đề tài nghiên cứu có liên quan đến loài cây Áo cộc đã trích dẫn khi đánh giá tổng quan: 14

1.2 Tổng quan về DNA barcode (DNA mã vạch): 15

1.2.1 Giới thiệu về mã vạch DNA barcode: 15

1.2.2 Một số DNA barcode được sử dụng: 17

1.2.3 Ứng dụng của DNA barcode trên thực vật: 24

CHƯƠNG II: MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 Mục tiêu nghiên cứu: 26

2.2 Nội dung nghiên cứu: 26

2.3 Vật liệu, hóa chất, các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu: 26

3

2.3.1 Vật liệu nghiên cứu: 26

2.3.2 Hóa chất sử dụng: 26

2.3.3 Thiết bị sử dụng: 28

2.4 Phương pháp nghiên cứu: 28

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 35

3.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số: 35

3.2 Kết quả nhân bản vùng gen nghiên cứu bằng kĩ thuật PCR: 35

3.3 Phân tích kết quả: 36

3.3.1 Xác định và phân tích trình tự DNA trên các vùng gen nghiên cứu: 36

3.3.2 So sánh khả năng phân biệt của các đoạn trình tự: 49

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51

4.1 Kết luận: 51

4.2 Kiến nghị: 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO 52

4

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

viết tắt Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt

1 ATP Adenosin triphosphat Adenosin triphosphat

2 BME β-mereaptoethanol β-mereaptoethanol

3 BOLD Barcode of Life data Barcode of Life data

5 CBOL Consortium for the Barcode

of Wild Fauna and Flora

Công ước về buôn bán quốc tế các loài nguy cấp

7 cpDNA Chloroplast DNA Bộ gen lục lạp

8 CTAB Cetyl trimethylammonium

bromide

Cetyl trimethylammonium bromide

12 EBA Extraction Buffer A Đệm tách A

13 EBB Extraction Buffer B Đệm tách B

5

14 EDTA Ethylenediaminetetraacetic

acid

Axit ethylenediamine tetraacetic

17 ITS Internal Transcribed Spacer Vùng DNA nằm giữa các gen

18 Kb Kilobase (1000 base) 1000 cặp base

19 mtDNA Mitochondrial DNA DNA ty thể

20 NAD(P)H Nicotinamide adenine

dinucleotide phosphate

Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate

21 NCBI National Center for

Biotechnology Information

Trung tâm Quốc gia về Thông tin Công nghệ sinh học

23 PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi polymerase

24 PVP Polyvinyl pyrrolidone Polyvinyl pyrrolidone

25 RFLP Restriction fragment length

polymorphism Phân tích đa hình trình tự DNA

26 RNA Ribonucleic acid Axit ribonucleic

28 SDS Sodium Dodecyl Sulphate Sodium Dodecyl Sulphate

6

30 TAE Tris-Acetate-EDTA Tris-Acetate-EDTA

7

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 – Hình thái cây Áo cộc 12

Hình 1.2 – Hình thái lá cây Áo cộc 13

Hình 1.3 – Hình thái hoa cây Áo cộc 13

Hình 1.4 – Hình thái quả cây Áo cộc 13

Hình 3.1 – Kết quả tách chiết DNA tổng số của 3 mẫu Áo cộc 35 Hình 3.2 - Kết quả PCR gen matK, TrnH-psbA, rbcL, ITS2 của mẫu Áo cộc 36

Hình 3.3 - Cây phân loại dựa vào trình tự trên đoạn matK 38

Hình 3.4 - Sự sai khác trình tự đoạn gen matK của loài Áo cộc với trình tự với trình tự gen của loài Liriodendron chinenes 40

Hình 3.5 - Cây phân loại dựa vào trình tự trên đoạn rbcL 42

Hình 3.6 - Sự sai khác trình tự đoạn gen rbcL của loài Áo cộc với trình tự với trình tự gen của loài Liriodendron chinenes 45

Hình 3.7 - Cây phân loại dựa vào trình tự trên đoạn TrnH-psbA 46

Hình 3.8 - Sự sai khác trình tự đoạn gen TrnH-psbA của loài Áo cộc với trình tự với trình tự gen của loài Liriodendron chinenes 48

8

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 – Phân loại khoa học cây Áo cộc 11

Bảng 1.2 - Thông tin của một số mồi DNA barcode thiết kế cho hệ gen lục lạp 21

Bảng 2.1 - Thành phần đệm tách A 26

Bảng 2.2 - Thành phần đệm tách B 27

Bảng 2.3 - Thành phần đệm TE 27

Bảng 2.4 - Trình tự và thông tin của các cặp mồi được sử dụng 31

Bảng 2.5 - Thành phần của một phản ứng PCR 32

Bảng 3.1 - Một số loài có trình tự đoạn gen matK tương đồng với loài Áo cộc 37

Bảng 3.2 - Bảng so sánh khoảng cách di truyền của loài Áo cộc với các loài khác trên ngân hàng gen quốc tế NCBI của đoạn trình tự matK 38

