Những nghiên cứu về cây Xá xị ở Việt Nam trong những năm qua thường là những nghiên cứu về bảo tồn và khai thác Nguyễn Xuân Dũng, 1995 và Vũ Văn Thông, 2017, nhân giống và gây trồng cây
TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
Tổng quan về tinh dầu và phương pháp xác định thành phần hóa học
Tinh dầu là hỗn hợp nhiều thành phần thu được qua phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước, do đó nó không tan hoặc kém tan trong nước Mỗi loại tinh dầu từ các loài thực vật khác nhau có số lượng và hàm lượng thành phần xác định, dẫn đến các hằng số vật lý như tỷ trọng, chiết suất, độ quang cực, cùng với các chỉ số hóa học như chỉ số axit, ancol, cacbonyl và este cũng được xác định Do đó, các hằng số vật lý và chỉ số hóa học của tinh dầu là cơ sở để nhận biết và đánh giá chất lượng của chúng.
Tinh dầu là chất lỏng thơm, dễ bay hơi, được chiết xuất từ nguyên liệu thực vật và có hương vị mạnh mẽ, dễ chịu Chúng được sử dụng rộng rãi trong thực phẩm, mỹ phẩm và dược phẩm như chất tạo hương vị và chất bảo quản an toàn Đối với cam quýt, tinh dầu được chiết xuất từ vỏ chanh qua phương pháp chưng cất hơi nước, trong đó khí bay lên trải qua các biến đổi sinh hóa để trở thành tinh dầu Tinh dầu là tinh chất của cây, bao gồm các phân tử dễ bay hơi và không chứa chất béo tự nhiên, và được ứng dụng trong thực phẩm, thuốc và mỹ phẩm.
Tinh dầu là hỗn hợp phức tạp gồm nhiều thành phần hóa học hoạt tính sinh học như tecpen, tecpenoit và phenylpropenes Chúng được chiết xuất từ hơn 17.000 loài thực vật có mùi thơm, chủ yếu thuộc các họ hạt kín như họ Hoa môi và họ Zingiberaceae.
Tsegaye F.E (2020) cho rằng tinh dầu, hay còn gọi là "tinh chất", là những chất dễ bay hơi có mùi, được chiết xuất từ thực vật thông qua quá trình chưng cất hơi nước hoặc đồng chưng cất với dung môi Tinh dầu tập trung ở các cơ quan khác nhau của cây thơm, bao gồm hoa (như hoa nhài), lá (như cây xô thơm), quả (như cam), hạt (như thì là), vỏ cây (như quế) và rễ (như bạch chỉ).
Lê Ngọc Thạch (2003) định nghĩa tinh dầu là hỗn hợp các chất hữu cơ có mùi đặc trưng, thường ở thể lỏng và có khối lượng riêng d < 1 Một số tinh dầu như quế và đinh hương có khối lượng riêng d > 1, không tan trong nước hoặc chỉ tan rất ít, nhưng lại hòa tan tốt trong các dung môi hữu cơ như ancol, ete và chất béo.
Tinh dầu phân làm 2 loại chính:
Tinh dầu nguyên chất là loại tinh dầu chưa pha chế, được chiết xuất 100% từ thực vật thiên nhiên Chúng thường an toàn và có thể ăn uống, trừ một số loại tinh dầu từ dược thảo không ăn được Các tinh dầu chiết xuất từ thảo dược ăn được như cam, chanh, quế, bạc hà, gừng, sả, tiêu thì có thể sử dụng khi ở dạng tinh khiết Nếu không, các loại tinh dầu này có thể không đảm bảo tính nguyên chất từ thiên nhiên.
Tinh dầu không nguyên chất là loại tinh dầu được pha trộn với các hóa chất khác hoặc chiết xuất từ thực vật nhưng chưa đạt tiêu chuẩn tinh khiết hoàn toàn Theo Văn Ngọc Hướng (2005), loại tinh dầu này vẫn giữ được hương thơm đặc trưng nhưng không đảm bảo chất lượng tối ưu.
Tinh dầu là chất lỏng có nhiệt độ sôi không ổn định, có thể đạt đến 320 °C Chúng có chỉ số chiết suất từ 1,378 đến 1,5850 và tỷ trọng thường dao động quanh giá trị 1.
Tinh dầu có điểm nóng chảy không vượt quá 160 °C nếu ở dạng rắn Chúng không tan hoặc tan kém trong nước, nhưng lại hòa tan tốt trong các dung môi như cồn 99,5%, diethyl ether, benzen và ethyl acetate.
