Xây dựng hệ thống cảm ứng rễ tơ trên cây dưa chuột (cucumis sativus l ) phục vụ nghiên cứu biểu hiện gen (khóa luận tốt nghiệp)

Để cải thiện tình trạng trên ngoài, cải thiện các điều kiện dinh dưỡng, giảm tác động của yếu tố ngoại cảnh thì việc ứng dụng công nghệ sinh học trong nghiên cứu chọn tạo giống cây trồng

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

ĐỀ TÀI:

“XÂY D ỰNG HỆ THỐNG CẢM ỨNG RỄ TƠ TRÊN

CÂY DƯA CHUỘT (CUCUMIS SATIVUS L.) PHỤC VỤ

NGHIÊN C ỨU BIỂU HIỆN GEN”

Hà N ội - 2021

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

ĐỀ TÀI:

“XÂY D ỰNG HỆ THỐNG CẢM ỨNG RỄ TƠ TRÊN

CÂY DƯA CHUỘT (CUCUMIS SATIVUS L.) PHỤC VỤ

NGHIÊN C ỨU BIỂU HIỆN GEN”

Người thực hiện: Phương Thị Lựu

Người hướng dẫn: TS Đỗ Tiến Phát

TS Bùi Th ị Thu Hương

Hà N ội - 2021

i

L ỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả của nghiên cứu này là trung thực và chưa từng được công bố Nội dung lý thuyết có trong khóa luận tôi có tham khảo

một số tài liệu và đã trích dẫn trong mục tài liệu tham khảo Mọi sự giúp đỡ cho

việc thực hiện khóa luận này đã được cám ơn

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với những lời cam đoan trên!

Hà n ội, ngày 18 tháng 2 năm 2021

Sinh viên thực hiện

Phương Thị Lựu

ii

L ỜI CẢM ƠN

Để bài báo cáo khóa luận tốt nghiệp được hoàn thành, đầu tiên tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến TS Đỗ Tiến Phát và TS Bùi

Th ị Thu Hương đã luôn theo sát hướng dẫn và giúp đỡ tôi rất tận tình trong

suốt thời gian tôi thực hiện khóa luận tốt nghiệp

Tôi xin được cảm ơn ban Lãnh đạo của phòng Công nghệ tế bào Thực vật

- Viện Công nghệ Sinh học PGS.TS Chu Hoàng Hà và TS Đỗ Tiến Phát đã

tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện đề tài

Xin được gửi lời cảm ơn đến các thầy cô trong khoa Công nghệ sinh học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã truyền đạt cho tôi những kiến thức và những định hướng thật quý báu về ngành học hiện tại

Trong khoảng thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp, tôi đã nhận được

sự hướng dẫn và hỗ trợ tận tình của ThS Hoàng Thị Huyền Trang cùng với tất

cả các cô, anh chị cán bộ tại phòng Công nghệ tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công nghệ Việt Nam Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành và ấm áp đến tất cả anh chị cán bộ tại phòng đã giúp đỡ tôi

Đặc biệt lời cảm ơn cuối cùng tôi muốn giành cho gia đình, bạn bè, những người thân yêu đã luôn bên cạnh ủng hộ, giúp đỡ tôi trên tất cả mọi phương diện

Tôi xin trân trọng cảm ơn!

