Bài giảng Bảo tồn đa dạng sinh học: Chương 5.1

Bài giảng Bảo tồn đa dạng sinh học: Chương 5.1

CÁC CÔNG CỤ:

Sử dụng hoá sinh và

đánh dấu phân tử

Chương 5.1

ƒ Các yếu tố môi trường có thể làm ảnh hưởng đến các đặc điểm về hình thái

liệu di truyền hoặc các biến dị được

kiểm tra bởi các gen

ƒ Đo đếm vài chỉ số của đa dạng di truyền

ƒ Chọn các vật liệu di truyền cho các chương

trình chọn giống

Giới thiệu

ƒ Đánh dấu phân tử

ƒ Chuỗi DNA dễ phát hiện và một protein thừa kế có thể giám sát

ƒ Giống chứa các protein

Sử dụng đánh dấu phân tử để đo

đếm biến dị di truyền

ƒ Giới thiệu protein

Đánh dấu dựa trên protein

Cấu trúc cơ bản của protein

ƒ Tại sao sử dụng protein chứa trong hạt

giống ?

ƒ Hạt giống là nguồn chứa protein phong phú

ƒ Protein có sẳn về số lượng

ƒ Hạt giống dễ xác định được các giai đoạn phát triển

ƒ Trích protein (pH, acid)

ƒ Tách protein riêng lẽ theo phương pháp điện di

(Polyacrynamide gel electrophoresis)

ƒ Có thể nhìn thấy protein trên gel bằng cách nhuộm màu (Coomassie blue, Imido black)

ƒ Phân tích các kiểu dãi

Giống chứa các protein

ƒ Nhiều hình dạng của enzyme giống nhau

locus

ƒ Phương pháp

Isozyme và allozyme

ƒ Đồng hợp tử hay dị hợp tử

Phân tích các band

Ví duï

Đánh dấu trên cơ sở DNA

DNA cơ bản

Tổng hợp DNA

Tổ chức của DNA

ƒ Đa hình các đoạn cắt ( Restriction

Fragment Length Polymorphism –

RFLP) gồm các bước:

đoạn nhỏ

Đánh dấu dựa vào RFLP

Tách các đoạn cắt của DNA bằng gel điện di

Chuyển các DNA cắt qua bộ lọc

RFLP

Ví duï: RFLP cuûa Brassica

Phân tích kết quả (single-Locus probes)

Phân tích kết quả

(Multi-Locus probes)

ƒ Kỹ thuật trong sinh học phân tử mà một đoạn DNA nhỏ có thể nhân thành nhiều bản.

ƒ Polymerase Chain Reaction (PCR) sử dụng một enzyme được biết đến như là polymerase để nhanh chóng nhân lên từ một đoạn DNA nhỏ mà mang các đặc điểm di

truyền của sinh vật.

ƒ Pha 1: Làm biến tính của DNA thông qua nhiệt để các sợi tách ra

ƒ Pha 2: Nhiệt độ của hỗn hợp được hạ thấp để cho các miếng

Primer gắn vào với các DNA đã tách ra

ƒ Pha 3: Sự trùng hợp Nhiệt độ nóng lên để polymerase enzyme sao chép nhanh DNA

ƒ Mỗi chu kỳ PCR nhân đôi số lượng DNA, khoảng 1 tỉ bản sao của

1 đoạn DNA có thể tạo nên trong vài giờ

ƒ PCR được dùng để xác định một cá nhân nào đó từ một ít mô hoặc máu, để chẩn đoán bệnh di truyền và nghiên

cứu tiến hoá

Phản ứng chuỗi polymera

Polymerase Chain Reaction (PCR)

ƒ Enzyme giới hạn ( restriction enzymes ) có trong

vi khuẩn có nhiệm vụ như chiếc kéo phân tử để cắt các cột Phosphat của phân tử DNA ở các

chuỗi bazơ cụ thể.

1 đuôi được gọi là điểm dính tận cùng (sticky

ends) do nó có thể nối lại với các đuôi khác của các mảnh vỡ của DNA nào đó.

và điểm dính được tạo ra bởi enzyme để thực

hiện việc tái tổ hợp kỹ thuật DNA

Tái tổ hợp DNA

(Recombinant DNA)

Polymerase Chain Reaction (PCR)

VCD: DNA Structure and Replication

ƒ Kỹ thuật PCR và tái tổ hợp DNA tạo nên nhiều đoãn DNA Để nghiên cứu cấu trúc của các đoạn này người

ta dùng phương pháp điện di gel

ƒ Trong điện di gel, các restriction enzymes tách các

DNA nghiên cứu thành những đoạn có chiều dài khác nhau Các dung dịch chứa nhựng đoạn này được đặt trong chất gel dày và cho dòng điện chạy qua, một đầu là âm một đầu là dương Tất cả các đoạn hạn chế bắt đầu di chuyển từ cực âm sang cực dương Những đoạn nhỏ hơn di chuyển nhanh hơn những đoạn lớn hơn.Sau vài giờ ngắt dòng điện thì các đoạn DNA trãi suốt xuyên qua chất gel, các đoạn nhỏ hơn thì gần phía cực dương Sự phân tán các đoạn trình bày 1 kiểu tương tự với sọc mã số Mỗi sọc trong kiểu này chứa các đoạn DNA của

1 kích thước nào đó Người ta xác định các đoạn giới hạn cụ thể bằng các vị trí của nó trên gel.

