Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng nhân thể chồi của loài lan Phi Điệp 5 cánh trắng mắt nai 5CT1 .... Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa
TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
Tổng quan về chi Lan Hoàng thảo (Dendrobium)
Chi Lan Hoàng thảo (Dendrobium) là một trong những chi lan lớn nhất, chỉ đứng sau lan lọng, với khoảng 1400 loài phân bố chủ yếu ở Đông Nam Á, Châu Á và Châu Úc Sự đa dạng về cấu trúc sinh học và hình thái của lan Hoàng thảo đã dẫn đến việc các nhà khoa học phân chia chúng thành 40 nhóm nhỏ để thuận tiện cho nghiên cứu và nuôi trồng.
- Nhóm thứ nhất có đặc điểm: lá xanh quanh năm, hoa thường mọc ở gần ngọn có nhiều màu sắc sặc sỡ như: Dendrobium bigibbum, Dendrobium phalaenopsis…
Nhóm thứ hai có đặc điểm nổi bật với các giả hành buông thõng, bao quanh là nhiều lá xanh ở hai bên Hoa của nhóm này thường mọc thành từng chùm hoặc từng bông riêng lẻ, điển hình như các loài Dendrobium anosmum và Dendrobium aphyllum.
- Nhóm thứ ba có đặc điểm: hoa mọc ở đỉnh, buông thõng xuống và có mùi thơm như: Dendrobium farmeri, Dendrobium chrysotoxum…
- Nhóm thứ tư có đặc điểm là chùm hoa mọc thẳng đứng, màu xanh hoặc màu vàng như: Dendrobium atroviolaceum, Dendrobium spetabile…
- Nhóm thứ năm có đặc điểm: giả hành mọc thẳng đứng có một lớp lông bao phủ như: Dendrobium draconis, Dendrobium formosum…
Bên cạnh đó, có thể căn cứ vào đặc điểm sinh trưởng và dạng thân, lan
Dendrobium được chia thành 2 nhóm chính:
Nhóm thân mềm có đặc trưng với các giả hành buông lỏng hoặc rủ xuống, thường xuất hiện ở những vùng khí hậu lạnh Các giống này chủ yếu được tìm thấy ở các cao nguyên tại Việt Nam, Miến Điện và thường phát triển ở độ cao trên 1000 m.
Nhóm thân cứng của Dendrobium thường mọc thẳng đứng ở các vùng khí hậu nóng như Malaysia và Indonesia Bên cạnh đó, có một nhóm Dendrobium trung gian có khả năng sinh sống ở cả vùng nóng và lạnh, ví dụ như Dendrobium primulimun và Dendrobium farmeri.
Giới thiệu về loài lan Phi điệp (Dendrobium anosmum Lindl.(1845))
Danh pháp: Dendrobium anosmum Lindl (1845)
Lan Phi điệp là loại lan sống phụ, với thân dài từ 1-2m và lá mỏng xếp thành hai hàng dọc Các giả hành thường rụng hết lá, mỗi mắt thường có một hoa, đôi khi là 2-3 hoa tạo thành chuỗi dài Hoa có kích thước từ 6-8cm, màu hồng tím với hai vết tím than đẹp trên môi hồng, được gọi là lưỡng điểm hạt Hoa thường nở đồng loạt, tạo nên vẻ đẹp ấn tượng.
Mười hương thơm này có thể kéo dài từ 5 đến 7 ngày trước khi tàn Chúng có khả năng được thúc đẩy hoặc hãm lại để nở đúng dịp Tết Trong chu kỳ sinh trưởng, các loài này cần trải qua giai đoạn khô cạn để ra hoa đồng loạt (Trần Hợp, 1998; Nguyễn Thị Hồng Huế, 2016).
Lan Phi điệp có nguồn gốc từ các quốc gia như Philippines, Malaysia, Lào và Việt Nam Cây phát triển từ Bắc vào Nam Trung Bộ, đặc biệt là ở Tây Nguyên, và được phân bố rộng rãi từ Sri Lanka, Ấn Độ, Myanmar, Lào, Thái Lan, Indonesia cho đến Papua New Guinea (Trần Hợp, 1998).
1.2.3 Các điề u ki ện cơ bản để nuôi tr ồng Lan Phi Đ i ệ p Ánh sáng: Lan cần nhiều ánh sáng gần như có thể để ở ngoài trời nhưng cần phải có lưới che phòng khi lá non bị cháy nắng Khi thấy cây quặt quẹo, đó là dấu hiệu thiếu nắng, nếu thiếu nắng cây khó ra hoa
Lan cần được nuôi trong nhiệt độ từ 8 - 25°C, có khả năng chịu nóng lên tới 38°C và lạnh xuống tới 3,3°C Trong mùa đông, nếu nhiệt độ dưới 15,6°C kéo dài từ 4 - 6 tuần, lan sẽ gặp khó khăn trong việc ra nụ Độ ẩm lý tưởng cho lan là từ 60 - 70%, giúp cây phát triển mạnh mẽ.
Cây non sẽ không phát triển tốt và có nguy cơ teo lại nếu chiều cao quá thấp Ngoài ra, cây cũng cần có không gian thoáng gió để phát triển mạnh mẽ; trong giai đoạn ra nụ, nếu không có gió, số lượng nụ sẽ giảm đi.
Giá thể là yếu tố quan trọng trong việc trồng lan, mặc dù một số loài có thể sinh trưởng tốt mà không cần giá thể Tuy nhiên, việc sử dụng giá thể sẽ mang lại lợi ích hơn cho sự phát triển của cây Các loại giá thể thường dễ kiếm và có sẵn trong tự nhiên, nhưng không phải ở đâu cũng giống nhau Việc lựa chọn giá thể phụ thuộc vào điều kiện môi trường, nhân lực, loài lan và quy mô sản xuất Những loại giá thể phổ biến bao gồm vỏ thông, xơ dừa và rêu.
Vào mùa hè, khi lan phát triển mạnh, cần tưới nước 2 - 3 lần mỗi tuần Sang mùa thu, khi cây ngừng tăng trưởng, chỉ cần tưới 1 lần mỗi tuần để tránh cho thân cây bị teo Mùa đông là thời gian lan chuẩn bị ra hoa, do đó ngưng tưới nước hoàn toàn Nếu độ ẩm quá thấp, nên phun sương 1 - 2 lần mỗi tháng.
Tổng quan về Phi điệp năm cánh trắng mắt nai
Phi điệp năm cánh trắng mắt nai là một trong những loại hoa phi điệp được ưa chuộng hiện nay nhờ sắc đẹp nổi bật Hoa có năm cánh trắng tinh khiết, môi và mắt hồng, mang lại vẻ đẹp thu hút Thời gian chơi hoa có thể kéo dài từ 10 đến 15 ngày, và trong điều kiện thuận lợi, có thể lên tới 20 ngày.
Phi điệp năm cánh trắng mắt nai là loại cây có thân thòng, nhỏ với đốt dài và lá mọc so le Lá cây có màu xanh đậm hoặc xanh vàng tùy thuộc vào mức độ ánh sáng, với các vết khuyết chéo ở đầu lá Cuối năm, cây ngừng phát triển và rụng lá từ gốc lên ngọn, nhưng vẫn hút nước qua rễ để chuẩn bị cho mùa hoa năm sau Vào mùa đông, rễ cây phát triển chậm hoặc ngừng lại Hoa của cây mọc dày ở các mắt thân, dài khoảng 2-5 cm, tùy thuộc vào kích thước cây Mùa hoa thường diễn ra vào tháng 5 - 6 Phi điệp năm cánh trắng mắt nai có khả năng chịu nóng và lạnh tốt, thích hợp với nhiều vùng miền.