Hà n ội, ngày 18 tháng 2 năm 2021

Sinh viên thực hiện

Phương Thị Lựu

iii

M ỤC LỤC

L ỜI CAM ĐOAN i

L ỜI CẢM ƠN ii

M ỤC LỤC iii

DANH M ỤC CHỮ VIẾT TẮT v

DANH M ỤC CÁC BẢNG vi

DANH M ỤC HÌNH vii

Ph ần 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1

1.2 Mục đích và yêu cầu của đề tài 2

1.2.1 Mục đích 2

1.2.2 Yêu cầu 2

Ph ần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu về dưa chuột 3

2.1.1 Giới thiệu chung 3

2.2 Giới thiệu về chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes 7

2.3 Hệ thống cảm ứng rễ tơ 10

2.4 Rễ tơ và ứng dụng nuôi cấy rễ tơ 11

Ph ần 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

3.1 Vật liệu nghiên cứu 14

3.1.1 Nguyên liệu biến nạp 14

3.1.2 Hóa chất và dụng cụ 14

3.2 Phương pháp nghiên cứu 15

3.2.1 Chuẩn bị nguyên liệu biến nạp 15

3.2.2 Chuẩn bị dung dịch huyền phù vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes 15

3.2.3 Lây nhiễm khuẩn 16

3.2.4 Kiểm tra biểu hiện GUS thông qua dịch nhuộm 17

3.2.5 Kiểm tra gen chuyển bằng phương pháp sinh học phân tử 17

iv

3.2.6 Các thí nghiệm nghiên cứu 19

3.2.7 Phương pháp xử lý số liệu 20

Ph ần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21

4.1 Ảnh hưởng của nồng độ chất chọn lọc PPT đến mẫu biến nạp 21

4.2.1 Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn đến hiệu quả chuyển gen 24

4.3 Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển gen 26

4.4 Kiểm tra hiệu quả quy trình với điều kiện tối ưu 28

Ph ần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 31

5.1 Kết luận 31

5.2 Kiến nghị 31

TÀI LIỆU THAM KHẢO 32

PHỤ LỤC 36

v

DANH M ỤC CHỮ VIẾT TẮT

ADN Acid Deoxyribonucleic

AS Acetosyringone

CTAB Cetyl trimethyl ammonium bromide

EDTA Ethylene Diamine Triacetic Acid

gus β-glucuronidase

MS Môi trường nuôi cấy cơ bản theo Murashige và Skoog (1962) NaCl Natri Clorua

OD Optical density

ORI Origin of replication

PCR Polymerase Chain Reaction

PPT Phosphinothricin

pRi plasmid root induction

pTi plasmid tumor induction

ss T-DNA single-stranded DNA

T-DNA Transfer DNA

TL-DNA Transfer DNA Left border repeat sequences

TR-DNA Transfer DNA Right border repeat sequences

Tris HCL Tris hydrochloride

Vir Virulence Region

X – Gluc 5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucoronide

YEP Yeast Extract Peptone

vi

DANH M ỤC CÁC BẢNG

Bảng 4.1 Ảnh hưởng của nồng độ chất chọn lọc PPT đến hiệu quả biến nạp 22

Bảng 4.2 Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn đến hiệu quả biến nạp 25

Bảng 4.3 Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển gen 27 Bảng 4.4 Kiểm tra hiệu quả quy trình với điều kiện tối ưu 29

vii

DANH M ỤC HÌNH

Hình 2.1 Giống dưa chuột Nhật Bản 3

Hình 2.2 Hình thái giải phẫu quả dưa chuột 5

Hình 2.3 Ri Plasmid của vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes 8

Hình 2.4 Cơ chế chuyển T-DNA của Ri-plasmid sang genome thực vật 10

Hình 3.1 Sơ đồ khái quát quy trình biến nạp vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes trên mẫu lá mầm 16

Hình 3.2 Sơ đồ chu kỳ nhiệt phản ứng chạy PCR 19

Hình 4.1 Mẫu rễ tơ 7 ngày tuổi cấy trên môi trường có chứa nồng độ chất chọn lọc PPT 22

Hình 4.2 Mẫu rễ tơ sau chọn lọc bắt màu với dung dịch nhuộm màu X – Gluc 23

Hình 4.3 Mẫu rễ tơ 15 ngày tuổi sau lây nhiễm 26

Hình 4.4 Mẫu rễ tơ 20 ngày tuổi sau lây nhiễm 28

Hình 4.5 Kết quả điện di sản phẩm PCR của mẫu rễ tơ 29

Hình 4.6 Sơ đồ quy trình chuyển gen tối ưu 30

1

Ph ần 1: MỞ ĐẦU

1.1 Tính c ấp thiết của đề tài

Dưa chuột (Cucumis sativus L) là cây rau ăn quả thuộc họ bầu bí, có

nguồn gốc từ Nam Á Chúng được biết đến đầu tiên ở Ấn Độ từ hơn 3000 năm trước và được mang đi dọc theo phía Tây châu Á, châu Phi và miền Nam châu

