Phân lập, tuyển chọn xác định một số điều kiện nuôi cấy của các giống vi sinh vật sinh enzyme nattokinase ứng dụng lên men natto

i LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp, bên cạnh sự nỗ lực của bản thân, em đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ bạn bè, Học viện và thầy cô, để em có thể hoàn

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

- -

NGUYỄN THỊ MINH PHƯƠNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐỀ TÀI:

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN XÁC ĐỊNH MỘT

SỐ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY CỦA CÁC GIỐNG

VI SINH VẬT SINH ENZYME NATTOKINASE

ỨNG DỤNG LÊN MEN NATTO

Hà Nội - Năm 2021

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

SỐ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY CỦA CÁC GIỐNG

VI SINH VẬT SINH ENZYME NATTOKINASE

ỨNG DỤNG LÊN MEN NATTO

Mã SV : 620703

Khóa : 62

Ngành : Công nghệ sau thu hoạch

Giáo viên hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Thị Minh

ThS Lê Minh Nguyệt Địa điểm thực tập: Bộ môn vi sinh vật khoa môi trường và khoa công nghệ thực phẩm

Hà Nội - Năm 2021

THÔNG TIN VỀ SINH VIÊN THỰC HIỆN KHÓA LUẬN

1 Họ và tên sinh viên: Nguyễn Thị Minh Phương MSV:620703 Tel: 0778624996 Email: nguyenphuong02047802@gmail.com

2 Địa chỉ liên hệ: Ngõ 37 An Đào, Trâu Quỳ, Gia Lâm, Hà Nội

3 Chuyên ngành: Công nghệ sau thu hoạch

4 Lớp: K62CNSTHA - Khoá 62

5 Giáo viên hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Thị Minh

ThS Lê Minh Nguyệt

6 Địa điểm thực tập: Bộ môn vi sinh vật – Khoa môi trường

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Minh Phương

i

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp, bên cạnh sự nỗ lực của bản thân, em đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ bạn bè, Học viện và thầy cô, để

em có thể hoàn thành đề tài nghiên cứu “ Phân lập, tuyển chọn xác định một số

điều kiện nuôi cấy của các giống vi sinh vật sinh enzyme Nattokinase ứng dụng lên men Natto”

Đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tất cả các thầy giáo, cô giáo trong khoa Công nghệ thực phẩm và khoa Môi trường - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tạo điều kiện cho em học hỏi và làm việc trong suốt thời gian vừa qua và đặc biệt em muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới cô giáo PGS TS Nguyễn Thị Minh và ThS Lê Minh Nguyệt người đã hướng dẫn, tận tình giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp

Em xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô, cán bộ quản lý phòng thí nghiệm Bộ môn Vi sinh vật đã luôn chỉ bảo, giúp đỡ và tạo điều kiện cho em hoàn thành đề tài này

Cuối cùng em xin bày tỏ lòng biết đến gia đình, bạn bè và người thân đã luôn

ở bên động viên, giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu tại trường Trong quá trình nghiên cứu do còn nhiều hạn chế, và thiếu sót em rất mong nhận được sự góp ý của thầy cô để đề tài này được hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 20 tháng 9 năm 2021

Sinh viên

Nguyễn Thị Minh Phương

ii

LỜI CAM ĐOAN

Em xin cam đoan mọi kết quả trong quá trình nghiên cứu trong khóa luận tốt

nghiệp “Phân lập, tuyển chọn xác định một số điều kiện nuôi cấy của các giống vi

sinh vật sinh enzyme Nattokinase ứng dụng lên men Natto” do em thực hiện, các

số liệu trích dẫn có nguồn gốc rõ ràng, kết quả trình bày trong khóa luận được thu thập từ quá trình thực hiện nghiên cứu và chưa từng được công bố trong một nghiên cứu nào trước đó Em xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước các nội dung đã trình bày trong khóa luận