1.1.2 Đặc tính kháng khuẩn của tinh dầu
Tinh dầu có nhiều công dụng như kích thích thần kinh, sát trùng, kháng viêm và kháng khuẩn mạnh, nên đã được con người sử dụng trong đời sống hàng ngày và các ngành công nghiệp như dược phẩm, chế biến thực phẩm và hóa mỹ phẩm Trong ngành thực phẩm, tinh dầu không chỉ được dùng làm gia vị mà còn để bảo quản thực phẩm và chế rượu mùi Nhiều loại thực vật chứa tinh dầu được sử dụng làm gia vị, và một số loại tinh dầu còn có khả năng diệt khuẩn, giúp kéo dài thời gian bảo quản thực phẩm.
Trong y dược, tinh dầu và các nguyên liệu chứa tinh dầu được sử dụng làm thuốc chữa bệnh, như tinh dầu chứa azulen trong Ngải cứu có tính kháng khuẩn mạnh Nhiều loại tinh dầu như Long não, Thông, và Quế được dùng trong xoa bóp và chống viêm Tinh dầu Bạc hà, Hồi, Bạch đàn, và Khuynh diệp hỗ trợ điều trị bệnh đường hô hấp và tiêu hóa Ngoài ra, các nguyên liệu chứa tinh dầu còn được áp dụng trong đông y để làm thuốc, xông hơi, và nấu nước tắm.
Hoạt tính sinh học của tinh dầu từ các loài cây thực phẩm, gỗ quý và những cây được ưa chuộng đang thu hút sự chú ý của nhiều nghiên cứu Một số hoạt tính của tinh dầu đã được kiểm nghiệm và đánh giá.
Khả năng kháng vi sinh vật:
Nghiên cứu của Nguyễn Thị Hoàng Lan và cộng sự (2015) cho thấy tinh dầu lá Tía tô có khả năng kháng khuẩn mạnh mẽ, đặc biệt là đối với vi khuẩn gram dương Tinh dầu nguyên chất đã ức chế hoàn toàn 4 chủng vi khuẩn gram dương, bao gồm Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, và Streptococcus feaium, trong khi chỉ ức chế một chủng vi khuẩn gram âm là Pseudomonas fluorescens.
Liêu Thùy Linh và cộng sự (2017) đã “Khảo sát ảnh hưởng của tinh dầu Quế,
Nghiên cứu về tác dụng của Sả chanh, Húng quế, Bạc hà đối với Saccharomyces cerevisiae và Aspergillus niger cho thấy cả bốn loại tinh dầu đều có khả năng kháng nấm, với đường kính vòng kháng nấm từ 5,33±0,58 đến 59,33±3,06mm Hỗn hợp tinh dầu Quế - Sả chanh cho hiệu quả tốt nhất, nhưng vẫn thấp hơn so với tinh dầu Quế đơn lẻ Trong khảo sát ức chế sự phát triển hệ sợi nấm, các nồng độ 50ppm và 100ppm đã ảnh hưởng đến sự phát triển của A niger L2; đặc biệt, tinh dầu Quế, Sả chanh và hỗn hợp của chúng với các tinh dầu khác (ở nồng độ 100 ppm) đã hoàn toàn ức chế sự phát triển hệ sợi Hỗn hợp Húng quế - Bạc hà cũng cho thấy hiệu quả ức chế sự phát triển hệ sợi nấm tốt hơn so với khi sử dụng riêng lẻ từng loại tinh dầu.
Khả năng chống oxy hóa:
Nguyễn Ngọc Yến và cộng sự (2019) đã tiến hành khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính kháng oxy hóa của tinh dầu cây Hương thảo (Rosmarinus officinalis L.) Kết quả nghiên cứu cho thấy điều kiện trích ly tối ưu tinh dầu đạt hiệu suất 2,93%, với 22 chất hóa học được xác định, trong đó α-Pinene chiếm 26,13%, Eucalyptol 19,41%, và cis-verbenone 17,34% Tinh dầu hương thảo thể hiện khả năng kháng oxy hóa cao với giá trị IC50 là 75,7 µg/mL.
1.1.3 Phương pháp xác định thành phần của tinh dầu a) Phương pháp phân tách thành phần hóa học
Tổng quan về cây Xá xị
1.2.1 Giới thiệu về cây Xá xị
Xá xị có tên hoa học: Cinnamomum parthenoxylon (Jack) Meisn
Tên đồng nghĩa: Laurus parthenoxylon Jack, 1820; Laurus porrecte Roxb
1832; Sassafras parthenoxylon (Jack) Nees, 1836; Cinnamomum simondii Lecomte,
1913; Cinnamomum porrectum (Roxb.) Kosterm 1952 (Phùng Văn Phê, 2012); Camphora parthenoxylon (Jack) Nees 1831; Camphora porrecta (Roxb.) Voigt 1845;
Cinnamomum pseudosassafras Meisn 1864; Cinnamomum inunctum (Nees) Meisn
Tên khác: Re dầu, Re hương, Co chấu
+ Trên thế giới: Trung Quốc, Ấn Độ, Indonexia (Phạm Quốc Hùng, 2010)
Xá xị được phân bố chủ yếu ở các tỉnh phía Bắc và Bắc Trung Bộ của Việt Nam, bao gồm Cao Bằng, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Bắc Cạn, Tuyên Quang, Vĩnh Phúc, Thái Nguyên, Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Bình, Quảng Trị và Thừa Thiên Huế.