Âu Thế kỉ 16, dưa chuột được trồng lần đầu tiên tại Trung Quốc Cho đến nay cây dưa chuột đã được biết đến rộng rãi và là một trong 5 loại cây được trồng nhiều nhất trên thế giới ở hầu hết tất cả các quốc gia trên thế giới (Liu L & cs, 2011; Zhao & cs, 2019)

Cây dưa chuột được trồng quanh năm vì dưa chuột thuộc nhóm ưa nhiệt, thích nghi tốt với nhiều loại đất trồng khác nhau Tuy nhiên, dưa chuột rất nhạy

cảm với độ ẩm, độ mặn của đất (Liu & cs, 2013; Ma & cs, 2018) Độ ẩm quá cao tạo điều kiện cho các loại nấm gây bệnh phát triển mạnh điều này dẫn đến năng suất, chất lượng dưa chuột bị giảm đáng kể (Li & cs, 2017; Liu & cs, 2017) Để cải thiện tình trạng trên ngoài, cải thiện các điều kiện dinh dưỡng, giảm tác động của yếu tố ngoại cảnh thì việc ứng dụng công nghệ sinh học trong nghiên cứu chọn tạo giống cây trồng đang được các nhà khoa học quan tâm trong thời gian gần đây Việc chỉnh sửa bộ gen của dưa chuột nhằm tạo ra giống

ưu việt có khả năng tăng cường tính kháng và chống chịu với sâu bệnh hại hay điều kiện bất thường của môi trường

Hiện nay, kỹ thuật chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium

rhizogenes đang là một hướng nghiên cứu đầy tiềm năng với nhiều triển vọng

lớn trong việc tạo vật liệu cho nghiên cứu chọn tạo giống cây trồng Tuy nhiên việc, để chuyển gen thành công, bên cạnh việc xây một quy trình chuyển gen tối

ưu cần phải thiết kế và kiểm tra được hoạt động của cấu trúc chuyển gen trước khi tiến hành công tác biến nạp

Nhiều nghiên cứu trong nước và trên thế giới đã báo cáo về kết quả chuyển gen thông qua vi khuẩn A rhizogenes trên nhiều đối tượng thực vật như:

hệ thống biểu hiện nhanh và hiệu quả để đánh giá khả năng hoạt động của một

cấu trúc chuyển gen trên dưa chuột Hệ thống cảm ứng rễ tơ đã được ứng dụng thành công trong nghiên cứu chỉnh sửa gen và biểu hiện của một số đối tượng cây trồng khác nhau Xuất phát từ cơ sở trên chúng tôi tiến hành đề tài “ Xây

- Xác định được nồng độ chất chọn lọc thích hợp cho mẫu rễ tơ chuyển gen

trên dưa chuột thông qua vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes

- Hoàn thiện hệ thống cảm ứng rễ tơ xây dựng trên đối tượng dưa chuột

- Kiểm tra hiệu quả của quy trình với các điều kiện tối ưu

3

Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về dưa chuột

 Phân loại khoa học của cây dưa chuột

Tên khoa học Cucumis sativus

4

FAO (Food and Agriculture Organization of the United Nations) (http://faostat.fao.org) sản lượng dưa chuột trên thế giới năm 2017 là 83,3 triệu tấn Sản lượng sản xuất dưa chuột tại Nhật Bản là 0,56 triệu tấn, trở thành nước sản xuất dưa chuột lớn thứ 10 trên thế giới Năm 2016, giá trị sản xuất dưa chuột đạt 40,229 triệu đô la Mỹ Tại Việt Nam sản lượng dưa chuột năm 2009 là 577.218 tấn, với tổng diện tích gieo trồng là 31.570 ha và có xu hướng tăng dần theo từng năm Cho đến nay, dưa chuột được gieo trồng trên khắp đất nước nhưng chủ yếu ở các tỉnh thành như: Tây Ninh, Đồng Nai, Tiền Giang, Cần Thơ, Đồng Tháp, An Giang, Lý Nhân (Hà Nam), Nam Định, Bắc Giang, Thanh Hoá… Hiện nay dưa chuột hay một số cây rau quả ngắn ngày đang được trồng theo các mô hình quy mô trồng trong khu nhà lưới, nhà màng cách biệt với bên ngoài nhưng vẫn có đầy đủ các chất dinh dưỡng, ánh sáng theo các tiêu chuẩn

chất lượng hiện hành Nhờ vậy mà sản lượng dưa chuột sản xuất ngày một tăng cao và chất lượng được kiểm soát ổn định