Hình 1.1 Hoa cây Phi điệp năm cánh trắ ng m ắ t nai
Một số nghiên cứu về nhân giống in vitro lan Dendrobium
Phong lan là một trong những loại cây trồng thành công nhất trong nhân giống vô tính qua nuôi cấy mô tế bào Nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới và tại Việt Nam đã được thực hiện để nhân nhanh các giống lan, nhằm bảo tồn và tăng số lượng phục vụ sản xuất Kỹ thuật nhân giống đã góp phần tạo ra sự phát triển vượt bậc cho nghề trồng lan ở quy mô lớn.
1.4.1 Tình hình nghiên c ứ u trên th ế gi ớ i
Vào tháng 8/2010, Maridass và cộng sự đã thực hiện nhân giống in vitro phong lan Dendrobium nanum từ thân rễ Vật liệu này được xử lý bằng nước cất, ethanol 70%, và khử trùng với hyponatri 3% có thêm Tween80 EAC Sau khi rửa sạch, thân rễ được cắt thành miếng nhỏ 5 mm và cấy trên môi trường MS bổ sung NAA, BAP và kinetin Kết quả cho thấy protocorm phát triển tốt nhất trên môi trường MS + kinetin 1,2μM + NAA 2.0μM, và sau đó phát sinh chồi hiệu quả nhất trên môi trường MS + BAP 0,5μM.
Năm 2011, Sana A và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu nhân nhanh chồi giống lan Dendrobium nobile var Emma từ chồi nách, sử dụng môi trường có
Nghiên cứu cho thấy, trong môi trường có chứa BAP 1,5 mg/l kết hợp với kinetin, tỷ lệ nhân chồi đạt cao nhất Đối với việc tạo cây hoàn chỉnh, môi trường chứa IBA 2 mg/l mang lại hiệu quả tốt nhất với tỷ lệ tạo rễ đạt 97,5%, số lượng rễ là 4,70 và chiều dài cây đạt 3,47 cm, vượt trội hơn so với NAA Ngược lại, nồng độ cao hơn của IBA và NAA (3,0 mg/l) cho thấy khả năng hình thành rễ kém.
Bijaya P và Deepa T (2012) khi nghiên cứu nhân nhanh giống
Dendrobium primulinum Lindl đã nhận thấy: Thông qua việc nuôi cấy các đỉnh chồi có kích thước từ 0,3 đến 0,5 mm trên môi trường MS cơ bản và môi trường
Môi trường MS bổ sung NAA và BAP với các nồng độ khác nhau đã giúp hình thành protocorm, tạo ra chồi và rễ Sau 5 tuần nuôi cấy, số lượng chồi phát triển nhanh nhất trên môi trường MS + BAP 1,5 mg/l + NAA 0,5 mg/l Trong thí nghiệm tạo rễ, rễ được quan sát sau 3 tuần cấy trên môi trường MS + IAA 0,5 mg/l, cho thấy cây lan phát triển rễ tốt nhất Khi chuyển cây ra giá thể đất sạch và rêu (dớn) theo tỷ lệ 2:1, gần 70% cây con sống sót.
1.4.2 Tình hình nghiên c ứ u t ạ i Vi ệ t Nam
Phong lan Việt Nam sở hữu sự đa dạng về chi và loài, trở thành một trong những họ cây có giá trị tài nguyên và kinh tế hàng đầu Trong những năm gần đây, Việt Nam đã tiến hành nhiều nghiên cứu về nhân giống phong lan, đặc biệt là các loài lan có giá trị cao.
Bùi Thị Tường Thu và cộng sự (2007) đã nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến quá trình phát sinh phôi và tế bào ở lan Dendrobium Kết quả cho thấy mẫu nuôi cấy ban đầu là chồi non, được cắt thành lát mỏng và nuôi cấy trên môi trường VW kết hợp với sucrose 20 g/l và nước dừa.
Trong thí nghiệm, môi trường nuôi cấy bao gồm 100 ml/l nước, 1 g/l peptone, 1 mg/l BA, 0,3 mg/l NAA và 1 g/l AC Sau 30 ngày nuôi cấy, tế bào soma phát sinh trên vết cắt với tỷ lệ tạo soma đạt 100% ở tất cả các mẫu Tế bào soma có màu trắng sáng và được nhân sinh khối trên 6 môi trường thực nghiệm Kết quả cho thấy tế bào soma tăng sinh mạnh mẽ nhất trên môi trường VW kết hợp với 1 mg/l BA, 0,3 mg/l NAA và 100 ml/l nước dừa.
Nguyễn Thanh Tùng và cộng sự (2010) đã áp dụng phương pháp nuôi cấy
Nghiên cứu về nhân giống in vitro cây Hoàng thảo thân gãy (Dendrobium aduncum) đã sử dụng 16 lát mỏng tế bào Vật liệu khởi đầu là chồi in vitro được cắt lát mỏng theo chiều ngang Kết quả cho thấy mẫu cảm ứng tốt trên môi trường MS + BA 0,5 mg/l và sinh trưởng tốt trên môi trường MS + kinetin.
3 mg/l + NAA 0,3 mg/l Từ protocorm tỷ lệ chồi đạt được 5,67 chồi/mẫu [8]
Nghiên cứu nhân nhanh in vitro giống lan Hoàng thảo phi điệp tím
Nghiên cứu của Nguyễn Thị Mỹ Duyên tại trường Đại học An Giang (2010) đã xác định môi trường tối ưu cho sự nảy mầm và phát triển protocorm của hạt Dendrobium anosmum Lindl là MS + 1,0 mg/l NAA và MS + 1 mg/l BA + 0,2 mg/l NAA Chồi lan Dendrobium anosmum Lindl phát triển mạnh mẽ trên môi trường MS + BA 2 mg/l Trong giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh, chồi lan Hoàng thảo phi điệp tím cho rễ phát triển tốt nhất trên môi trường MS + 1 mg/l NAA.
Nghiên cứu của Nguyễn Văn Song (2011) về nhân nhanh in vitro giống lan Kim điệp (Dendrobium chrysotoxum) đã xác định môi trường tối ưu cho việc nảy mầm và phát sinh protocorm từ hạt, bao gồm MS + 20 g/l saccharose + 8 g/l agar.
150 ml/l nước dừa + 2,0 mg/l v Môi trường nhân nhanh protocorm tốt nhất là
Môi trường MS kết hợp với 20 g/l saccharose, 8 g/l agar, 150 ml/l nước dừa và 2,0 mg/l BAP là điều kiện tối ưu cho việc tái sinh chồi từ protocorm và sự phát triển của chồi in vitro Đối với sự ra rễ của chồi in vitro, môi trường MS với 20 g/l saccharose, 8 g/l agar, 150 ml/l nước dừa và 1,0 mg/l NAA là lựa chọn thích hợp nhất.