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 20 tháng 9 năm 2021

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Minh Phương

iii

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

LỜI CAM ĐOAN ii

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH ẢNH vii

I MỞ ĐẦU 1

1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài 2

1.2.1 Mục tiêu tổng quát 2

1.2.2 Yêu cầu 2

II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Tổng quan về đậu tương 3

2.1.1 Giới thiệu chung về đậu tương 3

2.1.2 Thành phần dinh dưỡng của đậu tương 3

2.1.3 Lợi ích của đậu tương 5

2.1.4 Tình hình sản xuất và tiêu thụ đâu tương trên thế giới và Việt Nam 8

2.2 Tổng quan về Natto 10

2.2.1 Giới thiệu chung về Natto 10

2.2.2 Thành phần dinh dưỡng, tính chất của Natto 10

2.2.3 Vai trò của Natto trong đời sống 11

2.2.4 Ứng dụng của Natto 13

2.2.5 Tình hình sản xuất, tiêu thụ và chế biến Natto trên thế giới và Việt Nam 13

2.3 Tổng quan về vi sinh vật lên men Natto 14

iv

2.3.1 Giới thiệu về các chủng vi sinh vật lên men Natto 14

2.3.2 Cơ sở khoa học sản xuất Natto nhờ lên men vi sinh vật 17

2.3.3 Tình hình nghiên cứu, sử dụng vi sinh vật lên men Natto trên thế giới và Việt Nam 17

III ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

3.1 Đối tượng nghiên cứu 19

3.1.1 Đối tượng 19

3.1.2 Môi trường 19

3.1.3 Nguyên liệu và thiết bị 19

3.2 Phạm vi nghiên cứu 19

3.3 Nội dung nghiên cứu 19

3.4 Phương pháp nghiên cứu 20

3.4.1 Xác định đặc điểm của các chủng vi sinh vật lên men Natto 20

3.4.2 Xác định nhân sinh khối tối ưu của vi sinh vật 26

3.5 Đánh giá chất lượng chế phẩm vi sinh trong lên men 27

3.6 Đánh giá tiềm năng sản xuất Natto từ vi sinh vật theo các điều kiện đã xác định 28

3.6 Phương pháp xử lý số liệu 30

IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

4.1 Đặc điểm của các chủng vi sinh vật sử dụng lên men Natto 31

4.1.1 Kết quả phân lập và đặc điểm của các chủng vi sinh vật sử dụng lên men Natto 31

4.1.2 Khả năng phân giải enzyme amylase và protease của các chủng vi sinh vật 36

4.1.3 Hoạt tính enzyme Nattokinase của các chủng vi sinh vật 39

v

4.1.4 Khả năng thích ứng nhiệt độ của các chủng vi sinh vật 40

4.1.5 Khả năng thích ứng pH của các chủng vi sinh vật 41

4.1.6 Khả năng đối kháng vi sinh vật gây bệnh 43

4.1.7 Khả năng kháng kháng sinh của các chủng vi sinh vật 44

4.4.8 Mức độ an toàn sinh học của các chủng vi sinh vật tuyển chọn 44

4.1.9 Hình thái các chủng vi sinh vật được tuyển chọn 45

4.2 Điều kiện nhân sinh khối tối ưu 49

4.3 Điều kiện sản xuất chế phẩm vi sinh 49

4.3.1 Xác định tỷ lệ phối trộn thích hợp 50

4.3.2 Xác định tỷ lệ tiếp giống thích hợp 50

4.4 Đánh giá chất lượng chế phẩm vi sinh 51

4.5.Hiệu quả tiềm năng sản xuất Natto từ vi sinh vật đã chọn 51

V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO 57

Phụ lục 62

vi

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Thành phần dinh dưỡng có trong 100g đậu tương luộc……… ….5

Bảng 2.2 Diện tích, năng suất và sản lượng đậu tương Việt Nam từ 2008–2018 9

Bảng 2.3 Thành phần dinh dưỡng có trong 100g Natto 11

Bảng 2.4: Bảng thành phần môi trường phân giải enzyme amylase, protease… 22

Bảng 3.1 Tỉ lệ bột gạo và bột đậu nành trong môi trường nuôi cấy ……… …….26

Bảng 4.1 Các chủng vi sinh vật phân lập được……….………….32

Bảng 4.2 Hoạt tính enzyme của các chủng vi sinh vật 37

Bảng 4.3 Hoạt tính enzyme Nattokinase kết tủa (g) 39

Bảng 4.4.a Khả năng thích ứng với các nhiệt độ của các chủng VSV……… 40

Bảng 4.4.b Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khối lượng kết tủa enzyme 41

Bảng 4.5.a Khả năng thích ứng pH của các chủng vi sinh vật 42

Bảng 4.5.b Ảnh hưởng của pH đến khối lượng kết tủa enzyme 43

Bảng 4.6 Khả năng đối kháng vi sinh vật gây bệnh của VSV……… 43

Bảng 4.7 Khả năng kháng kháng sinh của các chủng VSV……… 44

Bảng 4.8 Đặc điểm sinh học của các chủng VSV được tuyển chọn……… 47

Bảng 4.9 Thông số kỹ thuật phù hợp cho lên men thu sinh khối……… 49

Bảng 4.10 Tỷ lệ phối trộn chất mang bột gạo và bột đậu tương 50

Bảng 4.11 Tỷ lệ tiếp giống vi sinh vật 50

Bảng 4.12 Chất lượng chế phẩm vi sinh……… 51

Bảng 4.13 Hoạt độ enzyme của sản phẩm Natto ……… 51

Bảng 4.14 Đánh giá cảm quan sản phẩm Natto……….…52

Bảng 4.15 Đánh giá cảm quan sản phẩm Natto hoàn thành của các cảm quan viên mẫu N.M1C3 53

Bảng 4.16 Đánh giá cảm quan sản phẩm Natto hoàn thành của các cảm quan viên mẫu N N21 53

Bảng 4.17 Đánh giá cảm quan sản phẩm Natto hoàn thành của các cảm quan viên mẫu N.M5C3 54

vii

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 4.1 Một số chủng VSV phân lập được 36

