Ứng dụng phương pháp phân tích adn góp phần nhận dạng một số loài thực vật tại quần đảo trường sa, việt nam

I LỜI CAM ĐOAN Đề tài nghiên cứu của tôi về “Ứng dụng phương pháp phân tích ADN góp phần nhận dạng một số loài thực vật tại Quần đảo Trường Sa, Việt Nam”.. 22 Hình 3.4 Mối quan hệ họ hà

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP&PTNT

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

Tên đề tài: ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ADN

GÓP PHẦN NHẬN DẠNG MỘT SỐ LOÀI THỰC VẬT TẠI

QUẦN ĐẢO TRƯỜNG SA, VIỆT NAM

Họ tên học viên : Lưu Thị Phương Người hướng dẫn : 1 TS Vũ Đình Duy

2 PGS.TS Bùi Văn Thắng Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

Hà Nội, 2021

I

LỜI CAM ĐOAN

Đề tài nghiên cứu của tôi về “Ứng dụng phương pháp phân tích ADN góp phần nhận dạng một số loài thực vật tại Quần đảo Trường Sa, Việt Nam”

Đây là đề tài nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của TS Vũ Đình Duy và PGS TS Bùi Văn Thắng Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là

trung thực, chưa từng được công bố trong bất kì công trình nào khác

Hà Nội, ngày 10 tháng 6 năm 2021

Người thực hiện

Lưu Thị Phương

II

LỜI CẢM ƠN

Đề tài nghiên cứu của tôi được thực hiện tại phòng thí nghiệm Viện Sinh thái Nhiệt đới, Trung tâm Nhiệt đới Việt – Nga và Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, trường Đại học Lâm nghiệp Qua đây, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ban lãnh đạo Viện đã tạo điều kiện để các công việc chuyên môn của đề tài được tiến hành thuận lợi

Khi thực hiện đề tài, tôi đã nhận được sự động viên và giúp đỡ nhiệt tình của các thầy cô, bạn bè và đồng nghiệp Sự ủng hộ về mặt tinh thần và những chỉ dẫn, góp ý, chia sẻ kinh nghiệm, tài liệu vô cùng quý báu này khiến tôi thực sự cảm kích, biết ơn

Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Vũ Đình Duy và PGS.TS Bùi Văn Thắng, người thầy đã tận tình hướng dẫn tôi trong quá trình hoàn thiện luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn những góp ý, chỉ dẫn, chia sẻ kinh nghiệm của các cán bộ nghiên cứu thuộc Viện Sinh thái Nhiệt đới, Trung tâm Nhiệt đới Việt – Nga và Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, trường Đại học Lâm nghiệp

đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ của cơ sở đào tạo trường Đại học Lâm nghiệp đã tận tâm truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt khóa học

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các thầy cô làm việc và giảng dạy tại Viện Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và những người thân đã luôn bên tôi, là động lực để tôi vượt qua mọi khó khăn để hoàn thành luận văn

Luận văn được thực hiện thông qua sự hỗ trợ kinh phí của đề tài: “Nghiên cứu

đa dạng sinh vật các hệ sinh thái cạn quần đảo Trường Sa, đề xuất các giải pháp quản lý, bảo tồn và khai thác bền vững phục vụ cho các nhiệm vụ quân sự, quốc phòng” Mã số: KCB-TS-04 Chủ nhiệm Thượng tá, TS Lê Xuân Đắc

Hà Nội, ngày 10 tháng 6 năm 2021

Người thực hiện

Lưu Thị Phương

III

MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN I LỜI CẢM ƠN II MỤC LỤC III DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT V DANH MỤC BẢNG VI DANH MỤC HÌNH VII

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận văn 2

PHẦN I TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 3

1.1 Các phương pháp phân loại học 3

1.1.1 Phương pháp phân loại học truyền thống 3

1.1.2 Phương pháp phân loại học hiện đại 3

1.2 Hệ gen sử dụng trong nghiên cứu phân loại phân tử ở thực vật 4

1.2.1 Vùng đệm trong được sao mã (Internal Transcribed Spacer - ITS) 4

1.2.2 Một số vùng gen thuộc hệ gen lục lạp 6

1.3 Ứng dụng phương pháp phân tích ADN nhận dạng các loài thực vật ở Việt Nam và trên thế giới 8

1.3.1 Ngoài nước 8

1.3.2 Trong nước 11

PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.1 Vật liệu nghiên cứu 13

2.2 Địa điểm thực hiện nghiên cứu 14

IV

2.3 Hóa chất và các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 14

2.3.1 Hóa chất 14

2.3.2 Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 14

2.4 Phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm 15

2.4.1 Sơ đồ nghiên cứu 15

2.4.2 Tách chiết ADN tổng số: 15

2.4.3 Định lượng ADN tổng số 16

2.4.4 Trình tự mồi 16

2.4.5 Nhân dòng đoạn gen đích bằng kỹ thuật PCR 16

2.4.6 Phương pháp điện di ADN trên gel agarose 1.5% 17

2.4.7 Giải trình tự nucleotide 17

2.4.8 Hiệu chỉnh trình tự nucleotide 19

2.4.9 Phân tích mối quan hệ di truyền-xây dựng cây phát sinh chủng loại 19

PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20

3.1 Kết quả tách chiết ADN tổng số 06 loài thu tại Trường Sa, Việt Nam 20

3.2 Nhân bản trình tự ADN đích vùng gen ITS-rDNA 06 loài ở Trường Sa, Việt Nam 22

3.3 Xác định trình tự nucleotide vùng gen ITS-rDNA của 06 loài trong nghiên cứu 22

3.4 Định danh khoa học 06 loài thực vật thu tại quần đảo Trường Sa, Việt Nam dựa trên trình tự nucleotide vùng gen ITS-rDNA 27

PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35

4.1 Kết luận 35

4.2 Kiến nghị 35

TÀI LIỆU THAM KHẢO 36

V

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Các chữ

ATP Adenosin triphosphat Adenosin triphosphat ADN Acid deoxyribonucleic Axit deoxyribonucleic

CTAB Cetyl trimethylammonium

HPLC High-Performance Liquid

Chromatography Sắc ký lỏng cao áp

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid axit ethylenediamine

tetraacetic

ITS Internal Transcribed Spacer vùng DNA nằm giữa các gen

NAD(P)H Nicotinamide adenine

dinucleotide phosphate

Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate NCBI National Center for

Biotechnology Information

Trung tâm Quốc gia về Thông tin Công nghệ sinh học PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi polymerase TLC Thin Layer Chromatography Sắc kí lớp mỏng

RFLP Restriction fragment length

polymorphism Phân tích đa hình trình tự DNA

VII

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Sơ đồ cấu trúc tổng quát của vùng rDNA trong thực vật 5

Hình 1.2 Hệ gen lục lạp của loài Arabidopsis thaliana 7

Hình 2.1 Hình ảnh Hoa và Quả của 06 loài thực vật ở quần đảo Trường Sa 13

Hình 2.2 Sơ đồ thiết kế trong nghiên cứu 15

Hình 2.3 Hiển thị kết quả giải trình tự qua phần mềm Chromas pro 2.1.6 19

Hình 3.1 Kết quả điện di ADN tổng số của 18 mẫu của 06 loài ở quần đảo Trường Sa trên gel agarose 1% 20

Hình 3.2 Sản phẩm PCR của 06 loài thực vật phân tích với cặp mồi ITS-rDNA điện di trên gel agarose 1,5% 22

Hình 3.4 Mối quan hệ họ hàng của mẫu nghiên cứu (PB) với các loài trong cùng chi lấy trên GenBank trên cơ sở phân tích trình tự nucleotide vùng gen ITS-rDNA bằng phương pháp Maximum Likelihood (ML) 28

Hình 3.5 Mối quan hệ họ hàng của mẫu nghiên cứu (BT) với các loài trong cùng chi lấy trên GenBank trên cơ sở phân tích trình tự nucleotide vùng gen ITS-rDNA bằng phương pháp Maximum Likelihood (ML) 29

Hình 3.6 Mối quan hệ họ hàng của mẫu nghiên cứu (BV) với các loài trong cùng chi lấy trên GenBank trên cơ sở phân tích trình tự nucleotide vùng gen ITS-rDNA bằng phương pháp Maximum Likelihood (ML) 30

Hình 3.7 Mối quan hệ họ hàng của mẫu nghiên cứu (NH) với các loài trong cùng chi lấy trên GenBank trên cơ sở phân tích trình tự nucleotide vùng gen ITS-rDNA bằng phương pháp Maximum Likelihood (ML) 31

Hình 3.8 Mối quan hệ họ hàng của mẫu nghiên cứu (MU) với các loài trong cùng chi lấy trên GenBank trên cơ sở phân tích trình tự nucleotide vùng gen ITS-rDNA bằng phương pháp Maximum Likelihood (ML) 32

Hình 3.9 Mối quan hệ họ hàng của mẫu nghiên cứu (TR) với các loài trong cùng chi lấy trên GenBank trên cơ sở phân tích trình tự nucleotide vùng gen ITS-rDNA bằng phương pháp Maximum Likelihood (ML) 33

DNA-et al., 2017; Hosein DNA-et al., 2017) Sau 20 năm nghiên cứu và phát triển, đến nay

các nhà khoa học đã công bố 620.379 công trình khoa học trên các tạp chí chuyên ngành với 60.563.080 trình tự mã vạch ADN, trong đó: động vật có 26.037.155 trình tự, thực vật có 14.214.896 trình tự, nấm có 2.353.923 trình tự và các dạng sinh vật khác có 15.195.843 trình tự (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)

Trong tiến trình phát triển đó, ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu đa dạng sinh học trên các đảo, quần đảo được nhiều nhà nghiên cứu quan tâm

(Hawlitschek et al., 2013; Li et al., 2018; Liu et al., 2018) Để hiểu rõ hơn quá

trình tiến hóa của loài trong quần thể ở đảo, Yi và cộng sự (2016) đã phân tích bộ

dữ liệu gồm: microsatellite (vi vệ tinh) và mtDNA của các mẫu loài ruồi phương

đông Bactrocera dorsalis thu được từ 6 đảo xa bờ miền Nam Trung Quốc Phân

tích dữ liệu microsatellite chỉ ra tỷ lệ gen dị hợp tử quan sát (H0), tỷ lệ gen dị hợp

tử kỳ vọng (He), khoảng cách di truyền chuẩn Nei (D), tính tương đồng di truyền (I) và tỷ lệ phần trăm của locus đa hình (PIC) cho thấy mức độ đa dạng di truyền cao trong số 6 quần thể ở các đảo nghiên cứu; phân tích dữ liệu mtDNA vùng gen COI cho thấy, sự đa dạng nucleotide cao (0,9655) và đa dạng haplotype (kiểu gen đơn bội) thấp (0,00680) ở các quần thể của cả 6 đảo; kết quả đã làm rõ cấu trúc di

truyền của quần thể ruồi phương đông Bactrocera dorsalis ở đảo Gần đây, Li và

cộng sự (2018) đã ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để xây dựng cơ sở dữ liệu

mã vạch ADN cho thực vật có hoa từ quần đảo Hoàng Sa Kết quả đã xây dựng được bộ cơ sở dữ liệu mã vạch cho 155 loài thực vật từ quần đảo Hoàng Sa bằng

cách sử dụng vùng gen ITS, rbcL và matK; những dữ liệu này là lần đầu tiên cung

2

cấp dữ liệu ADN thực vật của hệ sinh thái độc đáo khu vực quần đảo Hoàng Sa và

bổ sung đáng kể cho thư viện mã vạch ADN thực vật có hoa trên các đảo đại dương Cho đến hiện nay, đã có nhiều ứng dụng phương pháp sinh học phân tử trong nghiên cứu sinh thái, đa dạng sinh học ở đảo và đã thu được nhiều tư liệu mới làm

cơ sở bảo tồn, phát triển bền vững Nhưng đối với các đảo thuộc quần đảo Trường

Sa đến nay vẫn còn ít nghiên cứu sử dụng các phương pháp sinh học phân tử trong làm rõ tính đa dạng, phân bố các loài thực vật trên đảo còn chưa được thực hiện làm cơ sở cho việc bảo tồn, phát triển, thích nghi của chúng ở khu vực đặc thù

này Từ những lý do trên, tôi thực hiện đề tài “Ứng dụng phương pháp phân tích ADN góp phần nhận dạng một số loài thực vật tại Quần đảo Trường Sa, Việt Nam”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Nhận dạng 06 loài thực vật đặc trưng thu tại quần đảo Trường Sa, Việt Nam

dựa trên giải mã trình tự nucleotide vùng gen nhân (ITS – rDNA)

3 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Tách chiết ADN tổng số một số loài thực vật thu tại quần đảo

Trường Sa, Việt Nam

Nội dung 2: Thực hiện phản ứng PCR một số loài thực vật thu tại quần đảo

Trường Sa, Việt Nam với vùng gen nhân (ITS – rDNA)

Nội dung 3: Giải mã trình tự nucleotide vùng gen nhân (ITS – rDNA) và một

số loài thực vật thu tại quần đảo Trường Sa, Việt Nam

Nội dung 4: Định danh khoa học một số loài thực vật thu tại quần đảo Trường

Sa, Việt Nam dựa trên trình tự nucleotide vùng gen nhân

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận văn

Kết quả nghiên cứu sẽ góp phần bổ sung cơ sở dữ liệu về di truyền cho danh lục các loài thực vật ở Việt Nam, góp phần cho công tác bảo tồn nguồn gen, làm

cơ sở khoa học cho công tác bảo tồn và phát triển bền vững loài này tại quần đảo Trường Sa nói riêng và của Việt Nam nói chung

3

PHẦN I TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1 Các phương pháp phân loại học

Phân loại học có vai trò và ý nghĩa đối với nhiều ngành, nhiều lĩnh vực (Đặng Ngọc Thanh và Trần Đức Lương, 2018) Có nhiều cách phân chia về các phương pháp phân loại học, phần dưới đây sẽ trình bày một số phương pháp phân loại chính được sử dụng hiện nay

1.1.1 Phương pháp phân loại học truyền thống

Trong phân loại học truyền thống có bao hàm phân loại học dựa trên chỉ thị cảm quan (hình thái, màu sắc, mùi vị…) và chỉ thị hóa học (sắc ký lớp mỏng - Thin Layer Chromatography - TLC; sắc ký lỏng cao áp - High-Performance Liquid Chromatography - HPLC ).Phương pháp phân loại bằng đặc điểm hình thái (phương pháp hình thái học) là một phương pháp giữ vai trò rất quan trọng trong nghiên cứu phân loại học Nó được sử dụng rất rộng rãi và phổ biến Phương pháp cho phép so sánh các đặc điểm hình thái của các cơ quan trong cơ thể sinh vật, trước hết là cơ quan sinh dưỡng và sinh sản Nhờ việc làm nổi bật các đặc điểm giống, khác nhau và nhờ tính ổn định của chúng mà ta có thể sắp xếp các sinh vật vào các nấc thang phân loại khác nhau, xác định được mối quan hệ thân cận Hạn chế lớn nhất của phương pháp là phân biệt các loài đồng hình Đôi khi

do lợi ích kinh tế hoặc lỗi trong khâu thu hái mà người ta có thể nhầm lẫn các sinh vật với nhau một cách vô tình hoặc cố ý; gây hậu quả nghiêm trọng nhất là với các cây có chất độc Tuy vậy, chúng ta không thể phủ nhận và thay thế được vai trò to lớn của các cách phân loại truyền thống đối với phân loại học nói chung

1.1.2 Phương pháp phân loại học hiện đại

Phân loại học phân tử: Cùng với sự phát triển của sinh học phân tử và tin sinh

học, các kỹ thuật chỉ thị sinh học phân tử ra đời từ thập kỷ 80 của thế kỷ trước đem lại những thành tựu kỳ diệu và bước tiến quan trọng trong phân loại học (Nguyễn Đức Thành,2014) Phân loại học phân tử xác định các loài dựa trên các đặc điểm khác biệt về trình tự ADN, protein hoặc isozyme Phần lớn chỉ thị phân

tử được sử dụng hiện này là các chỉ thị ADN, các chỉ thị này nằm gần hay liên kết với gen và không có hoặc ít ảnh hưởng đến kiểu hình Bằng phương pháp này, sự khác biệt giữa các cơ thể hoặc các loài khác nhau trở nên nhanh và chính xác Phương pháp đặc biệt có ích trong trường hợp giải quyết các vấn đề về loài đồng

4

hình hay nghiên cứu các biến dị, khắc phục một phần nhược điểm của phương

pháp phân loại truyền thống

Phân loại học hiện trạng số (numerical taxonomy): sử dụng các dấu hiệu

giống nhau của sinh vật (từ 60 trở lên) mà không xét nguồn gốc của các dấu hiệu Phương pháp căn cứ vào mức độ giống nhau của các đối tượng để xác định quan

hệ phân loại bằng cách dùng các thuật toán Ưu điểm của phương pháp này là loại

bỏ được tính chủ quan và đảm bảo tính tự nhiên của hệ thống phân loại Tuy nhiên nhược điểm lớn là đã loại trừ yếu tố tiến hóa và không thể thay thế phương pháp phân loại truyền thống

Phân loại học Phylocod: xác định các đặc điểm tổ tiên, các đặc điểm phân ly

từ tổ tiên và hình thành các bậc tiến hóa đơn dòng xác định như các loài Khác với phân loại truyền thống phân chia thành nhiều thứ bậc (loài, giống, họ, bộ ), Phylocod chỉ là hệ thống danh pháp Theo phương pháp này, số lượng loài sẽ tăng lên hay vấn đề mẫu chuẩn của loài sẽ là những điểm hạn chế Vì vậy, hệ thống danh pháp này chỉ mang tính tham khảo

Cận phân loại học (Parataxonomy): sử dụng để so sánh tổng quát về mức độ phong phú của sinh vật nói chung của một khu vực Phương pháp phân loại này

chủ trương phân thành các đơn vị phân loại mà không thành các loài theo những nguyên tắc chung Nó có thể phù hợp cả những người không chuyên về phân loại học bằng cách phân loại bằng mắt thường Vì vậy, nhiều nhà khoa học cho rằng

đây sẽ chỉ là một kỹ thuật trợ giúp trong phân loại học

1.2 Hệ gen sử dụng trong nghiên cứu phân loại phân tử ở thực vật

1.2.1 Vùng đệm trong được sao mã (Internal Transcribed Spacer - ITS)

Vùng đệm trong được sao mã (Internal Transcribed Spacer - ITS) (vùng gen

nhân) nằm giữa gen RNA ribosome tiểu đơn vị nhỏ và gen RNA ribosome tiểu đơn vị lớn là một dấu hiệu phát sinh gen được sử dụng rộng rãi cho phân loại

nhiều loài ITS ở thực vật nhân thực chứa rRNA 5,8S được bảo tồn và các khu vực có thể biến đổi là ITS1 và ITS2 Các vùng này có chiều dài có thể thay đổi và

khuếch đại bằng cách sử dụng các đoạn mồi bổ sung cho các vùng được bảo tồn của các gen sườn của chúng Có nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng việc loại bỏ

các khu vực được bảo tồn dẫn đến phân loại chính xác hơn (Rivers et al., 2018)

Các vùng tổ chức nhân (nucleolar organizing regions – NORs) nằm trong nhiễm

5

sắc thể chứa các ADN ribosome (rDNA) là các phần của các đơn vị lặp lại (Hình 1a) được sắp xếp theo thứ tự nhất định với số lượng bản sao lên đến 30000 trong một tế bào (Péter và Jaakko, 2010; Nguyễn Đức Thành, 2014) Do đó, vùng rDNA như một công cụ cho các nghiên cứu phát sinh gen do thành phần cấu trúc của nó khác nhau về mức độ bảo tồn

Xen kẽ giữa các rDNA là các vùng intron không được sao mã với chức năng chưa được biết rõ Mỗi Exon (rDNA) chứa các tiểu phần ribosome nhỏ (16S-18S),

vùng ITS và tiểu phần lớn (26S-28S) Theo đó, Hình 1b thể hiện được vùng ITS bao gồm ba phần là ITS1, 5,8S và ITS2 nằm xen kẽ giữa các tiểu phần ribosome Vùng này được gọi chung là vùng đệm trong được sao mã (Internal Transcribed Spacer –ITS)

Hình 1.1 Sơ đồ cấu trúc tổng quát của vùng rDNA trong thực vật

(a) Vị trí nhiễm sắc thể của các vùng rDNA (b) Cấu tạo của vùng Intron, Exon liền kề

vùng gen ITS Ngoài ra, do đoạn trình tự gen không dài, nên việc khuếch đại là

không khó khăn

Phân tích vùng gen ITS là một kỹ thuật chỉ thị phân tử quan trọng cho nghiên

cứu đa dạng di truyền giúp phân loại phân tử các nhóm taxon có liên kết gần gũi

6

(Li Rong and Jun Wen, 2013) Bởi vì ITS có tính bảo thủ cao trong loài nhưng lại thay đổi ở các loài khác nhau (Thomas et al., 1991) Có nhiều nghiên cứu đã tiến hành phân tích riêng biệt từng vùng trình tự ITS1 và ITS2, song kết quả cho thấy chưa đủ bằng chứng để phân tích tiến hóa Do đó sự kết hợp dữ liệu vùng ITS cho

kết quả khả quan hơn Hầu hết các nghiên cứu được báo cáo, sự khác biệt giữa

các chuỗi ITS chủ yếu là do đột biến điểm Một tỷ lệ tương đối nhỏ của những vị

trí bị chèn (insert) hoặc xóa (indels) nucleotide trong các trình tự tương tự nhau

để giữ lại tín hiệu đủ cho phân tích phát sinh gen (Bruce et al., 1995) Nghiên cứu

đa dạng di truyền sử dụng vùng gen ITS có thể được tiến hành bằng cách: Sử dụng

những cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại số lượng bản sao vùng gen mong muốn; tiến hành giải trình tự trực tiếp; xây dựng cây phát sinh phân loài sử dụng các trình

tự nghiên cứu và các trình tự tham chiếu có sẵn trên Genbank

Với đặc tính như trên, hiện nay, ITS đã và đang được ứng dụng rất rộng rãi

trong nhiều lĩnh vực như phân tích di truyền và phân loại, nghiên cứu phát sinh loài…Điển hình có thể kể tên các nghiên cứu ứng dụng của các chi, họ khác nhau

như Sorghum (Poaceae) (Sun et al., 1994), Glycine (Krishna et al., 1997), họ Rosoideae (Torsten et al., 2003), chi Bambusa (Jayadri et al., 2017), thậm chí cả nấm (Conrad et al., 2012),… hoặc các nghiên cứu về sự khác biệt di truyền trong

họ Araliaceae (Jun et al., 2001; Li và Jun, 2016; Nông Văn Duy và cộng sự, 2016), Dendropanax (Li và Jun, 2016),… Ngoài ra, hiện nay để dữ liệu phân tích thêm

đồ sộ và có độ tin cậy lớn hơn, người ta thường kết hợp phân tích da dạng di truyền của nhiều gen chỉ thị khác nhau Trong đó, một sự kết hợp phổ biến là sử

dụng cả vùng gen nhân ITS và cả cùng gen lục lạp (matK, atpB, ndhF, rbcL, tnrH

- tnrK,…) để phân tích

1.2.2 Một số vùng gen thuộc hệ gen lục lạp

Hệ gen lục lạp (cpDNA) là một phân tử ADN vòng, sợi đơn, mỗi gen thường không lặp lại, có kích thước từ 120 kb - 220 kb Không giống như các gen nhân, các gen lục lạp chỉ mã hoá các protein cần thiết cho chức năng quang hợp Hệ gen lục lạp thường được sử dụng cho nghiên cứu phân loại ở thực vật do đặc tính di

truyền theo dòng mẹ, không bị tái tổ hợp di truyền cho thế hệ sau và rất bảo thủ

7

Hình 1.2 Hệ gen lục lạp của loài Arabidopsis thaliana

Hệ gen lục lạp được đánh giá là sự tích lũy các đột biến theo thời gian, nên phản ánh đúng mức độ tiến hóa của loài Các gen lục lạp có tốc độ đột biến thấp hơn từ 4-5 lần so với gen trong nhân, nhưng nhanh hơn khoảng ba lần so với ADN

ty thể thực vật và thường xuyên được sử dụng trong nghiên cứu phân loại Hiện

nay, các vùng gen matK, trnL-trnF, vùng đệm psbA-trnH, rpoC2…hay được sử

dụng trong nghiên cứu hệ thống học phân tử thực vật Tất cả các gen thuộc hệ gen lục lạp thường có mức độ biến đổi không lớn hơn 2% giữa các loài lân cận

a Vùng đệm psbA - trnH: thường được sử dụng cho nghiên cứu phân loại (Son

et al., 2010) Vùng này có kích thước xấp xỉ 450bp, xác suất nhân bản thành công

rất cao (100% với các loài đã được nghiên cứu) Mức độ khác biệt trình tự nucleotide giữa các loài trung bình là 1,24% và sự khác biệt bên trong loài rất thấp

từ 0 - 0,08% (Laila et al., 2017) Trình tự psbA - trnH cũng đã được công bố trên

ngân hàng gen với nhiều loài khác nhau thuộc thực vật hạt trần, dương xỉ, rêu và rêu tản (liverwort)

b Gen matK: cùng với vùng đệm psbA - trnH đã được đề xuất làm ADN barcode

cho nhóm thực vật có hoa Kết quả sử dụng gen matK cho phân loại đã thu được

sự tương đồng rất cao với phân loại hình thái và cho giá trị bootstrap từ 92 – 100%

(Hammad et al., 2017)

Vùng gen nghiên cứu

Vùng gen nghiên cứu

8

c Gen trnL: Là gen mã hoá cho tARN vận chuyển Leucine trong lục lạp, có kích

thước từ 452bp đến 528bp với các loài thuộc họ đậu Gen này được sử dụng nhiều

trong nghiên cứu phân loại phân tử (Mort et al., 2005; Kress et al., 2005; Yang et al., 2007) Các kết quả thu được trong các nghiên cứu nguồn gốc phát sinh loài sử dụng gen trnL cho thấy đây là một vùng ADN hữu ích cho phân loại

Ngoài các locus được nêu trên, các vùng gen rbcL, vùng đệm trnL-trnF, trnL, thuộc hệ gen lục lạp cũng thường được sử dụng cho nghiên cứu phân loại,

trnT-tiến hóa, Việc sử dụng mỗi vùng gen cho những ưu nhược điểm khác nhau, kết quả phân loại sẽ chính xác hơn khi phân tích tổ hợp nhiều gen

1.3 Ứng dụng phương pháp phân tích ADN nhận dạng các loài thực vật ở Việt Nam và trên thế giới

1.3.1 Ngoài nước

Mã vạch ADN (DNA barcode) là một khái niệm được đưa ra bởi Paul Heber vào năm 2003 Mã vạch ADN là trình tự nucleotide của một chuỗi ADN ngắn, có cùng nguồn gốc tổ tiên (orthologous), trong đó có vùng ít bị thay đổi (rất ổn định

- bảo thủ) và có vùng dễ thay đổi trong quá trình tiến hóa Dựa vào mức độ thay đổi trong trình tự ADN này để đánh giá sự sai khác di truyền giữa các sinh vật, nó tương tự như máy quét trong siêu thị đọc hai mã vạch của hai sản phẩm mà nhìn bên ngoài chúng rất giống nhau nhưng thực sự là khác nhau Như vậy, mã vạch ADN là một phương pháp định danh mới sử dụng một đoạn ADN chuẩn ngẳn nằm trong hệ genome của sinh vật đang nghiên cứu, nhằm xác định sinh vật đó thuộc về loài nào (http://www.barcodeoflife.org) Sau khoảng 20 năm nghiên cứu

và phát triển DNA barcode, đến nay các nhà khoa học đã công bố 620.379 công trình khoa học trên các tạp chí khoa học chuyên ngành, với 60.563.080 trình tự

mã vạch ADN, trong đó động vật có 26.037.155, thực vật có 14.214.896, nấm có 2.353.923 và các dạng sinh vật khác có 15.195.843 (theo ngân hàng gen thế giới thống kê đến 30/03/2020; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) Từ cơ sở dữ liệu trên cho thấy hướng nghiên cứu xây dựng cơ sở dữ liệu mã vạch ADN đang được nhiều quốc gia, nhiều nhà khoa học trên thế giới rất quan tâm phát triển, đặc biệt trong những năm gần đây và sẽ là một xu thế nghiên cứu trong thời gian tới

(Hendrich et al., 2014; Carew et al., 2017; Wong et al., 2018) Mã vạch ADN

được xem là một công cụ mới, hỗ trợ có hiệu quả trong nghiên cứu về phân loại, phát hiện loài mới, giám định loài và các mẫu có nguồn gốc từ sinh vật sống hoặc

9

đã chết thậm chí đã qua chế biến, vì vậy mã vạch ADN có rất nhiều ứng dụng

trong nghiên cứu cũng như thực tiễn (Yang et al., 2011; Hosein et al., 2017)

Đến nay, nhiều kết quả nghiên cứu đã chỉ ra, có nhiều đoạn ADN đặc trưng được

sử dụng làm ADN mã vạch, các đoạn ADN mã vạch có thể là những đoạn ADN nằm ở trong nhân (nuclear DNA - nDNA), như: 18S, 5,6S, 26S, 5S spacer và vùng ITS (Li and Zhang, 2002); nằm ở ty thể (Mitochondrial DNA - mtDNA), như:

Cytb và vùng kiểm soát (control region) (Laopichienpong et al., 2016); nằm ở lục lạp (Chloroplast DNA - cpDNA), như: matK, rcbL, atpB, ndnF, 16S (Cuenoud, 2002; Kress et ai, 2008) Có rất nhiều gen cpDNA tham gia trong phân tích phân loại thực vật như: 16S, rbcL, atpB, ndhF, intron trnL và matK, trải rộng từ bộ

cho đến mức dưới loài Mỗi đoạn mã vạch ADN có những đặc trưng riêng và có khả năng phân biệt sinh vật ở các mức độ khác nhau Ví dụ, các đoạn ADN như: 18S, 16S 5,6S có khả năng phân biệt sinh vật ở mức họ và chi; các đoạn ADN,

như: 26S, rbcL có khả năng phân biệt ở mức chi và loài; các đoạn ADN, như: ITS, matK, cytb, 5S spacer có khả năng phân biệt ở mức loài và dưới loài (subspecies, variety, strain) (Li et al, 2010; Chen et al, 2010) Tuy nhiên, các nhà khoa học

cũng đã khuyến cáo, chưa có đoạn ADN nào được sừ dụng làm mã vạch chung cho tất cả các loài sinh vật Vì vậy, việc lựa chọn những đoạn ADN (gen) đặc trưng để làm mã vạch và việc phối hợp giữa các đoạn mã vạch ADN là rất cần

thiết và đem lại hiệu quả cao (Kress et al, 2008; CBOL Plant Working Group, 2009; Yao, 2010)

Ví dụ đối với động vật các nhà khoa học thường khuyến cáo sử dụng các

marker nằm trên hệ gen của ty thể, như: gen cytb, gen COI và vùng D-loop, Trong đó COI được coi là marker phổ biến và tiềm năng bậc nhất trong phân định

loài động vật Tuy vậy, các marker khác vẫn được sử dụng nhằm hạn chế các kết

quả không mong đợi (Luo A et al., 2011) Tuy nhiên khác với động vật trên đối tượng thực vật, các nhà khoa học đã khuyến cáo việc sử dụng chuỗi trình tự COI

là không thích hợp cho hầu hết các loài thực vật, bởi mức độ tiến hóa của gen mã hóa cytochrome c oxidase 1 ở thực vật chậm hơn động vật rất nhiều (Chase MW

et al., 2005; Kress et a.l, 2005) Ở thực vật, tốc độ tiến hóa cùa các gen trên ty thể

không nhanh như ở động vật, do vậy không đủ sai khác để phân biệt được các loài Vì vậy, thường sử dụng các đoạn ADN đặc trưng ở lục lạp và nhân để làm

mã vạch ADN (Kress et al., 2007) Tùy vào mức độ phân tích mà mỗi vùng gen

và mỗi phương pháp được áp dụng phù hợp Tổ chức hệ thống cơ sở dữ liệu mã

10

vạch sự sống (BOLD) khuyến cáo, ở thực vật ngoài vùng ITS ở trong nhân, nên dùng thêm các marker khác riêng rẽ hoặc kết hợp Nghiên cứu của CBOL Plant

Working Group (2009) đã chỉ ra sự kết hợp giữa gen matK và gen rbcL ở lục lạp

để sử dụng như một mã vạch ADN có hiệu quả cao nhất trong định danh phân tử

cho nhiều loài thực vật (Gao, 2011) Sau đó Kress et al., (2007) bổ sung thêm vùng gen thứ ba là vùng xen trnH-psbA Tính đến năm 2009, đã có khoảng 8 locus

gen được sử dụng làm mã vạch ADN ở các loài thực vật, bao gồm cả hệ gen nhân

và hệ gen lục lạp (vùng xen atpF-atpH, gen matK, gen rbcL, gen rpoC1, vùng xen psbK-psbI, vùng xen trnH-psbA và vùng gen nhân ITS) Ngoài ra, BOLD cũng

khuyến cáo cần kết hợp kết quả của nhiều vùng gen để tăng hiệu quả giám định

loài Ví dụ, một số tổ hợp, như: rpoC1+rpoB+matK hay rpoC1 +matK psbA, rbcL+trnH và atpF-H+psbK-I+matK (Kress et al., 2007; CBOL Plant

+trnH-Working Group, 2009; Costion, 2011) Đối với nhóm vi khuẩn và nấm các nhà khoa học đề xuất sử dụng vùng ITS cho hiệu quả cao nhất, ngoài ra có thể phối hợp với các marker bổ trợ như SSU-LSU, gene beta-tubulin, alpha-elongation lactor để tăng độ chính xác

Đối với những loài mới hoặc mẫu vật (bộ phận cơ thể, mảnh mô đã thay đổi hình thái hoặc qua chế biến) không thể xác định được bằng các chỉ thị hình thái Việc giám định loài, trình tự nucleotide của các đoạn mã vạch ADN sẽ được phân tích, so sánh với những trình tự nucleotide của các đoạn ADN mã vạch trong thư viện/ngân hàng mã vạch để xây dựng cây phát sinh loài thông qua việc ước tính quan hệ tiến hóa giữa trình tự chưa biết và bộ dữ liệu trình tự đã biết Trên cơ sở

đó có thể xác định được giám định loài hoặc phát hiện loài mới (CBOL Plant Working Group, 2009)

11

Như vậy, việc ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong nhận dạng các loài động thực vật là rất cần thiết và có ý nghĩa quan trọng Những nghiên cứu xây dựng ngân hàng mã vạch ADN có quy mô quốc tế sẽ cho phép mở rộng cơ sở dữ liệu này và thúc đẩy việc ứng dụng phương pháp này trong quá trình định danh, phát hiện loài mới và phân loại sinh vật Trong tương lai, mã vạch ADN sẽ trở thành một công cụ hữu hiệu cho việc nhận diện sinh vật, quản lý nguồn gốc, xuất

xứ và chất lượng hàng hóa Các trình tự ADN thu được có thể được sử dụng để phân loại, xây dựng cây phát sinh loài, hình thái học, bảo tồn, Những nghiên cứu về mã vạch ADN có liên quan chặt chẽ đến các dự án cơ sở dữ liệu đa dạng

di truyền sinh học Do đó, mã vạch ADN sẽ mở ra hướng khám phá mới cho đa dạng sinh học và nó sẽ được ứng dụng như cầu nối giữa nghiên cứu trong lĩnh vực đa dạng sinh học và di truyền học

để giám định sinh vật và xác định mối quan hệ di truyền giữa các loài Xây dựng

cơ sở dữ liệu mã vạch ADN là hướng nghiên cứu mới Nhận thấy vai trò, ý nghĩa

và sự cần thiết của việc xây dựng ngân hàng mã vạch ADN, ở Việt Nam các nhà khoa học cũng như các nhà quản lý cũng đã bắt đầu tiểp cận và quan tâm đến hướng nghiên cứu này, nhằm hướng tới xây dựng một ngân hàng dữ liệu mã vạch ADN quốc gia cho các loài sinh vật (Động vật, thực vật, vi sinh vật, virut, ) phục

vụ phân loại, giám định chuẩn đoán bệnh, bảo tồn và quản lý thương mại nguồn tài nguyên sinh vật ở Việt Nam Một số kết quả công bố đã chỉ ra có thể sử dụng

gen 18S rRNA để phân loại các loài thuộc chi Bình vôi (Stephania) (Huỳnh Thị Thu Huệ et al., 2003), để xác định mức độ quan hệ họ hàng giữa Sa mộc (Cunninghamia lanceolata Lamb.) nhập từ Trung Quốc và Sa mộc dầu (Cunninghamia konishii Hayata) mọc tự nhiên (Nguyễn Thị Phương Trang et al.,

2009) Nguyễn Đức Thành và cộng sự (2007) đã sử dụng một số gen ở lục lạp để nghiên cứu đa dạng di truyền và xuất xứ một số loài cây lâm nghiệp Kết quả

12

nghiên cứu đã chỉ ra, các chỉ thị gen lục lạp là công cụ hữu hiệu trong nghiên cứu

đa dạng di truyền và xuất xứ các loài cây lâm nghiệp Nhóm nghiên cứu của Trần Hoàng Dũng và cộng sự (2014) đã tiến hành xác định một số đoạn ADN đặc trưng

để làm mã vạch cho một số nhóm thực vật quý hiếm đặc hữu có giá trị kinh tế và

dược tính như: Lan hài (Paphiopedilum), Hoàng thảo (Dendrobium), Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamemis), Củ hoài sơn (Discorea persimilis), Ngải sậy hoang An Giang họ Gừng Zingiberaceae, hoặc nấm dược liệu như Linh Chi (Ganoderma), nấm gây bệnh (Phytothphora); động vật quý hiếm đặc hữu Việt Nam Nguyễn Thị

Thanh Nga và cộng sự (2012) đã tiến hành nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền

một số loài cây dược liệu Việt Nam thuộc chi Đảng sâm (Codonopsis sp) bằng kỹ

thuật ADN mã vạch, kết quả nghiên cứu đã khuếch đại thành công hai vùng gen

ITS và matK và phân tích được sự đa hình trên mỗi vùng gen Nghiên cứu đã ứng dụng mã vạch ADN trong phân tích đa dạng di truyền các loài Codonopsis ở Việt

Nam và cùng các kết quả nghiên cứu trước đây trên thế giới đã khẳng định vùng

gen ITS va matK có thể giúp nhận diện loài và dưới loài như một mã vạch phân

tử, đồng thời có thể được dùng cho các nghiên cứu tiếp theo về tiến hóa phân tử

và nghiên cứu bảo tồn nguồn gen của loài dược liệu quý Hoàng Đăng Hiếu và cộng sự (2012), đã sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong phân tích đa dạng

và định dạng của tập đoàn cây Dó bầu (Aquilaria sp.) tại Hà Tĩnh, kết quả nghiên

cứu đã tách chiết và tinh sạch được ADN tổng số của 18 mẫu Dó bầu trong đó có

3 loài của Lào, 4 mẫu thu tại Phú Quốc và 11 mẫu thu tại Hà Tĩnh; đã nhân bản

thành công các đoạn gen trnH-psbA, rbcL, rpoB, ITS bằng phương pháp PCR từ

ADN tổng số của 18 mẫu Dó bầu Hà Văn Huân (2014) đã triển khai nghiên cứu

“Xây dựng cơ sở dữ liệu chỉ thị phân tử ADN mã vạch cho loài Sến mật (Madhuca pasquierii) phục vụ giám định loài” và phân lập đoạn DNA barcoding cho loài Trà hoa vàng Tam Đảo (Camellia tamdaoensis) phục vụ bảo tồn và phát triển loài

Trà đặc hữu, quý hiếm của Việt Nam

Các nghiên cứu trên đã tạo tiền đề quan trọng cho hướng nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử vào việc phân loại, giám định, đánh giá đa dạng di truyền, bảo tồn

và quản lý thương mại nguồn tài nguyên sinh vật ở nước ta

13

PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

Trong chuyến khảo sát thực địa tại quần đảo Trường Sa TS Vũ Đình Duy và nhóm nghiên cứu đã thu được 18 mẫu sinh học (lá) của 6 loài thực vật được dùng làm vật liệu trong nghiên cứu này (Hình 2.1, Bảng 2.1) Các mẫu lá được bảo quản trong túi nhựa dẻo có chứa silicagel ngay tại thực địa và chuyển đến phòng thí nghiệm giữ ở tủ lạnh âm sâu 30oC đến khi sử dụng tách chiết ADN

Hình 2.1 Hình ảnh Hoa và Quả của 06 loài thực vật ở quần đảo Trường Sa:

Phong ba (a); Bão táp (b); Bàng vuông (c); Nhàu (d); Mù u (e); Tra (f)

[Ảnh: TS Bùi Văn Thanh]

Số hiệu tiêu bản

Số mẫu thu

Phong ba Tournefortia

quần đảo Trường Sa, Việt Nam

2.2 Địa điểm thực hiện nghiên cứu

Phòng thí nghiệm của Trung tâm nhiệt đới Việt – Nga và Viện Công nghệ

Sinh học Lâm nghiệp (từ tháng 1/2020 đến tháng 6/2021)

2.3 Hóa chất và các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

2.3.1 Hóa chất

+ Hóa chất sử dụng để tách chiết ADN: Nitơ lỏng, bộ kít tách ADN tổng số + Hóa chất dùng cho điện di gel agarose: đệm TAE 1X, agarose, 6x Loading dye, thuốc nhuộm redgel 10.000X

+ Hóa chất PCR: H2O deion, Master Mix PCR, các cặp mồi

2.3.2 Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

Các trang thiết bị và dụng cụ thí nghiệm được tiến hành trong Phòng thí nghiệm của viện Sinh thái Nhiệt đới, Trung tâm Nhiệt đới Việt – Nga và Viện Công nghệ Sinh học, trường Đại học Lâm nghiệp Các thiết bị bao gồm: Cân phân tích, Máy quang phổ NP80 (Nanophotometer, Đức), Máy chụp ảnh gel (Gel Doc

It, Mỹ), Hệ thống điện di (Cleaver Scientific Ltd, Anh), Bể ổn nhiệt, Máy lắc VELP (Scientifica, Đức), Tủ ấm (Panasonic, Nhật Bản), Tủ lạnh âm sâu -30oC (Panasonic, Nhật Bản), Tủ mát 4oC (FRIMED, Nhật Bản) Máy PCR (Prime

15

Thermal Cycler, Anh), Tủ an toàn sinh học (ESCO, Singapore), Máy li tâm EBA

21 (Hettich Zentrifugen, Đức)

2.4 Phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm

2.4.1 Sơ đồ nghiên cứu

Quy trình nghiên cứu được tiến hành theo sơ đồ Hình 2.2

Hình 2.2 Sơ đồ thiết kế trong nghiên cứu

2.4.2 Tách chiết ADN tổng số:

ADN tổng số được tách chiết từ mẫu lá khô của 18 mẫu thuộc 6 loài thu ở Trường Sa đã được nghiền thành bột mịn trong nitơ lỏng, sử dụng bộ hóa chất Plant ADN isolation Kit (Norgenbiotek, Canada) Các bước được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất

16

2.4.3 Định lượng ADN tổng số

Định lượng nồng độ ADN và độ tinh sạch bằng cách đo chỉ số OD260/280 (tỷ lệ hấp thụ quang của ADN ở bước sóng 260 nm so với độ hấp thụ quang tại bước sóng 280 nm) trên máy quang phổ Nanodrop 2000 Mỗi mẫu ADN tổng số được

đo 03 lần và lấy giá trị trung bình của 03 lần đo Nồng độ ADN thu được càng cao

và giá trị OD260/280 nằm trong khoảng 1,8 – 2,0 được coi là ADN tách chiết có độ tinh sạch cao

Độ dài sản phẩm PCR

Tham khảo

Li et al., 2018

2.4.5 Nhân dòng đoạn gen đích bằng kỹ thuật PCR

Để tìm ra quy trình nhân dòng đặc hiệu và ổn định cho các mẫu trong quá trình PCR, chúng tôi tiến hành 3 loại phản ứng tối ưu: Tối ưu nhiệt độ, tối ưu nồng

độ ADN và tối ưu nồng độ mồi Mỗi phản ứng PCR có thể tích 25µL với các thành phần: 7 µL H2O deion, 12,5 µL PCR Master mix 2X (Thermo Scientific™), 1,25 µL mồi xuôi (10 pmol/µL), 1,25 µL mồi ngược (10 pmol/µL), 3 µL ADN (10 – 20 ng) Phản ứng được thực hiện trên máy PCR model 9700 (GeneAmp PCR System 9700, Mỹ) Chu trình nhiệt của phản ứng PCR gồm: 940C trong 3 phút; tiếp sau là 35 chu kỳ nối tiếp nhau với các bước: 940C trong 45 giây, 550C trong 45 giây, 720C trong 45 giây; kết thúc phản ứng nhân gen ở 720C trong 10 phút, giữ sản phẩm ở 4C

17

2.4.6 Phương pháp điện di ADN trên gel agarose 1.5%

Điện di ADN là phương pháp được sử dụng trong cả phân tích định tính và định lượng mẫu ADN ADN là đại phân tử sinh học mang điện tích âm, khi đặt trong môi trường có điện trường các phân tử ADN có kích thước khác nhau sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dương với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào kích thước Gel agarose là loại gel thông dụng và phổ biến nhất, thao tác đơn giản, thường được sử dụng để phân tích những đoạn ADN có kích thước khoảng 0,5 – 20 kb Gel được đổ trên một giá thể nằm ngang

Chúng tôi thực hiện điện di kiểm tra ADN tổng số và sản phẩm PCR bằng điện di trên gel Agarose 1,5%, sử dụng đệm TAE 1X, nhuộm gel bằng Redgel 10000X, thực hiện trên thiết bị điện di của hãng Biorab

Bước 1: Pha gel agarose 1,5%

+ Cân 1,5g agarose cho vào 100ml TAE 1X

+ Đun nóng bằng lò vi sóng

+ Bổ sung 1µl Redgel 10000X/100ml gel, mix đều

Bước 2: Lắp lược vào bản gel, đổ gel, chờ 20 - 30 phút cho gel đông lại Bước 3: Điện di

+ Tra vào mỗi giếng 5µl sản phẩm PCR

+ Chạy điện di trong dung dịch TAE 1X, 120V trong 30 phút

+ Soi gel bằng tia UV

Có hai phương pháp đọc trình tự được phát triển cùng lúc là phương pháp phân hủy hóa học của Maxam, Gilbert (Mỹ) và phương pháp xác định trình tự bằng đánh dấu huỳnh quang của Sanger (Anh) Cả hai phương pháp đều cho phép