Quảng Nam, Lâm Đồng, Đồng Nai, Bình Phước, Bình Thuận (Phùng Văn Phê,
Xá xị là cây gỗ với các đặc điểm đặc trưng như sau:
- Kích thước trung bình hoặc lớn; thân hình trụ thẳng, đôi khi có bạnh gốc
- Vỏ ngoài màu nâu, nâu xám đến nâu đậm, thường nứt dọc và bong ra từng mảng; thịt vỏ có màu nâu đỏ nhạt
- Cành non tròn, thon, có cạnh, màu lục xám
Lá đơn nguyên mọc cách, có phiến lá hình trứng hoặc hình bầu dục thuôn với kích thước từ 5-15 x 2,5-8 cm Đầu lá nhọn và ngắn, gốc lá hình nêm hoặc nêm rộng, hai mặt lá nhẵn Gân bên có từ 3-8 đôi, và cuống lá dài từ 1,2-3 cm (Phạm Quốc Hùng, 2010).
Cụm hoa của cây có dạng chùy hoặc tán, thường mọc ở đầu cành hoặc nách lá, mỗi cụm chứa khoảng 10 hoa Hoa lưỡng tính với bao hoa có 6 thùy, màu trắng vàng Cây có 9 nhị, trong đó bao phấn có 4 ô và chỉ nhị có lông Đặc biệt, 3 nhị ở vòng trong có 2 tuyến mật, trong khi có 3 nhị lép (Phùng Văn Phê, 2012).
- Quả ha ̣ch hình cầu 8-10mm, có đế phình mâ ̣p, khi chín màu tím đen (Trần Hợp, 2002)
Hình 1 Hình ảnh thân lá cành của cây Xá xị
Cây xá xị sinh trưởng tự nhiên trong rừng mưa nhiệt đới thường xanh, ở độ cao từ 300 đến 900m Loài cây này ưa sống trên đất dày, phì nhiêu, tơi xốp, ẩm ướt và thoát nước tốt, thường phát triển ở những khu vực khuất gió Khi trưởng thành, cây ưa sáng nhưng có thể chịu bóng khi còn non, và sinh trưởng tốt trong rừng có mật độ trung bình Xá xị có khả năng tái sinh bằng hạt hoặc chồi, với khả năng tái sinh chồi mạnh mẽ Mùa hoa của cây diễn ra từ tháng 3 đến tháng 5, trong khi quả chín vào tháng 8 đến tháng 10.
Xá xị có khả năng phát triển trên nhiều loại đất khác nhau, tuy nhiên, sự phát triển và hình thái của cây có thể bị ảnh hưởng bởi loại đất Cụ thể, trên đất bazan, vỏ cây thường có màu nâu đỏ hoặc nâu vàng, trong khi trên đất sét, đất thoái hóa và đất axit, vỏ cây lại có màu đỏ vàng.
Theo tác giả Kha L.D., (2004) điều kiện khí hậu phù hợp cho sự phát triển của
+ Lượng mưa trung bình hàng năm: 1500 – 2300 mm
+ Mùa mưa (≥ 100 mm / tháng): 6 – 7 tháng
+ Nhiệt độ trung bình hàng năm: 21,5 – 23,0°C
+ Nhiệt độ cao nhất trung bình lúc nóng nhất tháng: 32 – 33°C
+ Nhiệt độ thấp nhất trung bình của tháng lạnh nhất: 10 – 14°C
Theo JIAC (1996), Xá xị ở Việt Nam phát triển tốt trong khí hậu nhiệt đới ẩm - gió mùa, với lượng mưa hàng năm từ 800–2.500 mm Loài này phân bố rộng rãi trong các vùng sinh thái, phát triển nhanh trên đất sâu, nhiều cát và thoát nước tốt, với độ che phủ rừng trung bình Xá xị có khả năng tái sinh mạnh mẽ từ hạt hoặc từ thân, đặc biệt phát triển nhanh ở độ tuổi 15 - 25 Khi còn nhỏ, cây ưa bóng râm nhẹ, nhưng khi trưởng thành lại ưa sáng.