Hình 4.2 Vòng phân giải enzyme protease của một số chủng vi sinh vật 37

Hình 4.3 Vòng phân giải enzyme amylase của một số chủng vi sinh vật 37

Hình 4.4 Thí nghiệm đánh giá độ an toàn của các chủng vi sinh vật tuyển chọn trên thực vật………45

Hình 4.5 Hình thái các chủng VSV tuyển chọn……….46

Hình 4.6 Hình thái chủng N.M1C3 48

Hình 4.7 Tế bào khuẩn lạc chủng N.M1C3 48

Hình 4.8 Hình thái chủng N.N21 48

Hình 4.9 Tế bào khuẩn lạc chủng N.N21 48

Hình 4.10 Hình thái chủng N.M5C3 48

Hình 4.11 Tế bào khuẩn lạc chủng N.M5C3 48

1

I MỞ ĐẦU 1.1 Tính cấp thiết của đề tài

Trong những năm gần đây, tỷ lệ đột quỵ ngày càng có xu hướng tăng lên nhất

là đối với người trẻ tuổi Theo tổ chức y tế thế giới WHO mỗi năm có khoảng 15 triệu người bị đột quỵ dẫn đến tàn phế vĩnh viễn và tử vong Ở Việt Nam, tỷ lệ đột quỵ tăng trung bình khoảng 2% mỗi năm ở người trẻ tuổi Năm 2020 đã ghi nhận trường hợp đột quỵ não 12 tuổi tại Bệnh viện Trung ương Quân đội (TƯQĐ) 108

Mà nguyên nhân chính do huyết khối hoặc cục máu đông gây tắc nghẽn mạch máu não

Natto là món ăn truyền thống đã có hơn 1200 năm lịch sử ở Nhật Bản, là một phần quan trọng trong chế độ ăn uống của người Nhật được biết đến với khả năng ngăn ngừa tụ huyết khối Enzyme nattokinase chiết xuất từ natto được bác sĩ Hyroyki Sumi phát hiện có khả năng phân giải sợi huyết giúp làm tan cục máu đông và tránh đột quỵ Ngoài những lợi ích về mặt y học, Natto có hàm lượng chất dinh dưỡng cao và khả năng đem lại giá trị kinh tế cho ngành chế biến thực phẩm Với nhiều tác dụng như vậy nên Natto không chỉ là một món ăn phổ biến ở Nhật

mà còn được biết đến rộng rãi trên thế giới, nhất là ở Châu Á

Tại thị trường Việt Nam, Natto cũng đã có mặt trên các hệ thống siêu thị và các trung tâm thương mại cùng với các sản phẩm nhập khẩu khác Tuy nhiên, do Natto hiện có trên thị trường và đều là mặt hàng nhập khẩu có giá thành cao nên nhiều người dân khó tiếp cận được Gần đây người tiêu dùng ngày càng quan tâm không những các lợi ích, giá trị dinh dưỡng của thực phẩm mà còn có xu hướng sử dụng các sản phẩm có chức năng bảo vệ sức khỏe Vì vậy, ngày càng có nhiều người biết sản phẩm Natto và tác dụng có lợi của sản phâm này đến Việc sản xuất Natto cung cấp cho thị trường trong nước sẽ đem lại nhiều giá trị kinh tế cao trong tương lai Bên cạnh đó, viêc sản xuất Natto sẽ làm tăng nhu cầu, quy mô trồng và tiêu thụ đậu tương, đóng góp vào sự phát triển kinh tế bền vững cho nông dân ở các vùng nguyên liệu đậu tương và phát triển công nghệ chế biến của Việt Nam

2

Từ những yêu cầu thực tiễn đó, chúng tôi thực hiện đề tài “Phân lập, tuyển chọn

xác định một số điều kiện nuôi cấy của các giống vi sinh vật sinh enzyme Nattokinase ứng dụng lên men Natto”

1.2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài

1.2.1 Mục tiêu tổng quát

- Xác định được điều kiện nuôi, sản xuất giống vi sinh vật sử dụng cho lên men Natto

Mục tiêu cụ thể:

• Phân lập, tuyển chọn giống vi sinh vật có khả năng lên men Natto

• Sơ bộ định tên các chủng phân lập được

• Xác định được điều kiện nuôi cấy, sản xuất các chủng vi sinh vật được chọn

sử dụng lên men Natto

• Ứng dụng chủng vi sinh vật có hoạt tính cao để lên men Natto theo quy mô phòng thí nghiệm

1.2.2 Yêu cầu

- Phân lập và tuyển chọn được các chủng vi sinh vật có khả năng lên men tốt, hoạt tính sinh học cao sử dụng cho lên men Natto

- Xác định điều kiện nuôi cấy của các chủng vi sinh vật lên men Natto

- Chất lượng của chế phẩm đạt tiêu chuẩn TCVN

3

II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan về đậu tương

2.1.1 Giới thiệu chung về đậu tương

Glycine max (L.) Merr (đậu tương) là một loài thực vật cận nhiệt đới có nguồn gốc từ Đông Nam Á Đậu nành đã là một thực phẩm chủ yếu trong chế độ ăn uống