Bảng 3.3 - Một số loài có trình tự gen rbcL tương đồng với loài Áo cộc 42

Bảng 3.4 - Bảng so sánh khoảng cách di truyền của loài Áo cộc với các loài khác trên ngân hàng gen quốc tế NCBI của đoạn trình tự rbcL 43

Bảng 3.5 – Một số loài có trình tự gen TrnH-psbA tương đồng với loài Áo cộc 46

Bảng 3.6 - Bảng so sánh khoảng cách di truyền của loài Áo cộc với các loài khác trên ngân hàng gen quốc tế NCBI của đoạn trình tự TrnH-psbA 47

Bảng 3.7 - Bảng so sánh khả năng phân biệt của các đoạn trình tự matK, rbcL, TrnH-psbA 49

9

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cây Áo Cộc (Liriodendron chinense) là loài bản địa Châu Á được miêu tả

khoa học lần đầu tiên năm 1903, được ghi trong sách đỏ Việt Nam (1996) với cấp đánh giá “bị đe dọa” (T), nhóm thực vật bị đe dọa VU A1c, d, B1+2b, e (sách đỏ Việt Nam , 2007), trong sách đỏ thế giới (IUCN) (2014) với trạng thái nguy cơ thấp/ gần bị đe dọa (Status: Lower Risk/near threatened ver 2.3)

Chi Liriodendron thuộc họ Magnoliaceae phát triển từ loại gốc Oligocene, phù hợp với khí hậu ấm áp Hiện có hai loài còn lại ở chi này, một là L.tulipifera phân bố ở phía đông Hoa Kỳ, còn lại là L.chinense (Áo cộc) nằm ở vùng núi có độ

cao 450 m đến 1800 m ở miền nam Trung Quốc và miền bắc Việt Nam Hình dáng

tổng thể của cây Áo cộc gọn gàng, là một trong số những cây có bóng mát lớn, lá

cây có hình dạng như những chiếc áo phông, trong mùa thu sắc lá chuyển từ vàng

sang xanh lá, hoa màu vàng có hình dạng giống như hoa tulip Áo cộc là một trong

mười sáu kiểu che phủ rừng, mức độ thống trị của loài này đã tạo ra sự khác biệt giữa các cộng đồng sinh thái [20], không những thế nó còn có giá trị như một nguồn mật hoa để sản xuất mật ong, một nguồn thực phẩm hoang dã, một loài cây cho bóng mát lớn tại các đồn điền đô thị [2] Gỗ của loài được sử dụng trong một loạt sản phẩm thiết yếu như: nội thất, pallet, khung xây dựng [5], [15] Ngoài ra, chiết xuất hóa học từ gỗ hoặc lá đã được chứng minh hữu ích có tác dụng chống khối u, chống đông máu cho các loài động vật ăn cỏ [11] và các alcaloid kháng khuẩn [1]

Tuy nhiên, Áo cộc đang bị đe dọa và đã được liệt kê trong danh sách các loài

thực vật có nguy cơ tuyệt chủng vì hiệu quả sinh sản thấp (Fu, Jin 1992, Wang và cộng sự, 2012), tỷ lệ nảy mầm của hạt thấp, điều này ảnh hưởng rất lớn tới việc nhân giống và phổ biến nhanh chóng của loài

10

Việc ứng dụng các gen mã vạch, xác định các đoạn DNA barcode là một phương pháp định danh, sử dụng một đoạn DNA chuẩn ngắn nằm trong bộ genome của sinh vật đang nghiên cứu để phục vụ giám định loài, mang lại hiệu quả cao trong thời gian ngắn, góp phần không nhỏ vào sự định danh và bảo tồn các loài thực vật trên thế giới Phương pháp xác định các đoạn DNA barcode cũng được áp dụng phổ biến cho các loài thực vật có giá trị kinh tế cao

Từ những lý do trên, tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu xác định các đoạn DNA barcode cho Loài Áo cộc (Liriodendron chinense) phục vụ giám định loài”

sẽ là căn cứ để phát triển giống, xây dựng dữ liệu gen góp phần quản lý tài nguyên thiên nhiên, bảo tồn nguồn gen quý của quốc gia

11

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN ĐỀ TÀI 1.1 Tổng quan về Áo cộc:

1.1.1 Phân loại khoa học:

Bảng 1.1 – Phân loại khoa học cây Áo cộc [28]