1.2.4 Thành phần và giá trị của tinh dầu Xá xị
Tinh dầu Xá xị có giá trị thương mại rất lớn trên thị trường Quốc tế (Kumar và Kumari (2019) - bảng 1)
Bảng 1 Thành phần và Giá trị y học của cây Xá xị
Bộ phận Thành phần hợp chất Hoạt tính sinh học
Vỏ rễ Acid béo: Myristic acid; palmitic acid; pentadecanoic acid;
Hydrocarbons: Alloaromadendrene; guaiazulene; ccadinene; d-cadinene; ⍺- copaene
Terpinenes: Cadalene; caryophyllene oxide; germacrene-D; spathulenol; valencene; viridiflorol; bbisabolene; b- elemene; b-selinene; d-cadinol (torreyol);
⍺-cadinol, ⍺-humulene và ⍺-muurolene có nhiều tác dụng tích cực như viêm, hạ huyết áp, kháng khuẩn, chất chống oxy hóa, kháng tyrosinase, chống đông máu và bảo vệ gan Chúng cũng có khả năng hoạt hóa glycosidase, hỗ trợ điều trị các vấn đề như vô kinh, đau lưng, tuần hoàn máu kém, kiết lỵ, khó tiêu, bất lực, ho gà, sốt, thấp khớp, viêm thấp khớp, đau dạ dày và chấn thương Ngoài ra, các hợp chất này còn giúp tăng cường sức khỏe sau sinh.
Fatty acid: Myristic acid; palmitic acid; pentadecanoic acid
Terpinenes: 1,8-Cineole; borneol; bicyclogermacrene; camphene; camphor; caryophyllene oxide; linalool; myrcene; terpinen-4-ol; terpinolene; b- caryophyllene; b-cymene; b-phellandrene; b-pinene; ⍺-farnesene; ⍺- humulene;
(3R, 4R, 3R, 4R)-6, 6’-Dimethoxy-3, 4, 3’, 4’-tetrahydro 2H, 2’H-[3, 3’] bichromenyl-4, 4’-diol; 1,2,4- trihydroxybenzene;
⍺-Lrhamnoside; quercetin-3-O-⍺-L- rhamnoside; bsitosterol, methyl eugenol, b-sitosterol và stigmast-4-en-3-one
Flavonoid rutinosides: Scopoletin, isorhoifolin, epicatechin, blumenol A, 4- hydroxybenzoic acid, rutin, hexadecanoic acid methyl ester, nicoflorin
Aldehyde: Benzaldehyde Terpinenes:1,8-Cineole; borneol; camphene; caryophyllene oxide; linalool; myrcene; terpinen-4-ol; terpinolene; b- caryophyllene; b-cymene; bphellandrene; b-pinene; c-terpinene; ⍺-humulene;
1.2.5 Bảo tồn và phát triển loài cây Xá xị
Nghiên cứu về Xá xị tại Việt Nam đã bắt đầu từ năm 1996 và chủ yếu tập trung vào giá trị bảo tồn cũng như nhân giống loài này.
Cây Re hương (Cinnamomum parthenoxylon) là một loài cây quý, đa tác dụng
Gỗ Re hương được sử dụng trong xây dựng, làm tà vẹt và đóng đồ, trong khi tinh dầu từ cây này có tác dụng xoa bóp, chữa thấp khớp và đau nhức, đồng thời được ứng dụng rộng rãi trong công nghệ hóa mỹ phẩm, thực phẩm và dược phẩm Tinh dầu Xá xị, chưng cất từ các bộ phận của cây như lá, cành, gốc và rễ, trước đây có giá 2 chỉ vàng/lít tại lò chưng cất Mặc dù Nhà nước đã cấm khai thác, nhưng cây này vẫn đang bị khai thác một cách tận diệt.
Loài cây Re hương, với giá trị kinh tế cao, đang bị khai thác kiệt quệ, dẫn đến sự cần thiết phải bảo tồn Số lượng cây tái sinh tự nhiên rất ít, và loài này đã được ghi nhận trong Nghị định 32/2006/NĐ-CP thuộc nhóm IIA, hạn chế khai thác vì mục đích thương mại Theo Sách Đỏ Việt Nam, Re hương được phân hạng cực kỳ nguy cấp CR A1a, c, d Mặc dù phân bố rộng rãi, nhưng việc khai thác mạnh mẽ để cung cấp tinh dầu Xá xị đã làm giảm số lượng cây trưởng thành, gây khó khăn trong việc thu hái giống gieo ươm cho trồng rừng và bảo tồn Để bảo tồn và phát triển loài Re hương, các nghiên cứu đã được thực hiện nhằm tìm ra giải pháp hiệu quả.
Kỹ thuật nhân giống cây Re hương (Cinnamomum parthenoxylon) đã được nghiên cứu tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam Huỳnh Văn Kéo (2007) đã chỉ ra rằng chất điều hòa sinh trưởng IBA (indol butyric acid) có ảnh hưởng tích cực đến khả năng ra rễ trong giâm hom cây.
Việc bảo tồn và phát triển nguồn gen loài Re hương tại vườn quốc gia Bạch Mã đóng vai trò quan trọng trong việc khuyến khích người dân trồng cây phân tán, tập trung ở vùng đệm Nghiên cứu này không chỉ cải thiện cơ cấu cây trồng bản địa mà còn gia tăng sự đa dạng của các loài cây trồng đa mục đích, góp phần vào phát triển kinh tế xã hội và xóa đói giảm nghèo Điều này phù hợp với chương trình phát triển kinh tế vùng đệm của các vườn quốc gia và khu bảo tồn ở Việt Nam, nơi có điều kiện sinh thái thuận lợi cho sự phát triển của loài Re hương (Huỳnh Văn Kéo, 2007).
Tình hình nghiên cứu tinh dầu Cinnamomum ở Việt Nam và trên thế giới
Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã xác định thành phần hóa học và khả năng kháng khuẩn, kháng nấm của tinh dầu chiết xuất từ một số loài thực vật Tinh dầu Xá xị và loài Cinnamomum đang được các nhà nghiên cứu phân tích để tìm hiểu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học, từ đó ứng dụng trong thực phẩm và y dược Loài Cinnamomum bao gồm nhiều cây quý hiếm, thường được người dân bản địa sử dụng trong cuộc sống hàng ngày.
Một số nghiên cứu về xác định thành phần hóa học và khả năng kháng khuẩn của tinh dầu Cinnamomum như:
Palanuvej và cộng sự (2006) đã nghiên cứu thành phần hóa học và khả năng kháng lại nấm Candida albicans của tinh dầu từ lá cây Cinnamomum porrectum
Loài (Roxb.) Kosterm chứa khoảng 1,1% tinh dầu theo trọng lượng tươi Phân tích tinh dầu bằng GC/MS và quang phổ NMR proton cho thấy safrole là hợp chất chính, chiếm 99,8% Ngoài ra, tinh dầu này cũng có hoạt tính kháng nấm Candida albicans với MIC là 0,063%.
Nghiên cứu của Phongpaichit S và cộng sự (2006) đã chỉ ra rằng tinh dầu từ rễ Cinnamomum porrectum (Roxb.) Kosterm có khả năng kháng khuẩn mạnh mẽ, đặc biệt là đối với vi khuẩn Streptococcus mutans với MIC 0,01 mg/ml Tinh dầu này cũng cho thấy hiệu quả kháng nấm đối với Candida albicans và Dermatophytes (0,5-1,0 mg/ml), cùng với khả năng ức chế vi khuẩn Bacillus subtilis (2 mg/ml) và Staphylococcus aureus nhạy cảm (4-16 mg/ml) Tuy nhiên, tác động của tinh dầu đối với nấm Cryptococcus neoformans là vừa phải (MIC 16-64 mg/ml) và không có khả năng kháng lại vi khuẩn P aeruginosa.
Giang P.M và cộng sự (2006) đã nghiên cứu thành phần hóa học từ vỏ cây Gù hương (Cinnamomum illicioides A Chev) tại Việt Nam Qua phương pháp GC/MS, nghiên cứu xác định được 17 monoterpenoit, trong đó eugenol chiếm tỷ lệ 25 - 41,2% tổng số chất trong tinh dầu, cùng với 36 sesquiterpenoit, chiếm 27,9% Các thành phần chính bao gồm terpinen-4-ol (10,4%), eugenol (41,2%) và δ-cadinene (5,6%).
Nghiên cứu của Bin S và cộng sự (2007) đã chỉ ra rằng tinh dầu Thanh quế (Cinnamomum burmannii) có khả năng kháng khuẩn đáng kể đối với năm loại vi khuẩn gây bệnh phổ biến trong thực phẩm, bao gồm Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Escherichia coli và Salmonella anatum Nồng độ MIC và MBC của tinh dầu này đã được xác định, cho thấy hiệu quả kháng khuẩn mạnh mẽ Phân tích thành phần tinh dầu bằng phương pháp sắc ký khí - khối phổ (GC-MS) và sắc ký lỏng (LC-MS) cho thấy sự hiện diện của (E)-cinnamaldehyde và các polyphenol như proanthocyanidins và (epi) catechin, trong đó (E)-cinnamaldehyde và proanthocyanidins đóng góp quan trọng vào hoạt tính kháng khuẩn Sử dụng kính hiển vi điện tử quét, nghiên cứu cũng đã quan sát được những thay đổi hình thái của vi khuẩn khi tiếp xúc với tinh dầu và các thành phần riêng lẻ Kết quả cho thấy tinh dầu Thanh quế và các hoạt chất sinh học của nó có tiềm năng ứng dụng làm chất bảo quản thực phẩm tự nhiên.
Uthairatsamee1 S and colleagues (2012) investigated the antioxidant and antibacterial activities of hexane, dichloromethane, and methanol extracts from the leaves, bark, wood, and roots of Cinnamomum porrectum (Roxb.) Kosterm in Bangkok, Thailand The results indicated that the methanol extract from the bark and roots exhibited significant antioxidant properties Additionally, the antibacterial activity of the essential oil was tested against five harmful bacteria: Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Shigella flexneri, and Vibrio parahaemolyticus The study found that the methanol extract from the bark of Cinnamomum porrectum effectively inhibited B cereus, S aureus, S flexneri, and V parahaemolyticus, with minimum inhibitory concentrations (MIC) identified.
Nghiên cứu của Li Z.W và cộng sự (2014) cho thấy tinh dầu từ lá Cinnamomum longepaniculatum có khả năng kháng ba chủng vi khuẩn: Staphylococcus aureus, Escherichia coli và Salmonella enteritidis Các thành phần chính của tinh dầu bao gồm 1,8-cineole, α-terpineol, terpinene-4-alcohol, safrole và γ-terpinene, trong đó 1,8-cineole có khả năng kháng lại S aureus và E coli với nồng độ MIC và MBC nằm trong khoảng 0,781 àl/ml đến 6,25 àl/ml Mặc dù γ-terpinene có giá trị MIC cao hơn 50 àl/ml đối với E coli và S aureus, nhưng lại có giá trị MIC và MBC thấp hơn với S enteritidis là 3,125 àl/ml α-terpineol được xác định là có hoạt tính kháng khuẩn tốt nhất, và tác giả cho rằng cơ chế kháng khuẩn của 1,8-cineole đối với E coli và S aureus có thể liên quan đến tính kỵ nước của chúng.
Nghiên cứu của Charles S.V và cộng sự (2014) đã chỉ ra thành phần hóa học và khả năng kháng khuẩn của sáu loài Cinnamomum tại Borneo, bao gồm C crassinervium Miq., C racemosum Kosterm, C cuspidatum Miq., và C politum Miq.
C javanicum Blume và Cinnamomum sp Tác giả đã xác định được hàm lượng và thành phần tinh dầu từ vỏ cây của 6 loài bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước và GC - MS cho thấy tinh dầu của 6 loài Cinnamomum đều chứa hàm lượng cao các monoterpen oxy hóa: Eucalyptol (1,2~31,1%), terpinen-4-ol (7,9 ~ 22,1%), eugenol (0,4 ~ 37,9%) và α-cadinol(0,4 ~ 1,8%) Đặc biệt, tinh dầu C crassinervium và C cuspidatum ức chế đáng kể vi khuẩn Listeria monocytogenes và nồng độ MBC của tinh dầu này trên Listeria monocytogenes thấp hơn đối với Staphylococcus aereus
In a study conducted by Farah H.S et al (2017), the antibacterial activity of essential oil extracted from the entire Xá xị plant was evaluated against six Gram-positive strains (Streptococcus pyogenes, Staphylococcus epidermidis, Bacillus thuringiensis, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis) and eight Gram-negative strains (Vibrio parahaemolyticus, Serratia marcescens, Shigella sonnei, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, Salmonella typhimurium) The results indicated that the essential oil exhibited antibacterial activity only against two strains: P aeruginosa (8.7 ± 0.565 mm) and S sonnei (8 ± 0.141 mm) among the 14 tested strains.
Wei X và cộng sự (2017) đã phân tích thành phần dịch chiết ethanol của lá Xá xị (Cinnamomum parthenoxylon (Jack) Meisn.) tại Trung Quốc cho thấy thành phần dịch chiết chứa 8 chất thường có mặt trong chi Cinnamomum bao gồm: f (3R, 4R, 30
40 -diol (1), 4-hydroxybenzaldehyde (2), 1,2,4- trihydroxybenzene (3), kaempferol-3- O-a-L-rhamnoside (4), herbacetin (5), quercetin-3- O-a-L-rhamnoside (6), daucosterol (7) và b-sitosterol (8)
Sukcharoen O và cộng sự (2017) đã nghiên cứu khả năng kiểm soát sự phát triển của các chủng nấm mốc aflatoxigenic, cụ thể là Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus, bằng tinh dầu Cinnamomum porrectum Tinh dầu được chiết xuất qua hệ thống chưng cất Clevenger trong 3 giờ, và thành phần của nó được xác định bằng phương pháp sắc ký khí - khối phổ, cho thấy các hợp chất chính bao gồm safrole (93,9%), elemicine (4,3%) và methyl eugenol (1,7%) Kết quả cho thấy rằng tinh dầu Cinnamomum porrectum với nồng độ trên 200ppm có khả năng ức chế sự phát triển của sợi nấm, quá trình hình thành bào tử và khả năng sinh aflatoxin B1.
1.3.2 Ở Việt Nam Ở Việt Nam những nghiên cứu về tinh dầu đang được rất nhiều nhà nghiên cứu quan tâm đến nhằm phục vụ cho việc khai thác tinh dầu, sản xuất, bảo vệ giống loài quý hiếm có giá trị cao, đồng thời nâng cao nhận thức bảo tồn nguồn gen quý hiếm phục vụ nghiên cứu khoa học, giảng dạy, đào tạo và phát triển sản xuất trong tương lai
Trong những năm gần đây, nghiên cứu về thành phần hóa học của tinh dầu và khả năng kháng vi sinh vật đã được thực hiện thông qua các phương pháp như GC-MS, xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC), nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC), nồng độ ức chế thành phần (FIC) và khả năng chống oxy hóa bằng phương pháp DPPH.
Ngô Quốc Luân và cộng sự (2006) đã nghiên cứu thành phần hóa học của tinh dầu và flavonoid trong cây Cỏ Lào tại tỉnh Phú Yên Sử dụng phương pháp sắc ký khí và sắc ký khí ghép khối phổ, nhóm tác giả đã cô lập được hợp chất chalcone Odoratin và flavonol 3,3’, 5-trihydroxy-4’, 7-dimethoxyflavone từ dịch chiết ethyl acetate Kết quả thử nghiệm cho thấy các flavonol này có hoạt tính kháng khuẩn đối với P aeruginosa, A niger và F oxyporum.
MỤC TIÊU NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Mục tiêu nghiên cứu
Xác định được hàm lượng, thành phần và hoạt tính kháng vi sinh vật của tinh dầu Xá xị thu thập từ một số tỉnh miền bắc Việt Nam.
Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu xác định hàm lượng tinh dầu của các cây Xá xị thu thu thập từ một số tỉnh miền bắc Việt Nam
- Xác định thành phần hóa học trong tinh dầu Xá xị.
- Xác định hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của tinh dầu Xá xị.
Vật liệu và môi trường nuôi cấy
- Đối tượng: Các mẫu lá, cành, vỏ của cây Xá xị khác nhau thu thập được từ các tỉnh miền bắc Việt Nam năm 2020
- Vật liệu nghiên cứu: Các mẫu lá, cành, vỏ thân cây Xá xị tươi được nghiền nhỏ đến kích thước từ 1-2mm
Các chủng vi khuẩn và nấm được thu thập từ bộ môn Công nghệ Vi sinh – Hóa sinh, thuộc Viện Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp, Đại học Lâm Nghiệp.
+ Chủng vi khuẩn gram âm: Pseudomonas aeruginosa,
+ Chủng vi khuẩn gram dương: Staphylococus aureus,
+ Chủng nấm mốc: Aspergillus brasiliensis
Bảng 2.1 Môi trường nuôi cấy SDA cho chủng nấm
Bảng 2.2 Môi trường nuôi cấy LB cho các chủng vi khuẩn:
Địa điểm thực tập
Phòng thí nghiệm bộ môn Công nghệ Vi sinh – Hóa sinh, Viện công nghệ sinh học, Trường đại học Lâm Nghiệp.
Phương pháp nghiên cứu
2.5.1 Tách chiết thu tinh dầu Xá xị
Thu thập mẫu từ cây Xá xị bao gồm thân, lá và vỏ cây, được thực hiện vào buổi sáng trong điều kiện thời tiết khô ráo Các mẫu thu hái được bảo quản trong túi zip có gắn nhãn rõ ràng với thông tin như số hiệu cây, loại mẫu và thời gian thu hái, sau đó được vận chuyển về phòng thí nghiệm.
Phương pháp tách chiết tinh dầu sử dụng thiết bị chưng cất Duran (Đức) bằng cách gia nhiệt mẫu nguyên liệu/nước cho đến khi hỗn hợp sôi Hơi nước sinh ra sẽ kéo theo tinh dầu lên, sau đó hỗn hợp hơi lỏng được làm nguội và ngưng tụ Để thu hồi tinh dầu, cần bổ sung muối khan Na2SO4 với hàm lượng 5% khối lượng/thể tích tinh dầu.
Hình 2.1 Các mẫu lá, cành và vỏ thân tươi thu thập tại Thanh Hóa
Các phương pháp thu thập mẫu và tách chiết được áp dụng trong nghiên cứu “Khai thác và phát triển nguồn gen cây Xá xị ở một số tỉnh Miền Bắc” của GS Hoàng Văn Sâm Mỗi thí nghiệm chưng cất sử dụng 100 g mẫu, với nước làm dung môi Mẫu tươi được nghiền nhỏ dưới 2mm và chưng cất trong 4 giờ, với tỷ lệ nguyên liệu: nước là 1:30 g/ml cho lá và 1:6 g/ml cho cành, vỏ thân Thí nghiệm được thực hiện với 3 lần lặp lại.
Hàm lượng tinh dầu (d>1) được tính theo công thức
X (%, v/w) Trong đó: a: thể tích của tinh dầu và xylen (ml) b: khối lượng của mẫu đã trừ độ ẩm (g) c: thể tích xylen cho vào trước khi định lượng (ml)
Bảng 2.3 Công thức tách chiết tinh dầu Xá xị
Loại mẫu Lá (NL/DM %) Thân (NL/DM %) Vỏ thân (NL/DM %)
Hình 2.2 Các mẫu lá, cành và vỏ thân tươi được nghiền nhỏ
(A: cành, B: vỏ thân và C: lá)
2.5.2 Xác định thành phần hóa học có trong tinh dầu
Thành phần hóa học của tinh dầu Xá xị đã được phân tích bằng phương pháp sắc ký khí nối ghép khối phổ (GS-MS) và detector ion hóa ngọn lửa Thí nghiệm được thực hiện tại Phòng phân tích hóa học thuộc Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Phương pháp GS-MS được tiến hành trên máy GC789A-MS 5975C của Agilent Technologies với điều kiện nhiệt độ cột là 60 độ.
170 o C, tốc độ tăng nhiệt 4 o C/phút, nhiệt độ buồng bơm mẫu ở 180 o C và detector (FID) 230 o C, khí mang là heli tốc độ 1,0 ml/phút; tốc độ chia dòng 1
2.5.3 Xác định hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu bằng phương pháp đo đường kính vòng kháng khuẩn
Mẫu tinh dầu từ lá, cành và vỏ thân thu thập tại Vĩnh Phúc và Thanh Hóa năm
Tinh dầu nguyên chất năm 2020 là kết quả nghiên cứu từ mẫu tinh dầu năm 2019, được cung cấp bởi nhóm nghiên cứu “Khai thác và phát triển nguồn gen cây Xá xị” tại một số tỉnh miền Bắc.
Xác định hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu:
- Chuẩn bị dịch vi khuẩn:
Cấy ria tạo khuẩn lạc trên môi trường LB agar, vi khuẩn được nuôi cấy trong đĩa petri và bảo quản lạnh Sau đó, tiến hành nuôi cấy trong môi trường lỏng bằng cách chọn 1 - 2 khuẩn lạc từ mỗi chủng và đưa vào ống nghiệm khác nhau (1 chủng/ống) chứa 5ml môi trường LB lỏng đã khử trùng Việc nuôi cấy lỏng được thực hiện ở nhiệt độ 30°C với tốc độ lắc 150 vòng/phút trong 24 giờ.
Mật độ vi khuẩn được xác định bằng phương pháp cấy trang trên môi trường LB đặc với các độ pha loãng khác nhau và đo mật độ quang (OD) ở bước sóng 600nm Giá trị trung bình OD600nm của mỗi chủng được sử dụng để tính toán mật độ vi khuẩn (Li Z.W., 2014).
- Xác định hoạt tính kháng khuẩn:
Khả năng kháng khuẩn của tinh dầu Xá xị được xác định thông qua phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch Cụ thể, 100 µL dịch vi khuẩn - nấm kiểm định (mật độ tế bào 10^6 CFU/ml) được nhỏ lên đĩa petri chứa môi trường LB agar và trải đều Sau đó, khoan lỗ thạch trên đĩa và cho 100 µL tinh dầu Xá xị vào các giếng thạch Đĩa được ủ ở 4 °C trong 2 giờ để cho hoạt chất kháng khuẩn khuếch tán vào môi trường, sau đó tiếp tục ủ ở 37 °C trong 24 giờ (Nguyễn Thị Hoàng Lan, 2015).
+ Đường kính kháng khuẩn được xác định theo công thức: D - d (mm), trong đó D: đường kính vòng kháng khuẩn (mm), d: đường kính lỗ khoan (mm)
+ Đối chứng được sử dụng là nước cất đã hấp khử trùng ở nhiệt độ cao
- Phương pháp xử lý số liệu: Số liệu thu thập được xử lý bằng phần mềm Excel 2010, các thí nghiệm được lặp lại 3 lần
- Thí nghiệm được bố trí như bảng 2.4 và 2.5
Bảng 2.4 Hoạt tính kháng nấm của tinh dầu Xá xị
Chủng nấm Nguồn tinh dầu
Vi khuẩn gram âm Đường kính vòng kháng D - d (mm)
Bảng 2.5 Hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu Xá xị
Vi khuẩn gram âm Đường kính vòng kháng D - d (mm)