ở các nước châu Á trong ít nhất 5000 năm Trong triều đại Chou ở Trung Quốc, kỹ thuật lên men đã được phát hiện cho phép chế biến đậu tương ở các dạng dễ tiêu hóa hơn như tempeh, miso và nước tương tamari Đậu phụ được phát minh ra ở Trung Quốc vào thế kỷ thứ hai Đậu nành được du nhập vào Châu Âu vào những năm 1700 và đến Hoa Kỳ vào những năm 1800 Hiện tại, nông dân Trung Tây Hoa

Kỳ sản xuất khoảng một nửa nguồn cung đậu tương của thế giới Đậu nành có nguồn gốc từ Đông Á, nhưng chỉ có 45% sản lượng đậu tương nằm ở đó 55% sản lượng còn lại là ở Mỹ Hoa Kỳ đã sản xuất 75 triệu tấn đậu tương vào năm 2000, trong đó hơn một phần ba được xuất khẩu Các nhà sản xuất hàng đầu khác là Brazil, Argentina, Paraguay, Trung Quốc và Ấn Độ (Joy et al., 1998)

Hiện tại, Mỹ đang giữ kỷ lục là nước sản xuất đậu tương lớn nhất thế giới cho đến nay, tiếp theo là Brazil (USDA, 2017) Đậu nành đã được tiêu thụ rộng rãi trên toàn cầu như một nguồn thực phẩm và đồ uống giàu protein Nó cũng được sử dụng trong các món ăn lớn ở một số nơi trên thế giới như Nhật Bản (súp Miso), Hàn Quốc (Doenjang), Trung Quốc (Đậu phụ, còn được gọi là sữa đông), Indonesia (Tempeh), và nhiều nước khác Bên cạnh việc được sử dụng như một thành phần chính trong các món ăn ngon của địa phương, nó cũng thường được sử dụng dưới dạng nước sốt đóng vai trò như một chất tăng hương vị trong các món

ăn gia đình Đậu nành được sử dụng rộng rãi làm dầu ăn

2.1.2 Thành phần dinh dưỡng của đậu tương

Đậu tương là một trong những nguồn cung cấp protein thực vật tốt nhất, chứa khoảng 48 đến 50% protein Globulin 7S và 11S là hai protein dự trữ chiếm 80% tổng hàm lượng protein trong đậu tương (MC García et al, 1997) Đậu tương cũng

là nguồn cung cấp nhiều vitamin và khoáng chất như vitamin K, folate, thiamin,

4

Ca, Mg, … Các chất này được tìm thấy chủ yếu ở trong các mô tế bào nhất là ở trong hạt và nhất là molypden, một nguyên tố vi lượng chủ yếu được tìm thấy trong hạt ngũ cốc và các loại đậu (Hiroyuki Hattori et al, 2004) Đặc biệt trong hạt đậu tương đang nảy mầm hàm lượng vitamin tăng lên nhiều, đặc biệt là vitamin C Phân tích thành phần sinh hoá cho thấy trong hạt đậu tương đang nảy mầm, ngoài hàm lượng vitamin C cao, còn có các thành phần khác như: vitamin PP, và nhiều chất khoáng khác như Ca, P, Fe v.v Chính vì thành phần dinh dưỡng cao như vậy nên đậu tương có khả năng cung cấp năng lượng khá cao khoảng 4700 cal/kg (Nguyễn Danh Đông, 1982)

Đậu tương rất giàu các hợp chất thực vật có hoạt tính sinh học cao như isoflavones, axit phytic, saponin (P.A Murphy et al, 2002; Ulrich Schlemmer et

al, 2009; Sun-Ok Lee et al, 2005) Một hợp chất quan trọng trong đậu tương được biết đến có tác dụng ngăn ngừa ung thư là các hợp chất isoflavones (Fazlul H Sarkar et al, 2003), một dạng phytoestrogen đã được nghiên cứu bởi các nhà dinh dưỡng và các bác sĩ Đậu nành chứa lượng isoflavone cao hơn các loại thực phẩm thông thường khác (AA Franke et al, 1998) Các loại isoflavone chính trong đậu nành là genistein (50%), daidzein (40%) và glycitein (10%) (P.A Murphy et al, 2002)

Hạt đậu tương có chứa hàm lượng dầu béo cao hơn các loại đậu đỗ khác nên được coi là cây cung cấp dầu thực vật quan trọng Lipit của đậu tương chứa một tỉ

lệ cao các axít béo chưa no (khoảng 60-70%) có hệ số đồng hoá cao, mùi vị thơm như axit linoleic chiếm 52-65%, oleic từ 25-36%, linolenolic khoảng 2-3% (Ngô Thê Dân và cs, 1999)

Năng lượng 721( kJ) Axit béo, tổng số bão hòa 1.297(g) Chất đạm 18,21(g) Axit béo, tổng số bão hòa đa 5,064(g) Chất béo 8,97(g) Axit béo,tổng số bão hòa đơn 1,981(g)