Giới (Regnum) Plantae

Họ (Familia) Magnoliaceae

Chi (Genus) Liriodendron

Loài (Species) Liriodendron chinense

1.1.2 Phân bố:

Loài này sinh sống tại miền bắc Việt Nam (Sa Pa, Lào Cai) trên các cao độ

từ 900 tới 1000 m, cũng như tại khu vực miền trung và nam Trung Quốc, ở các tỉnh và thành phố như An Huy, Trùng Khánh, Quảng Tây, Giang Tô, Phúc Kiến, Quý Châu, Hồ Bắc, Hồ Nam, Giang Tây, Thiểm Tây, Chiết Giang, Tứ

Xuyên và Vân Nam Nó tương tự như loài hoàng dương Bắc Mỹ, Liriodendron tulipifera, chỉ khác ở chỗ là cây cao lớn lớn hơn và các lá xẻ thùy sâu hơn, các lá đài trong ngắn hơn, thiếu các sắc tố vàng của L tulipifera Áo cộc có thể cao tới 40

m Nó không chịu rét tốt như loài châu Mỹ, nhưng vẫn được trồng tại Anh (nhiều tại Vườn Thực vật Hoàng gia Kew), Ireland, Bỉ, Hà Lan, Đức Tại Bắc Mỹ, nó mọc

xa về phía bắc tới tận Boston, Massachusetts tại miền đông,

và Vancouver, Canada ở phía tây Trong gieo trồng nó phát triển nhanh như hoàng dương Bắc Mỹ [28]

12

1.1.3 Đặc điểm sinh học:

Hình 1.1 – Hình thái cây Áo cộc

Cây thân gỗ với lá sớm rụng, cao tới 40 m, đường kính thân cây tới 1 m Cành màu xám tới nâu xám Cuống lá dài 4–8 cm; phiến lá có kích thước 4-12 × 3-9,5 cm; dạng màng tới dạng giấy; có phấn phía xa trục; gốc hơi cụt tới hơi hình tim

và với 1 thùy bên gần gốc của mỗi bên; đỉnh 2 thùy Hoa hình đấu Có 9 lá đài, với

3 lá đài ngoài màu xanh lục, cong và rủ xuống ra phía ngoài, các lá đài trong 2 vòng màu xanh lục với các vằn vàng, thẳng, giống cánh hoa, hình trứng ngược, lá đài dài khoảng 3–4 cm Chỉ nhị 5–6 mm; bao phấn 1-1,6 cm Bầu nhụy cao hơn các lá đài khi hoa nở bung ra; các lá noãn màu xanh lục ánh vàng Quả 7–9 cm; các hạt nhỏ khoảng 6 mm, có cánh, đỉnh tù hay nhọn, 1 tới 2 hạt Ra hoa tháng 5-7, kết quả tháng 9-10

13

Hình 1.2 – Hình thái lá cây Áo cộc

Hình 1.3 – Hình thái hoa cây Áo cộc

Hình 1.4 – Hình thái quả cây Áo cộc

14

1.1.4 Giá trị sử dụng:

Áo cộc là một trong mười sáu kiểu che phủ rừng, mức độ thống trị của

loài này đã tạo ra sự khác biệt giữa các cộng đồng sinh thái [20], không những thế nó còn có giá trị như một nguồn mật hoa để sản xuất mật ong, một nguồn thực phẩm hoang dã, một loài cây cho bóng mát lớn tại các đồn điền đô thị [2]

Gỗ của loài được sử dụng trong một loạt sản phẩm thiết yếu như: nội thất, pallet, khung xây dựng [5, 15] Ngoài ra, chiết xuất hóa học từ gỗ hoặc lá đã được chứng minh hữu ích có tác dụng chống khối u, chống đông máu cho các

loài động vật ăn cỏ [11] và các alcaloid kháng khuẩn [1] Vỏ cây Áo cộc có tác

dụng trừ bệnh phong thấp Lá cây có hình dạng lạ nên có thể trồng làm cây cảnh Ở Việt Nam, loài cây này nằm trong sách đỏ, số lượng còn rất ít Các nghiên cứu trong nước chủ yếu nghiên cứu về phân loại thực vật, đặc điểm sinh vật học

1.1.5 Một số đề tài nghiên cứu có liên quan đến loài cây Áo cộc đã trích dẫn khi

đánh giá tổng quan:

 Đề tài trong nước:

- Phan Quỳnh Giang Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học loài cây Áo cộc và cây đuôi ngựa làm cơ sở cho việc bảo tồn các loài thực vật quý hiếm tại khi bảo tồn thiên nhiên Phia Oắc – Phia Đen tỉnh Cao Bằng (2015) Đại học Thái Nguyên

 Đề tài ngoài nước:

- Chaw Chaw Sein Ralph Mitlöhner Ecology and silviculture in Vietnam, CIFOR Jl CIFOR, Situ Gede Bogor Barat 16115 Indonesia

