TỔNG QUAN
Giới thiệu về cây Dó Bầu
- Tên khoa học: Aquitarra crassna Pierre ex Lecomte,
- Tên khác: Kỳ nam, trầm, Dó bầu, rà hương
Tên gọi của nước ngoài cho gỗ trầm khác nhau tùy theo từng quốc gia Ở Anh, nó được gọi là Agarwood hoặc malayan eaglewood; ở Pháp, tên gọi là bois d’aigle; trong khi ở Trung Quốc, người ta gọi là tuchenxiang (tiếng phổ thông Ch’en Hsiang).
1.1.1 Đặc điểm sinh thái của cây Dó Bầu
Dó bầu là cây trung tính, ưa bóng khi còn nhỏ và cần ánh sáng khi trưởng thành Loài cây này thường mọc rải rác trong các khu rừng ẩm nhiệt đới nguyên sinh hoặc thứ sinh, xanh quanh năm, và thích hợp trong rừng hỗn giao với cây lá rộng Dó bầu có thể được tìm thấy ở độ cao lên đến 1.000m, nhưng thường tập trung chủ yếu ở độ cao dưới 700m.
Thuận Hải thường phát triển ở độ cao từ 300-800m với độ dốc trên 25° Nhiệt độ lý tưởng cho cây không dưới 15°C và không vượt quá 35°C, thường dao động trong khoảng 22-29°C Khu vực này có lượng mưa hàng năm từ 1.200mm trở lên và mùa khô kéo dài từ 3 đến 6 tháng Cây Trầm thích hợp với đất thịt pha cát, có tầng đất sâu, dày và nhiều mùn, đồng thời ưa sống trong môi trường rừng hỗn giao cây lá rộng và rừng nhiệt đới thường xanh.
1.1.2 Đặc điểm hình thái của cây Dó Bầu
Dó bầu là cây gỗ lớn, thường xanh, cao từ 15 - 30m, với đường kính ngang ngực 40 - 80cm Thân cây thẳng, vỏ nhẵn màu xám, dày 2 - 4mm, có vết nhăn dọc Cành non có lông mềm màu vàng xám, lá hình bầu dục hoặc lưỡi mác, mọc đối, mặt trên xanh bóng, mặt dưới xanh nhạt với gân nổi rõ Gỗ dó bầu có màu trắng hoặc vàng nhạt, nhẹ và mềm, đặc biệt có cấu trúc Libe xen gỗ, là hiện tượng quan trọng trong nghiên cứu tạo Trầm.
Cây trên 3 năm tuổi có khả năng ra hoa với hoa lưỡng tính, thường mọc thành chùm ở nách lá và có màu trắng tro Đài hoa hình chuông có lông ở miệng, trong khi cụm hoa dạng tán hoặc ở đầu cành với cuống dài 2 - 3cm Hoa nhỏ, mặt trong nhẵn, có 10 đường gân rõ và 5 thuỳ dài hình trứng thuôn, dài 12 - 15mm Phần phụ dạng cánh hoa gắn gần họng, với 10 nhị và bầu hình trứng 2 ô có lông rậm cùng tuyến mật ở gốc Quả nang gần hình trứng ngược hoặc hình quả lê, dài 3 - 4cm và đường kính 2,5 - 3cm, có lông mềm và ngắn, khi khô nứt thành hai mảnh, mỗi quả thường cho một đến hai hạt.
Hạt có cấu trúc gồm hai phần: phần chính hình nón ở trên và phần kéo dài ở dưới Khi chín, hạt có màu nâu với lớp vỏ ngoài cứng và bên trong chứa nhiều dầu Tuy nhiên, hạt Trầm hương có tuổi thọ ngắn và không thể lưu trữ lâu Trong tự nhiên, khi hạt rụng xuống đất và gặp điều kiện độ ẩm thích hợp, chúng sẽ nảy mầm ngay lập tức Nếu lưu trữ hạt quá một tuần, tỷ lệ nảy mầm sẽ giảm đến 80% hoặc có thể không nảy mầm.
Hình 1.1: Hình thái cây và lá Trầm hương 1.1.3 Đặc điểm sinh học của cây Dó Bầu
Hình 1.2: Mặt cắt ngang thân cây Dó bầu có trầm hương
Cơ chế hình thành trầm hương trong cây Dó bầu vẫn còn là một bí ẩn chưa được giải mã hoàn toàn Các khối trầm hương được cho là sản phẩm của quá trình chuyển hóa bệnh lý tại những vùng bị tổn thương hoặc nhiễm bệnh.
Căn cứ vào sự hóa nhựa (sự tụ dầu) nhiều hay ít mà ta có các loại trầm hương khác nhau như:
- Tóc (có nguồn gốc từ chữ tok của người campuchia), nhựa(dầu) nhiễm bên ngoài mạch gỗ
Trầm hương là loại gỗ có sự phân hóa không hoàn chỉnh, với ít tấm nhựa hơn, màu nâu hoặc có sọc đen Gỗ trầm hương nhẹ, có khả năng nổi trên nước và thường được sử dụng để chưng cất tinh dầu.
Kỳ nam, hay còn gọi là điều kỳ diệu của phương nam, là sản phẩm từ sự biến đổi hoàn toàn của các phần tử gỗ Những phần tử này thường thoái hóa, biến dạng và mất đi mộc tố, tạo ra một chất nhựa thơm có màu nâu đậm hoặc đen Kỳ nam nặng, chìm trong nước và có vị đắng, thường hình thành ở phần lõi gỗ, với nhựa nhiễm cả bên trong lẫn bên ngoài mạch gỗ đậm đặc.
1.1.4 Địa điểm phân bố của cây Dó bầu
Cây Aquilaria, hay còn gọi là cây Trầm hương, phân bố rộng rãi ở các nước Châu Á, từ Trung - Cận Đông, Nam Á, Trung Quốc đến Đông Nam Á Tại khu vực Trung - Cận Đông, cây Trầm hương thường mọc trên những dãy núi hiểm trở phía Nam Ả Rập Ở Trung Quốc, Trầm hương chủ yếu tập trung ở các tỉnh miền Nam, đặc biệt là Quảng Đông và Hải Nam, tuy nhiên chất lượng trầm ở đây không cao (Thổ Trầm) Vùng này có ba loài chính, bao gồm Aquilaria grandiflora Bth và Aquilaria sinensis.
Merr, Aquilaria yunnanensis S.C Huang Ở vùng Nam Á cây Trầm hương có nhiều ở Ấn Độ, chủ yếu là loài
Vùng Đông Nam Á bao gồm các quốc gia:
- Malaysia: Có 4 loài: Aquilaria beccariana van Tiegh, Aquilaria microcarpa Baill, Aquilaria hirta Ridl và Aquilaria rostrata Ridl
- Thái Lan: Chủ yếu là loài Aquilaria subintegra Ding Hou
- Indonesia (Tập trung chủ yếu ở đảo Sumatra) Có 4 loài: Aquilaria beccariana van Tiegh, Aquilaria hirta Ridl, Aquilaria microcarpa Baill,
- Philippin có các loài: Aquilaria cumingiana (Decne) Ridl, Aquilaria filaria (Oken) Merr, Aquilaria apiculata Merr, Aquilaria acuminate
- Ở Singarpore chủ yếu là loài Aquilaria hirta Ridl
- Ở Campuchia, Trầm hương thường mọc phân tán trong các khu rừng nằm ven biển, có 2 loài chính là: Aquilaria crassna Pierre ex Lecomte, Aquilaria baillonii Pierre ex Lecomte
- Việt Nam Trầm hương có tất cả 5 loài, đó là: Aquilaria crassna Pierre ex Lecomte, Aquilaria baillonii Pierre ex Lecomte, Aquilaria banaense
Pham-hoang-Ho, Aquilaria yunnanensis S.C Huang và loài Aquilaria rugosa L.C.Kiệt & PJ.A Kessler [12] Ở Việt Nam cây Trầm hương phân bố tại các địa bàn như:
- Phía Bắc: Hoàng Liên Sơn, Tuyên Quang, Hòa Bình, Quảng Ninh, Bắc Giang, Cao Bằng, Lạng Sơn, Hà Giang
- Miền Trung: Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên, Quảng Nam, Đà Nẵng, Quảng Ngãi, Bình Định, Phú Yên, Bình Thuận, Khánh Hòa
- Tây Nguyên: Gia Lai, Kontum, ĐăLăk, Lâm Đồng
Miền Nam Việt Nam bao gồm các tỉnh Bình Phước, Đồng Nai, Tây Ninh, An Giang, Kiên Giang và Đảo Phú Quốc Cây Dó bầu từng phổ biến dọc theo dãy Trường Sơn, nhưng hiện nay do khai thác bừa bãi, chúng chỉ còn xuất hiện ở những vùng xa xôi, đầu nguồn rừng già.
Trong những năm gần đây, nhiều tác giả đã đề cập đến các vấn đề sinh thái và phân bố của cây Dó bầu trong các báo cáo nghiên cứu.
Cây Dó bầu, theo GS Lê Văn Ký, phân bố rộng rãi trên lãnh thổ Việt Nam và nhiều nước Châu Á nhiệt đới như Lào, Cambodia, và Ấn Độ Tại Việt Nam, cây Dó bầu mọc rải rác ở nhiều tỉnh từ Bắc vào Nam, bao gồm Lạng Sơn, Quảng Ninh, Hà Tuyên, Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Bình, Quảng Trị, Huế, Quảng Nam, Đà Nẵng, và hầu hết các tỉnh phía Nam Tuy nhiên, nơi tập trung nhiều nhất là các tỉnh Duyên Hải và huyện đảo Phú Quốc.
1.1.5 Công dụng của cây Dó bầu
1.1.5.1 Lợi ích với sức khỏe
Công dụng nổi bật của loại lá này đó chính là đối với y học và sức khỏe
Ngày nay, thực phẩm chức năng từ lá cây ngày càng được ưa chuộng, đặc biệt là lá cây có tuổi đời từ 7 năm trở lên, được phơi khô và chiết xuất thành cao để tăng cường sức khỏe và hỗ trợ điều trị bệnh Đối với trà, lá cây từ 9 tháng tuổi được sử dụng, và sản xuất trà này không chỉ diễn ra ở Việt Nam mà còn ở nhiều nước châu Á như Lào và Thái Lan Đây là loại thức uống có lợi cho sức khỏe, hiện đang rất phổ biến và được yêu thích tại Lào.
1.1.5.2 Lợi ích kinh tế, xã hội
Cây Dó bầu, với toàn bộ thân, rễ và lá, được sử dụng để chưng cất tinh dầu Trầm, mang lại giá trị kinh tế cao Trầm Hương, đặc biệt là Kỳ Nam, có giá trị lên đến hàng tỷ đồng, với Kỳ Nam là loại cao cấp nhất, có giá trị lên đến hàng nghìn tỷ đồng cho một khối Sản phẩm này không chỉ được ưa chuộng trên thị trường mà còn chứa nhiều hoạt chất tốt cho sức khỏe.
Tổng quan nghiên cứu tạo Trầm hương
1.2.1 Nghiên cứu tạo Trầm hương tại Việt Nam
Nhu cầu về Trầm hương trên thế giới đang gia tăng, dẫn đến nhiều tổ chức trong và ngoài nước đầu tư vào dự án trồng cây Dó Bầu Ông Nguyễn Ngọc Toàn, chủ tịch hội đồng quản trị công ty Fong San, đã đầu tư trồng 60 hecta Dó Bầu tại xã An Khương, tỉnh Bình Phước Kết quả cho thấy việc gây tạo Trầm trên cây Dó Bầu đã thành công, giúp công ty phát triển và mở rộng mô hình này ra nhiều tỉnh thành như Quảng Ngãi, Quảng Nam, Đà Nẵng, Gia Lai, Lâm Đồng, và nhiều nơi khác trên cả nước.
Người dân nhiều tỉnh thành trên cả nước đã phát triển và trồng cây Dó bầu tại nhà, áp dụng các phương pháp tạo Trầm hiệu quả như đốt sắt, cấy bột sắn và mảnh bom đạn vào thân cây để tạo vết thương và dẫn dụ kiến Một nghiên cứu của Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam cho thấy trong số 59 cây Dó bầu, có 13 cây có khả năng xuất khẩu (21%), 21 cây có dấu hiệu hình thành Trầm hương (35,6%), và 25 cây không có Trầm hương Kỹ sư Nguyễn Hồng Lam đã thực hiện nghiên cứu tạo Trầm hương trên 54 cây Dó bầu từ 6 đến 18 tuổi, cho thấy 27 cây chỉ tác động cơ giới không có dấu hiệu tạo Trầm sau 2 năm, trong khi 27 cây còn lại sử dụng dung dịch Benlat không cho kết quả Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng việc tạo Trầm liên quan đến bệnh lý của cây Thêm vào đó, một nghiên cứu khác về khả năng tạo Trầm bằng chế phẩm sinh học cho thấy sự hình thành Trầm không phụ thuộc vào lứa tuổi của cây, nhưng cây lớn hơn có đường kính lớn hơn sẽ cho Trầm nhiều hơn.
1.2.2 Nghiên cứu tạo Trầm hương trên thế giới Ở Ấn Độ, TS Shiva cho rằng kết quả hình thành Trầm trong tự nhiên có liên quan đến bệnh lý của cây nhưng về nguồn gốc gây bệnh thì tác giả chưa kết luận được Ở Malaysia, sau khi tìm hiểu về vấn đề tạo Trầm hương ngoài tự nhiên tiến sĩ khoa học Julajudin đã kết luận: quá trình hình thành Trầm trong tự nhiên có liên quan đến bệnh lý của cây, nguồn gốc hình thành Trầm là do sự cộng sinh của các loài nấm Criptophoerica mangifera với thân gỗ mà thành (1996)
Năm 1989, tiến sĩ Naiyna Thpongijem và cộng sự (Thái Lan) đã nghiên cứu về vấn đề tạo Trầm, họ cho rằng quá trình hình thành Trầm hương trên cây
Dó bầu là kết quả cộng sinh của các loại nấm Cephalos Potrium, Botriodiplodia,
Các phương pháp kích thích tạo Trầm hương
Sự gia tăng số lượng rừng trồng Dó bầu và nỗ lực phát triển các phương pháp cảm ứng nhân tạo nhằm kích thích hình thành Trầm hương đang hướng tới việc nâng cao sản lượng Trầm hương chất lượng cao cho người sử dụng Các phương pháp này cần thiết thực cho các đồn điền và doanh nghiệp lớn, với mục tiêu tối đa hóa nguồn cung gỗ trầm hương trong thời gian ngắn nhất Kết hợp với các thực hành nông nghiệp tốt, các phương pháp nhân tạo dự kiến sẽ mang lại sản lượng gỗ trầm hương cao hơn so với quy trình tự nhiên, với chất lượng lý tưởng gần giống hoặc thậm chí vượt trội hơn so với gỗ Trầm hương tự nhiên.
Trầm hương là hợp chất nhựa do cây Aquilaria spp sản xuất để phản ứng với tổn thương sinh học và phi sinh học Quá trình hình thành trầm hương diễn ra trong tế bào nhu mô, bao gồm phloem và mạch, khi cây kích hoạt bộ máy tế bào để tổng hợp các chất bảo vệ chống lại tác nhân bên ngoài Các cấu trúc giải phẫu này có vai trò quan trọng trong việc sản xuất, lưu trữ và phân phối các thành phần gỗ vào khu vực bị thương, từ đó tạo ra gỗ trầm hương Hiện nay, có hai phương pháp chính để tạo ra gỗ trầm hương nhân tạo: phương pháp truyền thống và phương pháp hiện đại.
1.3.1 Phương pháp tạo trầm hương truyền thống
Phương pháp truyền thống là các phương pháp được hình thành dựa trên các kinh nghiệm cá nhân, được truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác
Trung Quốc đã sử dụng trầm hương từ rất sớm, với các phương pháp tạo ra sản phẩm này được phát triển trước thời nhà Tống (A.D 960) (Liu và cộng sự 2013) Theo Pojanagaroon và Kaewrak (2005), phương pháp cơ bản để kích thích cây tạo trầm hương là làm tổn thương cây, dẫn đến việc nông dân áp dụng các kỹ thuật như khoan, đốt, cắt tỉa, và sử dụng rìu hoặc dao rựa để loại bỏ vỏ cây, cũng như đóng đinh trên cây nhằm kích thích quá trình này (Liu và cộng sự 2013; Rasool và Mohamed 2016).
Các phương pháp tạo Trầm hương có thể hiệu quả và tiết kiệm chi phí, nhưng lại tốn nhiều công sức và thời gian, dẫn đến quá trình sản xuất kéo dài và có thể ảnh hưởng đến chất lượng gỗ Trầm Hơn nữa, khi sử dụng phương pháp vật lý để kích thích tạo Trầm, hương chỉ hình thành ở những vùng bị tổn thương, do đó năng suất thu hoạch không cao.
1.3.2 Phương pháp tạo trầm hương hiện đại
Sử dụng các phương pháp hiện đại để tạo ra điều kiện gần gũi với tự nhiên cho sự hình thành Trầm hương bao gồm việc áp dụng chất xúc tác hoặc chất cảm ứng để kích thích cây Hiện nay, chất cảm ứng trên thị trường được chia thành hai loại: phương pháp cảm ứng sinh học và phương pháp cảm ứng hóa học Tóm tắt các nghiên cứu về việc tạo Trầm hương bằng các phương pháp này được trình bày trong bảng 1.1.
Bảng 1.1 Các nghiên cứu tạo trầm hương bằng phương pháp sinh học [14]
Năm Đề tài Người thực hiện
Agarwood constituents stimulated by crude extracts of Trichoderma in cell suspension culture of A malaccensis
Fifteen different fungal isolates from Fusarium,
Cladosporium, Scytalidium, and Mucor species, identified from A malaccensis pre-inoculated with
Patent of selected strains of Fomitopsis, L theobromae, Rigidoporus vinctus, Pestalotiopsis virgatula and Trichoderma erinaceum
Four different F solani strains (GSL1-GSL4) introduced for commercial inoculation Faizal et al
Acremonium and Fusarium species found effective on
The patent describes a chemical inducer composed of various compounds, including glucohexaose, potassium dihydrogen phosphate, magnesium chloride, calcium nitrate, ammonium nitrate, potassium sulfate, copper sulfate, sodium molybdate, boric acid, zinc sulfate, manganese sulfate, and ethylene diamine tetraacetic acid This innovative formulation is designed to enhance plant growth and improve agricultural productivity.
The fermentation liquid from L theobromae and F solani induced agarwood formation in A sinensis Chen et al
A chemical solution and fungal elicitor from L theobromae produced 2-(2-phenylethyl)chromones in
Arthrinium, Colletotrichum and Diaporthe species associated to a broad spectrum of volatile compounds in agarwood oil
Các chất cảm ứng sinh học, hay còn gọi là "inoculum", thường là chế phẩm sinh học có nguồn gốc từ vi sinh vật như nấm men và nấm mốc Kỹ thuật này bao gồm việc nuôi cấy nấm vào cây để mô phỏng tình trạng bệnh lý của Aquilaria ở giai đoạn non Các loài nấm được phân lập từ tự nhiên và nuôi cấy trong điều kiện kiểm soát tại phòng thí nghiệm, có thể thực hiện trên môi trường thạch trong đĩa petri hoặc trong môi trường lỏng để thu thập dịch bào tử.
“Inocula” được sản xuất từ các thành phần địa phương như rỉ đường và nước ép trái cây, chứa nhiều loại vi khuẩn và sản phẩm lên men do môi trường không kiểm soát Thời gian ủ dài là cần thiết để tạo ra gỗ sẫm màu hơn và thu được trầm hương chất lượng tốt hơn, giúp vi sinh vật phát triển và tấn công vào cấu trúc cây, kích thích sản sinh nhựa cây để chống lại tác nhân vi sinh vật Nghiên cứu đã phân lập nấm từ gỗ trầm hương tự nhiên để tìm hiểu vai trò của nấm trong quá trình hình thành trầm hương.
Chi nấm đã thu hút sự quan tâm của các nhà nghiên cứu ở Indonesia là
Nhiều loại nấm như Fusarium, Paraconiothyrium variabile, Botryosphaeria dothidea, Aspergillus niger, Fomitopsis spp., Lasiodiplodia theobromae và Trichoderma spp đã được phân lập từ cây trầm hương và đang được nghiên cứu Mục tiêu của việc thử nghiệm các loại nấm này là xác định những loài có khả năng kích thích tạo ra trầm hương chất lượng cao Tuy nhiên, kết quả có thể khác nhau tùy thuộc vào địa điểm áp dụng.
Các chất cảm ứng hóa học có khả năng phản ứng nhanh và mang lại năng suất cao, được sử dụng để bảo vệ cây và thúc đẩy sản xuất nhựa không chỉ cho Aquilaria spp mà còn cho các loài khác như vân sam Na Uy (Picea abies) Loài Picea abies tạo ra oleoresin dựa trên terpenoid để chống lại côn trùng và mầm bệnh Đối với Aquilaria, các hoạt chất như methyl jasmonate, ethylene và axit salicylic đã được xác định là có khả năng kích thích sản xuất gỗ trầm hương Các chất cảm ứng hóa học phổ biến trên thị trường bao gồm methyl jasmonate, hydro peroxide, natri methyl bisulfite, natri clorua, sắt clorua, axit formic, cellobiose, axit salicylic và chitin Tuy nhiên, việc sử dụng các chất này cần được nghiên cứu thực địa để xác định nồng độ thích hợp, tránh gây chết cây do nồng độ quá cao.
Một số công trình nghiên cứu cấy tạo trầm hương nhân tạo
Trước nhu cầu ngày càng cao về Trầm hương nguyên liệu và giá cả tăng, nhiều dự án đầu tư vào trồng cây Dó bầu đã được triển khai Ông Nguyễn Ngọc Toàn, chủ tịch Hội đồng quản trị công ty Fongsan, đã đầu tư 60 hecta Dó bầu tại xã An Khương, huyện Bình Long, tỉnh Bình Phước, với cây đã được 5 năm tuổi Ông Toàn và ông Sơn đang tạo Trầm hương từ những cây Dó bầu này và đã đạt được những thành công ban đầu Công ty Fongsan cũng đã mở rộng mô hình này ra nhiều tỉnh thành khác như Quảng Nam, Đà Nẵng, Quảng Ngãi, Phú Yên, Lâm Đồng, Gia Lai.
Nhiều nông dân ở các tỉnh thành trên cả nước đã phát triển và trồng Dó bầu tại vùng đất của mình, dựa vào kinh nghiệm dân gian để tạo Trầm hiệu quả Họ áp dụng các phương pháp như cấy bột sắn, cấy mảnh bom, đạn, và cho dầu vào vết thương để dẫn dụ kiến, từ đó tạo ra Trầm mắt kiến Một nghiên cứu của Viện khoa học Lâm nghiệp đã điều tra 59 cây Dó bầu, trong đó 13 cây cho Trầm hương xuất khẩu (21%), 21 cây có dấu hiệu hình thành Trầm hương (35,6%), và 25 cây không có Trầm hương Đề tài gây tạo Trầm hương bằng tác động cơ giới của Kỹ sư Nguyễn Hồng Lam đã thực hiện trên 54 cây Dó bầu từ 6 đến 18 tuổi, cho thấy 27 cây chỉ bị tổn thương mà không có tác động thêm, trong khi 27 cây còn lại sau khi bị tổn thương đã được phun dung dịch phòng bệnh Benlat 1%.
Nghiên cứu cho thấy việc phun chế phẩm sinh học Benlat theo định kỳ 2 tháng một lần trong 3 lần không mang lại hiệu quả tạo Trầm hương cho 27 cây Dó bầu đã bị tổn thương Trong khi đó, 2 cây không phun Benlat sau 4, 6, và 8 năm đã tạo Trầm hương Điều này cho thấy sự hình thành Trầm hương có liên quan đến bệnh lý của cây Đề tài nghiên cứu khả năng tạo Trầm bằng chế phẩm sinh học (Lt) từ Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam đã thực hiện gây chấn thương cơ giới tại các vị trí 0,8m, 1,2m, và 1,5m trên thân cây, sau đó đưa chế phẩm sinh học vào vết thương, với 3 nhóm tuổi cây Dó bầu: nhóm 1 từ 4 - 8 tuổi, nhóm 2 từ 10 - 14 tuổi.
3 từ 16 đến 20 tuổi Ngoài ra trong phạm vi đề tài còn đánh giá sự tạo Trầm ở rừng trồng tập trung và phân tán
Kết quả nghiên cứu cho thấy sự hình thành Trầm ở các nhóm lứa tuổi là đồng nhất, và quá trình tạo Trầm bằng chế phẩm sinh học không bị ảnh hưởng bởi độ tuổi của cây Tuy nhiên, cây có độ tuổi cao hơn và đường kính gốc lớn hơn sẽ cho sản lượng Trầm cao hơn.
Từ năm 1996 đến 1998, GS.TS Trịnh Tam Kiệt đã hợp tác với tổ chức rừng mưa nhiệt đới quốc tế và các sở Lâm nghiệp tại Kiên Giang, Lâm Đồng và Quảng Nam để triển khai dự án gây tạo Trầm hương trên cây Dó bầu Dự án áp dụng một số chế phẩm sinh học và hóa học nhằm tạo ra Trầm hương thông qua việc gây vết thương cơ giới trên cây Tuy nhiên, đến nay, các tác giả vẫn chưa công bố kết quả đạt được.
Huỳnh Văn Mỹ (1997) cho biết nông dân ở Tiến Phước, Quảng Nam đã tự nghiên cứu và áp dụng kỹ thuật tạo Trầm trên cây Dó bầu từ 10 năm tuổi trở lên Kết quả cho thấy họ có thể tạo Trầm theo ý muốn, điều này mở ra cơ hội cho các nhà khoa học nghiên cứu, đánh giá và nhân rộng quy trình để sản xuất đại trà.
Nghiên cứu cấy tạo trầm đã được các nhà khoa học trên thế giới theo đuổi trong nhiều năm và đạt được nhiều thành công Tại Mỹ, Đại học Harvard đã phát triển thành công phương pháp này vào những năm 1980 Đến năm 1994-1995, Đại học Kyoto ở Nhật Bản cũng đã nghiên cứu thành công phương pháp cấy tạo trầm bằng men vi sinh, và phương pháp này sau đó được GS Gishi Honda thử nghiệm tại Trung Quốc với tỷ lệ thành công vượt 80%.
Trong những năm gần đây, GS Gishi Honda (Nhật Bản) và GS.TS Trần Kim Qui (Việt Nam) đã áp dụng quy trình công nghệ sinh học để tạo trầm trên thân gỗ cây Dó bầu tại Lâm Đồng, với kết quả ban đầu cho thấy sau 6 - 12 tháng cấy men vi sinh, mỗi cây thu được khoảng 700gr trầm Tại Malaysia, tiến sĩ Julajudin đã nghiên cứu và kết luận rằng quá trình hình thành trầm ngoài tự nhiên liên quan đến bệnh lý của cây, và nguồn gốc của trầm là do sự cộng sinh giữa loài nấm Criptophoerica Mangifera và thân gỗ.
Vào năm 1989, tiến sĩ Naiyna Thongijem cùng các cộng sự từ Thái Lan đã tiến hành nghiên cứu về quá trình tạo Trầm hương Họ cho rằng sự hình thành Trầm hương trên cây Dó bầu là kết quả của sự cộng sinh giữa các loài nấm như Cephalosporium, Fusarium, Botryodiplodia và Chactomium.
MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Mục tiêu nghiên cứu
- Phân lập và định danh được 3 - 5 chủng nấm tạo trầm hương từ thân cây
Dó bầu có trầm tự nhiên ở Khánh Hoà
- Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào của các dòng nấm đã phân lập và định danh
- Bước đầu nghiên cứu tạo chế phẩm vi sinh có khả năng kích thích tạo trầm hương.
Nội dung nghiên cứu
- Phân lập một số chủng nấm tạo trầm hương ở từ thân cây Dó bầu có trầm tự nhiên ở Khánh Hoà
- Định danh các dòng nấm phân lập được: Định danh thông qua hình thái và định danh thông qua sinh học phân tử
- Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào của các dòng nấm đã phân lập và định danh
- Nghiên cứu tạo chế phẩm vi sinh có khả năng kích thích tạo trầm hương
Vật liệu nghiên cứu
Thân cây Dó bầu có trầm tự nhiên ở Hương Khê - Hà Tĩnh
2.3.2 Các thiết bị, dụng cụ và hóa chất
Các thiết bị cần thiết bao gồm tủ cấy vô trùng, máy đo pH, máy lắc, nồi hấp khử trùng, máy xay, cân điện tử, cân phân tích, tủ nuôi vi sinh vật, box cấy, máy ly tâm, tủ lạnh và bếp điện.
- Dụng cụ: pipet, đĩa petri, ống đong, bình thủy tinh, ống falcon, ống eppendorf … và các dụng cụ khác
- Hoá chất: Cồn 960 , cồn 700, Lugol, xanh metylen, Kháng sinh Cefotaxime, Pepton, cao nấm men, Đường sucrose, Glucose, Agar, Khoai tây, NaOH 10% , NaCl 5%, Dầu soi kính
Các loại môi trường và thành phần sử dụng trong nghiên cứu:
Phương pháp nghiên cứu
2.4.1 Phương pháp phân lập nấm
Các mẫu gỗ từ thân cây Dó bầu có trầm được thu thập và bảo quản trong túi nilon vô trùng, với đầy đủ thông tin như tên mẫu, ngày lấy mẫu, số thứ tự và vị trí lấy mẫu.
Các mẫu gỗ được cắt thành từng mảnh nhỏ khoảng 2-3mm và được xử lý trước khi cấy lên môi trường trong đĩa petri Mỗi đĩa petri sẽ chứa từ 5-10 mẫu được rải đều, và sau khi cấy xong, các đĩa này được bảo quản ở nhiệt độ phòng 25°C Quá trình theo dõi diễn ra từ 2-7 ngày để kiểm tra sự phát triển của từng loại môi trường.
Hình 2.1: Đĩa môi trường đã được cấy mẫu và mẫu sau 7 ngày nuôi cấy
Để sàng lọc và tách các chủng nấm từ môi trường PDA, cần thực hiện việc cấy chuyển liên tục các khuẩn lạc ra môi trường PDA vô trùng Quá trình này nên được thực hiện nhiều lần (3-4 ngày cấy chuyển 1 lần) nhằm thu được giống nấm thuần khiết.
2.4.2 Phương pháp định danh nấm
2.4.2.1 Phương pháp định danh thông qua dặc diểm
- Quan sát hình thái và màu sắc hệ sợi của các chủng đã phân lập được;
- Quan sát sự hình thành bào tử và sự biến đổi màu sắc của bào tử nấm bằng mắt thường;
- Quan sát các hình thái hệ sợi và bào tử nấm dưới kính kiển vi ở vật kính40x, 100x sau đó:
Lấy mẫu lên lam kính rồi nhỏ nhuộn bằng xanh metylen để trong 3 phút rồi rửa bằng nước;
Nhuộn tiếp dung dịch lugol trong 1 phút rồi rửa lại bằng nước;
Rửa mẫu bằng côn trong 30 giây;
Soi dưới kính hiển vi quan sát bắt màu và các bào tử trên kính hiển vi.20
- Tiến hành so sánh các mẫu đã quan sát với khóa phân loại để phân loại sơ bộ các chủng đã phân lập
2.4.2.2 Phương pháp định danh bằng kĩ thuật sinh học phân tử a Chiết DNA và giải trình tự gen vùng ITS
DNA được chiết xuất từ các mẫu nấm thuần khiết sau 7 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA, sử dụng phương pháp CTAB (Cetyl trimethyl ammonium bromide) theo hướng dẫn của Doyle & Doyle (1987).
Cặn DNA được hòa trong 50 µl đệm TE và bảo quản ở -20 °C Phản ứng PCR được thực hiện với cặp mồi ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′) và ITS5 (5'-AGT AAA AGT ACA AGG CGT-3') để nhân toàn bộ vùng gen ITS của các mẫu nấm Tổng thể tích phản ứng là 25 µl, bao gồm 12,5 µl 2x PCR Master mix (INtRON), 0,5 µl mồi ITS5, 0,5 µl mồi ITS4, 0,5 µl DNA khuôn và 11,0 µl dH2O Quy trình PCR được thực hiện theo chu trình: (94 °C trong 5 phút) x 1 chu kỳ, (94 °C trong 40 giây, 52 °C trong 40 giây, 72 °C trong 1 phút) x 35 chu kỳ, (72 °C trong 5 phút) x 1 chu kỳ, và dừng phản ứng ở nhiệt độ phòng.
Sản phẩm PCR được chiết xuất từ agarose gel bằng kít DNA Gel Extraction Kit (NORGEN) theo hướng dẫn của nhà sản xuất Nồng độ DNA được ước lượng thông qua điện di agarose Sản phẩm PCR sau đó được giải trình tự trực tiếp với cặp mồi ITS4 và ITS5 bằng kít BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) trên máy PCR Cuối cùng, trình tự được phân tích để xác định tên loài nấm.
Dựa trên các trình tự thu được, chúng tôi đã thực hiện tìm kiếm trên cơ sở dữ liệu GenBank bằng phần mềm BLAST tại NCBI Các trình tự mẫu nấm và các mẫu tương đồng từ ngân hàng gen được sử dụng để phân tích trình tự và xây dựng phả hệ thông qua các phần mềm BioEdit 7.0, ClustalX2 và MEGA X.
2.4.3 Phương pháp xác định khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào
Khả năng sinh tổng hợp enzym ngoại bào của các chủng nấm được nghiên cứu trên môi trường PDA với 1% các nguồn cơ chất như tinh bột, carboxy methyl cellulose (CMC) và pectin, nuôi ở nhiệt độ 28˚C trong 2-14 ngày Nấm sẽ tiết enzym thủy phân cơ chất, phân giải chúng thành các cấu tử nhỏ hơn Phương pháp đục lỗ thạch được sử dụng để khảo sát khả năng sinh enzym ngoại bào, bằng cách nhỏ dịch nuôi cấy chứa enzym vào các lỗ thạch trên môi trường chứa cơ chất tương ứng Sau 24 giờ, sử dụng thuốc nhuộm Lugol 1%, các chủng nấm có khả năng sinh enzym ngoại bào sẽ tạo ra vòng phân hủy trong suốt trên môi trường.
2.4.4 Phương pháp tạo chế phẩm vi sinh có khả năng kích thích tạo Trầm hương
Nấm sau khi được phân lập và định danh sẽ được cấy vào môi trường lỏng và nuôi lắc trong điều kiện bình thường Trong quá trình này, cần quan sát sự thay đổi màu sắc của dịch trong các bình tam giác.
Sử dụng môi trường lỏng có bổ sung kháng sinh cefotaxime để nhân sinh khối sợi nấm:
Thành phần: Hàm lượng (g/l) Dịch chiết khoai, giá đỗ: 100
2.4.4.1 Tạo các chế phẩm vi sinh
Các dòng nấm nuôi trong môi trường lỏng trong 48 giờ được sử dụng để pha trộn thành các chế phẩm vi sinh với các công thức khác nhau, như được trình bày trong bảng 2.1 dưới đây.
Bảng 2.1: Công thức phối trộn các dòng nấm
Công thức Thể tích chủng nấm (ml)
Tổng dịch nấm 100ml 100ml 100ml
2.4.4.2 Đánh giá khả năng sống của các dòng nấm sau khi phối trộn với nhau theo tạo chế phẩm vi sinh
Bốn dòng nấm được phối trộn thành ba công thức chế phẩm vi sinh khác nhau và nuôi lắc ở nhiệt độ phòng trong 7 ngày Sau đó, các dòng nấm được phân lập lại bằng môi trường PDA trên đĩa petri, với dịch nấm được cấy đều trên bề mặt đĩa Các đĩa được nuôi ở nhiệt độ 25 °C và sau 2-7 ngày, tiến hành theo dõi để xác định số lượng dòng nấm phân lập lại được, từ đó đánh giá khả năng sống sót của các dòng nấm sau khi phối trộn.
Để sàng lọc và tách các chủng nấm từ môi trường PDA, cần thực hiện quá trình cấy chuyển liên tục nhiều lần nhằm thu được giống nấm thuần khiết.
2.4.5 Phương pháp thu thập và xử lý số liệu
Các thí nghiệm được lặp lại ít nhất 3 lần và số liệu thu thập được xử lý bằng các phần mềm chuyên dụng.