2.1.3 Lợi ích của đậu tương

• Hạt đậu tương có thể tăng cường sức khỏe cho tim

Đã có nhiều nghiên cứu cho thấy rằng đậu tương có thể cải thiện mức cholesterol trong cơ thể và các yếu tố nguy cơ khác cho bệnh tim Những lợi ích này mạnh hơn ở những đối tượng có mức cholesterol máu cao (O A Tokede et al, 2015) Theo cơ quan Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ cũng phát hiện

ra rằng những người trưởng thành bao gồm ít nhất 25g protein đậu tương (khoảng bốn phần đậu tương) hàng ngày trong chế độ ăn ít chất béo bão hòa và cholesterol

có thể giảm cholesterol LDL khoảng 3-4%

Các sản phẩm đậu tương nguyên chất (như sữa đậu nành, đậu nành và các loại hạt đậu tương) có tác dụng cải thiện mức cholesterol nhiều hơn so với các sản phẩm đậu tương đã qua chế biến (O A Tokede et al, 2015)

Đậu tương chứa rất nhiều isoflavone, và hợp chất này hoạt động như chất chống oxy hóa trong cơ thể Trong một đánh giá của 35 nghiên cứu về mối liên quan này

• Hạt đậu tương có thể chống lại một số bệnh ung thư

Các nghiên cứu hiện tại cho thấy các sản phẩm đậu tương có thể làm giảm nguy cơ mắc bệnh ung thư vú (Anna H Wu et al, 2002) cũng như ung thư tuyến tiền liệt Tuy nhiên, vẫn còn nhiều tranh luận về tác dụng của hạt đậu tương đối với nguy cơ ung thư Các nghiên cứu trên động vật cho kết quả hỗn hợp liên quan đến isoflavone của đậu nành và tăng trưởng khối u, đặc biệt là đối với ung thư vú Một phân tích tổng hợp gần đây cho thấy lượng đậu tương có liên quan nghịch với nguy cơ ung thư vú ở người châu Á chứ không phải người phương Tây, điều này cho thấy rằng việc bảo vệ chống lại ung thư vú có thể yêu cầu phụ nữ tiêu thụ lượng đậu tương điển hình trong chế độ ăn của người châu Á (Chisato Nagata, 2010)

Hơn nữa, các nghiên cứu cũng chỉ ra về mối liên quan giữa việc sử dụng hạt đậu nành với tác dụng bảo vệ chống lại nguy cơ mắc ung thư tuyến tiền liệt, nhiều kết quả phân tích cho thấy rằng tiêu thụ thực phẩm từ đậu nành có liên quan đến việc giảm nguy cơ ung thư tuyến tiền liệt ở nam giới (Yoshie Nagata et al, 2007; Lin Yan et al, 2009)

Gần đây, người tiêu dùng ngày càng quan tâm đến lợi ích sức khỏe tiềm năng của các polypeptit và protein hoạt tính sinh học từ đậu nành có tác dụng chống ung thư có thể là do khả năng hoạt động của isoflavone- hoạt động như chất chống oxy hóa, cũng như lunasin là một polypeptide có tác dụng ngăn chặn sự phân chia

tế bào và gây ra quá trình apoptosis ở các tế bào ác tính (Elvira Gonzalez de Mejia

et al, 2003)

7

• Hạt đậu nành có thể tăng cường sức khoẻ xương

Isoflavone trong hạt đậu nành có cấu trúc và chức năng tương tự như estrogen giúp ngăn ngừa loãng xương Can thiệp Isoflavone làm giảm đáng kể tình trạng mất xương cột sống ở phụ nữ mãn kinh Những tác động thuận lợi này trở nên đáng kể hơn khi tiêu thụ hơn 90 mg isoflavone / ngày (De-Fu Ma et al, 2007) Vì thế một nhóm nghiên cứu thuộc Đại học Hull, Anh đã tiến hành nghiên cứu khả năng phòng bệnh loãng xương cho phụ nữ của đạm đậu tương và isoflavone Nhóm nghiên cứu cho 200 phụ nữ đã mãn kinh được 2 năm uống 30 g đạm đậu nành và 66 mg isoflavone hoặc chỉ uống 30 g đạm đậu nành mỗi ngày trong 6 tháng Sau đó nhóm kiểm tra xương của những phụ nữ này bằng các chỉ số liên quan Nhóm nghiên cứu phát hiện thấy phụ nữ uống đạm đậu nành chứa isoflavone có các chỉ số thấp hơn phụ nữ chỉ uống đạm đậu nành không Điều này cho thấy tỷ lệ mất tế bào xương đang chậm lại và nguy cơ loãng xương đã giảm Isoflavones trong đậu nành làm giảm đáng kể deoxypyridinoline trong nước tiểu ở mức độ vừa phải, nhưng không ảnh hưởng đến phosphatase kiềm trong huyết thanh và osteocalcin ở phụ nữ mãn kinh Isoflavones trong đậu nành có thể ngăn ngừa loãng xương sau mãn kinh và cải thiện xương, do đó giảm nguy cơ gãy xương ở phụ nữ mãn kinh bằng cách tăng mật độ khoáng xương cột sống thắt lưng

và giảm chất đánh dấu hủy xương deoxypyridinoline trong nước tiểu (Kyoko Taku

et al, 2011)