- W J Beal Tulip Tree Liriodendron tulipifera Botanical Garden

- Dữ liệu liên quan tới Liriodendron chinense tại Wikispecies, Vườn thực vật hoàng gia Kew; Đại học Harvard; Australian Plant Name Index

1.2 Tổng quan về DNA barcode (DNA mã vạch):

1.2.1 Giới thiệu về mã vạch DNA barcode:

Từ giữa những năm 1990, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân

tử, một phương pháp nghiên cứu mới trong lĩnh vực phân loại học đã hình thành và được gọi là phương pháp phân loại học phân tử Phương pháp này dựa trên các dữ liệu thông tin về hệ gen (DNA) trong và ngoài nhân hoặc các sản phẩm của chúng (protein) Tùy mục đích hoặc đối tượng nghiên cứu, người ta

có thể lựa chọn các gen (đoạn DNA) khác nhau hoặc các sản phẩm khác nhau của hệ gen Trong phương pháp phân loại phân tử, các kỹ thuật thường được ứng dụng để nghiên cứu tính đa dạng sinh học, mối quan hệ tiến hóa giữa các loài, xây dựng cây phát sinh chủng loại cũng như giúp nhận dạng đến cấp phân loại loài hoặc chi [19]

Ở thực vật, một số phương pháp chỉ thị phân tử được sử dụng để nhận dạng loài cũng như sử dụng enzyme giới hạn kết hợp với lai DNA (RFLP), dấu vân tay DNA (DNA fingerprinting), phản ứng chuỗi trùng hợp PCR và đặc biệt việc sử dụng các kỹ thuật mã vạch DNA (DNA barcode) ngày càng trở nên phổ biến Các phương pháp này đều dựa trên thực tế rằng cấu trúc hóa học của DNA từ mọi loài là giống nhau và sự khác biệt duy nhất giữa chúng là trình tự các cặp base

16

Năm 2003, Paul Hebert, nhà nghiên cứu tại Đại học Guelph ở Ontario, Canada, đề xuất “mã vạch DNA” (DNA barcode) như là một cách để xác định loài [20] Mã vạch được sử dụng là một đoạn DNA ngắn từ một phần của hệ gen và được dùng giống như một máy quét ở siêu thị phân biệt được các sản phẩm bằng cách nhận diện các sọc màu đen đặc trưng của từng sản phẩm Trong công nghệ mã vạch, có thể hai mặt hàng trông rất giống nhau và không phân biệt được bằng mắt thường song qua mã vạch, máy quét có thể phân biệt được

DNA barcode là một trình tự nucleotide của một chuỗi DNA ngắn của một gen đã biết, trong đó có vùng ít bị thay đổi và vùng dễ thay đổi trong quá trình tiến hóa Dựa vào mức độ thay đổi trong trình tự DNA này để đánh giá sự sai khác di truyền giữa các sinh vật [21]

DNA barcode là một công cụ mới, rất có hiệu quả cho các nghiên cứu về phân loại, giám định sinh vật, gồm cả động vật, thực vật, vi sinh vật và virus Việc xác định loài bằng DNA mã vạch có hiệu quả cao trong việc phân biệt các loài sinh vật khi những quan sát hình thái, sinh trưởng và phát triển chưa đủ cơ

sở để định danh hoặc phân biệt loài

Việc giải mã toàn bộ hệ gen của sinh vật gặp nhiều khó khăn, tốn kém nhiều công sức và kinh phí nên không phải phòng thí nghiệm nào cũng có thể thực hiện được Vì vậy việc xác định một đoạn DNA đã biết, đặc trưng cho loài (thậm chí cá thể) để làm căn cứ phân biệt cá thể này với cá thể khác, loài này với loài khác DNA mã vạch được xem là một công cụ quan trọng trong phân tích, đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen, xác định nguồn gốc, xuất xứ của sinh vật, bản quyền các sản phẩm sinh học Vì vậy, hướng nghiên cứu DNA mã vạch đang được phát triển mạnh mẽ và được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau: nghiên cứu về đa dạng sinh vật, giám định loài, giám định mẫu

17

vật, xét nghiệm bệnh, bản quyền sản phẩm (giống cây trồng, vật nuôi, sản phẩm nông - lâm - thủy sản,…)

Việc sử dụng DNA barcode để nhận dạng các loài trên quy mô toàn cầu

có ý nghĩa ngày càng lớn Theo “Barcode of Life Data Systems”, năm 2011

đã lưu trữ được hơn 1.100.000 DNA barcode từ hơn 95.000 đối tượng sinh vật khác nhau Đã có hơn 180.000 trình tự DNA barcode của thực vật được lưu trữ trong Ngân hàng gen quốc tế và liên kết với hơn 2.000 bài báo khác nhau Để chuẩn hóa ở mức độ quốc tế về việc sử dụng DNA barcode, cộng đồng khoa học đã nỗ lực trong việc tìm kiếm các vùng trình tự DNA có thể làm mã vạch

có thể phân biệt đồng thời nhiều loài [4, 6, 7, 12]