 Đặc điểm hình thái cây dưa chuột

 Thân

Dưa chuột thuộc cây thân thảo hằng niên, có nhiều tua cuốn để bám khi leo,

đa số dưa chuột phân nhánh khi leo Chiều dài thân tùy điều kiện canh tác và giống, các giống canh tác ngoài đồng thường chỉ dài từ 0.5 - 2,5m, còn đối với

giống canh tác trong điều kiện nhà lưới, chiều dài thân có thể lên đến 2 - 3m Thân có dạng hình trụ đứng có góc cạnh và có lông

 Lá

Lá cây dưa chuột có hình chân vịt năm cạnh, hai bên mặt và cả phiến lá đều

có lông trắng bao phủ, cuống có chiều dài từ 5 - 15cm Rìa lá nguyên có răng cưa

 Hoa

Hoa dưa chuột có màu vàng tươi đặc trưng, cây có cả 2 loại hoa: đơn tính

và lưỡng tính Với hoa đơn tính (đơn tính đực và đơn tính cái), hoa đơn tính đực thường mọc thành cụm hoa từ 5 - 7 hoa còn hoa đơn tính cái lại chỉ mọc ở nách

dục thon dài màu trắng ngày

Hình 2.2 Hình thái giải phẫu quả dưa chuột

mặt sẽ giúp cải thiện thâm sạm, nám, tàn nhang Một cách làm đẹp từ bên trong

6

cơ thể nhờ sử dụng dưa chuột, ta có thể uống sinh tố dưa chuột kết hợp với cà

rốt, cam, táo hàng ngày sẽ góp phần bổ sung các loại vitamin thiết yếu và làm đẹp da

 Đối với sức khỏe

Giúp giảm cân: dưa chuột là thực phẩm cung cấp ít năng lượng cho cơ thể nên rất nhiều người muốn giảm cân đã lựa chọn dưa chuột làm thức ăn chính trong bữa ăn của mình Trong dưa chuột có rất nhiều vitamin, chúng sẽ giúp cơ

thể trao đổi chất và chuyển hóa năng lượng tăng khả năng đốt cháy năng lượng

Giải độc, thanh nhiệt cơ thể: sử dụng nước ép dưa chuột để uống hàng ngày

có thể giúp cơ thể giải độc một các hiệu quả (200g dưa chuột + 200g rau cần tây + 1 thìa mật ong)

Chữa bệnh gout: thành phần dinh dưỡng trong dưa chuột có công dụng làm chuyển hóa chất giảm hàm lượng acid Uric và Oxalat Canxi Sử dụng 2 quả dưa chuột ép lấy nước và uống trực tiếp sau 2 giờ người có bệnh gout sẽ có thể đi lại được thoải mái

Ngoài ra dưa chuột cũng góp phần chữa bệnh tiểu đường Do nước ép dưa chuột chứa một loại hormone đặc biệt cần thiết để các tế bào tuyến tụy sản sinh insulin và do vậy ăn dưa chuột rất có lợi cho bệnh nhân tiểu đường

Chống ung thư: trong dưa chuột có chứa 3 lignans là pinoresinol, lariciresinol và secoisolariciresinol, có tác dụng làm giảm nhiều loại ung thư như ung thư buồng trứng, ung thư vú, ung thư tuyến tụy và ung thư tử cung

 Một số thành tựu về chuyển gen trên cây dưa chuột trên dưa chuột

 Trên thế giới

Cây dưa chuột chuyển gen đầu tiên đã được tạo ra từ năm 1986 bằng các

đoạn mô từ rễ, lá mầm, thân rễ và lá bằng cách biến nạp thông qua vi khuẩn A

rhizogenes và Agrobacterium tumefaciens (Trulson AJ & cs, 1986) Cây dưa chuột biến đổi gen đã thu được thông qua phôi soma phát sinh từ mô sẹo tại lá