Nghiên cứu nhân nhanh in vitro giống lan Hoàng thảo Long nhãn
Theo nghiên cứu của Nguyễn Thị Sơn (2011), môi trường tối ưu cho sự nảy mầm và phát sinh protocorm của hạt Dendrobium fibriatum là MS kết hợp với 10 g/l saccharose, 6 g/l agar và 100 ml/l nước dừa Để nhân nhanh protocorm, môi trường Knud với 10 g/l saccharose, 6 g/l agar, 100 ml/l nước dừa và 60 g/l khoai tây là lựa chọn tốt nhất Đối với việc nhân nhanh chồi in vitro, môi trường MS với 20 g/l saccharose, 6 g/l agar, 100 ml/l nước dừa và 60 g/l chuối chín được khuyến nghị Cuối cùng, môi trường RE với 10 g/l saccharose, 1 g/l than hoạt tính và 6 g/l agar là thích hợp để tạo ra cây hoàn chỉnh.
Dựa vào các kết đã đạt được của một số nghiên cứu về giống lan Phi điệp
Nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng vẫn còn nhiều hạn chế cần được khắc phục trong quy trình nhân giống lan Phi điệp, bao gồm thời gian khử trùng mẫu tạo mẫu sạch in vitro, tìm kiếm môi trường nuôi cấy phù hợp cho việc nhân nhanh thể chồi và chồi, cũng như môi trường ra rễ để tạo ra cây hoàn chỉnh Do đó, cần thiết phải xác định thời gian khử trùng tối ưu nhằm tạo ra mẫu sạch và nâng cao khả năng tái sinh, từ đó cải thiện hiệu quả của quy trình nhân giống Đồng thời, việc theo dõi và đánh giá khả năng sinh trưởng của cây lan Phi điệp là rất quan trọng, vì sản phẩm cuối cùng mà chúng ta thu nhận và sử dụng là cây lan giống.
Chưa có nghiên cứu nào được công bố trong và ngoài nước về việc nhân giống lan Phi điệp năm cánh trắng mắt nai bằng phương pháp nuôi cấy mô.
Tổng quan về DNA barcode
DNA barcode là trình tự nucleotide ngắn của một gen đã biết, bao gồm vùng ít thay đổi và vùng dễ thay đổi trong tiến hóa Mức độ thay đổi trong trình tự DNA này giúp đánh giá sự khác biệt di truyền giữa các sinh vật Hiện nay, DNA barcode là công cụ hiệu quả cho nghiên cứu phân loại và giám định sinh vật, bao gồm động vật, thực vật, vi sinh vật và virus Xác định loài bằng DNA mã vạch cũng là công cụ quan trọng trong phân tích đa dạng di truyền, xác định nguồn gốc và xuất xứ của sinh vật, cũng như bản quyền các sản phẩm sinh học.
Việc sử dụng DNA barcode để nhận dạng các loài trên toàn cầu ngày càng trở nên quan trọng Tính đến năm 2011, hệ thống Barcode of Life Data đã lưu trữ hơn 1.100.000 DNA barcode từ hơn 95.000 loài sinh vật khác nhau Trong đó, hơn 180.000 trình tự DNA barcode của thực vật đã được lưu trữ trong Ngân hàng gen quốc tế, liên kết với hơn 2.000 bài báo Để chuẩn hóa việc sử dụng DNA barcode trên quy mô quốc tế, cộng đồng khoa học đã nỗ lực tìm kiếm các vùng trình tự DNA có khả năng phân biệt nhiều loài cùng lúc.
Từ giữa những năm 1990, sự phát triển của sinh học phân tử đã dẫn đến sự hình thành phương pháp phân loại học phân tử, dựa trên dữ liệu gen (DNA) và sản phẩm của chúng (protein) Phương pháp này cho phép lựa chọn các gen hoặc sản phẩm khác nhau tùy theo mục đích nghiên cứu Trong phân loại phân tử, các kỹ thuật như RFLP, DNA fingerprinting, PCR và DNA-barcode được sử dụng để nghiên cứu đa dạng sinh học, mối quan hệ tiến hóa và nhận dạng loài Các phương pháp này dựa trên sự khác biệt trong trình tự các cặp base của DNA giữa các loài tương tự.
Vào năm 2003, Paul Hebert, một nhà nghiên cứu tại đại học Guelph ở Canada, đã giới thiệu phương pháp xác định loài dựa trên DNA-barcode DNA-barcode là một chuỗi nucleotide ngắn của ADN có nguồn gốc tổ tiên chung, bao gồm cả vùng bảo tồn ít thay đổi và vùng biến đổi theo tiến hóa.
Việc lựa chọn vùng trình tự DNA-barcode cần đảm bảo các đặc điểm sau: độ dài phù hợp để có sự đa dạng giữa các taxon, không quá ngắn hoặc quá dài; không phải là vùng dị hợp để có thể nhân bản trực tiếp mà không cần tách dòng; thuận lợi cho việc so sánh trình tự dựa trên vị trí khác biệt của các base; và không chứa đoạn trình tự chưa chắc chắn, như các đoạn lặp microsatellite, để duy trì chất lượng trình tự.
Dựa vào sự thay đổi trong trình tự ADN, chúng ta có thể đánh giá sự khác biệt di truyền giữa các sinh vật Hai mẫu vật của hai loài có thể có hình thái bên ngoài tương tự, nhưng có thể được phân biệt thông qua phân tích DNA.
DNA-barcode có hai mục đích chính: nhận dạng phân tử cho các loài đã được mô tả và phát hiện các loài mới chưa được mô tả.
DNA-barcode là công cụ hiệu quả cho nghiên cứu phân loại và giám định sinh vật, bao gồm động vật, thực vật, nấm, vi sinh vật và virus Phương pháp này giúp xác định loài một cách chính xác, đặc biệt khi các quan sát về hình thái và sinh trưởng không đủ để phân biệt các loài.
Việc áp dụng DNA-barcode để xác định các loài trên toàn cầu ngày càng trở nên quan trọng Sau hơn 10 năm nghiên cứu, đã có nhiều tiến bộ đáng kể trong lĩnh vực này.
Theo số liệu từ BOLD, đã có 6000 công trình khoa học được công bố, với khoảng 5 triệu trình tự ADN mã vạch ở các loài sinh vật Để đạt được tiêu chuẩn quốc tế trong việc sử dụng DNA-barcode, cộng đồng khoa học đang nỗ lực tìm kiếm các vùng trình tự ADN có khả năng phân biệt nhiều loài cùng một lúc.
Một DNA-barcode điển hình phải đáp ứng được các yêu cầu sau:
- Có tính phổ biến cao (dễ dàng nhân bản và giải trình tự)
- Trình tự có tính đặc hiệu cao
- Có khả năng phân biệt đồng thời được nhiều loài [26]
Mỗi đoạn mã vạch DNA có đặc trưng riêng, giúp phân biệt sinh vật ở các mức độ như chi, họ, loài hay dưới loài Các đoạn DNA-barcode có thể thuộc hệ gen nhân (như 18S, 5.8S, 26S, ITS), hệ gen ty thể (Cytb, CO1) và hệ gen lục lạp (matK, rbcL, trnH - psbA) Hiện tại, chưa có đoạn ADN nào được công nhận là mã vạch chung cho tất cả các loài sinh vật; do đó, việc lựa chọn và phối hợp các đoạn DNA-barcode đặc trưng sẽ mang lại hiệu quả cao hơn Tùy thuộc vào đối tượng giám định, các đoạn DNA-barcode sẽ được sử dụng một cách hợp lý.