Một DNA barcode điển hình phải đáp ứng được các yêu cầu sau:

- Có tính phổ biến cao để có thể thực hiện trên nhiều loài thực vật [10]

- Trình tự có tính đặc hiệu cao và có hiệu suất nhân bản cao [10]

- Có khả năng phân biệt đồng thời được nhiều loài [10]

Đến nay, có rất nhiều đoạn DNA được sử dụng làm DNA barcode, tùy thuộc nhóm sinh vật mà đoạn DNA được sử dụng làm mã vạch khác nhau

1.2.2 Một số DNA barcode được sử dụng:

1.2.2.1 Mã vạch DNA ở động vật:

Việc lựa chọn các vùng DNA barcode liên quan đến việc lựa chọn một hoặc một vài locus có thể thu được trình tự thường xuyên và đáng tin cậy trong bộ mẫu lớn và đa dạng, đưa ra dữ liệu so sánh một cách dễ dàng giúp phân biệt các loài với nhau, hay có thể nói đây là vùng thông tin di truyền có ý nghĩa thực sự có thể cung cấp thông tin nhận dạng: nó thường phải đủ dài để chứa đủ thông tin để có thể phân biệt giữa các loài nhưng đủ ngắn để thuận tiện cho phân tích Mã vạch DNA

Đặc biệt hệ gen của ty thể cũng được sử dụng trong việc lựa chọn các vùng

mã vạch DNA Do đó một số đoạn ngắn DNA ty thể (mtDNA) có thể được dùng

để phân biệt các loài Ngoài ra, DNA ty thể có nhiều bản sao hơn so với DNA nhân, vì vậy dễ phục hồi từ các mẫu vật, đặc biệt từ các mẫu với lượng nhỏ hoặc các mẫu đã bị xuống cấp

Ngoài locus gen CO1, các đoạn gen ty thể Cytb (cytochrome b), gen ribosome 12S, 16S cũng được dùng như mã vạch DNA trong nhận dạng ở động vật [17]

1.2.1.2 Mã vạch DNA ở thực vật:

Khác với ở động vật, ngoài bộ gen nhân và ty thể, thực vật còn có một bộ gen bổ sung là bộ gen lục lạp (cpDNA) DNA nhân, ty thể và lục lạp đều được sử dụng trong phân tích phát sinh loài Tùy vào mức độ phân tích mà mỗi vùng gen và mỗi phương pháp được áp dụng thích hợp Do tính phức tạp và lặp đi lặp lại, chỉ có

một số gen thuộc DNA hệ gen nhân như 18S, 26S, vùng ITS,… được sử dụng

Vùng 18S và 5,8S thường được sử dụng để xác định ở mức bộ hoặc họ, vùng 26S

thường được sử dụng để xác định ở mức dưới họ cho đến loài, vùng ITS và vùng

5S spacer thường được dùng để phân tích ở mức loài cho tới mức dưới loài [24]

Nếu như các gen ty thể như CO1 và Cytb được dùng rộng rãi cho động vật

và tảo thì khi chúng được áp dụng cho các loài thực vật trên cạn lại biểu hiện tính

nghiên cứu phát sinh loài thực vật trên cạn là ribosome ITS nhân (vùng đệm của

tiểu đơn vị lớn RNA ribosome), tuy nhiên vùng này không đạt hiệu quả cao ở một

số nhóm thực vật do các yếu tố khác liên quan đến các diễn biến tiến hóa phức tạp của các vùng lặp lại cao trong hệ gen nhân [16] Tính đến năm 2009, có khoảng 8 locus gen được sử dụng làm mã vạch DNA ở các loài thực vật, bao gồm cả hệ gen nhân và hệ gen lục lạp [25]

a Trình tự gen nhân:

Các trình tự barcode được nhân bản từ DNA hệ gen của bố mẹ dự kiến sẽ cung cấp nhiều hơn thông tin về các loài cần xác định Tuy nhiên khó khăn trong việc khuếch đại PCR từ gen nhân vì gen nhân chủ yếu là đơn gen hoặc có bản sao gen thấp, đặc biệt từ sự suy thoái và chất lượng DNA genome và khả năng phân biệt dưới loài do bảo toàn gen chức năng có thể chính là lý do tại sao hạn chế số lượng các gen nhân được thử nghiệm trong xác định loài bằng phương pháp DNA barcode [3, 16]

b Vùng gen mã hóa ribosome:

Gen rDNA là hệ thống đa gen mã hóa phần RNA của ribosome Các gen DNA ribosome (rDNA) mang trình tự vừa có tính bảo thủ vừa có tính đa dạng thích hợp để phân biệt các loài gần gũi Trong tế bào, rDNA được sắp xếp như các đơn vị được lặp lại ngẫu nhiên bao gồm DNA mã hóa ribosome 18S; 5,8S; 28S và

xen giữa các trình tự không mã hóa ITS1, ITS2 (internal transcribed spacers) nằm ở

20

hai bên sườn của vùng 5,8S Vùng mã hóa của ba gen rDNA được bảo tồn cao hơn

hai vùng ITS Nhìn chung các đơn vị rDNA được lặp lại hàng nghìn lần và được

sắp xếp tập trung tại vùng lớn trên nhiễm sắc thể Một trong những tính năng đáng chú ý nhất của rDNA là từng đơn vị trong hệ thống đa gen không tiến hoá độc lập, thay vào đó tất cả các đơn vị tiến hoá một cách phối hợp nhờ vậy mà rDNA đạt mức ổn định cao hơn trong loài nhưng khác biệt giữa các loài khác nhau

Hiện tại, nrITS vùng ITS của gen nhân được xem là một trong những công

cụ hữu ích nhất để đánh giá phát sinh loài ở cả thực vật và động vật vì nó phổ biến trong tự nhiên, kế thừa từ bố mẹ và biến đổi cao do ít hạn chế chức năng Một số nghiên cứu gần đây ở cây sinh sản hữu tính và cây sinh sản vô tính cho thấy một số

mức độ biến đổi số các bản sao của trình tự ITS1 và ITS2 do nhiều nguyên nhân

như lai gần, phân ly, tái tổ hợp, tỷ lệ đột biến cao và hình thành gen giả của các gen chức năng dẫn đến những thay đổi đó Trên cơ sở này nrDNA có thể được sử dụng

để phân định chính xác và hiệu quả thực vật trong cùng loài với đặc điểm lịch sử đời sống khác nhau (một năm, lâu năm, trên cạn, dưới nước) và nguồn gốc tiến hóa khác nhau [8,18]

c Trình tự gen lục lạp:

Hệ gen lục lạp của thực vật gồm phân tử DNA mạch vòng có kích thước 120

- 160 kb chia làm hai bản sao đơn là bản sao đơn lớn (large single - copy region)

và bản sao đơn nhỏ (small single - copy region) Hai bản sao được phân cách bởi hai chuỗi lặp lại đảo nhau (IRa và IRb) có độ dài trung bình 20 - 30 kb Hệ gen lục lạp chứa tất cả các gen rRNA (4 gen ở thực vật bậc cao), các gen tRNA (35 gen) và các gen khác mã hóa cho các protein tổng hợp trong lục lạp (khoảng 100 gen) cần thiết cho sự tồn tại của chúng

→

←

matK

matK 1F matK 1R matK 2F matK 2R

GAACTCGTCGGATGGAGTG GAGAAATCTTTTTCATTACTACAGTG CGTACTTTTATGTTTACAGGCTAA TAAACGATCCTCTCATTCACGA

AAGTGCATTGTTGGAACTGG ATGCAACGTCAAGCAGTTCC CCGTATGTGAAAAGAAGTATA GATCCCAGCATCACAATTCC

GTGGATACACTTCTTGATAATGG GGCAAAGAGGGAAGATTTCG TGAGAAAACATAAGTAAACGGGC CCATAAGCATATCTTGAGTTGG

GGATTATTAGTCACTCGTTGG ACTTTAGAGCATATATTAACTC ACTTACGTGCATCATTAACCA CCCAATACCATCATACTTAC

CGCGCATGGTGGATTCACAATCC GTTATGCATGAAAGTAATGCTC ACTGCCTTGATCCACTTGGC CGAAGCTCCATCTACAAATGG

CGAAATCGGTAGACGCTACG GGGGATAGAGGGACTTGAAC GGTTCAAGTCCCTCTTATCCC

→

←

→

trnL-f trnL-g trnL-h

ATTTGAACTGGTGACACGAG GGGCAATCCTGAGCCAA CCATTGAGTCTCTGCACCTATC

←

→

←

→: mồi xuôi; ←: mồi ngược

Hệ gen lục lạp có tính bảo thủ cao và mang tính đặc thù của từng loài do vậy việc sử dụng các kết quả phân tích hệ gen lục lạp vào nghiên cứu phát sinh loài và phân loại thực vật được các nhà khoa học rất quan tâm Dựa trên những thông tin

22

có sẵn từ các nghiên cứu về phát sinh loài và các nghiên cứu gần đây, một số locus

là đoạn gen hay các gen được chọn để nghiên cứu làm chỉ thị barcode tiềm năng cho các loài thực vật trên trái đất Có khoảng 20 gen lục lạp có độ dài phù hợp (khoảng 1 kb) được sử dụng trong nghiên cứu phát sinh loài Các gen này chứa đựng nhiều mức độ tiến hoá và vì vậy phù hợp cho nhiều mức độ phân loại [14, 16,18]