Isoflavone đậu nành là sản phẩm tự nhiên có thể được sử dụng thay thế cho liệu pháp hormone mãn kinh vì chúng có liên quan về cấu trúc và chức năng với 17beta-estradiol Các nghiên cứu trong ống nghiệm và động vật đã chỉ ra rằng chúng hoạt động theo nhiều cách để phát huy tác dụng hỗ trợ xương Chúng hoạt động trên cả nguyên bào xương và tế bào hủy xương thông qua các con đường gen

và hệ gen Các nghiên cứu dịch tễ học và thử nghiệm lâm sàng cho thấy isoflavone trong đậu nành có tác dụng có lợi đối với mật độ khoáng của xương, các dấu hiệu chu chuyển xương và độ bền cơ học của xương ở phụ nữ sau mãn kinh (Aysegul Atmaca et al, 2008)

hè thu 31,3%, vụ thu đông 22,1% và vụ đông xuân 29,7% (Ngô Thế Dân và cs, 1999)

Nhìn chung, diện tích đậu tương Việt Nam không ổn định, sản xuất đậu nành nội địa mới chỉ đủ cung cấp cho khoảng 8–10 % nhu cầu, đến năm 2017, diện tích trồng đậu nành trên cả nước đạt khoảng 100 ngàn ha, năng suất khoảng 1,57 tấn/ha, sản lượng đạt 157 ngàn tấn Dự kiến năm 2018 diện tích đậu tương cả nước đạt 105 ngàn ha, năng suất trung bình 1,6 tấn/ha, sản lượng đạt 168 ngàn tấn (Bảng 1)

Theo Cục Chăn nuôi (2007), lượng đậu nành nhập khẩu hàng năm đã vào khoảng 2,8 triệu tấn quy hạt (0,2 triệu tấn hạt, 2,2 triệu tấn khô dầu với giá 400–

500 USD/tấn với kim ngạch 1,5 tỷ USD, tăng 60–70% so với năm trước), dự kiến tới năm 2015-2020, Việt Nam thiếu hụt tới 3,5–4,0 triệu tấn/năm trở thành một nước nhập khẩu đậu nành lớn với kim ngạch 2,0–2,5 USD/năm, hơn cả kim ngạch xuất khẩu gạo hiện nay

Năng suất đậu tương bình quân của nước ta rất thấp chỉ đạt khoảng trên 50% so với năng suất bình quân trên thế giới Tuy nhiên, nhờ những nỗ lực rất lớn của các nhà khoa học trong công tác nghiên cứu chọn tạo giống và các biện pháp canh tác, năng suất đậu tương trong 5 năm gần đây đã có một bước nhảy vọt quân trọng, năng suất tăng 1,8 lần so với năm 1980 (Trần Đình Long và Andrew, 2001)

9

Với lợi thế thị trường tại chỗ giảm được cước phí vận chuyển, lưu thông, chất

lượng hạt tươi mới, thích hợp chế biến thức ăn cho người, đậu nành Việt Nam sẽ

cạnh tranh được với đậu nành ngoại nhập, cạnh tranh với các cây trồng khác về

mặt thu nhập như lúa, ngô

Theo thống kê sơ bộ của Tổng cục Hải quan, tháng 1/2021, cả nước nhập khẩu

143.780 tấn đậu tương, trị giá 73,66 triệu USD, tăng 13,9% về lượng, tăng 18% về

kim ngạch so với tháng 12/2020; cũng tăng mạnh cả về lượng, kim ngạch so với

tháng 1/2020, với mức tăng tương ứng 60,5% và 98,5%

Bảng 2.2 Diện tích, năng suất và sản lượng đậu tương Việt Nam từ 2008–

2018 Chỉ tiêu 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015 2016 2017 2018

Nguồn: Tổng cục Thống kê (GSO), Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn

2.1.4.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ đậu tương trên thế giới

Đậu tương là cây trồng lấy hạt, cây có dầu quan trọng bậc nhất trên thế

giới,đứng hàng thứ 4 sau cây lúa mì, lúa nước và ngô Do khả năng thị trường rộng

nên nó đã được trồng ở khắp năm châu lục, nhưng tập trung nhiều nhất ở châu Mỹ

trên 70%, tiếp đến là châu Á

Năm 2019, giá trị xuất khẩu đậu tương của Mỹ ra thế giới đạt 18,7 tỷ USD,

tăng 9% về giá trị so với năm trước và tăng 13% về lượng Xuất khẩu sang Trung

Quốc tăng đáng kể bù đắp cho xuất khẩu giảm sút sang các thị trường lớn

khác Tuy nhiên, xuất khẩu của Mỹ sang Trung Quốc vẫn thấp hơn 3 triệu tấn so

với năm 2017 Mặc dù tăng trưởng xuất khẩu hàng năm trong năm 2019, nhưng

10

tổng giá trị xuất khẩu đậu tương của Hoa Kỳ thấp hơn 14% so với mức trung bình

5 năm 2013-2017

2.2 Tổng quan về Natto

2.2.1 Giới thiệu chung về Natto

Natto là một loại thực phẩm lên men truyền thống của Nhật Bản, nó có nguồn gốc từ miền Bắc nước Nhật khoảng 1000 năm trước được tạo thành từ quá trình lên men đậu tương Natto là thực phẩm lên men dạng nguyên hạt, khi được chế biến đúng cách nó có dạng sệt được phủ một lớp màng nhầy mỏng, có màu vàng óng, vị ngọt, giòn và mềm, mùi thơm đặc trưng, các sợi nhớt sẽ được kéo dài khi dùng đũa nhấc lên Ở Nhật Bản, Natto là món ăn ưa chuộng thường được ăn với nước tương hoặc mù tạt và dùng với cơm vào buổi sáng Natto chứa nhiều chất dinh dưỡng với hàm lượng axit amin cao hơn so với đâu tương hấp và nấu chín và

nó cũng được xếp vào hàng với thực phẩm chức năng Hơn thế nữa enzyme Nattokinase được tìm thấy trong Natto là protease chuỗi đơn chứa 275 amino acid)

đã được Hyroyuki Sumi phát hiện về khả năng làm tan huyết khối năm 1980 (Sumi et al., 1987) có tác dụng làm giảm và ngăn ngừa bệnh huyết khối, nó hoạt tính tương đối mạnh, và kéo dài, giảm chứng cao huyết áp (Kimet at el al., 2011)

2.2.2 Thành phần dinh dưỡng, tính chất của Natto

Natto có chứa nhiều thành phần dinh dưỡng có lợi cho sức khỏe chứa hàm lượng dinh dưỡng rất cao, protein chiếm 16,5% sinh khối, giàu vitamin B12, B2, K1

và sắt (Chu Đức Hà và Cs, 2019) Bên cạnh đó, Natto còn có chứa các hoạt tính chống oxy hóa mạnh, chứa hàm lượng lớn các polyamine, đặc biệt là spermidine (0,13 mg/g trọng lượng khô) - một hợp chất đã được chứng minh đóng vai trò quan trọng trong kéo dài tuổi thọ của nấm men, ruồi giấm và tế bào miễn dịch ở người (T Eisenberg, et al 2009) Đặc biệt là Nattokinase một loại enzyme được ứng dụng rộng rãi trong ngành dược phẩm, chăm sóc sức khỏe và Y học, nó hỗ trợ hoạt động tiêu sợi huyết thanh, góp phần làm khỏe mạnh chức năng của tim và hệ thống tim mạch bằng cách duy trì lưu lượng máu thích hợp, làm loãng máu và ngăn ngừa cục đông máu (Debajit et al., 2012)

Magie (mg) 115 Axit béo, tổng số

bão hòa đa (g)

6,21

Phốt pho (mg) 174 Axit béo, tổng số

không bão hòa đơn (g)

2.2.3 Vai trò của Natto trong đời sống

2.2.3.1 Natto tăng cường hệ thống miễn dịch

Natto là thực phẩm lên men nên chứa nhiều probiotic giúp cho hệ vi sinh đường ruột khỏe mạnh, thúc đẩy sản xuất kháng thể tự nhiên, làm giảm nguy cơ nhiễm trùng hơn nữa và có thể giúp bạn phục hồi nhanh hơn nếu bạn bị ốm (Jose

C Clemente et al, 2012)

Trong một nghiên cứu, những người cao tuổi được cung cấp 2 tỷ CFU

của B subtilis - chủng lợi khuẩn có trong Natto - hoặc giả dược Những người

12

được cung cấp chủng vi khuẩn probiotic có nguy cơ bị nhiễm trùng đường hô hấp thấp hơn 55% trong thời gian nghiên cứu bốn tháng (Marie Lefevre et al,2015)

Ngoài hàm lượng probiotic cao, Natto còn giàu vitamin C, sắt, kẽm, selen

và đồng, tất cả đều đóng vai trò quan trọng trong chức năng miễn dịch

2.2.3.2 Natto góp phần giúp chắc khoẻ xương

Natto cung cấp khoảng 22% lượng canxi khuyến nghị hằng ngày, ngoài ra Natto còn chứa rất nhiều vitamin K2 (Katarzyna Maresz, 2015)

Vitamin K2 giúp hoạt hóa protein osteocalcin tạo xương, gắn canxi vào khung xương Khi cơ thể thiếu vitamin K2, protein osteocalcin dù đã được tạo nhưng vẫn không có khả năng gắn và mang canxi vào khung xương Khi điều này xảy ra canxi sẽ rời xương và răng gây ra chứng loãng xương (Vamsee D Myneni and Eva Mezey, 2017)