mầm của dưa chuột nhờ sự xâm nhiễm của vi khuẩn A tumefaciens (Chee &

Paula P, 1990; Tabei Y & cs, 1998) Cho đến năm 2009, Huang và cộng sự đã

7

giải mã được tình tự gen của cây dưa chuột (Huang & cs, 2009), một đóng góp

to lớn cho việc nắm rõ toàn bộ cấu trúc, đặc điểm bộ gen của dưa chuột góp phần nghiên cứu cải tiến, chỉnh sửa cho bộ gen của dưa chuột và cải tạo giống mới có năng suất, chất lượng tốt Một số nghiên cứu đã tạo ra được dòng dưa chuột chuyển gen có khả năng kháng mầm bệnh, xác định giới tính trên dưa chuột (Narusaka M & cs, 2013; Zhang Y & cs, 2014) Tuy nhiên do các phương pháp chuyển gen chưa được tối ưu về quy trình trên đối tượng này, nên cho đến nay vẫn có rất ít nghiên cứu về chuyển gen trên đối tượng dưa chuột

 Việt Nam

Tại Việt Nam, ứng dụng của chuyển gen trên dưa chuột vẫn đang được nghiên cứu và tiến hành Hoàng Thị Huyền Trang và cộng sự (2021) đã xây

dựng thành công quy trình tái sinh cây in vitro giống dưa chuột Choka F1 sử

dụng vi khuẩn biến nạp là A tumefaciens Nghiên cứu mới đây Phan Thủy

Quyên và cộng sự (2020) đã tối ưu được một số nhân tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens trên giống dưa leo nếp ta như:

nồng độ AS, thời gian đồng nuôi cấy là 4 ngày,… Đây là các nghiên cứu chuyển gen đầu tiên tại Việt Nam đã hoàn thiện quy trình tái sinh và tối ưu một số yếu

tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen trên cây trên dưa chuột thông qua vi khuẩn A tumefaciens Đó cũng là cơ sở để chúng tôi lựa chọn một chủng vi khuẩn mới, sử dụng A rhizogenes để xây dựng hệ thống chuyển gen tối ưu và

hiệu quả nhất trên đối tượng dưa chuột Bước đầu hoàn thiện quy trình và các kết quả thu được nhằm phục vụ nghiên cứu biểu hiện gen

2.2 Giới thiệu về chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes

Agrobacterium sp thuộc nhóm vi khuẩn đất, gram âm Đây là một trong những nhóm vi khuẩn có ứng dụng quan trọng trong công nghệ sinh học nói chung và công nghệ chuyển gen thực vật nói riêng Agrobacterium được phân

loại dựa trên những bệnh mà chúng gây ra trên thực vật hai lá mầm

Agrobacterium gồm bốn nhóm chính: Agrobacterium tumefaciens,

Agrobacterium rubi là hai nhóm gây bệnh khối u ở thực vật, nhóm

8

Agrobacterium rhizogenes có khả năng tạo rễ tơ tại các vị trí tổn thương trên

cây Nhóm Agrobacterium radiobacter không gây bệnh thực vật (Bernard R Glick & cs, 2010)

Khả năng gây bệnh của Agrobacterium sp đã được chứng minh do sự có mặt của pTi (plasmid tumor induction) ở Agrobacterium tumefaciens và pRi

(plasmid root induction) Agrobacterium rhizogenes

Cấu trúc pRi và pTi gồm bốn vùng cơ bản: vùng khởi đầu sao chép (ORI), vùng mang cấu trúc gen độc (vir), vùng T-DNA và vùng gen phân giải opine Vùng T-DNA và vùng gen độc vir đóng vai trò quan trọng trong việc chuyển gen vào thực vật

T-DNA được giới hạn bởi biên trái (LB) và biên phải (RB) Mỗi biên là

một trình tự đặc hiệu có độ dài khoảng 25 bp Vùng T-DNA của pTi có các gen sinh auxin và cytokinin Ngược lại, pRi lại chỉ có các gen sinh tổng hợp auxin và vùng T-DNA được chia làm 2 phần TR-DNA và TL-DNA Hầu hết các gen được định vị bên trong T-DNA chỉ được hoạt hóa sau khi chèn vào bộ gen thực