Các locus khác nhau đã được đề xuất về điều tra nhóm, mồi thích hợp cho các gen này được trình bày trong bảng 1.2

d Trình tự gen rbcL:

Trong các gen lạp thể, rbcL là trình tự gen đặc trưng nhất, mã hóa các tiểu

đơn vị lớn của rubilose - 1,5 - bisphosphate cacboxylase/ oxygenase (RUBISCO)

rbcL là gen đầu tiên được giải trình từ thực vật rbcL đã được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu phát sinh loài và phân loại thực vật với hơn 10.000 trình tự rbcL

có sẵn trong GenBank Do sự dễ dàng trong khuếch đại PCR ở một số nhóm thực

vật, CBOL gần đây đã công nhận rbcL là một trong những trình tự gen tiềm năng

nhất cho các nghiên cứu DNA barcode ở thực vật Tuy nhiên, do khả năng phân

biệt loài thấp, nên hầu hết các nhóm đều cho rằng nên sử dụng kết hợp rbcL với các với các chỉ thị barcode khác, ví dụ như matK là hai locus barcode chuẩn cho

thực vật [16, 17, 18]

e Trình tự gen matK:

Trong số các gen lục lạp, matK là một trong những gen tiến hoá nhanh nhất,

có kích thước khoảng 1550 bp và mã hóa cho Enzyme maturase liên quan đến quá

trình loại bỏ các intron loại 2 trong quá trình phiên mã RNA Do matK tiến hoá

nhanh và có mặt hầu hết trong thực vật nên đã được sử dụng như một chỉ thị trong nghiên cứu mối quan hệ giữa các loài và phát sinh loài ở thực vật CBOL đã thử

23

nghiệm matK trên gần 550 loài thực vật và thấy rằng 90% mẫu thực vật hạt kín dễ

dàng khuếch đại trình tự bằng cách sử dụng một cặp mồi đơn và đề nghị sử dụng

matK là một trong những locus barcode chuẩn cho thực vật [8]

f Trình tự gen rpoB và rpoC1:

Gen rpoB, rpoC1, rpoC2 mã hóa ba trong 4 tiểu đơn vị của RNA

polymerase lục lạp Khi nghiên cứu họ Dipterocarpaceae, Tsumura và đồng tác giả

(1996) đã nhận thấy gen rpoB là thích hợp để nghiên cứu phát sinh loài Hiện nay rpoB là gen được sử dụng nhiều trong nghiên cứu phát sinh loài và xác định các

loài vi khuẩn, đặc biệt là khi nghiên cứu các chủng có quan hệ gần gũi Cùng với

gen 16S rRNA, rpoB được sử dụng trong nhiều nghiên cứu để xác định loài vi

khuẩn mới, do vậy các gen này được đề xuất là chỉ thị barcode độc lập hoặc kết hợp với một số gen khác Trong các nghiên cứu gần đây, CBOL đã thử nghiệm 7

locus và thấy rằng khả năng phân biệt loài cuả đoạn gen rpoC1 là thấp nhất (43%) Mặc dù vậy, trong nghiên cứu Liu và đồng tác giả (2010) đã chỉ ra rpoC1 là một

chỉ thị rất hữu ích khi được sử dụng để phân biệt các loài bryophytes Do vậy cần

có các nghiên cứu tiếp theo để chứng minh sự phù hợp khi sử dụng rpoB và rpoC1

làm chỉ thị barcode trong các nghiên cứu giám định loài [8, 24]

g Trình tự gen ycf5:

Gen ycf5 mã hóa cho một protein có chứa 330 amino acids Gen này được

bảo tồn trên tất cả các vùng thực vật và đã được kiểm nghiệm cho phù hợp với DNA barcode của một vài nhóm Tuy nhiên, gen này chưa được công nhận và sử dụng nhiều trong vai trò của một DNA barcode [8, 9]

h Trình tự hai gen TrnH-psbA:

Gen TrnH-psbA có kích thước trung bình khoảng 450 bp, nhưng thay đổi từ

296 đến 1120 bp, TrnH-psbA được chứng minh là có khả năng xác định loài cao

24

Locus TrnH-psbA đã được khuếch đại thành công ở nhiều thực vật hạt kín và hạt trần Tuy nhiên, trong nhiều thực vật hạt kín TrnH-psbA lại có kích thước rất ngắn (~ 300 bp), kích thước của gen này thay đổi lớn do sự có mặt của gen rpS19 hoặc các gen giả nằm giữa cùng gen của hai gen TrnH và psbA Trong nhiều nghiên cứu gần đây đã đề xuất việc sử dụng TrnH-psbA như chỉ thị barcode độc lập cho thực vật hay kết hợp với matK CBOL thấy rằng khả năng phân biệt loài của TrnH- psbA là cao nhất (69%) trong số 7 locus được thử nghiệm và do đó đề nghị nó như

là chỉ thị barode bổ sung TrnH-psbA có thể sử dụng trong hệ thống barcode ba

locus khi hệ thống barcode hai locus không cung cấp đầy đủ khả năng phân tích [13, 16]