1.5.2 M ộ t s ố locus đượ c s ử d ụ ng làm ch ỉ th ị DNA-barcode ở th ự c v ậ t a) Trình tự gen nhân
Các trình tự mã vạch được nhân bản từ ADN hệ gen của bố mẹ dự kiến sẽ
Việc xác định các loài thông qua DNA-barcode gặp khó khăn do gen nhân thường là đơn gen hoặc có số lượng bản sao thấp Điều này đặc biệt đúng khi ADN hệ gen bị suy thoái và chất lượng kém trong quá trình tách chiết Sự bảo tồn gen chức năng cũng có thể là nguyên nhân hạn chế số lượng gen nhân được thử nghiệm Bên cạnh đó, vùng gen mã hóa ribosome cũng đóng vai trò quan trọng trong việc cung cấp thông tin về các loài cần xác định.
Gen rDNA là hệ thống đa gen mã hóa ARN ribosome, với các gen DNA ribosome mang trình tự bảo thủ và đa dạng, giúp phân biệt các loài gần gũi Trong tế bào, rDNA được sắp xếp thành các đơn vị lặp lại ngẫu nhiên, bao gồm DNA mã hóa ribosome 18S, 5,8S, 28S và các trình tự không mã hóa ITS1, ITS2 nằm ở hai bên vùng 5,8S Vùng mã hóa của ba gen rDNA có độ bảo tồn cao hơn hai vùng ITS Các đơn vị rDNA lặp lại hàng nghìn lần và tập trung tại vùng lớn trên nhiễm sắc thể Một đặc điểm nổi bật của rDNA là các đơn vị trong hệ thống đa gen không tiến hóa độc lập, mà tiến hóa phối hợp, giúp rDNA đạt mức ổn định cao trong loài nhưng vẫn khác biệt giữa các loài.
Hiện nay, nrITS vùng ITS của gen nhân được coi là công cụ quan trọng trong việc đánh giá sự phát sinh loài ở thực vật và động vật Công cụ này phổ biến trong tự nhiên, có khả năng di truyền từ bố mẹ và cho thấy sự biến đổi cao do ít bị hạn chế về chức năng.
Nghiên cứu gần đây cho thấy sự biến đổi số lượng bản sao của trình tự ITS1 và ITS2 ở cây sinh sản hữu tính và vô tính có thể do nhiều nguyên nhân như lai gần, phân ly, tái tổ hợp, tỷ lệ đột biến cao và hình thành gen giả Dựa trên điều này, nrDNA có thể được sử dụng để phân định chính xác và hiệu quả các loài thực vật có đặc điểm lịch sử sống khác nhau, bao gồm cây một năm, lâu năm, trên cạn và dưới nước, cũng như nguồn gốc tiến hóa khác nhau.
Hệ gen lục lạp của thực vật gồm phân tử ADN mạch vòng có kích thước
MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Mục tiêu nghiên cứu
Xác định các chỉ thị DNA-bardoce và phát triển kỹ thuật nhân giống cho loài lan Phi điệp năm cánh trắng mắt nai thông qua phương pháp nuôi cấy mô.
- Xác định được 03 trình tự DNA-barcode cho loài lan Phi điệp năm cánh trắng mắt nai
- Xây dựng được 01 kỹ thuật nhân giống cho loài lan Phi điệp năm cánh trắng mắt nai.
Đối tượng, phạm vi và nội dung nghiên cứu
Loài lan Phi điệp năm cánh trắng mắt nai (Dendrobium anosmum)
- Phạm vi về nội dung
+ Sử dụng các chỉ thị DNA - barcode: ycf1b, trnH-psbA, rbcL
Sử dụng quả lan chín sinh lý từ cây lan Phi điệp năm cánh trắng mắt nai, được chọn lọc từ cây mẹ trồng tại vườn lan Bắc Việt - Thạch Thất - Hà Nội, làm vật liệu cho mẫu nhân giống in vitro.
- Phạm vi về không gian
Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng nuôi cấy mô tế bào thực vật thuộc Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm nghiệp.
Quả lan chín sinh lý được chọn từ cây lan Phi điệp năm cánh trắng mắt nai khỏe mạnh, mập mạp và không bị sâu bệnh là vật liệu lý tưởng để vào mẫu nuôi cấy mô.
+ Vật liệu để tách chiết DNA: Lá non của cây lan Phi điệp năm cánh
- Phạm vi về thời gian: Từ tháng 07/2020 - tháng 05/2021
Nội dung nghiên cứu
(1) Nghiên cứu xác định 03 chỉ thị DNA-barcode cho dòng lan Phi điệp năm cánh trắng mắt nai
- Tách chiết DNA tổng số của dòng lan Phi điệp năm cánh trắng mắt nai
- Nhân bản các đoạn gen ycf1b, trnH-psbA, rbcL
- Xác định và phân tích trình tự nucleotide của đoạn gen
- Xử lý và phân tích dữ liệu các trình tự DNA mã vạch
(2) Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống dòng lan Phi điệp năm cánh trắng mắt nai bằng kỹ thuật nuôi cấy mô
- Nghiên cứu kỹ thuật tạo mẫu sạch và nuôi cấy khởi đầu
- Nghiên cứu kỹ thuật nhân thể chồi
- Nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh thể chồi
- Nghiên cứu kỹ thuật ra rễ, tạo cây hoàn chỉnh
- Nghiên cứu huấn luyện và ra cây ở vườn ươm.
Phương pháp nghiên cứu
2.4.1 Phương pháp nghiên c ứu xác đị nh ch ỉ th ị DNA - barcode (P hương pháp t á ch chi ế t DNA t ổ ng s ố ) a) Tách chiết DNA tổng số
Bước 1: Cõn 0,2 g mẫu lỏ cho vào cối chày sứ, bổ sung 600 àl EBA, 1800 àl EBB và 200 àl SDS, nghiền mẫu bằng cối chày sứ để phỏ vỡ tế bào
Bước 2: Hỳt 1,5 àl mẫu cho vào ống eppendorf 1,5 àl sạch
Bước 3: Ủ mẫu ở 65 o C trong bể ổn nhiệt, thời gian 10 phút
Bước 4: Ly tâm 12.000 v/ p trong 10 phút ở 4 o C
Bước 5: Chuyển 1,0 µl dung dịch nổi sang ống Eppendorf 1,5 µl Bước 6: Thêm 410 µl CH3COOK, trộn đều và để ống trong đỏ trong 5 phút Bước 7: Ly tâm ở 12.000 vòng/phút trong 15 phút tại 4 °C để thu dịch nổi.
Bước 8: Thu dịch nổi và bổ sung isopropanol lạnh theo tỷ lệ là V mẫu:
Visopropanol = 1:1, đảo nhẹ và ủ ở - 20 o C trong 20 phút
Bước 9: Ly tâm thu tủa 12.000 vòng/ phút trong 10 phút ở 4 o C Loại bỏ dịch nổi, thu tủa
Bước 10: Rửa tủa bằng 500 àl ethanol 70% (cồn 70% để rửa cỏc cặn bẩn kết tủa cùng DNA)
Bước 11: Ly tâm 12.000 vòng/ phút trong 5 phút ở 4 o C, loại bỏ dịch nổi rồi làm khô tủa (ít nhất 30 phút)
Bước 12: Hũa tan tủa trong 100 àl đệm Elution
Bước 13: Kiểm tra chất lượng DNA bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1% có chứa RedSafe, sử dụng đệm TAE 1X với hiệu điện thế 90V, và so sánh với thang chuẩn marker 1kb.
Bước 14: Bảo quản mẫu ở - 20 o C b) Kiểm tra kết quả tách chiết DNA tổng số
Sản phẩm DNA sau khi tách chiết được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1%, trong đệm TAE ở hiệu điện thế 90V
• Pha gel agarose với nồng độ 1%: Cân 1g agarose cho vào 100ml dung dịch TAE 1X Đun sôi bằng lò vi sóng cho agarose tan thật đều
• Để hỗn hợp giảm nhiệt độ xuống còn 50 – 60 0 C bổ sung Redsafe với tỷ lệ 5 àL Redsafe/100 mL gel agarose 1% Trộn đều và đổ vào khay điện di
Trước khi đổ gel, cần lau sạch giá đổ bằng giấy thấm mềm để hút nước, sau đó cài lược tạo giếng ở phía cực âm của bể điện di Tiến hành cân bằng mặt phẳng của giá bể bằng giọt nước, sau đó đổ gel và chờ agarose đông trước khi tháo lược.
• Đổ dung dịch TAE 1X vào bể điện di, dung tích TAE có thể linh động thay đổi để phù hợp khi đặt bản gel trong bể
Đặt bản gel vào bể điện di, đảm bảo rằng dung dịch TAE 1X được điều chỉnh sao cho bản gel ngập khoảng 1mm so với bề mặt dung dịch điện di.
Lấy 5 µL từ các mẫu DNA, trộn với 2 µL Dye trên bề mặt giấy parafilm Cẩn thận cho hỗn hợp 7 µL vào giếng điện di bằng micropipet và ghi chép lại thứ tự của các mẫu ADN tương ứng với giếng Chạy điện di ở điều kiện 90V, 400mA trong khoảng 30 phút Quan sát bằng mắt thường, hỗn hợp mẫu trong giếng điện di sẽ dịch chuyển chậm từ phía cực âm sang cực dương.
• Lấy bản gel từ bể điện di soi trực tiếp dưới đèn tia UV c) Phương pháp nhân bản gen đích của kỹ thuật PCR
Bảng 1.1 Trình tự và thông tin của các cặp mồi được sử dụng
Vùng gen Tên m ồ i Trình t ự m ồ i Nhi ệ t độ g ắ n m ồ i (Ta) Ycf ycf1b F 5’-
TCTCGACGAAATCAGATTGTTGTGAAT-3’ 48 0 C ycf1b R 5’- ATACATGTCAAAGTGATGGAAAA-3’ trnH- psbA trnPF1 5’- GTTATGCATGAACGTAATGCTC -3’
50 0 C psbPR1 5’- CGCGCATGGTGGATTCACAATCC -3’ rbcL rP2F 5’- ATGTCACCACAAACAGAAAC-3’ 48 0 C rP2R 5’- TCGCATGTACCTGCAGTAGC-3’
- Bước 1: Cho các thành phần phản ứng PCR vào ống PCR Thực hiện ở nhiệt độ thấp (trong đá)
Bảng 1.2 Thành phần của một phản ứng PCR
STT Th à nh ph õ̀ n N ồng độ Th ể t í ch (àL)
Thể tớch mỗi phản ứng PCR mỗi mẫu là 20 àL
- Bước 2: Trộn (mix) đều hỗn hợp bằng pipet hoặc máy Vortex, sau đó làm lắng (spin) bằng máy ly tâm (8000 vòng/phút, 1 phút)
- Bước 3: Lập chương trình và chạy PCR trên máy
Chu trình nhiệt (nhiệt độ gắn mồi thay đổi phụ thuộc mồi)
Sau khi thực hiện phản ứng PCR, chạy điện di để kiểm tra, so sánh với thang chuẩn marker 1kb
- Bước 4: Kiểm tra kết quả PCR bằng điện di trên gel agarose 1%
Sau khi thực hiện phản ứng PCR, cho 1,5 µl sản phẩm PCR vào mỗi giếng và tiến hành điện di trong đệm TAE với hiệu điện thế 80V Kết quả được so sánh với thang chuẩn marker 1kb để kiểm tra độ chính xác Cuối cùng, tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR.
Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit PCR purification kit của Norgen Các bước tinh sạch tiến hành như sau:
- Thêm 5V binding solution vào sản phẩm PCR, mix và ly tâm nhẹ
- Lắp cột, chuyển dịch sang cột
- Ly tâm 8000vòng/phút trong 1 phút
- Thờm 500àl wash solution A Ly tõm 10000 vũng/phỳt trong 1 phỳt
- Loại bỏ dịch, lắp lại cột
- Ly tâm 14000 vòng/phút trong 2 phút để làm khô
- Lắp cột vào ống eppendorf
- Bổ sung 50àl elution buffer
- Ly tâm 14000 vòng/phút trong 2 phút
Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch được gửi đi giải trình tự nucleotide e) Phương pháp đọc trình tự
Xác định trình tự gen tự động dựa trên nguyên tắc của phương pháp Sanger, nhưng sử dụng kỹ thuật PCR để tổng hợp DNA Mỗi ddNTP được đánh dấu để phân biệt trong quá trình phân tích.
Fluochrom 32 có màu sắc đa dạng, cho phép thực hiện cả 4 phản ứng tổng hợp trong cùng một ống nghiệm Kết quả điện di tự động được đọc bằng tia laze và phần mềm xử lý số liệu.
Phân tích bằng Bioedit, BLAST trong NCBI
BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) là công cụ dùng để so sánh cấu trúc chuỗi DNA và chuỗi amino acid, giúp phân tích và tìm kiếm sự tương đồng với các chuỗi trong Ngân hàng dữ liệu Chương trình này xác định các vùng tương đồng và mức độ phân ly cấu trúc giữa chuỗi phân tích và các chuỗi khác trong Ngân hàng gen.
Phân tích bằng phần mềm NCBI giúp xây dựng cây phân loại, thể hiện mối tương quan giữa mẫu lan Phi điệp năm cánh trắng mắt nai và các loài Phi điệp khác.
2.4.2 Nghiên c ứ u k ỹ thu ậ t nhân gi ố ng m ẫu lan Phi điệp năm cánh trắ ng m ắ t nai b ằ ng k ỹ thu ậ t nuôi c ấ y mô a) Thí nghiệm tạo mẫu sạch từ quả lan Phi điệp năm cánh trắng mắt nai
Quả lan Phi điệp năm cánh trắng mắt nai cần được ngâm trong nước xà phòng pha loãng và lắc trong 5 phút Sau đó, hãy xả lại dưới vòi nước sạch để loại bỏ hoàn toàn xà phòng.
Để tiến hành khử trùng quả lan, đầu tiên, mẫu được rửa bằng nước cất vô trùng từ 2 đến 3 lần Sau đó, quả lan được khử trùng bằng cồn 70% trong 1 phút, rồi loại bỏ cồn ra khỏi bình Cuối cùng, mẫu được tráng lại bằng nước cất vô trùng thêm 2 đến 3 lần để hoàn tất quá trình khử trùng.
Chuẩn bị panh kẹp, đĩa và dao mổ đã được khử trùng bằng cồn 96 độ C, sau đó để nguội Sử dụng dao để cắt đầu và đuôi quả, rồi bổ quả theo chiều dọc Dùng mũi dao để lấy phôi hạt và gieo vào bình chứa môi trường nuôi cấy khởi đầu, bao gồm: MS + 20 g/l sucrose + 5 g/l agar + dịch chiết 200 g/l khoai tây + 0,2 mg/l BAP + 0,1 mg/l NAA với pH 5,8 Gieo phôi hạt vào các bình tương đương nhau, đảm bảo số lượng không quá nhiều hay quá ít để thuận tiện cho khả năng tái sinh.