9

vật Một số nghiên cứu cho thấy, nếu chèn vào một đoạn gen lạ hay xóa bỏ các gen ở phần TR-DNA thì có thể tạo rễ nhưng không mạnh bằng đồng thời cả TR-DNA và TL-DNA (Monica T & cs, 2008) Điều này cho thấy TL-DNA có vai trò quan trọng trong biểu hiện hình thái rễ ở tế bào chủ Nhóm gen rol A, rol B, rol C, rol D liên quan đến việc hình thành rễ tơ được xác định là nằm trên vùng TL-DNA Nhiều nghiên cứu đã tách dòng và biểu hiện riêng rẽ các gen rol để nghiên cứu chức năng của chúng một cách riêng biệt

Gen rol A được tìm thấy ở bất kỳ Ri plasmid nào, tuy nhiên chức năng của protein do gen rol A mã hóa chưa được xác định rõ Một số nghiên cứu đã tách dòng gen rol A và biểu hiện trong cây thuốc lá đã ghi nhận được sự thay đổi

kiểu hình rõ rệt: khi biểu hiện gen rol A bằng chính promoter nguyên gốc nhận

thấy cây thuốc lá trở nên còi cọc, giảm chiều cao và chiều dài lóng thân Việc biểu hiện gen rol A trong cây thuốc lá là nguyên nhân của trạng thái suy giảm một vài hợp chất điều hòa sinh trưởng trong đó có nhóm auxin, cytokine và gibberellin (Spen & cs, 1995)

Gen rol B được tìm thấy ở hầu hết trong các Ri plasmid và gần 60% gen đã được nhận dạng giữa các chủng khác nhau Gen rol B được chứng minh là gen quan trọng nhất trong nhóm gen tạo rễ tơ, do khi bị bất hoạt thì tế bào chủ sẽ không tạo kiểu hình rễ tơ (Monica & cs, 2008) Kết quả cho thấy rằng khi biểu

hiện gen rol B chính promoter nguyên gốc nhận thấy thay đổi hình thái lá và

hoa, đặc biệt gia tăng sự hình thành rễ bất định ở Agrobacterium rhizogenes thân

cây Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu thu nhận sự biểu hiện gen rol B và chất điều hòa sinh trưởng auxin Trên cây cà rốt, nếu chỉ có gen rol B thì kiểu hình

rễ tơ không biểu hiện, qua đó thấy được auxin là cần thiết cho việc tạo rễ tơ và

có thể cung cấp bởi gen aux – mã hóa cho các enzyme sinh tổng hợp auxin (IAA) nằm trên vùng Tr-DNA (Spen & cs, 1995)

Các gen rol C rol D vẫn đang được tiếp tục nghiên cứu về chức năng trong quá trình tạo rễ tơ Thực vật mang gen rol C cùng promoter gốc sẽ bị ngắn, giảm

ưu thế ngọn, tạo lá hình lưỡi giáo, ra hoa sớm và nhỏ Thêm vào đó, sự tạo rễ có

10

gia tăng so với những cây đối chứng không chuyển gen nhưng lại giảm so với những cây có mặt đầy đủ các gen rol A rol B rol C rol D (Monica & cs, 2008) Ngoài các gen sinh tổng hợp auxin và cytokinin thì vùng T-DNA còn mang gen tổng hợp opine Đây là sản phẩm nhưng kết giữ một acid và keto acid amin hoặc với đường Opine được tổng hợp bên trong khối u và được tiết ra ngoài,

Agrobacterium sp sử dụng opine như một nguồn dự trữ cacbon hay nitơ do đều

có vùng gen phân giải opine trong plasmid Vùng vir chứa các gen độc có chức

năng quan trọng trong việc chuyển đoạn T-DNA từ Agrobacterium rhizogenes

vào tế bào thực vật Các gen của vùng này bao gồm virE2, virB, virC, virD… các gen có chức năng tạo cầu nối, nhận dạng T-DNA, cắt và vận chuyển đoạn T-DNA vào trong tế bào thực vật

2.3 Hệ thống cảm ứng rễ tơ

Khi thực vật bị tổn thương sẽ tiết ra các chất phenol hấp dẫn Agrobacterium

sp đến vị trí tổn thương Tuy nhiên, qua nghiên cứu nhận thấy các vi khuẩn này đáp ứng với các hợp chất phenol nhất định của thực vật như acetosyringone và hydroxy acetosyringone (Bernard R & cs, 2010)