1.2.3 Ứng dụng của DNA barcode trên thực vật:

Mã vạch DNA thực vật được xem là một công cụ hữu hiệu trong việc nhận diện và phân chia ranh giới giữa các loài Đồng thời hỗ trợ quá trình nhận diện các mẫu vật không nhận biết được hoặc chưa xác định được thuộc loài nào Vì vậy, hướng nghiên cứu DNA mã vạch đang được phát triển mạnh mẽ và được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực liên quan đến việc thực hiện hoặc sử dụng nhận dạng thực vật như phân loại học, sinh thái học, bảo vệ môi trường, lâm nghiệp, nông nghiệp, hải quan, kiểm dịch và trong nhiều tình huống cần xác định “nhóm loài”

Sử dụng DNA barcode để nhận dạng các loài trên quy mô toàn cầu có ý

nghĩa ngày càng lớn Theo “Barcode of Life Data Systems”, năm 2011 đã lưu trữ

được hơn 1.100.000 DNA barcode từ hơn 95.000 đối tượng sinh vật khác nhau Đã

có hơn 180.000 trình tự DNA barcode của thực vật được lưu trữ trong Ngân hàng gen quốc tế và liên kết với hơn 2.000 bài báo khác nhau Để chuẩn hóa ở mức độ quốc tế và việc sử dụng DNA barcode, cộng đồng khoa học đã nỗ lực trong việc tìm kiếm các vùng trình tự DNA có thể làm mã vạch có thể phân biệt đồng thời

25

nhiều loài [22, 23, 27] Có khoảng 29.000 loài cây trồng được bảo hộ trong Công ước CITES, và việc phát triển các phương pháp hiệu quả để phân biệt loài nằm trong danh sách CITES với những loài không nằm trong danh sách CITES

DNA mã vạch được sử dụng để tăng cường sự hiểu biết các loài thực vật

có hạt, hoặc thông qua đó đóng góp đến sự khám phá các loài ẩn danh [9] Phương pháp tiếp cận mã vạch DNA cũng đã cung cấp các thông tin hữu ích về những bí

ẩn trong đa dạng loài của các nhóm thực vật Bryothytes (Rêu) [8] Ngoài ra, DNA

mã vạch còn được sử dụng để xác định các rễ cây, cây giống hoặc giai đoạn sống chưa rõ (ví dụ như cây Dương xỉ Gametophytes)

Nghiên cứu DNA mã vạch thực vật đã vượt xa nhiệm vụ so sánh các vùng DNA khác nhau để tiến tới những ứng dụng thực tế hơn Bằng cách so sánh mã vạch DNA ở một vài sinh vật khác với các mã vạch đã được biên soạn trong thư viện thông tin, có thể giúp nhận diện loài, xác định các loài mới hoặc các loài quý hiếm Các nhà khoa học đã có những nghiên cứu, ứng dụng đầy hứa hẹn, mở ra một triển vọng mới cho công tác đánh giá, phân loại, quản lý và bảo tồn đa dạng sinh học

26

CHƯƠNG II: MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU 2.1 Mục tiêu nghiên cứu:

- Phân lập được các đoạn gen matK, ITS2, rbcL, TrnH-psbA của loài cây Áo cộc (L.chinense)

2.2 Nội dung nghiên cứu:

- Tách chiết, tinh sạch DNA tổng số từ mẫu lá cây Áo cộc

- Nhân bản các đoạn gen matK, ITS2, rbcL, TrnH-psbA

- Xác định và phân tích trình tự nucleotide của đoạn gen

- Xác định mối quan hệ di truyền của cây Áo cộc

2.3 Vật liệu, hóa chất, các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu:

2.3.1 Vật liệu nghiên cứu:

- Lá của cây Áo cộc

1 2%(w/v) CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide) 2,0g

27

- Đệm tách B (EBB- Extraction Buffer B): pha 100ml

Bảng 2.2 - Thành phần đệm tách B (100ml)

 Các hóa chất khác:

 20% SDS (sodium doecyl sulphate)

 5M CH3COOK (bảo quản ở -20OC)

 Mồi (F-Primer, R-Primer)

 Bộ hóa chất PCR: 2X PCR Master Mix Solution và hóa chất sử dụng trong điện di RedSafe

 Hoá chất chạy điện di: