Bước đầu nghiên cứu quy trình nhân giống cây hoàn ngọc trắng (pseuderanthemum palatiferum (nees) radlk ) bằng kỹ thuật in vitro

Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến khả năng tạo mẫu sạch in vitro cây Hoàn ngọc trắng.. Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp chất ĐHST đến khả năng nhân nhanh in vitro cây Hoàn

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÂM NGHIỆP

===***===

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Tên đề tài:

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG

CÂY HOÀN NGỌC TRẮNG (Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk.)

BẰNG KỸ THUẬT IN VITRO

NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

MÃ SỐ: 7420201

Giảng viên hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Văn Việt

ThS Đoàn Thị Thu Hương Sinh viên thực hiện: Triệu Thị Thắm

Mã SV: 1753070550

Hà Nội, tháng 5/2021

i

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập tại Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp – Trường Đại học Lâm Nghiệp, dưới sự hướng dẫn tận tình của các thầy cô giáo, tôi tích lũy thêm các kiến thức và rèn luyện kỹ năng thực hành, thực tập vô cùng quý báu Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp đã tạo điều kiện cho tôi được thực hiện đề tài khóa luận tốt nghiệp:

Bước đầu nghiên cứu quy trình nhân giống cây Hoàn ngọc trắng

(Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk.) bằng kỹ thuật in vitro

Để có được kết quả ngày hôm nay, tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ nhiệt tình của các thầy cô Bộ môn Công nghệ tế bào, Viện Công nghệ sinh học Lâm

Nghiệp

Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Văn Việt và ThS Đoàn Thị Thu Hương đã hướng dẫn và giúp đỡ tôi tận tình trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp

Cuối cùng tôi xin cảm ơn bạn bè và người thân đã động viên, chia sẻ giúp đỡ tôi hoàn thành đề tài này

Tôi xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày 15 tháng 5 năm 2021

Sinh viên thực hiện

Triệu Thị Thắm

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC VIẾT TẮT iv

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC HÌNH v

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 2

1.1 Tổng quan cây Hoàn ngọc trắng 2

1.1.1 Nguồn gốc và hệ thống phân loại 2

1.1.2 Đặc điểm hình thái và phân bố 2

1.2 Giá trị dược liệu cây Hoàn ngọc trắng 3

1.2.1 Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm 3

1.2.2 Cây Hoàn ngọc trắng hỗ trợ điều trị ung thư, ức chế sự phát triển của khối u 3

1.2.3 Cây Hoàn ngọc trắng chữa bệnh tiểu đường, huyết áp cao 4

1.2.4 Tác dụng bảo vệ gan 4

1.2.5 Tác dụng trong chữa bệnh về đường tiêu hóa, lở loét 4

1.3 Giá trị dinh dưỡng trong cây Hoàn ngọc trắng 5

1.4 Giá trị kinh tế cây Hoàn ngọc trắng 6

1.5 Tình hình nghiên cứu cây Hoàn ngọc trắng 6

1.5.1 Trên thế giới 6

1.5.2 Trong nước 10

1.5.3 Một số nghiên cứu nhân giống in vitro của các loài cùng họ 12

Chương 2.MỤC TIÊU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Mục tiêu nghiên cứu 15

2.1.1 Mục tiêu chung 15

2.1.2 Mục tiêu cụ thể 15

2.2 Đối tượng, phạm vi nghiên cứu 15

2.3 Địa điểm thực tập, thời gian làm KLTN 15

2.4 Nội dung nghiên cứu 16

iii

2.5 Phương pháp nghiên cứu 16

2.5.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến khả năng tạo mẫu sạch in vitro cây Hoàn ngọc trắng 16

2.5.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp chất ĐHST đến khả năng nhân nhanh in vitro cây Hoàn ngọc trắng 17

2.5.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của chất ĐHST đến khả năng ra rễ in vitro cây Hoàn ngọc trắng 18

2.5.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến khả năng sống của cây Hoàn ngọc trắng 19

2.5.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần ruột bầu đến khả năng sống và sinh trưởng của cây Hoàn ngọc trắng ngoài vườn ươm 19

2.6 Phương pháp thu thập và xử lí số liệu 20

2.6.1 Phương pháp thu thập số liệu 20

2.6.2 Phương pháp xử lý số liệu 21

Chương 3.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22

3.1 Kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến khả năng tạo mẫu sạch in vitro cây Hoàn ngọc trắng 22

3.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp chất ĐHST đến khả năng nhân nhanh in vitro cây Hoàn ngọc trắng 24

3.3 Kết quả ảnh hưởng của chất ĐHST đến khả năng ra rễ in vitro cây Hoàn ngọc trắng 28

3.4 Kết quả ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến khả năng sống của cây Hoàn ngọc trắng 30

3.5 Kết quả ảnh hưởng của thành phần ruột bầu đến khả năng sống và sinh trưởng của cây Hoàn ngọc trắng ngoài vườn ươm 32

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ BIỂU

4 ĐHST Điều hòa sinh trưởng

5 IBA indole -3- butyric acid

6 MS Môi trường Murashige và Skoog (1962)

7 NAA α – naphthaleneacetic acid

v

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến khả năng tạo mẫu

sạch in vitro cây Hoàn ngọc trắng 17 Bảng 2.2 Ảnh hưởng của tổ hợp chất ĐHST đến khả năng nhân nhanh in vitro

cây Hoàn ngọc trắng 18

Bảng 2.3 Ảnh hưởng của chất ĐHST đến khả năng ra rễ in vitro cây Hoàn ngọc

trắng 18 Bảng 2.4 Ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến khả năng sống của cây Hoàn ngọc trắng 19 Bảng 2.5 Ảnh hưởng của thành phần ruột bầu đến khả năng sống và sinh trưởng của cây Hoàn ngọc trắng ngoài vườn ươm 20

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến khả năng tạo mẫu sạch in vitro cây Hoàn ngọc trắng 22 Bảng 3.2 Ảnh hưởng của tổ hợp chất ĐHST đến khả năng nhân nhanh in vitro

cây Hoàn ngọc trắng 24

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của chất ĐHST đến khả năng ra rễ in vitro cây Hoàn ngọc

trắng 28 Bảng 3.4 Ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến khả năng sống của cây Hoàn ngọc trắng 31 Bảng 3.5 Ảnh hưởng của thành phần ruột bầu đến khả năng sống và sinh trưởng của cây Hoàn ngọc trắng ngoài vườn ươm 32

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cây Hoàn ngọc trắng [18] 2

Hình 3.1 Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến khả năng tạo mẫu sạch in vitro

cây Hoàn ngọc trắng 23 Hình 3.2 Mẫu cây Hoàn ngọc trắng được khử trùng bằng công thức CT3 sau 4 tuần nuôi cấy 24

Hình 3.3 Ảnh hưởng của tổ hợp chất ĐHST đến hệ số nhân nhanh chồi in vitro

cây Hoàn ngọc trắng 25

Hình 3.4 Ảnh hưởng của tổ hợp chất ĐHST đến tỷ lệ chồi hữu hiệu in vitro cây

Hoàn ngọc trắng 25 Hình 3.5 Chồi Hoàn ngọc trắng trong các công thức môi trường nhân nhanh khác nhau sau 6 tuần nuôi cấy 27

Hình 3.6 Ảnh hưởng của chất ĐHST đến chiều dài trung bình rễ in vitro cây

Hoàn ngọc trắng 28

Hình 3.7 Ảnh hưởng của chất ĐHST đến số rễ trung bình/cây in vitro cây Hoàn

ngọc trắng 29 Hình 3.8 Chồi Hoàn ngọc trắng giai đoạn ra rễ sau 6 tuần nuôi cấy ở các công thức môi trường 30 Hình 3.9 Ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến khả năng sống của cây Hoàn ngọc trắng 31 Hình 3.10 Cây Hoàn ngọc sau huấn luyện ra bầu 7 ngày ở công thức T2 và T3 32 Hình 3.11 Ảnh hưởng của thành phần ruột bầu đến tỷ lệ sống của cây Hoàn ngọc trắng 33 Hình 3.12 Ảnh hưởng của thành phần ruột bầu đến khả năng sinh trưởng của cây Hoàn ngọc trắng ngoài vườn ươm 33 Hình 3.13 Cây Hoàn ngọc trắng được trồng ở công thức ruột bầu RB3 trước và sau 4 tuần trồng 34

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cây Hoàn ngọc trắng (Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk.) là

một loài cây dược liệu gần gũi với người dân Việt Nam Từ thời xưa theo kinh nghiệm dân gian, cây Hoàn ngọc trắng có tác dụng khôi phục sức khỏe cho người ốm yếu, mệt mỏi, suy nhược thần kinh, làm việc quá sức, khủng hoảng về tinh thần và thể lực, chữa cảm cúm, rối loạn tiêu hóa, viêm loét đại tràng, dạ dày, trĩ nội, xơ gan cổ trướng, viêm đường tiết niệu, viêm thận, chấn thương, đau mắt đỏ, mắt trắng, đau không rõ nguyên nhân, rối loạn đường tiêu hóa, vết thương chảy máu, viêm mũi, dạ dày,…

Những năm gần đây các nhà khoa học đã nghiên cứu thành phần dược học trong cây Hoàn ngọc trắng từ đó sản xuất các chế phẩm hỗ trợ phòng chống khối

u và các dược phẩm có hoạt lực cao điều trị các bệnh như: viêm nhiễm, các loại ung thư, tăng cường hệ miễn dịch gan,…

Cây Hoàn ngọc trắng có nhiều tác dụng nên bị khai thác quá mức, diện tích trồng trên cả nước rất nhỏ Cây Hoàn ngọc trắng nằm trong danh mục các loài dược liệu tập trung phát triển ở quy mô lớn nhưng chủ yếu nhân giống bằng giâm hom trong thời gian dài, năng suất thấp, chất lượng cây con không đồng

đều Do đó, việc áp dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro giúp tăng năng suất và chất

lượng cây con có vai trò rất quan trọng trong công tác nhân giống và phát triển cây Hoàn ngọc trắng

Nhận thức được giá trị dược liệu của cây Hoàn ngọc trắng và việc phát triển loài cây này là vấn đề cấp thiết Vì vậy, tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài:

“Bước đầu nghiên cứu quy trình nhân giống cây Hoàn ngọc trắng

(Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk.) bằng kỹ thuật in vitro”

Chương 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan cây Hoàn ngọc trắng

1.1.1 Nguồn gốc và hệ thống phân loại

Cây Hoàn ngọc trắng thuộc họ Ôrô (Acanthaceae), có tên gọi khác là cây con khỉ, cây Xuân hoa, nhật nguyệt, tu lình, trạc mã, cây mặt quỷ, nội đồng, lay gàm, dièng tòn pièng (Dao), nhần nhéng (Mường)… được các nhà khoa học phát hiện năm 1990, là giống cây mọc sâu trong vườn quốc gia Cúc Phương

Tên khoa học: Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk

1.1.2 Đặc điểm hình thái và phân bố

Cây Hoàn ngọc trắng thuộc cây bụi, cao từ 1 - 3 m, là loài sống nhiều năm Khi còn non thân trơn nhẵn, màu xanh rất mềm, thân già hóa gỗ màu nâu, phân

ra thành nhiều mảnh Lá đơn mọc đối, màu xanh 2 mặt lá, lá mặt trên xanh đậm,

lá mặt dưới hơi nhạt, không bền, khi lá hơi ngả vàng sẽ rụng, dài từ 12 - 17 cm, rộng từ 3 - 3,5 cm, gốc thuôn, đầu nhọn, mép nguyên Lá ngọn rất mềm, bên trong có nhiều dịch nhầy, nhớt Cụm hoa mọc ở kẽ lá hoặc đầu cành, hoa lưỡng

tính Mùa hoa từ tháng 4 đến tháng 5 âm lịch Hoa có màu trắng pha tím, 5 đài tách rời nhau, 5 cánh chia 2 môi, môi trên 3 thùy, môi dưới 2 thùy, thùy giữa có chấm tím, tràng hoa hợp có ống hẹp và dài Chỉ nhị ngắn đính ở hỗng tràng,nhị

4, có 2 nhị kép, bao phấn màu tím Quả nang chứa 4 hạt

Hoàn ngọc trắng thuộc loại cây ưa ẩm, ưa sáng và hơi chịu bóng, nhất là khi còn nhỏ Cây trồng sinh trưởng mạnh trong mùa xuân hè, mùa thu đông có hiện tượng nửa rụng lá Cây Hoàn ngọc trắng trồng khoảng trên một năm tuổi mới có quả, tái sinh tự nhiên chủ yếu từ hạt

Hiện nay, cây Hoàn ngọc trắng phân bố ở một số tỉnh đồng bằng sông Hồng: Thái Bình, Nam Định, Hưng Yên, Hải Dương, Bộ phận cây Hoàn ngọc trắng dùng làm dược liệu là lá và rễ, có thể dùng tươi và phơi khô.[18]

1.2 Giá trị dược liệu cây Hoàn ngọc trắng

Lá cây Hoàn ngọc trắng và cao (chiết xuất hoàn toàn từ lá) có tác dụng kháng nấm và kháng những loại vi khuẩn gồm: Vi khuẩn gram dương

(Streptococcus pyogenes, Bacillus subtilis, Staphyllococcus aureus), vi khuẩn gram âm (Escherichia coli, Psseudomonas aeruginosa), nấm mốc (Pyricularia oryzae, Rhezoctonia solani, Aspergillus niger, Fusarium oxysporum) và nấm men (Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae) [18]

1.2.2 Cây Hoàn ngọc trắng hỗ trợ điều trị ung thư, ức chế sự phát triển của khối u

Một trong những hoạt chất chính trong cây là axit pomolic hóa giải được MDR (khối u kháng các thuốc điều trị) Các axit pomolic tác động lên tế bào ung thư theo cơ chế áp đảo các protein Bcl – 2 hoặc Bcl – xl từ đó làm suy yếu

khả năng kháng thuốc của tế bào ung thư Bên cạnh đó axit pomolic trong cây Hoàn ngọc trắng còn chứa hàm lượng cao Lupeol, hoạt chất được đánh giá cao trong điều trị ung thư tuyến tụy

Hoạt chất betulin có khả năng ức chế nhiều loại khối u trong cơ thể như bệnh bạch cầu, ung thư biểu mô tuyến tiền liệt,… [17]

1.2.3 Cây Hoàn ngọc trắng chữa bệnh tiểu đường, huyết áp cao

Cây Hoàn ngọc trắng có tác dụng giúp ổn định và tăng cường hoạt động của hormone insulin trong máu, điều hòa đường huyết và ngăn ngừa nguy cơ mắc bệnh tiểu đường ở người bình thường

Dịch chiết từ lá cây Hoàn ngọc trắng có tác dụng hạ huyết áp và làm chậm nhịp tim hiệu quả [17]

1.2.4 Tác dụng bảo vệ gan

Hoàn ngọc trắng có công dụng làm mát và bảo vệ gan, phù hợp với người

bị nóng trong người hoặc các bệnh nhân mắc bệnh về gan như viêm gan, xơ gan,

xơ gan cổ trướng,…

Hoạt chất betulin có trong cây Hoàn ngọc trắng là một trong những hoạt chất có tác dụng thải độc tốt cho gan và được chiết xuất thành các sản phẩm giải độc gan, phòng chống ung thư, xơ gan, viêm gan, ngăn ngừa tổn thương gan do rượu,… [17]

1.2.5 Tác dụng trong chữa bệnh về đường tiêu hóa, lở loét

Cây Hoàn ngọc trắng có thể chữa được các bệnh lý về đường tiêu hóa như tiêu chảy, đầy hơi, chướng bụng, táo bón, rối loạn tiêu hóa,…

Hoàn ngọc trắng chứa hàm lượng đáng kể các sterol, flavonoid, carotenoid, acid hữu cơ và đường khử Vì vậy, cây Hoàn ngọc trắng có khả năng kháng khuẩn kháng nấm, làm lạnh vết thương và có thể tiêu mủ, làm tan sẹo lồi

Ngoài ra, cây Hoàn ngọc trắng còn giúp bồi bổ cơ thể, chống oxy hóa, có tác dụng trị các bệnh khác như viêm đại tràng, cầm máu, xuất huyết đường tiêu hóa, ho ra máu, viêm loét dạ dày, cảm cúm, sốt cao, giúp bình phục sức khỏe, chữa đau mắt đỏ,…[17]

1.3 Giá trị dinh dưỡng trong cây Hoàn ngọc trắng

Các nhà khoa học đã cùng doanh nghiệp Trà Hoàn ngọc 7 Nga Tây Ninh nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây Hoàn ngọc trắng Trong cây Hoàn ngọc trắng chứa các axit amin, axit amin là thành phần chính tạo nên giá trị dinh dưỡng riêng biệt của các phân tử protein, rất cần thiết cho sự sống 8 loại axit amin thiết yếu có trong cây Hoàn ngọc trắng cụ thể là:

(1) Phenylalanine: Bồi bổ cho não, tăng cường trí nhớ, tác động trực tiếp

đến não bộ, tạo ra vitamin D nuôi dưỡng làn da

(2) Lysine: Giúp cơ thể tăng khả năng hấp thụ canxi, giúp xương chắc khỏe, duy trì trạng thái cân bằng nitơ có trong cơ thể, tránh dãn cơ, mệt mỏi; giúp cơ thể tạo ra chất kháng thể và điều tiết hormone truyền tải thông tin

(3) Leucine: (Hàm lượng cao 46-85mg%) Rất quan trọng trong quá trình

điều chỉnh hàm lượng đường trong máu; tốt cho bệnh nhân mắc chứng

“hyperglycemia” hoặc những người mong muốn đốt cháy chất béo nhanh chóng Hơn nữa, loại axit amin này còn có chức năng duy trì lượng hormone tăng trưởng để thúc đẩy quá trình phát triển mô cơ

(4) Isoleucine: (25-150mg%) Đóng vai trò sống còn trong quá trình phục

hồi sức khỏe sau thời gian luyện tập thể dục thể thao Giúp điều tiết lượng đường glucose trong máu, hỗ trợ quá trình hình thành hemoglobin và đông máu

(5) Threonine: Hỗ trợ hình thành collagen và elastin – hai chất liên kết các

tế bào trong cơ thể Ngoài ra, nó rất tốt cho hoạt động gan, tăng cường hệ miễn dịch và thúc đẩy cơ thể hấp thụ mạnh các dưỡng chất

(6) Valine: (29-1001mg% ) Axit amin này chữa lành tế bào cơ và hình thành tế bào mới, đồng thời giúp cân bằng nitơ cần thiết Ngoài ra, nó còn giúp phân hủy đường glucose trong cơ thể

(7) Tryptophan: Có hai chức năng quan trọng, một là được gan chuyển

hóa thành niacin (vitamin B3), hai là cung cấp tiền chất của serotonin, một chất dẫn truyền thần kinh giúp cơ thể điều hòa sự ngon miệng, giấc ngủ và tâm trạng

(8) Methionine: Chứa lưu huỳnh có tác dụng bảo vệ đặc hiệu tế bào gan, chống nhiễm độc Methionine còn được dùng như một yếu tố ngăn ngừa tế bào gan thoái hóa mỡ

Kết quả phân tích thành phần axit amin trong cây Hoàn ngọc cho thấy axit amin tự do và liên kết đều đa dạng với hàm lượng tổng số đạt khá cao (751-1365 mg%) gần giống như lá chè xanh (1315 mg%) và cao hơn so với lá vối (545 mg%) [20]

1.4 Giá trị kinh tế cây Hoàn ngọc trắng

Cây Hoàn ngọc trắng có nhiều công dụng nên đem lại giá trị kinh tế cao,

lá và rễ Hoàn ngọc trắng khô có giá dao động từ 50.000đ – 180.000 đ/kg Nhiều sản phẩm được chiết xuất từ cây Hoàn ngọc trắng đem lại hiệu quả kinh tế cao như Tanu gold và Tanu green của doanh nghiệp Hoàn ngọc 7 Nga Tây Ninh, 2 sản phẩm chức năng này hỗ trợ điều trị cho bệnh nhân bị ung thư hay đang áp dụng các phương pháp xạ trị Ngoài ra, còn có các sản phẩm trà Hoàn ngọc như trà túi lọc, trà hòa tan Đây là doanh nghiệp có diện tích trồng cây Hoàn ngọc lớn nhất cả nước trên 20 ha [19]

1.5 Tình hình nghiên cứu cây Hoàn ngọc trắng

1.5.1 Trên thế giới

Tại Thái Lan, năm 2010, P Padee và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của cao dịch chiết 80% etanol lá cây Hoàn ngọc trên chuột bị tiểu đường bình thường và chuột bị tiểu đường do streptozotozin Kết quả cho thấy dịch chiết có tác dụng hạ đường huyết trên chuột bị tiểu đường Dịch chiết cũng

có tác dụng ngăn chặn các biến chứng do bệnh tiểu đường gây ra và tăng cường chức năng gan và thận FPG và insulin huyết thanh ở chuột bình thường không khác biệt đáng kể so với nhóm đối chứng và thử nghiệm ở tất cả các liều lượng Những con chuột mắc bệnh tiểu đường được điều trị bằng PPE và

glibenclamide cho thấy FPG giảm đáng kể (p < 0,05) và tăng mức insulin huyết

thanh vào cuối thử nghiệm Tác dụng hạ đường huyết của PPE ở liều 250 mg/kg

thể trọng hiệu quả hơn đáng kể (p < 0,05) so với glibenclamide Insulin huyết

thanh trong PPE cho chuột mắc bệnh tiểu đường ăn ở liều 250 mg/ kg thể trọng không khác với những con đã nhận glibenclamide, và liều này hiệu quả

hơn đáng kể (p < 0,05) so với PPE ở liều 500 và 1000 mg/kg bw trong khi PPE

làm tăng HDL và giảm TC, TG, LDL, BUN và ALP ở chuột mắc bệnh tiểu đường [9]

Kết quả nghiên cứu của P Khonsung và cộng sự (2011), cho thấy dịch chiết xuất của lá Hoàn ngọc tươi còn có tác dụng hạ huyết áp, giảm nhịp tim

Tác dụng lên tim mạch của chiết xuất từ lá tươi P palatiferum đã được đánh giá trên chuột ở cả mô hình in vivo và in vitro Chiết xuất P palatiferum bao gồm

các ancaloit, coumarin và sterol Chiết xuất (5- 25 mg/kg, IV) làm giảm cả huyết

áp động mạch trung bình và nhịp tim của huyết áp bình thường và L – N – (ω) –

nitro – arginine methyl ester (L – NAME) gây ra tăng huyết áp ở chuột được gây

mê Chất chiết xuất này làm giãn norepinephrine – nội mạc co thắt – vòng động mạch chủ nguyên vẹn (EC50= 81,0 µg/mL) Loại bỏ chức năng của lớp nội mạc làm giảm tác dụng giãn mạch của dịch chiết (EC50= 136,4 µg/mL) Tiền xử lý với L – NAME hoặc atropine không làm thay đổi tác dụng giãn mạch của dịch chiết Ủ trước bằng atropine không làm thay đổi hiệu ứng nhịp tim chậm của chiết xuất trên tâm nhĩ chuột Tác dụng của isoproterenol trên tâm nhĩ cô lập đã

bị giảm bớt bởi dịch chiết (2,5 – 5 mg/mL) Kết luận, nước chiết xuất từ lá tươi

của P.palatiferum có tác dụng hạ huyết áp và làm chậm nhịp tim Tác dụng

chống co mạch của chiết xuất phụ thuộc một phần vào nội mô mạch máu nhưng không phụ thuộc vào sự tổng hợp oxit nitric và không hoạt động thông qua việc kích hoạt thụ thể muscarinic [10]

P Padee và cộng sự (2015) đã nghiên cứu hoạt động hạ đường huyết ở chuột bị tiểu đường của stigmasterol và sitosterol-3-O-β-D-glucopyranoside

được phân lập từ Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk chiết xuất từ lá

Hai hợp chất chính, stigmasterol (ST) và sitosterol – 3-O-β- D –

glucopyranoside (SG) đã được phân lập từ chiết xuất lá Pseuderanthemum palatiferum được sử dụng theo truyền thống như một loại thuốc trị tiểu đường

ST và SG ở liều 0,25 và 0,50 mg/kg được cho chuột mắc bệnh tiểu đường ăn trong 21 ngày, mức đường huyết lúc đói (FBG) và dữ liệu sinh hóa vào ngày 0,

4, 7, 10, 14, 17 và 21 được xác định và so sánh với thuốc chống tiểu đường,

glibenclamine Mức FBG ở tất cả các liều ST và SG đều giảm đáng kể (p <

0,05) với sự gia tăng đồng thời insulin huyết thanh SG với liều 0,50 mg/kg cho hiệu quả hạ đường huyết cao nhất ST và SG cũng cải thiện các dữ liệu sinh hóa

và các thông số huyết học sau đây như cholesterol toàn phần, chất béo trung tính, lipoprotein tỷ trọng cao (HDL), lipoprotein tỷ trọng thấp (LDL), nito ure máu, creatinine, hồng cầu, tiểu cầu và bạch cầu [12]

Năm 2018, Phimphan Komonrit và Ratana Banjerdpongchai đã tìm ra tác

dụng của Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk chiết xuất etanolic lá tươi

đối với bệnh ung thư vú ở người MDA-MB-231 điều chỉnh tế bào chết Chất

chiết xuất từ lá của Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk đã được nghiên

cứu về tác dụng của chúng đối với việc ức chế tăng trưởng tế bào

MDA-MB-231 ở người Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk chiết xuất đã được chuẩn bị bằng cách sử dụng lá tươi hoặc khô và chiết xuất bằng nước hoặc ethanol 95% tương ứng Chiết xuất ethanolic lá tươi là chất độc nhất đối với các

tế bào MDA-MB-231 được đo bằng xét nghiệm 3-(4,5-dimethyl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide Chiết xuất etanolic từ lá tươi đã xử lý tế bào chết MDA-MB-231 được nhuộm bằng propidium iodide và kiểm tra dưới kính hiển vi huỳnh quang Tế bào chết được xác nhận bởi annexin V-fluorescein isothiocyanate / propidium iodide và các tế bào nhuộm propidium iodide sử dụng phương pháp đo dòng chảy Điện thế xuyên màng của ty thể bị phá vỡ trong các tế bào MDA-MB-231 được xử lý bằng chiết xuất etanolic lá tươi và tỷ

lệ tế bào có điện thế xuyên màng của ty thể bị giảm tăng theo nồng độ Các tế bào chết được điều chỉnh theo tiềm năng xuyên màng ty thể là ở dạng chết và hoại tử Đầu dò ứng suất oxy hóa, 2 ′,7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate, được sử dụng để chỉ ra trạng thái oxy hóa khử Mức độ Dichlorofluorescein thấp hơn đáng kể ở nồng độ chiết xuất etanolic lá tươi cao Tổng hàm lượng phenolic

được tìm thấy trong tất cả Các chất chiết xuất từ Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk, trong khi mức Ca 2+ trong tế bào tăng lên, cho thấy quá tải Ca 2+ và sự tham gia căng thẳng của lưới nội chất với sự hoạt hóa của caspase-3, -8 và -9 Kết luận, chiết xuất etanolic từ lá tươi gây ra bệnh ung thư vú ở người MDA-MB-231 được lập trình chết tế bào thông qua lưới nội chất

và stress oxy hóa bằng cách kích hoạt cả hai con đường tín hiệu bên ngoài và bên trong [11]

Năm 2019, P.khonsung và cộng sự đã nghiên cứu đánh giá các hoạt động

chống viêm, giảm đau và hạ sốt của Pseuderanthemum palatiferum Mục tiêu

của nghiên cứu này là đánh giá khả năng chống viêm, hoạt động giảm đau và hạ

sốt của nước chiết xuất từ lá tươi của Pseuderanthemum palatiferum

(WEPP) Hoạt động chống viêm của WEPP đã được đánh giá trong phù tai do ethylphenylpropiolate (EPP), phù chân do carrageenan, phù chân do axit arachidonic (AA), và thí nghiệm u hạt dạng viên bông Các thí nghiệm gây ra bởi axit axetic đã được thực hiện để đánh giá hoạt tính giảm đau Cuối cùng, hoạt tính hạ sốt được đánh giá trong mô hình tăng thân nhiệt do nấm men gây ra WEPP cho thấy hoạt động chống viêm và hoạt động giảm đau nhưng không có đặc tính hạ sốt WEPP (2 mg / tai) ức chế đáng kể độ dày phù nề do BPTNMT (75%) Uống WEPP (600mg / kg) đã ức chế đáng kể tình trạng phù chân do carrageenan (57%), và axit arachidonic (47%) WEPP (600 mg / kg) không làm giảm trọng lượng truyền, trọng lượng u hạt và hoạt động phosphatase kiềm trong

mô hình hình thành u hạt dạng viên bông Đặc tính chống viêm của WEPP được chứng minh ở giai đoạn cấp tính chứ không phải ở giai đoạn viêm mãn tính Uống WEPP (150, 300 và 600 mg / kg) làm giảm đáng kể phản ứng do axit axetic gây ra lần lượt là 21%, 57% và 79% Trong thử nghiệm vuốt đuôi, WEPP tăng nhẹ thời gian phản ứng của chuột (25%) Hoạt động giảm đau của WEPP

có thể hoạt động thông qua con đường ngoại vi Tác dụng hạ sốt của WEPP (600

mg / kg) không được quan sát thấy trong mô hình tăng thân nhiệt do nấm men WEPP hiển thị tác dụng chống viêm và có tác dụng giảm đau nổi bật trên hệ thống ngoại vi [7]

Năm 2020, Gun – Do kim và cộng sự đã nghiên cứu chiết xuất màu xanh

lá cây của các liên hợp polyphenolic-polysaccharide từ cây Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk.: Cấu hình hóa học và hoạt tính chống đông máu

Trong nghiên cứu này, chiết xuất chất lỏng có áp suất (PLE)

polyphenolic-polysaccharide (PP) từ Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk lá đã được

thực hiện và so sánh với một kỹ thuật thông thường sử dụng 0,1 M natri hydroxit Các chất chiết xuất được tinh chế theo phương pháp được báo cáo

trước đây để thu được các liên hợp PP đã được nghiên cứu thêm về cấu hình hóa học và hoạt tính chống đông máu Quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FTIR), UV – Vis, cộng hưởng từ hạt nhân (NMR), sắc ký thấm gel (GPC) và phân tích quang phổ được sử dụng để xác định đặc điểm của các liên hợp PP đã chọn Kết quả cho thấy liên hợp PP bao gồm các thành phần carbohydrate, phenol và protein với hiệu suất dao động từ 2,76% đến 14,34% Bảy loại đường đơn sắc tố có trong tất cả các liên hợp được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), cụ thể là arabinose, fucose, galactose, glucose, mannose, rhamnose và xylose Các liên hợp PP thu được từ PLE ở 150 ° C (PP-PLE5) cho thấy hoạt tính chống đông máu tốt hơn so với các chất được tìm thấy

ở 200 ° C và có thể so sánh với kỹ thuật thông thường Trên sắc ký thẩm thấu gel, PP-PLE5 cho thấy khối lượng phân tử rộng từ 6 đến 642 kDa Từ các kết quả thu được, PLE có thể được sử dụng như một kỹ thuật hiệu quả màu xanh lá

cây để thu hồi liên hợp PP từ lá P palatiferum [16]

1.5.2 Trong nước

Năm 2018, Huỳnh Kim Diệu và Đàm Thùy Nga đã nghiên cứu khả năng tác động trên tăng trọng và phòng bệnh cho vịt của lá Xuân hoa

(Pseuderanthemum palatiferum) đánh giá hiệu quả phòng bệnh và khả năng tác

động trên tăng trọng của lá Xuân hoa (XH), lá XH dạng bột sấy khô được trộn vào thức ăn của vịt Thí nghiệm được thực hiện trên 180 vịt siêu thịt Cherry Velley 10 ngày tuổi, thí nghiệm gồm 4 nghiệm thức: nghiệm thức 1(1,8 g bột lá XH/kg thức ăn), nghiệm thức 2 (2,4g bột lá XH/kg thức ăn) và nghiệm thức3 (3,0g bột lá XH/kg thức ăn) và nghiệm thức đối chứng (không bổ sung bột lá XH) Sau 30 ngày thí nghiệm, kết quả tăng trọng của vịt cao nhất ở nghiệm thức

bổ sung 2,4g bột lá XH/kg thức ăn (47,4g/con/ngày), kế đến lần lượt nghiệm thức bổ sung 3,0g bột lá XH/kg thức ăn (45,8 g/con/ngày), 1,8g bột lá XH/kg thức ăn (39,7 g/con/ngày) và thấp nhất là đối chứng (37 g/con/ngày) Tỉ lệ sống

ở nghiệm thức đối chứng thấp nhất (82,2%), kế đến nghiệm thức 1 (93,3%) và nghiệm thức 2 (95,6%) và cao nhất ở nghiệm thức 3 (97,8%) Liều 2,4 g và 3,0 g bột lá XH/kg thức ăn tác động tốt nhất trên các chỉ tiêu sinh lý máu (số lượng

hồng cầu, tỉ khối huyết cầu, số lượng bạch cầu, thể tích trung bình hồng cầu) Sau 30 ngày phòng bệnh bằng bột lá XH, khảo sát vi thể mẫu gan, thận vịt không có dấu hiệu bệnh tích Như vậy, bổ sung bột lá XH vào thức ăn tác động tốt trên sự tăng trưởng và phòng bệnh cho vịt và bột lá XH không có độc tính.[1]

Năm 2019, Nguyễn Hữu Hiệu và cộng sự đã nghiên cứu enzyme ‐ Hỗ trợ

chiết xuất Saponin Triterpenoid từ Pseuderanthemum palatiferum (Nees)

Radlk bột lá khô và kiểm tra hoạt tính sinh học của chất chiết xuất Các saponin

triterpenoid được chiết xuất từ cây Pseuderanthemum palatiferum (Nees)

Radlk bột lá khô bằng cách sử dụng phương pháp chiết xuất có hỗ trợ của enzyme Ảnh hưởng của các yếu tố đơn lẻ đến hàm lượng saponin tổng số (TSC)

đã được nghiên cứu Sau đó, một thiết kế giai thừa đầy đủ với hai cấp được tiến hành để sàng lọc các yếu tố chính ảnh hưởng đến TSC Hai yếu tố chính là nhiệt

độ và thời gian chiết đã được xác định Phương pháp bề mặt phản ứng với thiết

kế tổng hợp trung tâm đã được sử dụng để nghiên cứu tác động đồng thời của các yếu tố này đối với TSC Kết quả cho thấy điều kiện tối ưu là 54,9° C và 80,8 phút Dịch chiết trong các điều kiện này đã được thử nghiệm với các hoạt tính sinh học Dịch chiết có chỉ số tan huyết là 256,74 mL, hoạt tính chống viêm với

IC 20 là 0,56 µg / mL, hoạt tính chống oxy hóa với IC50 giá trị DPPH, ABTS và hydroxyl tương ứng là 61,47, 1,42 và 30,33 µg / mL và độc tính tế bào trên dòng

tế bào ung thư HepG2 Theo đó, saponin triterpenoid từ Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk có thể được coi là một thành phần có giá trị [15]

Năm 2020, Bùi Thị Bích Hằng, Nguyễn Thanh Phương nghiên cứu ảnh

hưởng của chất chiết lá cây Hoàn ngọc (Pseuderanthemum palatiferum (Wall.) Radlk) lên tăng trưởng và đáp ứng miễn dịch cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) Nghiên cứu được thực hiện nhằm tìm hiểu ảnh hưởng của bổ sung chất chiết lá Hoàn ngọc (Pseuderanthemum palatiferum (Wall.) Radlk) vào

thức ăn lên tăng trưởng và đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu của cá tra

(Pangasianodon hypophthalmus) Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên

với 4 nghiệm thức gồm 0%; 0,02%; 0,1% và 0,5% chất chiết lá Hoàn ngọc và được lặp lại 3 lần Các chỉ tiêu miễn dịch bao gồm tổng hồng cầu, tổng bạch cầu,

tế bào lympho, bạch cầu đơn nhân, trung tính, tiểu cầu và hoạt tính lysozyme được theo dõi vào tuần thứ 3 và 6 của thí nghiệm và 3 ngày sau cảm nhiễm với

vi khuẩn Kết quả cho thấy bổ sung chất chiết lá cây Hoàn ngọc không ảnh hưởng đến tăng trưởng cá tra Mật độ tổng hồng cầu và tổng bạch cầu tăng cao

có ý nghĩa ở các nghiệm thức bổ sung chất chiết lá cây Hoàn ngọc Sau 6 tuần thì hoạt tính lysozyme đạt giá trị cao nhất (90, 7 mg/mL) ở nghiệm thức 0,5%, khác biệt có ý nghĩa thống kê với nghiệm thức đối chứng (57,8 U/mL) (p<0,05) Sau khi gây cảm nhiễm với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri thì các nghiệm thức

có bổ sung 0,1% và 0,5% chất chiết lá cây Hoàn ngọc có tỉ lệ chết thấp hơn đối chứng Kết quả chỉ ra rằng bổ sung chất chiết lá cây Hoàn ngọc vào thức ăn giúp cải thiện hệ thống miễn dịch và giảm tỉ lệ chết của cá tra khi kháng lại vi khuẩn

E ictaluri [2]

1.5.3 Một số nghiên cứu nhân giống in vitro của các loài cùng họ

Nguyễn Thị Phương Khanh (2011) đã nghiên cứu nuôi cấy và tạo rễ cây

Hoàn ngọc ( Pseuderanthemum Bracteatum) trong điều kiện in vitro để thu nhận

Betulin - hợp chất thứ cấp Kết quả thu được khi khử trùng đốt thân cây Hoàn ngọc với chất khử trùng canxi hypocloric trong thời gian 10 phút, hiệu quả khử trùng cao nhất tại nồng độ 12% Tỷ lệ tái sinh chồi tốt nhất, sự tạo chồi sớm và kích thước chồi lớn trên môi trường bổ sung 0,4 mg/l BA và 0,2 mg/l NAA Mô sẹo từ thân non cây Hoàn ngọc hình thành và tăng sinh nhanh nhất trên môi trường MS bổ sung 0,6 mg/l 2,4 – D và 0,2 mg/l BA Mô sẹo từ lá non cây Hoàn ngọc hình thành và tăng sinh nhanh nhất trên môi trường MS bổ sung 0,4 mg/l 2,4 – D và 0,2 mg/l BA Hàm lượng betulin trong thân, lá, rễ và mô sẹo cây

Hoàn ngọc in vitro cao gấp nhiều lần (10 lần) so với hàm lượng betulin trong

các cơ quan thân, lá, rễ cây Hoàn ngọc tự nhiên Tái sinh rễ từ mô sẹo thân non cây Hoàn ngọc đạt hiệu quả cao nhất ở môi trường MS bổ sung 0,4 mg/l NAA

Hàm lượng betulin thu được cao nhất từ thân cây con in vitro tái sinh từ mô sẹo

nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 0,6 mg/l BA [3]

Năm 2014, Phan Ngô Hoàng và cộng sự đã nghiên cứu hình thành phôi

soma từ mô sẹo lá Hoàn ngọc Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk Mô

sẹo được cảm ứng ba tuần trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 1 mg/l hoặc 2 mg/l Phôi soma thu nhận trên môi trường MS theo tiến trình: phôi hình cầu hình thành sau 9 ngày, phôi hình tim hình thành sau 13 ngày, phôi hình ngư lôi hình thành sau 15 ngày và phôi lá mầm hình thành sau 17 ngày Số phôi trung bình thu được là 28,5 phôi/ cm2 mô lá Cường độ hô hấp và hoạt tính sinh học của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật nội sinh của mô lá trong quá trình nuôi cấy đã được ghi nhận [8]

Quách Ngô Diễm Phương và cộng sự (2014) đã nghiên cứu nuôi cấy rễ

cây Bán tự mốc (Hemigraphis glaucescens C B Clarkc) làm nguồn nguyên liệu

thu nhận Betulin Nghiên cứu này đã chứng minh so với Hoàn ngọc đỏ, Bán tự mốc cũng có hoạt tính kháng oxi hóa và mang cùng dược chất betulin, chủ yếu tập trung sàng lọc và tìm ra nguồn nguyên liệu có hoạt tính kháng oxi hóa từ cây

Bán tự mốc, từ đó ứng dụng các kỹ thuật nuôi cấy in vitro nhằm thu nhận nguồn

nguyên liệu này một cách chủ động Bằng cách sử dụng phương pháp thử năng lực khử Yen & Duh và phương pháp đánh bắt gốc tự do DPPH, phân đoạn ethanol rễ được xác định có hoạt tính kháng oxi hóa mạnh nhất trong các phân đoạn cao có độ phân cực khác nhau từ các bộ phận khác nhau của Bán tự mốc

Để tạo nguồn rễ in vitro, sử dụng phương pháp tạo rễ bất định bằng auxin và tạo

rễ tơ bằng phương pháp chuyển gen tự nhiên nhờ Agrobacterium rhizogenes

ATCC 15834 Với 2 phương pháp này, rễ cây bán tự mốc có thể được tạo thành một cách chủ động chỉ sau 10 ngày nuôi cấy [5]

Nguyễn Phương Thảo (2015), đã nghiên cứu về tái tạo chồi trực tiếp của

Pseuderanthemum Palatiferum Tái sinh thực vật hiệu quả trong ống nghiệm thông qua quy trình phát sinh chồi trực tiếp đối với P.palatiferum được báo cáo

trong nghiên cứu này Hai thí nghiệm đã được thực hiện; nhóm đầu tiên so sánh các nồng độ khác nhau của BA (0,1, 0,3, 0,5 và 1,0 mg / L) bằng cách sử dụng thân, lá và cuống lá từ các chồi 4-6 tuần tuổi, trong khi nhóm thứ hai thử nghiệm

sự kết hợp của BA, sử dụng nồng độ cho điều kiện tốt nhất để phát sinh cơ quan chồi trực tiếp trong tập đầu tiên, với nồng độ IAA khác nhau (0,1, 0,2, 0,3 và 0,5

mg / L) và TDZ (0,1, 0,3 và 0,5 mg/L) để nhân chồi Đối với tái sinh chồi (thí

nghiệm đầu tiên), mẫu cấy thân 5 tuần tuổi với BA ở nồng độ 0,3 mg/L là điều kiện hiệu quả nhất, tạo ra trung bình 3,13 chồi trên mỗi mẫu với chiều dài trung bình 0,55 cm Đối với nhân chồi (bộ thử nghiệm thứ hai), Môi trường MS chứa 0,3 mg/L BA bổ sung 0,1 mg/L IAA được coi là môi trường tốt nhất cho khả năng tăng chồi trong quá trình nhân chồi so với môi trường khác (tăng 1,50 chồi trung bình trên mỗi mẫu) Quy trình được mô tả cung cấp một cách đơn giản để tái sinh cây thông qua phát sinh cơ quan chồi trực tiếp, đây sẽ là sản xuất quy

mô lớn của các nghiên cứu biến đổi gen và hữu ích cho việc đa dạng hóa cây cảnh trong nhà ở nước ta, tăng nguồn thực vật y tế [14]

Nguyễn Thị Thảo (2018), bước đầu nghiên cứu khả năng nhân giống

Hoàn ngọc (Pseuderanthemum palatiferum) bằng nuôi cấy in vitro Công thức

khử trùng bằng HgCl2 trong 5 phút , chia 2 lần, lần đầu 3 phút cho tỷ lệ mẫu sạch tái sinh cao nhất là 89,45% Môi trường dinh dưỡng MS + 7g/l agar + 20g/l đường saccharose + 0,5 mg/l BAP, đạt tỷ lệ tái sinh là 60,0%, là công thức phù hợp nhất cho mẫu sạch tái sinh chồi Môi trường MS + 7g/l agar + 20g/l đường saccharose + 0,5mg/l kinetin + 0,3mg/l BAP + 0,3mg/l GA3 là phù hợp nhất cho tái sinh chồi (86,67%).[6]

Chương 2 MỤC TIÊU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Mục tiêu nghiên cứu

2.1.1 Mục tiêu chung

Bước đầu nghiên cứu quy trình nhân giống cây Hoàn ngọc trắng

(Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk.) bằng kỹ thuật in vitro

2.1.2 Mục tiêu cụ thể

- Xác định được công thức khử trùng tạo mẫu sạch;

- Xác định được môi trường tối ưu nhân nhanh chồi;

- Xác định được môi trường ra rễ tạo cây hoàn chỉnh thích hợp nhất;

- Xác định được thời gian huấn luyện phù hợp với khả năng sống của cây;

- Xác định được công thức thành phần ruột bầu phù hợp với cây con

2.2 Đối tượng, phạm vi nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu: cây Hoàn ngọc trắng (Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk.)

- Vật liệu nghiên cứu: Đoạn thân bánh tẻ cây Hoàn ngọc trắng được tuyển chọn từ những cây khỏe mạnh, sức sống tốt, không sâu bệnh

- Bố trí thí nghiệm: Các thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện nhân tạo tại phòng thí nghiệm với các điều kiện sau:

pH môi trường : 5,5 – 5,8

Cường độ chiếu sáng: 2000 – 3000 lux

Ánh sáng: Thời gian chiếu sáng 12 – 16h/ ngày

Nhiệt độ phòng nuôi cấy: 25 ± 2⁰C

Độ ẩm trung bình: 60 – 70%

Thí nghiệm lặp lại ≥ 3 lần

Số mẫu thí nghiệm đủ lớn (≥ 30 mẫu/ thí nghiệm)

2.3 Địa điểm thực tập, thời gian làm KLTN

Địa điểm thực tập: Phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật của Bộ môn Công nghệ tế bào, Viện Công nghệ Sinh học Lâm Nghiệp, Trường Đại học Lâm Nghiệp

Thời gian làm KLTN: Từ tháng 1/2021 đến hết tháng 5/2021

2.4 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến khả năng tạo mẫu

sạch in vitro cây Hoàn ngọc trắng

- Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp chất ĐHST đến khả năng nhân nhanh

in vitro cây Hoàn ngọc trắng

- Nghiên cứu ảnh hưởng của chất ĐHST đến khả năng ra rễ in vitro cây

2.5 Phương pháp nghiên cứu

2.5.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến khả năng tạo mẫu sạch in vitro cây Hoàn ngọc trắng

a) Khử trùng ngoài box cấy:

Đoạn thân cây Hoàn ngọc được cắt bỏ lá (để cách cuống 2-3 cm), chải sạch bụi bẩn bằng dung dịch xà phòng loãng

- Lắc mẫu trong dung dịch xà phòng loãng 1-2 phút và tráng lại bằng nước sạch cho hết xà phòng (lặp lại bước này 3 lần)

- Sau đó tráng nước cất vô trùng 2 - 3 lần, chuyển vào khử trùng trong box cấy

b) Khử trùng trong box cấy:

Hóa chất được sử dụng để tạo mẫu sạch : dung dịch HgCl2 0,1%

- Tráng nước cất vô trùng 2-3 lần, loại bỏ nước và tiến hành khử trùng mẫu bằng dung dịch HgCl2 0,1%, khử trùng với thời gian khác nhau: 5, 7, 9 và

11 phút

- Loại bỏ dung dịch HgCl2 0,1%, tráng sạch mẫu bằng nước cất vô trùng 3–5 lần

Sau khi khử trùng, loại bỏ phần bị tổn thương, dập nát, cắt mẫu thành từng đoạn 3-5 cm có chứa 1-2 mắt ngủ, cấy vào môi trường nuôi cấy khởi đầu:

MS + 0,3 mg/l BAP + 20 g/l đường saccharose + 6,5 g/l agar

Thí nghiệm được bố trí với 4 công thức và các thời gian khử trùng khác nhau như bảng 2.1 dưới đây

Bảng 2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến khả năng tạo

mẫu sạch in vitro cây Hoàn ngọc trắng

CTTN Thời gian khử

trùng( phút)

Tỷ lệ mẫu sạch (%)

Tỷ lệ nảy chồi (%)

6 tuần nuôi cấy

Bảng 2.2 Ảnh hưởng của tổ hợp chất ĐHST đến khả năng nhân nhanh in

vitro cây Hoàn ngọc trắng

CTTN

Chất ĐHST(mg/l) Hệ số

nhân nhanh chồi (lần)

Tỷ lệ chồi hữu hiệu (%)

Chất lượng chồi BAP Kinetin NAA

bổ sung NAA, IBA với nồng độ khác nhau Công thức thí nghiệm được bố trí như bảng 2.3 dưới đây Theo dõi và thu thập số liệu sau 6 tuần nuôi cấy

Bảng 2.3 Ảnh hưởng của chất ĐHST đến khả năng ra rễ in vitro cây Hoàn

ngọc trắng CTTN

Chất ĐHST (mg/l)

Chiều dài rễ trung bình (cm)

Số rễ trung bình/cây (rễ) Đặc điểm rễ