Bảng 0.1 Bố trí thí nghiệm về ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2 0,1% đến khả năng tạo mẫu sạch của loài 5CT1
Tỷ lệ mẫu sạch nảy mầm (%)
Chỉ tiêu thu thập: số bình mẫu sạch, số bình mẫu sạch tái sinh b) Thí nghiệm nhân nhanh thể chồi lan Phi điệp năm cánh trắng mắt nai
❖ Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng nhân thể chồi in vitro
Thể chồi in vitro được hình thành từ sự tái sinh của hạt lan trong môi trường nuôi cấy thích hợp Thể chồi này được sử dụng để nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng (ĐHST) đến khả năng nhân nhanh của thể chồi lan Phi điệp năm cánh trắng Mắt Nai (5CT1).
Thí nghiệm được bố trí với nhiều công thức khác nhau, mỗi công thức có
Phương pháp thu thập và xử lí số liệu
Số liệu được thu thập bằng phương pháp quan sát, đo đếm trực tiếp
Các chỉ tiêu thu thập số liệu cho thí nghiệm tạo mẫu sạch:
Tỷ lệ mẫu sạch (%) Tỷ lệ mẫu sạch tái sinh (%)
Chỉ tiêu thu thập số liệu cho thí nghiệm nhân nhanh thể chồi:
Hệ số nhân nhanh thể chồi (lần) Đặc điểm thể chồi: Kích thước và màu sắc thể chồi
Chỉ tiêu thu thập số liệu cho thí nghiệm nhân nhanh chồi:
Hệ số nhân nhanh chồi (lần) Đặc điểm chồi: Kích thước và màu sắc chồi
Chỉ tiêu cho ra rễ cây:
Tỷ lệ chồi ra rễ; Số lượng rễ
Tỷ lệ chồi ra rễ (%) Số rễ trung bình/cây Chỉ tiêu thu thập cho thí nghiệm huấn luyện và ra cây ở vườn ươm
Chất lượng cây con: Tốt, xấu, trung bình
- Phương pháp xử lí số liệu
Các số liệu được tính toán theo phương pháp phân tích thống kê toán học sử dụng phần mềm thống kê SPSS
So sánh các công thức thí nghiệm dựa trên các chỉ tiêu như tỉ lệ mẫu nảy chồi, tỉ lệ mẫu sạch, tỉ lệ chồi ra rễ và tỷ lệ số cây sống được thực hiện bằng phương pháp bình phương (χ2).
+ Nếu Sig (xác suất của χ2) nhỏ hơn 0,05 thì các chỉ tiêu sinh trưởng có sự sai khác giữa các công thức thí nghiệm
+ Nếu Sig (xác suất của χ2) lớn hơn 0,05 thì các chỉ tiêu sinh trưởng không có sự sai khác giữa các công thức thí nghiệm
So sánh các công thức thí nghiệm về hệ số nhân chồi, chiều dài rễ và số rễ trung bình trên mỗi cây được thực hiện thông qua phân tích phương sai một nhân tố Phương pháp này giúp xác định sự khác biệt có ý nghĩa giữa các công thức, từ đó rút ra kết luận về hiệu quả của từng công thức trong việc tối ưu hóa các chỉ tiêu sinh trưởng của cây.
+ Nếu Sig (xác suất của H hoặc F) nhỏ hơn 0,05 thì các chỉ tiêu sinh trưởng có sự sai khác giữa các công thức thí nghiệm
+ Nếu Sig (xác suất của H hoặc F) lớn hơn 0,05 thì các chỉ tiêu sinh trưởng không có sự sai khác giữa các công thức thí nghiệm
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
Kết quả xác định một số đoạn DNA- barcode
3.1.1 K ế t qu ả tách chi ế t DNA t ổ ng s ố
Các mẫu lan Phi điệp năm cánh trắng mắt nai đã được thu thập và tiến hành tách chiết DNA tổng số Kết quả tách chiết được thể hiện qua quá trình điện di trên gel agarose 1%, như mô tả trong hình 3.1.
Hình 3.1 cho thấy ảnh điện di DNA tổng số của mẫu Phi điệp năm cánh trắng mắt nai, với các băng vạch sáng rõ sau khi tách chiết Điều này cho thấy DNA thu được ít bị đứt gãy, chứng tỏ phương pháp tách chiết DNA phù hợp với mẫu nghiên cứu Do đó, DNA của mẫu lan Phi điệp năm cánh trắng mắt nai có thể được sử dụng cho các phản ứng PCR tiếp theo.
3.1.2 K ế t qu ả nhân b ả n vùng gen nghiên c ứ u b ằ ng k ỹ thu ậ t PCR
DNA được tách chiết sẽ được sử dụng làm khuôn để nhân bản các đoạn gen ycf, rbcL, và trnH-psbA thông qua kỹ thuật PCR với các cặp mồi thích hợp.
39 tương ứng đặc hiệu Kết quả PCR thu được như hình 3.2
Hình 3.2 Kết quả PCR các đoạn gen ycf, rbcL, trnH-psbA của mẫu Phi điệp năm cánh trắng mắt nai
Kết quả điện di cho thấy các băng sáng rõ nét và không có băng phụ, với kích thước tương đồng Đoạn gen rbcL dài gần 850bp, gen trnH-psbA dài gần 725bp, và gen ycf cũng dài gần 850bp, cho thấy mồi được sử dụng có độ đặc hiệu cao và nhiệt độ bắt mồi tối ưu Tất cả các mẫu đều được tinh sạch và đã được giải trình tự.
3.1.3.1 Xác định và phân tích trình tự DNA trên các vùng gen nghiên cứu a Trình tự đoạn gen trnH-psbA
Kết quả xác định trình tự nucleotide cho thấy đoạn gen trnH-psbA được nhân bản có kích thước 639 bp Giải trình tự đoạn gen trnH-psbA của mẫu Phi điệp năm cánh trắng mắt nai đã được thực hiện thành công.
GAAGAATTGAAAAACTCAACAGGAGGGAGGAGAAAGAAATCATAG TGACTTGGTCTCGGGCATCTACCATTATACCCACAATGATTGGCCAT ACAATCGCTATTCATAATGGAAAGGAACATTTACCTATTTATATCAC AGATCGTATGGTCGGTCACAAATTGGGAGAATTTGCACCTACTCTA ACTTTCGTGAGACACGCGAGAAACGATAATAAATCTCGTCGTTAGT CGTTCTACTAAGTATTCATGTGAAAAGCCTTATCTTAATAGTATTTC TAATAGTATTTAGACTTAAGAGTCTTTATCTTATAGTAAGAGTATAG GTATATTTCTTTTTCTAGTATACTAATATACTCACTTTTCTGACTTAT CTTATACTATACTTCACCTAGGCACTTATCATTCATTGGCGGGGGAG AACTTTTATGATAAAGAACGAAAATTCGGATAGAGAAGCAAAAGA CCCCTGAATCCGAATCCAAGAATGCAAATCCAACAAGATAGCAATC CCCCAATATCTTGTTCTTAGAACAAGATATTGGGGGA
Chúng tôi đã sử dụng đoạn gen trnH-psbA để so sánh loài Phi điệp năm cánh trắng mắt nai (Dendrobium anosumun) với các loài Lan khác trong ngân hàng quốc tế NCBI Một số loài có trình tự gen tương đồng với Dendrobium anosumun bao gồm Dendrobium aphyllum (MT019461.1) và Dendrobium crystallinum.
Kết quả xử lý bằng phần mềm NCBI cho các loài Dendrobium wangliangii (KF177561.1), Dendrobium tosaense (EU672794.1) và (MT019503.1) cho thấy cây phát sinh chủng loại và hệ số tương đồng di truyền giữa các loài.
Bảng 3.1 So sánh hệ số tương đồng di truyền giữa các loài trên đoạn gen trnH-psbA loài Phi điệp năm cánh trắng mắt nai (Dendrobium anosumun)
STT Tên loài Mã số Hệ số tương đồng di truyền (%)
Hình 3.3 Cây phân loại dựa vào trình tự đoạn trnH-psbA được xử lý bằng
Cây phân loại dựa trên trình tự gen trnH-psbA cho thấy loài Phi điệp năm cánh trắng mắt nai có trình tự gen giống 100% với Dendrobium anosumun trong ngân hàng NCBI, và có mối quan hệ xa nhất với Dendrobium wangliangii Kết quả này cũng tương đồng với hình thái hoa của hai loài này.
Chúng tôi đã tiến hành so sánh đoạn gen trnH-psbA ở cấp độ loài giữa Phi điệp năm cánh trắng mắt nai và Dendrobium tosaense, dựa trên dữ liệu từ ngân hàng gen quốc tế NCBI Kết quả cho thấy sự khác biệt rõ rệt giữa hai đoạn gen, như được minh họa trong hình 3.4.
Hình 3.4 Sự sai khác nucleotide của trình tự đoạn gen trnH-psbA giữa loài
Phi điệp năm cánh trắ ng m ắ t nai với loài Dendrobium tosaense (các vị trí sai khác được biểu thị bằng không xuất hiện dấu nối đối xứng)
Từ hình 3.4, tỷ lệ tương đồng giữa hai loài đạt 98.76%, với 13 điểm sai khác được thể hiện qua sự không xuất hiện dấu nối đối xứng Trình tự đoạn gen rbcL cũng được đề cập trong bối cảnh này.
Kết quả xác định trình tự nucleotide cho thấy đoạn gen rbcL được nhân bản có kích thước 501bp Dưới đây là kết quả giải trình tự đoạn gen rbcL của mẫu Phi điệp năm cánh trắng mắt nai.
CCTGACTACGAAACCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCATTCCGAG TAACTCCTCAACCGGGAGTTCCGCCTGAAGAAGCGGGGGCTGCGGT AGCTGCCGAATCTTCTACTGGTACATGGACAACTGTGTGGACTGAT GGACTTACCAGTCTTGATCGTTACAAAGGACGATGCTACCACATCG AGGTCGTTGTTGGGGAGGAAAATCAATATATTGCTTATGTAGCTTAT CCTTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTACTAACATGTTTACTTC CATTGTGGGTAATGTATTTGGTTTCAAAGCCCTGCGAGCTCTACGTC TGGAAGATCTGCGAATTCCTACTTCTTATTCCAAAACTTTCCAAGGT CCGCCTCATGGCATCCAAGTTGAAAGAGATAAATTGAACAAGTATG GTCGTCCCCTATTGGGATGTACTATTAAACCAAAATTGGGATTATCC GCAAAAAACTACGGTAGAGCGGTTTATGAATGTCTA
Chúng tôi đã sử dụng đoạn gen rbcL để so sánh loài Phi điệp năm cánh trắng mắt nai (Dendrobium anosumun) với các loài Lan khác trên ngân hàng NCBI, bao gồm Dendrobium anosumun (MT019344.1), Dendrobium catenatum (MG324302.1), Dendrobium flexicaule (LC348965.1), Dendrobium shixingense (LC348863.1) và Dendrobium tosaense (NC_038075.1) Kết quả phân tích bằng phần mềm NCBI cho thấy cây phát sinh chủng loại và hệ số tương đồng di truyền giữa các loài Phi điệp.
Bảng 3.2 So sánh hệ số tương đồng di truyền giữa các loài trên đoạn gen rbcL loài Phi điệp năm cánh trắng mắt nai (Dendrobium anosumun)
STT Tên loài Mã số Hệ số tương đồng di truyền
Hình 3.5 Cây phân loại dựa vào trình tự trên đoạn rbcL tạo bởi phần mềm NCBI của cây Phi điệp năm cánh trắng mắt nai
Cây phân loại dựa trên trình tự gen rbcL của cây phi điệp năm cánh trắng mắt nai cho thấy loài này có trình tự gen giống 100% với các loài Phi điệp khác trong ngân hàng NCBI.
Chúng tôi đã so sánh đoạn gen rbcL ở cấp độ loài giữa Phi điệp năm cánh trắng mắt nai và Dendrobium tosaense, theo dữ liệu từ ngân hàng gen quốc tế NCBI Kết quả cho thấy sự tương đồng giữa hai đoạn gen, như được thể hiện trong hình 3.6.
Hình 3.6 cho thấy sự tương đồng giữa trình tự đoạn gen rbcL của loài Phi điệp năm cánh trắng mắt nai và trình tự của loài Dendrobium tosaense, trong đó các vị trí sai khác được biểu thị bằng việc không xuất hiện dấu nối đối xứng.
Từ hình 3.6 nhận thấy tỷ lệ tương đồng là 100%, có 0 điểm sai khác giữa
2 loài và được biểu thị bằng không xuất hiện dấu nối đối xứng như trên hình 3.6 c Trình t ự DNA c ủa đoạ n gen ycf
Kết quả nhân giống mẫu lan Phi Điệp năm cánh trắng mắt nai bằng kỹ thuật nuôi cấy mô
kỹ thuật nuôi cấy mô
3.2.1 K ế t qu ả nghiên c ứ u ảnh hưở ng c ủ a th ờ i gian kh ử trùng đế n kh ả năng t ạ o m ẫ u s ạ ch c ủ a m ẫu lan Phi Điệp năm cánh trắ ng m ắ t nai (5CT1)
Tạo mẫu sạch là bước quan trọng nhất trong nuôi cấy in vitro, nhằm đảm bảo tỷ lệ nhiễm thấp và tỷ lệ sống cao cho mẫu Trong thí nghiệm, chúng tôi khử trùng quả lan bằng cồn 70% trong 1 phút và HgCl2 0,1% với thời gian khác nhau từ 3-10 phút Sau khi khử trùng, mẫu quả được bổ đôi, lấy phôi hạt và gieo vào môi trường nuôi cấy khởi đầu gồm MS, 20 g/l sucrose, 7 g/l agar, dịch chiết 200 g/l khoai tây, 0,2 mg/l BAP và 0,1 mg/l NAA.
Kết quả nghiên cứu cho thấy thời gian khử trùng có ảnh hưởng đáng kể đến khả năng vô trùng của mẫu sạch và sự tái sinh chồi sau 4 tuần theo dõi, như được trình bày trong bảng dưới đây.
Bảng 3.5 Kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng HgCl2 0,1% đến khả năng tạo mẫu sạch loài 5CT1
Thời gian khử trùng cồn 70 0 (phút)
Thời gian khử trùng bằng HgCl 2 (phút)
Tỷ lệ mẫu sạch tái sinh (%)
Sau 4-8 tuần theo dõi, kết quả thí nghiệm khử trùng ở bảng 3.5 cho thấy sự ảnh hưởng khác nhau của chất khử trùng theo thời gian, tác động đến khả năng tạo mẫu sạch và khả năng tái sinh của mẫu cấy.
Sử dụng dung dịch HgCl2 0,1% để khử trùng dòng 5CT1 trong thời gian từ 3 đến 10 phút cho tỷ lệ mẫu sạch đạt từ 33,36% đến 93,4% Cụ thể, khử trùng trong 7 phút cho tỷ lệ mẫu sạch của loài đạt 83,3% và tỷ lệ mẫu tái sinh thể chồi cao nhất là 77,78% Thời gian khử trùng có thể được kéo dài để cải thiện hiệu quả.
10 phút và thu được kết quả cao hơn (94,3%) nhưng khả năng tái sinh thể
Thời gian khử trùng kéo dài giúp nâng cao khả năng làm sạch mẫu, loại bỏ hiệu quả các chất bẩn, vi khuẩn và nấm bám trên bề mặt quả khi sống ngoài tự nhiên Kết quả cho thấy 51 chồi thấp hơn (66,6%) sau quá trình này.
Thời gian khử trùng mẫu ảnh hưởng đáng kể đến khả năng tái sinh của phôi hạt Cụ thể, tỷ lệ tái sinh của phôi hạt thay đổi theo thời gian khử trùng: ở KT1 (khử trùng 3 phút) đạt 35,3%, KT2 (khử trùng 5 phút) là 50,0%, KT3 (khử trùng 7 phút) đạt 77,78%, và KT4 (khử trùng 10 phút) là 66,6% Sự khác biệt này cho thấy thời gian khử trùng tác động trực tiếp đến phôi hạt, có thể gây tổn thương hoặc độc hại, từ đó làm giảm khả năng tái sinh của mẫu cấy.
Thời gian khử trùng là yếu tố quan trọng quyết định khả năng tạo mẫu sạch in vitro Nếu thời gian khử trùng quá ngắn, các mầm bệnh có thể không bị tiêu diệt hoàn toàn Ngược lại, nếu thời gian khử trùng quá dài, mặc dù các mầm bệnh được loại bỏ, nhưng mẫu có thể bị tổn thương hoặc gây độc.
Công thức khử trùng hiệu quả nhất cho dòng Lan phi điệp là KT3, đạt tỷ lệ mẫu sạch 83,3% và tỷ lệ tái sinh 77,78% khi sử dụng cồn.
Trong 1 phút, sử dụng 70 độ và HgCl2 0,1% trong 7 phút mang lại tỷ lệ cao và đồng đều Phôi được tái sinh cao, tạo điều kiện thuận lợi cho các giai đoạn nghiên cứu tiếp theo.
Kết quả trên tương ứng với công bố của Nguyễn Văn Việt và cộng sự
(2016) khi sử dụng hóa chất HgCl2 0,1% khử trùng mẫu quả Quế lan hương trong
Sau 15 phút, tỷ lệ mẫu sạch đạt 94,33% và tỷ lệ mẫu nảy mầm là 88,67% sau 40 ngày nuôi cấy Nghiên cứu của Vũ Kim Dung và cộng sự (2016) cho thấy kết quả khả quan hơn khi khử trùng quả lan Hoàng thảo ý thảo ba màu bằng HgCl2 0,1% trong 10 phút (lần 1: 7 phút; lần 2: 3 phút), với tỷ lệ tạo mẫu sạch đạt 96,67% và tỷ lệ mẫu nảy mầm đạt 90%.
Hình 3.9 Phôi hạt lan Phi Điệp 5 cánh trắng tái sinh trên môi trường nuôi cấy khởi đầu
Hình 3.10 Phôi hạt lan Phi Điệp năm cánh trắng mắt nai tái sinh thành protocom
3.2.2 K ế t qu ả nghiên c ứ u ảnh hưở ng c ủ a ch ất điều hòa sinh trưởng đế n kh ả năng nhân thể ch ồ i c ủa loài lan Phi Điệ p 5 cánh tr ắ ng m ắ t nai (5CT1)
Chồi lan Phi Điệp 5 cánh trắng mắt nai sau khi tái sinh trong môi trường nuôi cấy ban đầu sẽ được tiếp tục nuôi cấy cho đến khi đạt đủ điều kiện để cấy chuyển.
8 tuần) sẽ được chuyển sang môi trường nhân nhanh thể chồi
Khả năng nhân thể chồi là yếu tố quyết định hệ số nhân trong quy trình nhân giống lan, đóng vai trò quan trọng trong việc tạo nguồn nguyên liệu cho quá trình phát triển chồi và cây hoàn chỉnh Sự kết hợp giữa hai nhóm và Cytokinin ảnh hưởng đáng kể đến khả năng nhân thể chồi của lan.
Qua kết quả thống kê ở bảng 3.6 thấy rõ sự ảnh hưởng của chất ĐHST đến khả năng nhân thể chồi của loài lan Phi Điệp 5 cánh trắng mắt nai
Bảng 3.6 Kết quả ảnh hưởng của chất ĐHST đến khả năng nhân thể chồi loài lan 5CT1
Chất điều hòa sinh trưởng(mg/l) Hệ số nhân thể chồi (lần) Đặc điểm thể chồi NAA BAP Kinetin ĐC 0 0 0 1,56 Thể chồi nhỏ, màu xanh nhạt
NTC1 0,2 0,2 0,2 2,5 Thể chồi nhỏ, màu xanh nhạt
NTC2 0,2 0,3 0,3 2,53 Thể chồi nhỏ, màu xanh
NTC3 0,2 0,3 0,5 4,47 Thể chồi nhỏ, xanh đậm, đồng đều
NTC4 0,3 0,5 0,3 5,91 Thể chồi mập, xanh đậm, đồng đều
Từ bảng 3.6, hệ số nhân thể chồi đều có giá trị Sig nhỏ hơn 0,05, cho thấy sự khác biệt rõ rệt giữa các công thức thí nghiệm, điều này khẳng định rằng kết quả nghiên cứu là có ý nghĩa.
Công thức NTC4 cho chất lượng thể chồi tốt nhất với hệ số nhân đạt 5,91 lần, trong khi công thức NTC1 chỉ đạt hệ số nhân 2,5 lần và chất lượng thể chồi thấp Khi bổ sung Kinetin với nồng độ tăng dần trong các công thức NTC2 và NTC3, chất lượng chồi cải thiện, với hệ số nhân lần lượt là 2,53 và 4,47, chồi trở nên mập hơn và có cụm chồi lớn, màu xanh Đặc biệt, công thức NTC4 (0,3 mg/l NAA + 0,5 mg/l BAP + 0,3 mg/l Kinetin) khi sử dụng nồng độ cao hơn cho thấy sự phát triển đồng đều, chồi lớn, màu xanh đậm và hệ số nhân cao đạt 5,91 lần.
Hình 3.11 Thể chồi lan Phi Điệp 5 cánh trắng mắt nai nuôi cấy trên các
55 công thức môi trường nhân thể chồi
Nghiên cứu xác định công thức tối ưu cho nhân chồi in vitro loài 5CT1, bao gồm các thành phần: NTC4, môi trường MS, 20g/l đường, 7g/l agar, dịch chiết khoai và chuối 150g/l, cùng với 0,3 mg/l NAA, 0,5 mg/l BAP và 0,3 mg/l Kinetin.
3.2.3 K ế t qu ả nghiên c ứ u ảnh hưở ng c ủ a ch ất điề u hòa sinh trưởng đế n kh ả năng nhân nhanh chồ i c ủa loài lan Phi Điệp năm cánh trắ ng m ắ t nai