Nghiên cứu đa dạng di truyền loài sa mu dầu (cunninghamia konishh hayata) đang bị đe dọa tuyệt chủng ở việt nam bằng chỉ thị phân tử microsatellire (ssr)

Luận văn này được thực hiện thông qua sự hỗ trợ kinh phí của Trung tâm Nhiệt đới Việt Nga, Bộ Quốc phòng cho đề tài: “Ứng dụng phương pháp thông tin địa lý GIS và kỹ thuật sinh học phân

I

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP&PTNT

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

Tên đề tài: NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN LOÀI SA MU DẦU (CUNNINGHAMIA KONISHII HAYATA) ĐANG BỊ DE DỌA TUYỆT CHỦNG Ở VIỆT NAM BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ MICROSATELLIRE

(SSR)

Họ tên học viên : Vũ Thị Thu Hiền Người hướng dẫn : 1 TS Vũ Đình Duy

2 PGS.TS Bùi Văn Thắng Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

Hà Nội, 2021

I

LỜI CAM ĐOAN

Đề tài nghiên cứu của tôi về “Nghiên cứu đa dạng di truyền loài Sa mu Dầu (Cunninghamia konishii Hayata) đang bị đe dọa tuyệt chủng ở Việt Nam bằng chỉ thị phân tử microsatellite (SSR)” Đây là đề tài nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của TS Vũ Đình Duy và PGS TS Bùi Văn Thắng Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực, chưa từng được công

bố trong bất kì công trình nào khác

Hà Nội, ngày 25 tháng 05 năm 2021

Người thực hiện

Vũ Thị Thu Hiền

II

LỜI CẢM ƠN

Đề tài nghiên cứu của tôi được thực hiện tại phòng thí nghiệm Viện Sinh thái Nhiệt đới, Trung tâm Nhiệt đới Việt – Nga và Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, trường Đại học Lâm nghiệp Qua đây, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ban lãnh đạo Viện đã tạo điều kiện để các công việc chuyên môn của đề tài được tiến hành thuận lợi

Khi thực hiện đề tài, tôi đã nhận được sự động viên và giúp đỡ nhiệt tình của các thầy cô, bạn bè và đồng nghiệp Sự ủng hộ về mặt tinh thần và những chỉ dẫn, góp ý, chia sẻ kinh nghiệm, tài liệu vô cùng quý báu này khiến tôi thực sự cảm kích, biết ơn

Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Vũ Đình Duy và PGS.TS Bùi Văn Thắng, người thầy đã tận tình hướng dẫn tôi trong quá trình hoàn thiện luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn những góp ý, chỉ dẫn, chia sẻ kinh nghiệm của các cán bộ nghiên cứu thuộc Viện Sinh thái Nhiệt đới, Trung tâm Nhiệt đới Việt – Nga và Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, trường Đại học Lâm nghiệp

đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ của cơ sở đào tạo trường Đại học Lâm nghiệp đã tận tâm truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt khóa học

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các thầy cô làm việc và giảng dạy tại khoa Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và những người thân đã luôn bên tôi, là động lực để tôi vượt qua mọi khó khăn để hoàn thành luận văn

Luận văn này được thực hiện thông qua sự hỗ trợ kinh phí của Trung tâm Nhiệt đới Việt Nga, Bộ Quốc phòng cho đề tài: “Ứng dụng phương pháp thông tin địa lý (GIS) và kỹ thuật sinh học phân tử phục vụ điều tra, giám sát và phát triển loài Sa mu dầu (Cunninghamia konishii Hayata) ở Việt Nam” trong thời gian

từ 2020 – 2022 Chủ nhiệm: Phạm Mai Phương

Hà Nội, ngày 25 tháng 05 năm 2021

Người Thực Hiện

Vũ Thị Thu Hiền

III

MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN I LỜI CẢM ƠN II DANH MỤC HÌNH V DANH MỤC BẢNG VI BẢNH DANH MỤC VIẾT TẮT VII

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận văn 2

PHẦN I TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 3

1.1 Nghiên cứu về phân loại và phân bố của loài Sa mu dầu 3

1.2 Nghiên cứu giá trị sử dụng loài Sa mu dầu 6

1.3 Một số chỉ thị phân tử dùng trong phân tích đa dạng di truyền quần thể và loài thực vật 7

1.3.1 Kỹ thuật isozyme 8

1.3.2 Kỹ thuật RAPD 8

1.3.3 Kỹ thuật RFLP 9

1.3.4 Kỹ thuật AFLP 10

1.3.5 Kỹ thuật SSR 10

1.3.6 Kỹ thuật ISSR 11

1.4 Nghiên cứu đa dạng di truyền loài Sa mu dầu ở Việt Nam và trên thế giới 11 1.4.1 Ngoài nước 11

1.4.2 Trong nước 14

PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Vật liệu, thiết bị và hóa chất trong nghiên cứu 16

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 16

2.1.2 Thiết bị và hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu 16

IV

2.2 Phương pháp nghiên cứu 17

2.2.1 Phương pháp tổng quan tài liệu 17

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm 17

2.3 Phân tích số liệu 20

PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21

3.1.Tách chiết ADN tổng số, hàm lượng và độ tinh sạch ADN của 88 mẫu Sa mu dầu 21

3.2 Phản ứng PCR-SSR, điện di sản phẩm PCR-SSR trên gel polyacrylamide

8% 26

3.3 Mức độ đa dạng di truyền quần thể Sa mu dầu bằng chỉ thị phân tử SSR 27

3.3.1 Đa dạng di truyền 4 quần thể Sa mu dầu 27

3.3.2 Phân tích phương sai phân tử (AMOVA) 28

3.4 Mối quan hệ di truyền và khoảng cách giữa các quần thể Sa mu dầu 29

3.4.1 Khoảng cách di truyền và hệ số tương đồng di truyền quần thể 29

3.4.2 Mối quan hệ di truyền giữa 4 quần thể Sa mu dầu 30

PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 31

4.1 Kết luận 31

4.2 Kiến nghị 31

TÀI LIỆU THAM KHẢO 32

V

DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Sa mu dầu ngoài tự nhiên tại Kỳ Sơn, Nghệ An 4Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế trong nghiên cứu 17Hình 3.1 Kết quả điện di ADN tổng số của một số mẫu đại diện cho loài Sa mu dầu trên gel agarose 1% 21Hình 3.2 Phổ điện di sản phẩm PCR - SSR trên gel polyacrylamide 8% với một

số mồi SSR 26Hình 3.3 Mối quan hệ di truyền giữa 4 quần thể Sa mu dầu ở trên cơ sở khoảng cách di truyền 30

VI

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Địa điểm và số mẫu Sa mu dầu thu thập cho nghiên cứu 16

Bảng 2.2 Các thành phần phản ứng PCR 18

Bảng 2.3 Chu trình phản ứng PCR 18

Bảng 2.4 Trình tự các nucleotide của 8 cặp mồi SSR trong nghiên cứu 19

Bảng 3.1 Độ sạch và hàm lượng ADN của 88 mẫu Sa mu dầu 22

Bảng 3.2 Thông số đa dạng di truyền 4 quần thể Sa mu dầu phân tích với chỉ thị phân tử SSR 28

Bảng 3.3 Phương sai phân tử (AMOVA) giữa các quần thể và trong quần thể Sa mu dầu 29

Bảng 3.4 Khoảng cách di truyền (dưới) và hệ số tương đồng di truyền (trên) theo công thức Nei (1978) 29

VII

BẢNH DANH MỤC VIẾT TẮT

2 AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism

4 CI Chỉ số cạnh tranh

7 ISSR Interal simple sequence repeat

8 NCBI Trung tâm quốc gia về thông tin công nghệ sinh học

9 PCR Phản ứng chuỗi polymerase

10 RAPD Random Amplified Polymorphism DNA

11 RFLP Restriction fragment length Polymorphism

13 SSR Simple Sequence Repeat (Kỹ thuật Microsatellite)

14 TAE Tris - acetate - EDTA

16 VU Loài sắp nguy cấp

1 xếp Sa mu dầu ở cấp độ nguy cấp (EN), Sách đỏ Việt Nam (2007) thì Sa mu dầu được xếp vào VU A1a, d, C1 và thuộc nhóm I trong danh lục thực vật rừng động vật rừng nguy cấp quí hiếm của Nghị định 06/2019/NĐ-CP của Chính phủ Do

đó, việc đánh giá đa dạng di truyền cho các quần thể hiện còn sót lại là rất cần thiết để từ đó có thể đưa ra các biện pháp bảo vệ, chiến lược bảo tồn và phát triển hiệu quả nguồn gen quý hiếm này

Để bảo tồn nguồn gen của các loài thực vật quý hiếm, đang có nguy cơ tuyệt chủng cao, xác định mức độ trao đổi di truyền giữa các cây bố mẹ trong quần thể cùng với nghiên cứu mức độ đa dạng di truyền quần thể và loài trong tự nhiên đóng vai trò quan trọng góp phần đưa ra các chiến lược bảo tồn và phục hồi loài hữu hiệu (Gupta và Varshney, 2000) Kỹ thuật Microsatellite (SSR) là một trong những công cụ được sử dụng phổ biến cho việc đánh giá đa dạng di truyền ở thực vật hiện nay do có tính đa hình cao và tính kế thừa đồng trội trong genome Cho đến nay, các công trình nghiên cứu trước đây về mặt sinh thái học, hay nghiên cứu mức độ đa dạng di truyền của loài Sa mu dầu còn rất hạn chế, do vậy cơ sở khoa học cho công tác bảo tồn và phát triển bền vững loài này ở Việt Nam là đặc biệt thiếu dữ liệu

Luận văn nghiên cứu của tôi tập trung điều tra tính đa dạng di truyền trong và giữa các quần thể loài Sa mu dầu đang bị đe dọa tuyệt chủng ở Việt Nam để hiểu

rõ hơn về bản chất di truyền quần thể và loài, và góp phần giúp các nhà quản lý đưa ra giải pháp tối ưu cho công tác bảo tồn, quản lý, phục hồi và phát triển bền vững loài này

2

2 Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu chung: Đóng góp cho công tác bảo tồn và phục hồi hữu hiệu các loài quý hiếm đang bị đe doạ ở Việt Nam Giúp các nhà quản lý hiểu biết sâu hơn về mức độ đa dạng di truyền quần thể loài Sa mu dầu ở Việt Nam Các yếu tố tác động của con người làm xói mòn cấu trúc di truyền quần thể và loài Mục tiêu này cũng sẽ giúp cộng đồng các nhà khoa học hiểu biết tốt hơn về quá trình tuyệt chủng cũng như mức độ tiến hoá loài không chỉ cho loài Sa mu dầu và có thể áp dụng cho các loài cây khác có lịch sử sống tương tự

Mục tiêu cụ thể: Đánh giá mức độ đa dạng và khoảng cách di truyền của quần thể và loài Sa mu dầu trong các điều kiện môi trường và kích thước quần thể khác nhau

3 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Tách chiết ADN tổng số loài loài Sa mu Dầu (Cunninghamia konishii Hayata) đang bị đe dọa tuyệt chủng ở Việt Nam

Nội dung 2: Thực hiện phản ứng PCR-SSR quần thể Sa mu dầu ở Việt Nam với

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận văn

- Áp dụng phương pháp nghiên cứu sinh học phân tử hiện đại trong đánh giá

đa dạng di truyền quần thể thực vật ở Việt Nam làm cơ sở khoa học đề xuất giải pháp bảo tồn loài

- Kết quả nghiên cứu sẽ giúp cung cấp dẫn liệu đa dạng di truyền cho loài Sa

mu dầu ở Việt Nam Dẫn liệu thu được là cơ sở khoa học quan trọng để hiểu rõ hơn về bản chất di truyền quần thể dưới tác động của môi trường sống, đặc biệt liên quan đến các hoạt động của con người

- Kết quả nghiên cứu cũng góp phần cho công tác bảo tồn ở cả 2 mức độ quần thể và loài Sa mu dầu ở Việt Nam Nâng cao nhận thức của người dân địa phương

và những người quản lý về công tác bảo tồn loài Sa mu dầu đang bị đe dọa

Đỏ Việt Nam, phần II Thực vật”, “Thông Việt Nam - Nghiên cứu hiện trạng bảo tồn 2004”, “Cây lá kim Việt nam” và “Danh mục các loài thực vật Việt Nam” sử dụng tên tiếng Việt của loài Cunninghamia konishii Hayata là Sa mộc dầu, Sa mộc Quế Phong, Ngọc am (Nguyễn Tiến Hiệp và cộng sự, 2004; Nguyễn Đức Tố Lưu và Philip Ian Thomas, 2004; Nguyễn Hoàng Nghĩa, 2004; Sách Đỏ Việt Nam, 2007) Ngoài tên này, loài này còn có một số tên khác như: Mạy lâng lênh (Thái), Mạy lung linh (Nguyễn Tiến Hiệp và cộng sự, 2004)

Năm 1960, loài C konishii lần đầu tiên được phát hiện ở núi Pha Ca Tủn, huyện Quỳ Châu thuộc khu bảo tồn thiên nhiên Pù Huống (Tran Van Duong, 2001), sau đó chúng được tìm thấy ở Pù Hoạt, Pù Mát, Kỳ Sơn (Nghệ An) và Khu bảo tồn thiên nhiên Xuân Liên (Thanh Hóa) (Sách đỏ Việt Nam, 2007; Nguyễn Tiến Hiệp và cộng sự, 2004; Nguyễn Đức Tố Lưu và Thomas, 2004; Nguyen Minh Tam et al., 2009; Phan Kế Lộc và cộng sự, 2009) Gần đây vào năm 2015,

Sở Tài nguyên và Môi trường tỉnh Hà Giang phối hợp với các nhà khoa học thuộc Trung tâm Địa môi trường và Tổ chức lãnh thổ tiến hành điều tra, khảo sát hiện trạng cây Sa mộc dầu tại xã Túng Sán, huyện Hoàng Su Phì (Hà Giang) Kết quả,

đã phát hiện được tại dãy núi Tây Côn Lĩnh có 2 cây Sa mộc dầu ở tọa độ địa lý: N: 22o45’42’’5; E: 104o44’29’’5; ở độ cao 1.212 m so với mực nước biển Một cây có đường kính thân 90 cm, chiều cao 30 m Cây thứ hai có đường kính 70 cm, chiều cao 25 m Ở Sơn La, Sa mu dầu lần đầu tiên được ghi nhận thêm có mặt ở Khu bảo tồn thiên nhiên Xuân Nha năm 2014 Chúng phân bố khu vực sườn Đông Bắc dải Pa Luông (bản A Lang) ở độ cao 1.500 - 1.600 m Số lượng cá thể Sa mu dầu trưởng thành ước tính khoảng 4 cây, phân bố tập trung trên diện tích khu phân

bố của quần thể 2 km2, trong đó diện tích nơi cư trú khoảng 0,5 km2 Các cây đều

đã già cỗi và rỗng ruột và không có cây con tái sinh Quan sát thấy nhiều cây chết

và cứng như ở thứ chuẩn Nón hạt mọc chúc xuống, hình trứng, ít khi vượt quá 3

x 2,5 cm; hạt dẹt, cỡ 5 x 4 mm, kể cả hai cánh nhỏ hẹp ở hai bên sườn Loài này phân bố hẹp ở Lào và Trung Quốc Ở Việt Nam, chúng khá hiếm, chỉ phân bố ở

Hà Giang, Sơn La, Thanh Hóa và nhất là Nghệ An, trên dãy núi biên giới Việt - Lào Thụ phấn tháng 1 - 3, hạt chín 1 - 4; mọc trong rừng rậm nguyên sinh thường xanh mưa mùa nhiệt đới, đất có tầng dày, ẩm và thoát nước; khả năng nảy mầm của hạt rất tốt nhưng tái sinh tự nhiên rất kém chủ yếu vì hạt rụng xuống cùng với nón và nảy mầm ngay trong đó sau những trận mưa đầu mùa nhưng dễ mầm không thể đâm xuyên qua vẩy hạt để xuống đến đất; mặt khác nhưng hạt rụng trực tiếp xuống đất thì nảy mầm tốt nhưng thường bị chết do thiếu ánh sáng Tăng trưởng

5

granít hoặc các đá mẹ silicát khác ở độ cao 960 - 2.000 m trên mặt biển Các loài Thông mọc kèm gồm Pơ mu, Kim giao núi đất và Thông nàng (Nguyễn Tiến Hiệp và cộng sự, 2004)

Mai Văn Chuyên và cộng sự (2011) và Nguyễn Thị Phương Trang (2012) nghiên cứu Sa mu dầu ở Khu bảo tồn thiên nhiên Xuân Liên (tỉnh Thanh Hoá) ghi nhận loài phân bố ở rừng kín thường xanh chủ yếu cây lá rộng á nhiệt đới núi thấp, mọc ở độ cao trên 1.000 m, hỗn giao với Pơ mu và nhiều loài cây lá rộng thuộc các họ Dẻ (Fagaceae), họ Long não (Lauraceae), họ Dầu (Dipterocarpaceae), họ Ngọc lan (Magnoliaceae), họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) loại đất Feralit mùn có tầng thảm mục rất dày, loài này chiếm tầng vượt tán của lâm phần Loài Dẻ (Quercus sp.) là loài cạnh tranh mạnh nhất đối với Sa mu dầu (CI = 1,185, CI là chỉ số cạnh tranh), tiếp đến là loài Pơ mu (CI = 0,712) và giảm dần đến loài Sồi phảng (CI = 0,401), Trâm (CI = 0,302), Cà ổi (CI = 0,258), riêng các loài như: Máu chó (Knema sp.), Cà phê rừng (Coffea liberica), Bứa (Garcinia oblongifolia), Chòi mòi (Antidesma ghasembilla), Dẻ lá tre (Quercus bambusaefolia) cạnh tranh không đáng kể

Nghiên cứu đặc điểm sinh học và sinh thái loài Sa mộc dầu (Cunninghamia konishii Hayata) tại Vườn quốc gia Pù Mát, Khu bảo tồn thiên nhiên Pù Huống, tỉnh Nghệ An Loài này chủ yếu trên các sườn núi đá vôi và đất granit phong hoá, nhiệt độ trung bình 22 - 24oC, lượng mưa trung bình 1.700 - 2.000 mm, độ cao trên 1.200 m, địa hình biến đổi phức tạp, chia cắt, kích thước quần thể nhỏ (trung bình 50 cá thể/quần thể), tạo từng cụm 3 - 7 cây hoặc tạo thành từng tiểu quần thể

15 - 25 cá thể mọc từ chân núi lên dần sườn núi có độ dốc lớn, trên loại đất xám feralit phát triển trên đá sét (Xfs), mật độ trung bình trong các quần thể là 22,4 cây/ha Các quần thể Sa mộc dầu chỉ phân bố theo hướng phơi Đông Bắc và Tây Nam Chúng mọc cùng với một số loài trong họ Long não (Lauraceae), Dẻ (Fagaceae), Bứa (Clusiaceae), Chè (Theaceae), Ngọc Lan (Magnoliaceae) và Côm (Elaeocarpaceae) Loài Sa mộc dầu tạo thành tầng vượt tán trong rừng kín hỗn hợp cây lá rộng - lá kim ẩm á nhiệt đới núi thấp (Bùi Thế Đồi và Nguyễn Phi Hùng, 2011; Nguyễn Thị Phương Trang, 2012; Nguyễn Thị Thanh Nga và cộng

sự, 2015a, 2017)

Mặc dù, Sa mu dầu ở Việt Nam chỉ phân bố ở một số tỉnh, tuy nhiên các công trình công bố còn chưa thống nhất về thời gian ra nón và nón chín Theo Nguyễn

6

Đức Tố Lưu và Philip Ian Thomas (2004): loài này nón chín tháng 11 - 12 tuy nhiên thường khó thu hái do chỉ mọc ở phần trên của những cây trưởng thành rất lớn; Theo Sách Đỏ Việt Nam (2007), nón xuất hiện tháng 9, hạt trưởng thành vào tháng 3 - 5 năm sau; Phan Kế Lộc và cộng sự (2013): thụ phấn tháng: 1 - 3, hạt chín tháng 1 - 4

Kết quả nghiên cứu của Nguyễn Tiến Hiệp và cộng sự (2004), nhận định Sa

mu dầu không thấy tái sinh tự nhiên ở Khu BTTN Pù Huống hoặc ở núi Pù Mát của Kỳ Sơn, Nghệ An Ở những nơi khác sự tái sinh thường gặp ở những nơi đất

bị sạt lở hoặc các khu mới bị cháy vì vậy cần có khoảng rừng trống thì cây mới tái sinh Theo Sách Đỏ Việt Nam (2007), đặc điểm tái sinh Sa mu dầu thì tái sinh bằng hạt bình thường với nhiều cây có tuổi rất khác nhau, kể từ cây mạ trở lên Nguyễn Văn Sinh (2009), khi nghiên cứu Sa mu dầu ở VQG Pù Mát (Nghệ An) nhận định khả năng tái sinh của loài rất kém Cây tái sinh chủ yếu xuất hiện ở giai đoạn cây mạ và khi chuyển sang giai đoạn cây con thì ít bắt gặp, tỷ lệ cây con có triển vọng rất thấp; Mai Văn Chuyên và cộng sự (2011), không thấy có Sa mu dầu tái sinh tự nhiên tại tất cả các điểm phân bố ở Khu bảo tồn thiên nhiên Xuân Liên, Thanh Hoá Nguyễn Thị Phương Trang (2012), khi nghiên cứu tái sinh Sa mu dầu

ở tỉnh Nghệ An và Thanh Hóa không thấy có tái sinh tự nhiên Kết quả công bố theo Sách Đỏ Việt Nam (2007), cho thấy chưa có sự đồng nhất với các kết quả nghiên cứu của các tác giả sau này Nhận định chung theo nghiên cứu của các tác giả trên thì khả năng tái sinh của loài Sa mu dầu rất kém và một số vùng nghiên cứu không thấy có hiện tượng tái sinh

1.2 Nghiên cứu giá trị sử dụng loài Sa mu dầu

Gỗ Sa mu dầu được đánh giá cao do nó có hoa vân và màu sắc đẹp, có mùi thơm và khá bền, nhất là khi chôn dưới đất hoặc tiếp xúc với nước, rất được ưa chuộng để làm nhà, lợp mái bền vài chục năm (Phan Kế Lộc và cộng sự, 2013)

Nó cũng được trồng làm cây cảnh trong các công viên và các khu vườn lớn Loài

Sa mu dầu mọc tương đối nhanh và có tiềm năng sử dụng trong trồng rừng Tuy nhiên hiện tại, do có giá trị sử dụng cao nên các khu rừng Sa mu dầu đã bị các lâm tặc khai thác mạnh, cộng với đó là sự phân bố hạn chế cũng là nguyên nhân đe dọa tuyệt chủng đối với loài này (Tô Văn Thảo, 2003; Viện điều tra quy hoạch rừng 1970, 1971, 1980, 1999) Ngoài ra, mối đe dọa phụ khác là việc dẫn nhập các xuất xứ của loài Sa mộc (C lanceolata) từ nước ngoài vào trồng rừng Những taxon này được biết là có khả năng dễ dàng lai với nhau, và như vậy thì bản chất

Đỗ Ngọc Đài và Nguyễn Quang Hưng (2012) cho thấy thành phần chính tinh dầu

từ gỗ Sa mu dầu ở Tây Côn Lĩnh, Hà Giang là α-terpineol (36,6%), α-cedrol (29,8%), cis-α-dehydro terpineol (5,6%), borneol (4,6%), camphor (4,4%) and α-cedren (3,4%) Tinh dầu từ nón Sa mu dầu thu ở xã Na Ngoi, huyện Kỳ Sơn, tỉnh Nghệ An, Việt Nam được chưng cất bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước với hàm lượng tinh dầu đạt 0,6% theo nguyên liệu tươi và phân tích bằng phương pháp sắc

ký khí khối phổ (GC/MS) Ba mươi tám hợp chất đã được xác định chiếm 91,6% hàm lượng tinh dầu Thành phần chính tinh dầu gồm α-pinene (29,27%), germacren D (14.21%), β- Caryophyllene (7.05%), -muurolol (5,09%), δ3-carene (4,01%), α- amorphene (3,73%) và β- myrcene (3,60%) (Nguyễn Thị Thanh Nga

và cộng sự, 2016)

Do có nhiều giá trị sử dụng nên sa mộc dầu bị khai thác quá mức dẫn đến nguy

cơ tuyệt chủng Hiện Sa mộc dầu đã được ghi vào Sách đỏ Việt Nam (2007), được xếp ở mức VU tức là sẽ nguy cấp và trong Nghị định số 06/2019/NĐ-CP của Chính phủ thuộc nhóm I của Danh mục Thực vật rừng nguy cấp, quý hiếm, hạn chế khai thác, sử dụng vì mục đích thương mại Để bảo tồn loài Sa mộc dầu, hàng năm phải nghiêm cấm việc khai thác, mặt khác cần phải tuyển chọn những cây mẹ có phẩm chất tốt để xây dựng vườn cây giống, từ đó mở rộng, phát triển nguồn gen Sa mộc dầu tại Việt Nam

1.3 Một số chỉ thị phân tử dùng trong phân tích đa dạng di truyền quần thể

và loài thực vật

Trong vài thập kỷ qua, các kỹ thuật sinh học phân tử đã có sự phát triển mạnh

mẽ, tạo ra công cụ hữu hiệu cho con người nghiên cứu sự sống ở cấp độ phân tử, các kỹ thuật sinh học phân tử cũng nhanh chóng được ứng dụng trong nghiên cứu

và bảo tồn đa dạng sinh học, tạo ra lĩnh vực khoa học mới như tiến hóa phân tử,

di truyền bảo tồn Để nghiên cứu đa dạng di truyền quẩn thể và loài thực vật, ngoài

kỹ thuật isozym, còn có kỹ thuật ADN với các phương pháp như RAPD, SSR, ISSR, AFLP, RFLP,

đa dình ADN cho phép phân tích, so sánh những đặc tính bền vững (hoặc thay đổi) theo điều kiện khác nhau của môi trường (Khuất Hữu Thanh, 2005)

1.3.2 Kỹ thuật RAPD

RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA – đa hình các đoạn ADN được khuếch đại ngẫu nhiên) do William phát minh năm 1990, Welsh và cộng sự hoàn thiện năm 1991 (Watson và Barker, 2004) Phương pháp này sử dụng cùng một số cặp mồi ngẫu nhiên nhất định (thường từ 10 đến 40 cặp mồi) (mồi ngẫu nhiên là các đoạn oligo nucleotide gồm khoảng 8 đến 20 Nucleotide, đặc trưng với mỗi loài sinh vật) để thực hiện phản ứng PCR nhằm nhân các đoạn ADN đặc trưng của các mẫu nghiên cứu Nếu các mẫu nghiên cứu có bộ gen giống nhau hoàn toàn, sản phẩm PCR thu được gồm các đoạn ADN hoàn toàn giống nhau về kích thước và cấu trúc Khi bộ gen của các mẫu nghiên cứu có sự khác biệt nhau, kết quả PCR sẽ nhân được các đoạn khác biệt nhau (Hồ Huỳnh Thùy Dương,

2002, Khuất Hữu Thanh, 2005)

*Ưu điểm của kỹ thuật RAPD

Về mặt kỹ thuật, kỹ thuật RAPD dễ thực hiện và dễ thành công do không cần biết trước trình tự bộ gen của đối tượng cần nghiên cứu, thao tác đơn giản, chất lượng ADN khuôn không cần độ tinh sạch quá cao, thời gian thực hiện nhanh, khả năng nhân bản cao

Về mặt kinh tế, chi phí thực hiện cho kỹ thuật này thấp Trong nghiên cứu,

kỹ thuật RAPD thường được sử dụng kết hợp với những kỹ thuật cao cấp khác để

9

đánh giá đa dạng di truyền và nhận diện chỉ thị phân tử có độ tin cậy cao (Nguyễn Đức Thành, 2003)

* Những hạn chế của kỹ thuật RAPD

Kỹ thuật RAPD có độ chính xác không cao, không ổn định (thể hiện ở mức

độ lặp lại giống nhau thấp) Khả năng nhân bản trong phản ứng PCR cao nhưng khả năng xuất hiện đa hình thấp và độ tin cậy không cao Khả năng nhận diện chỉ thị phân tử thấp và có độ tin cậy không cao (Khuất Hữu Thanh, 2005, Nguyễn Đức Thành, 2003)

1.3.3 Kỹ thuật RFLP

RFLP (Restriction fragment length Polymorphism – đa hình chiều dài các đoạn ADN cắt bởi các enzyme giới hạn) Kỹ thuật này dựa trên đặc điểm của các enzyme giới hạn khác nhau, tạo nên các đoạn cắt ADN khác nhau phân biệt được bằng điện di đồ, các đoạn cắt còn được gọi là các “dấu vân tay” đặc trưng cho từng phân tử ADN Bản đồ di truyền kết quả RFLP có tính chính xác cao, thường được sử dụng trong nghiên cứu sự khác biệt trong cấu trúc bộ gene của các cá thể, các loài sinh vật, nhằm so sánh sự khác biệt giữa các mẫu nghiên cứu, xác định nguồn gốc hoặc mức độ tiến hóa giữa của các loài sinh vật (Khuất Hữu Thanh, 2005)

Kỹ thuật này được dùng phổ biến từ đầu thập niên 80 đến nay Kỹ thuật RFLP được sử dụng để kiểm tra sự phân ly di truyền của một số tính trạng theo qui luật Mendel, hoặc ứng dụng trong chọn giống động vật, chọn giống thực vật hoặc so sánh sự khác nhau giữa các cá thể, các loài sinh vật Kỹ thuật RFLP được thực hiện trên nguyên lý cắt enzyme giới hạn ADN của mẫu nghiên cứu sau khi được tách chiết và tinh sạch sẽ được cắt với cùng 1 số loại enzyme giới hạn Mỗi enzyme giới hạn sẽ nhận biết và cắt đặc hiệu ADN ở những vị trí xác định, do đó các bộ gen có cấu trúc khác nhau sẽ cho ra số lượng và kích thước các đoạn cắt ADN khác nhau, những bộ gen giống nhau thì sẽ cho ra số lượng, kích thước các đoạn cắt giống nhau, kích thước vá số lượng các đoạn cắt này sẽ quan sát được trên điện di đồ

10

1.3.4 Kỹ thuật AFLP

Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), được hiểu là sự

đa dạng của các đoạn ADN được nhân lên có định hướng sau khi bị cắt bởi 2 RE,

sử dụng những phân đoạn ADN làm khuôn cho phản ứng khuếch đại (PCR) Kỹ thuật này được Vos và cộng sự phát triển vào năm 1995 và ngay lập tức trở thành

1 công cụ hữu ích để nhận biết nhiều locus trong sự đa hình ADN mà không cần biết trước thông tin về trình tự ADN của chúng Phương pháp này có thể đưa ra nhanh chóng một ước lượng độ đa dạng di truyền trong và giữa các quần thể với nhau (Watson và Barker, 2004)

1.3.5 Kỹ thuật SSR

Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeat), còn được gọi là microsaterlite (vi

vệ tinh) là kỹ thuật nghiên cứu dựa trên trình tự lặp các đoạn đơn giản, đây là những trình tự ngắn (từ 2 đến 6 cặp ba zơ) có thứ tự lặp lại liên tiếp dao động từ

2 đến 40 Các trình tự lặp đơn giản rất phổ biến ở hệ gen động vật và thực vật, mật độ các trình tự dao động rất lớn Chúng được phân bố trong hệ gen và có tính đặc trưng cho từng loài (Khuất Hữu Thanh, 2005; Morgante, 2002)

Kỹ thuật này dựa trên nguyên lý phản ứng chuỗi PCR với mục tiêu đầu tiên là nhận dạng các trình tự lặp lại đơn giản Sau khi các trình tự lặp lại đơn giản này được nhận dạng, bước tiếp theo là xác định trình tự của ADN và thiết kế primer Các trình tự gần kề và các trình tự lặp lại sẽ tạo nên SSR SSR primer sau đó được

sử dụng tương tự như các RAPD primer

Kỹ thuật SSR có tiềm năng rất lớn do có khả năng phát hiện tính đa hình rất cao, có thể phân biệt được sự sai khác mà không xác định được bằng các marker khác như RAPD và RFLP SSR primer có từ 1 đến 12 locus (tuỳ vào loài) được

tổ hợp trong một ống phản ứng PCR do vậy cho phép đồng thời ghi nhân các kiểu gen có nhiều locus Phản ứng không quá tốn kém, tiết kiệm được thời gian và hoá chất Primer sử dụng trong SSR dài hơn mồi RAPD và dựa trên trình tự đặc trưng

và vì thế tỏ ra đáng tin cậy khi phát hiện cùng một locus và thích hợp cho việc nghiên cứu bản đồ gen Marker SSR là các locus đặc trưng, đa allele nên cung cấp nhiều thông tin rất có ích so viẹc phát hiện sự thay đổi các trình tự hiếm SSR là loại marker đồng trội nên đã nhanh chóng thay thế RFLP và RAPD và trở thành công cụ hữu hiệu trong các ứng dụng chọn giống thực vật và nghiên cứu di truyền

11

Nhược điểm của phương pháp này là quá trình thiết kế mồi đắt, mỗi loại mồi chỉ đặc trưng cho mỗi locus đa hình Để xây dựng các cặp mồi đặc hiệu cần tách dòng và đọc trình tự một số lượng lớn các đoạn ADN của genom có chứa SSR Hiện nay, số lượng primer thiết kế cho các loại cây trồng còn hạn chế, làm giảm hiệu quả của SSR trong việc lập bản đồ gen Một vấn đề khác cũng thường gặp phải trong sử dụng SSR là việc xác định quan hệ giữa các allele với các marker phân tử là rât khó SSR có thể được phân bố ngẫu nhiên trong genom nhưng cũng

có khi tập trung lại ở tâm động hay eo thứ cấp của nhiễm sắc thể Điều này hạn chế việc sử dụng các mẫu dò nhiều locus trong phân tích liên kết di truyền và nghiên cứu quần thể (Khuất Hữu Thanh, 2005, Triest, 2008)

1.3.6 Kỹ thuật ISSR

Kỹ thuật ISSR (Interal simple sequence repeat) là kỹ thuật phân tích dựa trên việc nhân bản đoạn ADN nằm giữa 2 vùng lặp đơn giản Với ISSR, mồi là những đoạn lặp đơn giản Nguyên lý của phương pháp này là khuếch đại những đoạn trình tự nằm giữa 2 đầu lặp đơn giản Bộ gen của sinh vật bậc cao có nhiều đoạn ADN lặp lại, các đoạn lặp thường có kích thước ngắn (vài nucleotide), số lần lặp lại là đặc trưng cho mỗi loài, mỗi giống Ví dụ, ở lúa có khoảng gần 1000 lần lặp lại trật tự AC/TG, khoảng trên 300 lần lặp lại trật tự GATA/CTAT Nhiều loài cây 1 lá mầm như ngô, lúa… lặp lại đoạn CGG/GCC

Phân tích ISSR sử dụng mồi bổ trợ với các vùng microsatellite nên còn gọi là MP-PCR có thể kế thừa mở rộng từ các phân tích microsatellites khác để tăng khả năng lặp lại và giảm tính đa hình so với RAPD Các chỉ thị RAPD, ISSR được dùng nhiều trong lập bản đồ, phân tích di truyền, chọn giống ở thực vật (Nguyen Minh Tam, 2009; Williams, 1990)

1.4 Nghiên cứu đa dạng di truyền loài Sa mu dầu ở Việt Nam và trên thế giới 1.4.1 Ngoài nước

Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong đánh giá mức độ đa dạng di truyền bên trong và giữa các quần thể của mỗi loài là hết sức cần thiết, là cơ sở khoa học nhằm nâng cao chất lượng di truyền và hiệu quả bảo tồn loài đang bị đe dọa Hiện nay có rất nhiều công trình nghiên cứu sâu về di truyền quần thể và loài phục vụ công tác bảo tồn, nhân giống và phục hồi các loài cây lá kim (Li et al., 2017; Zheng et al., 2019; Lin et al., 2020) Những nghiên cứu này cung cấp thông tin

12

quan trọng cho bảo tồn nguồn vật liệu di truyền, lựa chọn các vật liệu di truyền

ưu tú và lựa chọn cha mẹ cho nhân giống Trong hai mươi năm qua, mức độ đa dạng di truyền phân tử của các loài Cunninghamia spp đã được nghiên cứu khá tốt (Chung et al., 2004; Lin et al., 1998, 2020; Huang et al., 2012; Li et al., 2017; Duan et al., 2017; Zheng et al., 2019)

Loài C konishii và C lanceolata đều có bộ NST lưỡng bội là 2n = 22 (Han

et al., 1980; Schlarbaum và Tsuchiya, 1984) Mức độ đa dạng di truyền cao và sự khác biệt di truyền giữa năm quần thể của C konishii đã được xác định bằng kỹ thuật isozymes (Lin et al., 1998) Chung và cộng sự (2004) dựa vào chỉ thị phân

tử AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphisms) đã chỉ ra sự biến đổi di truyền giữa các quần thể C konishii khác nhau ở Đài Loan tương đối cao (24,60%)

và nguồn gốc tiến hóa của loài C konishii được bắt nguồn từ C lanceolata Khi công nghệ giải trình tự thế hệ mới xuất hiện, Huang và cộng sự (2012) đã tiến hành giải hệ gen phiên mã ngược loài C lanceolata ở Trung Quốc nhằm tìm kiếm các gen chức năng có liên quan đến con đường sinh tổng hợp cellulose và lignin bằng ứng dụng kỹ thật giải trình tự thông lượng cao (Illumina HiSeq™ 2000) Kết quả đã xác định 83.248 đơn vị gen với kích thước trung bình 449 bp; trong đó, 27.224 đơn vị gen chứa chuỗi protein cung cấp các gen chức năng (Swiss-Prot), 16.750 đơn vị gen là nguồn thông tin về các chức năng gen (GO) và 21,689 đơn vị gen hình thành 119 con đường chức năng gen với các nhóm: trao đổi chất, xử lý thông tin di truyền, phát triển tế bào, xử lý thông tin môi trường,

hệ thống tổ chức Bộ dữ liệu này cung cấp một nền tảng thông tin quan trọng để cải thiện sự hiểu biết về cơ chế phân tử của sự hình thành gỗ của loài C lanceolata

ở Trung Quốc

Mức độ đa dạng di truyền cao (h = 0,3593; I = 0,5283) và mối tương quan đáng kể giữa khoảng cách di truyền và khoảng cách địa lý giữa các kiểu gen (r = 0,4275, p < 0,01) của loài C lanceolata cổ đại được tiết lộ thông qua các chỉ thị phân tử SSR (Li et al., 2017) Ngoài ra, trong 47 cá thể C lanceolata cổ đại được phân thành 3 cụm: cụm I gồm có 14 kiểu gen phân bố ở khu vực Trung tâm và phía Tây Trung Quốc (bao gồm tất cả các mẫu từ các tỉnh Tứ Xuyên, Vân Nam, Quý Châu, Hồ Nam và hai mẫu ở Quảng Tây và Giang Tây); cụm II bao gồm ba kiểu gen phân bố ở các tỉnh Hồ Bắc và An Huy) và cụm III bao gồm tất cả các mẫu từ Phúc Kiến, Quảng Đông, Chiết Giang, một mẫu từ tỉnh Quảng Tây và hai

13

mẫu từ tỉnh Giang Tây Năm kiểu gen (GXJX, GDYS, GDHJ, GDSX và JXCY)

có cấu trúc di truyền khác nhau và mối quan hệ di truyền khá xa với các mẫu khác trong cụm III và chúng đều có nguồn gốc từ khu vực cận nhiệt đới phía nam Trung Quốc của vùng phân bố C lanceolata Tác giả cũng kiến nghị nên kết hợp các biện pháp bảo tồn bao gồm lưu trữ nguồn vật liệu di truyền và thực hiện bảo tồn tại chỗ

Cùng thời gian đó, Duan và cộng sự (2017) đã sử dụng 21 chỉ thị phân tử SSR với mục đích đánh giá đa dạng di truyền nguồn vật liệu di truyền của 700 cây C lanceolata ở 6 tỉnh ở miền nam Trung Quốc Phân tích di truyền cho thấy sự biến đổi di truyền rộng giữa các nhóm, với trung bình 8,31 alen trên mỗi locus và chỉ

số đa dạng Shannon trung bình là 1,31 Mức độ khác biệt di truyền thấp giữa các tỉnh, phù hợp với biến dị di truyền xen kẽ (1%) Ba cụm di truyền đã được xác định nhưng không phù hợp với các lý lịch địa lý cá thể

Trong nghiên cứu Zheng và cộng sự (2019), tác giả tập trung vào phát triển các dấu hiệu đa hình đơn nucleotide (SNP) thông qua kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới (SLAF-seq) đối với loài C lanceolata ở Trung Quốc Dựa trên SLAF- seq tác giả

đã tìm ra 108.753 SNP từ hệ genomic của loài Bộ chỉ thị SNP này đã tạo điều kiện hiểu rõ hơn về cơ sở di truyền của quần thể C lanceolata với 221 kiểu gen đã được xác định cho sự biến đổi di truyền ở cấp độ phân tử Kết quả thu được của nhóm tác giả chắc chắn sẽ giúp thúc đẩy chương trình nhân giống tiên tiến của C lanceolata trong thời gian tới

Gần đây, một khảo sát về bộ gen của loài C lanceolata ở Trung Quốc mới đây đã được Lin và cộng sự (2020) thực hiện bằng cách sử dụng kỹ thật giải trình

tự Illumina HiSeq Xten Phân tích K-mer chỉ ra rằng C lanceolata có bộ gen lớn xấp xỉ 11,6Gb với các vùng lặp lại 74,89% và dị hợp tử lớn Trong khi đó, kích thước bộ gen của nó được ước tính là 13,2 Gb bằng phương pháp đếm tế bào học dòng chảy (flow cytometry) Tổng số 362.193 locus SSR đã được phát hiện Lặp lại di-nucleotide là phong phú nhất (lên tới 73,6% tổng số SSR), tiếp theo là lặp lại tri-nucleotide và tetra-nucleotide 46 chỉ thị phân tử SSR đa hình đã được phát triển và 298 alen được khuếch đại thành công từ 199 cá thể C lanceolata Giá trị PIC trung bình là 0,53, chỉ ra rằng các chỉ thị genomic SSR (gSSR) được xác định

có mức độ đa hình cao Ngoài ra, trong số các cá thể nghiên cứu được chia thành

ba nhóm và một dòng gen hạn chế tồn tại trong số các nhóm này

14

1.4.2 Trong nước

Việt Nam hiện được xếp vào một trong 10 điểm nóng nhất trên thế giới về bảo tồn Thông, vì vậy việc nghiên cứu tính đa dạng di truyền nguồn gen của các loài có giá trị khoa học, kinh tế, các loài đặc hữu, quý hiếm đang bị đe dọa tuyệt chủng ở Việt Nam là hết sức cần thiết đặc biệt với các loài Thông (Nguyễn Tiến Hiệp và cộng sự, 2004; Nguyễn Hoàng Nghĩa và cộng sự, 2004) Đã có nhiều nghiên cứu sâu về đa dạng di truyền nguồn gen một số loài ngành Thông trên cơ

sở ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử

Phương pháp sinh học phân tử đã được sử dụng kết hợp với phương pháp phân loại truyền thống xác định lại bậc phân loại của loài Sa mộc trồng và Sa mu dầu (Nguyễn Thị Phương Trang và cộng sự, 2009) Cụ thể, Sa mộc trồng Cunninghamia lanceolata (Lamb.) Hook nhập từ Trung Quốc vào trồng và Sa

mu dầu Cunninghamia konishii Hayata mọc tự nhiên là 2 loài duy nhất của chi Sa mộc Cunninghamia Có một quan điểm khác nhập Cunninghamia konishii Hayata vào loài Cunninghamia lanceolata Cả 2 quan điểm đều chỉ dựa thuần túy vào một số đặc điểm hình thái bên ngoài Nhằm khắc phục tính phiến diện đó nhóm tác giả đã xác định trình tự nucleotide vùng 18S-rDNA của chúng và phân tích mối quan hệ di truyền của chúng với 7 loài khác chi nhưng trong cùng họ Hoàng đàn Cupressaceae theo phương pháp MP Kết quả cho thấy, có 2 nhóm tiến hóa, trong đó 2 loài Sa mộc tạo thành một nhóm riêng Giữa chúng có mối quan hệ rất mật thiết với nhau (bootstrap 99%) với hệ số sai khác rất nhỏ (0,018) Nhóm tác giả thống nhất nhập Cunninghamia konishii Hayata vào loài Cunninghamia lanceolata (Lamb.) Hook., coi nó chỉ như một thứ, Cunninghamia lanceolata var konishii (Hayata) Fujita bên cạnh thứ chuẩn Cunninghamia lanceolata (Lamb.) Hook var lanceolata

Ngay sau đó, Nguyễn Minh Tâm và cộng sự (2009) đánh giá đa dạng di truyền loài Sa mu dầu bằng chỉ thị phân tử ISSR từ 182 cá thể tự nhiên tại 4 địa điểm Khe Thơi, Tam Hợp, Tây Sơn tỉnh Nghệ An và Bát Mọt, tỉnh Thanh Hóa Kết quả chỉ ra mức độ đa dạng di truyền ở quần thể và loài thấp và sự khác biệt di truyền giữa các quần thể tương đối cao, đây chính là hậu quả của sự can thiệp thiếu hiểu biết của con người Các tác động này đã khiến cho nơi sống của các quần thể Sa

mu dầu bị suy giảm và phân cắt, hiện tại chỉ còn sót lại 1 vài quần thể tự nhiên

15

nhưng cũng đều có kích thước rất nhỏ (<100 cá thể/quần thể) Cần thiết phải có những chính sách để bảo tồn loài bằng cả 2 hình thức bảo tồn nguyên vị và bảo tồn chuyển vị

Nguyễn Minh Tâm và cộng sự (2010) đã đánh giá đa dạng di truyền của 4 loài thuộc họ Hoàng Đàn (Cupressaceae) là Pơ mu (Fokienia hodginsii), Sa mộc dầu (Cunninghamia lanceolata var konishii), Hoàng đàn hữu liên (Cupressus tonkinesis) và Thủy tùng (Glytostrobus pensilis) bằng sử dụng chỉ thị phân tử ISSR và giải mã vùng gen 18S đã chỉ ra hai loài Pơ mu và Sa mộc dầu có mức

độ đa dạng di truyền suy giảm cao hơn Thủy tùng và Hoàng đàn Hữu liên Sự suy giảm này đều liên quan đến hoạt động của con người, đặc biệt nơi sống bị phân cắt Tương tự, Đinh Thị Phòng và cộng sự (2014, 2015, 2016) và Trần Thị Liễu

và cộng sự (2015, 2018) cũng đã sử dụng chỉ thị phân tử RAPD, ISSR và SSR để nghiên cứu mối quan hệ di truyền cho Pơ mu, Bách xanh, Kim giao núi đất và thông Đà Lạt phục vụ cho nghiên cứu bảo tồn Gần đây, Vũ Đình Duy và cộng sự (2016) nghiên cứu đa dạng và biến đổi di truyền ở quần thể tự nhiên của dưới loài Thông xuân nha (Pinus armandii subsp xuannhaensis L.K.Phan) đặc hữu hẹp ở Sơn La, Việt Nam bằng chỉ thị ISSR Tác giả đã chỉ ra rằng sự suy giảm tính đa dạng di truyền liên quan đến kích thước quần thể nhỏ và số lượng quần thể ít và

cô lập Riêng với loài Thông đỏ nam (Taxus wallichiana Zucc.), nguồn nguyên liệu để tách chiết taxol làm thuốc chữa ung thư, hiện đang được ngành y tế quan tâm nghiên cứu gây trồng bằng biện pháp giâm cành Với loài này và loài Thông

đỏ bắc (Taxus chinensis (Pilg.) Rehder) cũng có một vài nghiên cứu về mối quan

hệ di truyền và đa dạng di truyền (Vu et al., 2017)

Đến nay có thể nói, các nghiên cứu trên đã tạo tiền đề quan trọng cho hướng nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử vào việc phân loại, giám định, đánh giá đa dạng di truyền, bảo tồn và quản lý thương mại nguồn tài nguyên sinh vật ở nước

ta Các dẫn liệu về đa dạng nguồn gen di truyền ở mức độ quần thể và loài Sa mộc dầu ở Việt Nam còn rất hạn chế nên cần được quan tâm nghiên cứu để có kế hoạch bảo tồn cũng như khai thác nguồn tài nguyên quý giá này