11

Ban đầu Agrobacterium sẽ tiếp xúc với tế bào thực vật Quá trình này được

thực hiện nhờ các gen chvA và chvB Hai gen này đảm nhiệm việc mã hóa và vận chuyển β-1,2-glucans vào không gian giữa thành tế bào và màng sinh chất Quá trình chuyển gen hoạt động dựa vào hệ thống protein virA/virG Sau khi

tiếp xúc, protein virA có chức năng như một sensor sẽ nhận biết các phân tử tín

hiệu từ tế bào thực vật Các tín hiệu này chính là các hợp chất do tế bào thực vật

bị tổn thương tiết ra Protein virA tự phosphoryl hóa rồi sau đó phosphoryl hóa protein virG (Schmulling T & cs, 1988) Sản phẩm của protein virG tiếp tục làm

hoạt hóa toàn bộ gen vir còn lại mà hai gen được hoạt hóa cuối cùng là virB và virE Trước đó, khi virD được hoạt hóa sản phẩm của gen này sẽ được thực hiện quá trình tạo sợi đơn T-DNA chiều 3’ – 5’ (ss T-DNA) từ sợi kép ban đầu Phức hợp ss T-DNA sẽ được đưa sang tế bào thực vật thông qua kênh vận chuyển được tạo bởi các protein virB, có khoảng 11 loại protein được mã hóa bởi gen virB

Khi vào đến nhân tế bào thực vật, bước cuối cùng và cũng là quan trọng

nhất là gắn kết sợi đơn T-DNA vào genome tế bào thực vật Hai protein có chức năng quan trọng, trong quá trình này là protein virE2 và virD2 Protein virE2 có chức năng bao bọc, bảo vệ đoạn T-DNA khỏi bị các endonuclease phân hủy (Tomy Michael, 1995) Trong khi đó, protein virD2 có chức năng tối quan trọng

đó là gắn kết T-DNA vào hệ genome (Bernard R Glick, 2010) Để thực hiện chức năng gắn kết này, protein virD2 có chức năng như một ligase (Schmulling

T & cs, 1988) Giai đoạn gắn kết là giai đoạn cuối cùng của biến nạp và cần sự

có mặt các protein của tế bào chủ tham gia vào chu trình Chức năng của các protein này là chuyển đoạn T-DNA từ sợi đơn trở về dạng sợi kép và tồn tại lâu dài trong genome thực vật

2.4 R ễ tơ và ứng dụng nuôi cấy rễ tơ

Từ những ngày đầu được phát hiện cho đến nay, công nghệ nuôi cấy rễ tơ

đã và đang được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nhờ vào các ưu điểm

12

của mình như: kĩ thuật biến nạp đơn giản, tốc độ sinh trưởng nhanh và tính di truyền ổn định Ngoài ra, hệ thống cảm ứng rễ tơ cũng đã cho thấy những ứng dụng vô cùng to lớn của chúng:

- Ứng dụng rễ tơ trong phân tích chức năng gen

Tương tự, sự hiểu biết về cơ bản cơ chế phân tử, dựa trên việc chuyển plasmid T-DNA của vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes, là bước ngoặt đầy triển vọng trong việc nghiên cứu các chức năng gen Điều đó có được là do hệ

thống rễ tơ cho phép gen tăng hoặc giảm chức năng gen và phân tích các bản khuếch đại của gen để phát hiện ra các gen chuyển hóa mới Mới đây năm 2019, Nguyễn Hồng Nhung và cộng sự (2019) đã tối ưu thành công hệ thống cảm ứng

rễ tơ thông qua vi khuẩn A rhizogenes trên một số giống cây đậu tương tại Việt Nam Bằng cách tiêm trực tiếp chủng vi khuẩn A rhizogenes vào trụ dưới hai lá

mầm của cây đậu tương 3 - 5 ngày tuổi, và rễ tơ đã được hình thành ngay tại vị trí có tổn thương Nhờ đó, hệ thống đã được ứng dụng để đánh giá được hoạt động của cấu trúc chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9, nghiên cứu đã thu được các đột

biến mới có sự sai khác đối với mẫu đối chứng Do đó sự phát triển của rễ tơ đã đem lại nhiều hứa hẹn cho một công nghệ mới và hiệu quả trong phân tích chức năng gen nhờ sử dụng thực vật chuyển gen

- Biểu hiện protein ngoại lai

Sau khi có sự xâm nhập của vi khuẩn A rhizogenes, trong cơ thể thực vật

có sự phản kháng lại với sự xâm nhập của tác nhân lạ, bằng cách chúng cảm nhận và kích hoạt một số protein lớp ngoài để bảo vệ ngăn chặn sự xâm nhập bất

hợp pháp Tuy nhiên không những vi khuẩn không bị đào thải ra ngoài bộ gen

của thực vật mà chúng còn tận dụng các protein ở lớp bảo vệ đó và làm chúng mất tác dụng Cho đến nay việc sản xuất các protein tái tổ hợp có nguồn gốc từ động vật còn gặp nhiều hạn chế như: chi phí sản xuất quá cao hoặc không có khả năng sản xuất, protein sản xuất thành công nhưng không biểu hiện,… (Cardon &

cs, 2020) Tuy nhiên, trong vài năm trở lại đây thì việc sản xuất protein tái tổ

hợp bằng phương pháp sử dụng thực vật chuyển gen có nhiều lợi thế “chi phí

13

sản xuất thấp, an toàn, và không quá phức tạp Do đó việc sản xuất protein tái tổ

hợp nhờ sử dụng thực vật chuyển gen đang là lựa chọn hàng đầu của các nhà nghiên cứu

- Sản xuất hợp chất thứ cấp

Rễ tơ được cho là nguồn thu tập các hợp chất thứ cấp đầy tiềm năng cho các ngành công nghiệp hóa mỹ phẩm, dược phẩm và phụ gia thực phẩm (Archana & Narasu, 2000) Tuy nhiên, nếu thu trực tiếp các mẫu rễ tơ tự nhiên

có thể gây tổn thương đến cây trồng Vì vậy, việc nghiên cứu tạo rễ tơ để sản xuất các hợp chất thứ cấp được sử dụng để thay thế cho nguồn rễ tự nhiên để giảm mức gây hại cho cây trồng Do đó, việc nuôi cấy sinh khối rễ tơ chuyển gen cây sâm Ngọc Linh trong điều kiện in vitro đã thu nhận hợp chất saponin có tác dụng tăng lực trên động vật thí nghiệm (Dương Tấn Nhựt và cs, 2015) Bởi

vậy, việc nuôi cấy rễ tơ đã được nghiên cứu trong vài thập kỷ qua để tạo ra các chất chuyển hóa thứ cấp được tổng hợp tự nhiên giống với rễ cây dại

14

Phần 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu nghiên cứu

 Vật liệu thực vật

Nguyên liệu được sử dụng để thực hiện thí nghiệm là hạt giống dưa chuột Nhật chịu nhiệt Choka F1 của công ty Trách nhiệm hữu hạn C.H Việt Nam đã được thương mại hóa và sản xuất trên thị trường Giống có ưu điểm: tỷ lệ nảy

mầm cao, sinh trưởng khỏe, đồng đều trong khoảng thời gian ngắn

 Chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes

Chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes K599 và các vector chuyển gen được cung cấp bởi phòng Công nghệ tế bào Thực vật - Viện Công nghệ Sinh

học - Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công nghệ Việt Nam cung cấp

Hóa chất: Các môi trường được sử dụng trong quá trình nuôi cấy vi khuẩn và nuôi cấy tế bào thực vật bao gồm: MS, YEP, dung dịch bắt màu X - Gluc Thành phần các hóa chất có trong môi trường và thành phần dung dịch nhuộm X - Gluc được hiển thị tại phần phụ lục 1 và phụ lục 2

Ngoài ra môi trường nuôi cấy được bổ sung thêm một số loại kháng sinh như: cefotaxim, timentin, streptomycin, spectinomycin… được cung cấp bởi phòng Công nghệ tế bào Thực vật – Viện công nghệ Sinh học – Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công nghệ Việt Nam

Dụng cụ: Máy đo pH, cân, nồi hấp khử trùng, box cấy chuyện dụng, tủ sấy, máy đo OD, bể ổn nhiệt, máy lắc, pipetman, ống fancol… và các dụng cụ máy móc khác tại phòng Công nghệ tế bào Thực vật