ƒ Một chuổi DNA bổ sung có thể được dùng thăm dò để tìm kiếm một đoạn giới hạn trong gel mà có chuỗi nucleotid có liên quan.

ƒ Các nhà khoa học dùng các DNA thấy được trong máu để so sánh DNA trong điện di gel để so sánh bằng

chứng của tội phạm

Ưùng dụng đánh dấu phân tử trong

lâm nghiệp

Đánh dấu phân tử ( Molecular markers)

ƒ Đánh dấu phân tử là các công cụ di truyền cho phép chúng ta nghiên cứu sự khác nhau giữa các cá thể ởnhiều vị trí trong không gian thông qua bộ gen Đánh dấu được sử dụng để ghi đại chỉ các gen kiểm soát các tính trạng Nhận biết vị trí của các gen rồi cho phép tách và mô tả theo quy luật tự nhiên Các dấu này cũng cho các ý tưởng để kiểm tra nghiên cứu các mối quan hệ trong giữa các cá thể, các quần thể vàphân loại phát sinh loài

ƒ Đánh dấu phân tử thường sử dụng trong lâm nghiệp là:

ƒ Điện di protein (Protein electrophoresis - Isozymes )

ƒ Đa hình độ dài các đoạn cắt (restriction fragment length polymorphism – RFLP )

ƒ Vi vệ tinh (Simple sequence repeats - SSR or microsatellites ),

ƒ Đa hình DNA nhân bản ngẫu nhiên (Random amplified polymorphic DNA - RAPD ),

ƒ Đa hình chiều dài các đoạn DNA được nhân bản (amplified fragment length polymorphism - AFLP )

ƒ

Theo Daniel Plat, 2004

Mô hình tính trạng di truyền số lượng của 1 locus

Các ảnh hưởng trung bình của

các Allen A1 và A2

Tương tác trong các loci

Tính gen trội

Mô hình tính trạng di truyền số lượng của 2 loci

Tương tác trong các loci

Tính gen trội

Theo Daniel Plat, 2004

Trong các loài cây, các bản đồ liên kết rất thường được sử dụng để xác định các vùng nhiễm sắc thể một cách cụ thể mà kiểm tra tính trạng có giá trị kinh tế quan trọng như tình kháng bệnh, tỉ trọng gỗ hay sinh

trưởng Các tính trạng biến động theo số

lượng trong mỗi loài cây và các vùng

được xác định được gọi là vị trí tính trạng số lượng (QTC).

Phân tích các locus tính trạng số lượng

(QTL Analysis)

ƒ Xây dựng bản đồ gen là một công cụ mạnh và mới trong nghiên cứu di truyền không những cho con người nhưng cũng cho cây

nông nghiệp, lâm nghiệp và động vật

ƒ Bản đồ liên kết gen cung cấp thông tin vị trí tương đối của các gen các tính trạng theo các nhiễm sắc thể của một loài Bơiû vì córất ít thông tin về các gen cụ thể hay các tính trạng mà có thể xác định trực tiếp từ một cây cá thể, chúng ta sử dụng đánh dấu phân tử DNA như các bảng dẫn đường cùng với bản đồ gen

ƒ Bản đồ được phát triển bằng cách xét nghiệm một số DNA

marker có liên quan mật thiết của các cá thể Mỗi marker xác định một vị trí trên bản đồ gọi là một locus

ƒ Nhiều bản đồ liên kết cho một loài cây kinh tế được phát triển đểxác định vị trí tính trạng số lượng (QLT loci) và để cung cấp cơ bản cho việc giúp đở chọn lựa các marker

ƒ Việc đánh dấu tính trạng có tính thương mại cần phải trải qua vài năm, chọn lọc đầu tiên là dùng các đánh dấu phân tử để cung cấp thay thế tính trạng hấp dẫn hơn cho cây lai tạo

Bản đồ liên kết (Linkage Maps)

Các gen thích hợp (Candidate Genes)

ƒ Người ta thường biệt lập một số gen mà ảnh hưởng đến các tính trạng nào đó của cây như sự ra hoa,

phát triển sợi gỗ Người ta xây dựng bản đồ các gen này và xác định các gen thích hợp mà cùng vị trí với QLT cho các tính trạng thương mại quan trọng Lên bản đồ gen thích hợp giúp chúng ta hiễu vai trò của một gen trong việc xác định của một tính trạng và

trong cải thiện hiệu qủa của việc lai tạo các tính

trạng

ƒ Với Eucalyptus globulus người ta đã xây dựng được

bản đồ cho 4 loại bạch đàn tương đồng của gen

thực vật Arabidopsis , 4 gen này đóng vai trò trong

việc tổng hợp vách tế bào và 6 gen trong con đường tổng hợp sinh của monolignol

Candidate Genes

4CL 4-Coumarate:Coenzyme A ligase

AGE1 Agamous homologue 1

AGE2 Agamous homologue 2

CCoAOMT Caffeoyl Coenzyme A O-methyltransferase CCR Cinnamoyl Coenzyme A reductase

COMT Caffeate O-methyltransferase

EAP1 Squamosa homologue

ECA1 Cellulase homologue

ECS1 Cellulose synthase homologue

ELF1 Leafy homologue

EXS1 Xylan synthase homologue 1

EXS2 Xylan synthase homologue 2

S-adenosyl-homocysteine hydrolase MsaS2

PAL Phenylalanine ammonia-lyase

Name Primer sequences (5' - 3') Repeat motif(s)

Dinucleotide microsatellites

Am008 CCACCCGTTACCCATTTATGCCGTGATTGACTCTCAGCG (TG)14

Am012 TGAGTCGATCGCTTAGCTTGTCCCGTTATTATGCCAAAGTG (TC)15(AC)7-(AC)10AG

Am014 GTACTAACGTTGCTATATGAGAAAGGCTGGTTGTTCGCTTATATGG (ATAC)3(AC)26(AT)3,(GTAT)2 (AT)3ACAm018 CACGGCTGTTATTTCCTTCGGGAAAGAGGTGTGACAGAGGAC (AC)14

Am030 GAGGTAATATTTTGAATTCCTTGAACGGTGTATACCTCTTTCCTGTGG (AT)9(GT)15

Am041 TAGGCTAATGGTCATATTCCTAGAGAGATAGGGGTACACACTAAAAAAC (GT)36

Am136 CCCATTGCCGTTTCTTTGGCATTTCCCTTGGAACAGTC (CT)20

Am164 ACCCGGACGTATAGAAATAAATACACGTGGAGGCAAGCAATATC (TG)93

Am173 TTGGATGTCAAGATTTTACGGCATTAGGCCACGTTTTGATAG (AC)18

Am326 GGACCAAACTTATGCAACACCGCATCAATGTACTAAACCATTTCC (CA)20

Am341 CCATTCGAGCATCCTAAGAGCGTATGGCTGAGCTACTTAATCA (CA)12(TA)2

Am352 CCTCATGTCCTTGAATGTCACGACTAACCCACAAGGAAGAGTTAC (TTC)2TA(AC)14

Am367 CGCAACTCCATCTGATTTACTGTTATGTTGGGTTAATACGCTAACTG (A)7G(A)6GG(A)14,(CA)14

CACAAGGAACTGAGCAATGG

Primer sequences of 33 A mangium microsatellite loci

ƒ Microsatellites, hay Simple Sequence Repeats (SSRs), gồm

nhiều cặp lập lại từ 1 – 5 cặp motif

ƒ Đa hình chiều dài trong chuỗi thường xuất hiện thông qua

polymerase trượt trong suốt quá trình lập lại của DNA, gia tăng hoặc giảm số lượng lặp motif bằng một đơn vị tổng quát

ƒ Microsatellites có chất lượng quan trọng mà chúng tạo nên các phân tử đánh dấu mong muốn

ƒ Microsatellite markers thì biến động cao hơn các marker khác

ƒ Tất cả các alleles trong một cá thể có thể thấy được mà không phải trường hợp cho các marker trội như trong RAPD

ƒ Microsatellites rất linh hoạt trong ứng dụng nó có thể sử dụng đểphát hiện các khác biệt và biến đổi di truyền trong các quần thể, xác định sự lai tạo giữa các loài, kiểu thụ phấn và phát tán hạt giống, cho phép phân tích nguồn gốc cha và đánh giá lịch sử di truyền vừa qua như quần thể cổ chai

ƒ Người ta dùng microsatellites đánh dấu các cá thể và loài để xây dựng bản đồ gen cho phân tích QTL và hỗ trợ đánh dấu chọn lọc

Theo Daniel Plat, 2004

Details of dinucleotide microsatellite loci characterised from

Eucalyptus nitens, E globulus and E sieberi

ƒ Một điện trường được dùng để tạo các protein di trú thông qua một gel và nạp điện khác nhau như là kết quả thay đổi khác nhau Vì vậy biến đổi gen được thấy các băng như

“chậm” hay “nhanh” trên gel

ƒ Tần số băng xuất hiện được dùùng để mô tả cây cá thể hoặc quần thể thực vật và có thể dùng để nghiên cứu các mối quan hệ trong phân loại, đa dạng loài và các hệ thống lai tạo hoặc giám sát các chương trình cải thiện giống cây

ƒ Kỹ thuật được dùng như là một phương pháp đơn giản, rẽ cho việc đánh giá nhanh nhưng đang được thay thế những kỹ thuật mạnh hơn để để đánh giá biến đổi trực tiếp của

DNA

Theo Daniel Plat, 2004

Theo Daniel Plat, 2004

Theo Daniel Plat, 2004

Theo Daniel Plat, 2004

Theo Daniel Plat, 2004