Các nghiên cứu cho thấy bổ sung vitamin K2 có thể làm chậm quá trình mất mật độ khoáng xương do tuổi tác, nhất là đối với phụ nữ mãn kinh (ZB Huang et

al, 2015; Sarah Cockayne et al, 2006)

2.2.3.3 Natto giúp cải thiện trái tim khỏe mạnh

Trên thực tế, một số nghiên cứu cho thấy chất bổ sung nattokinase làm giảm huyết áp khoảng 3-5 mmHg ở những người tham gia có giá trị huyết áp ban đầu là 130/90 mmHg hoặc cao hơn

Cuối cùng, ngoài việc củng cố xương của bạn, vitamin K2 trong Natto còn giúp ngăn chặn sự tích tụ canxi tích tụ trong động mạch của bạn (Margueritta S El Asmar et al, 2014)

Trong một nghiên cứu, thường xuyên ăn thực phẩm giàu vitamin K2 có liên quan đến việc giảm 57% nguy cơ tử vong do bệnh tim (Johanna M Geleijnse et al, 2004)

Trong một nghiên cứu khác chỉ bao gồm phụ nữ, cứ 10 mcg vitamin K2 tiêu thụ mỗi ngày có thể giảm 9% nguy cơ mắc bệnh tim (G C M Gast et al, 2009)

Natto được ước tính chứa khoảng 10 mg vitamin K2 trên mỗi khẩu phần 3,5 ounce (100 gram) (L J Schurgers et al, 2000)

13

Một nghiên cứu lâm sàng phối hợp giữa trường Đại học Oklahoma (Mỹ) và Đại học y khoa Miyazaki (Nhật Bản), tiến hành trên 12 tình nguyện viên khỏe mạnh trong độ tuổi từ 21 đến 55 cho thấy: Sau khi sử dụng 200g Natto vào trước bữa ăn sáng, các chỉ số thời gian làm tan cục máu đông của các tình nguyện viên

đã giảm tới 48% chỉ sau 2 giờ

2.2.4 Ứng dụng của Natto

Natto giờ đây không chỉ là một món ăn truyền thống được ăn hằng ngày mà còn được xem như một loại thực phẩm chức năng Natto được biết là có chức năng kháng khuẩn mạnh, và được sử dụng để điều trị các bệnh truyền nhiễm do vi khuẩn (Senbon et al, 1940) Hiện nay, enzyme nattokinase được chiết xuất từ Natto đã được sử dụng làm viên uống hỗ trợ điều trị và phòng ngừa các bệnh lý liên quan đến cục máu đông Probiotics trong Natto có thể góp phần giảm cân Các nghiên cứu cho thấy bổ sung probiotic có thể ngăn chặn sự gia tăng khối lượng chất béo và khối lượng cơ thể (Kristin L Osterberg et al, 2015)

2.2.5 Tình hình sản xuất, tiêu thụ và chế biến Natto trên thế giới và Việt Nam 2.2.5.1 Tình hình sản xuất, tiêu thụ và chế biến Natto trên thế giới

Thị trường Natto trên thế giới phụ thuộc rất lớn vào mức sản xuất đậu tương, những ảnh hưởng và bất kỳ những tác động liên quan đều tác động trực tiếp đến thị trường Natto trên toàn thế giới Sản lượng đậu tương tăng mạnh trong những giai đoạn tiếp theo dự báo sẽ thúc đẩy sự tăng trưởng của thị trường Theo Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ (USDA), trong năm 2017-2018, tổng sản lượng đậu nành toàn cầu ước tính đã tăng khoảng 27,6% so với năm 2010-2011, xuất khẩu đậu tương năm 2017 đã tăng khoảng 64,2% so với năm 2010 Trong cùng kỳ, Mỹ nổi lên là nhà sản xuất đậu tương lớn nhất và chiếm sản lượng khoảng 120,04 mmt, tăng 32,3% so với giai đoạn 2010-2011 điều này giúp tăng trưởng tốt cho thị trường trong giai đoạn tiếp theo

Nhật Bản là thị trường lớn nhất của Natto (tiêu thụ 125.000 tấn Natto mỗi ngày), được chế biến bằng cách nhập khẩu đậu tương từ các nước như Hoa

Kỳ Natto cũng đang chiếm lĩnh thị trường tại Hoa Kỳ khi Hiệp hội Đậu tương

14

Hoa Kỳ cùng với Hội đồng Xuất khẩu Đậu nành Hoa Kỳ đã tạo ra một giải thưởng được trao cho Natto được sản xuất bằng đậu nành Hoa Kỳ Ý tưởng đằng sau là thúc đẩy việc sử dụng Đậu tương Hoa Kỳ trong ngành công nghiệp Natto

Một yếu tố chính khác được kỳ vọng sẽ thúc đẩy sự tăng trưởng của thị trường

là sự gia tăng các ứng dụng của Natto Natto là một bữa ăn sáng rất bổ dưỡng và chủ yếu ở Nhật Bản Tuy nhiên, một số ứng dụng khác của thực phẩm đang phát triển, có thể thúc đẩy nhu cầu về Natto trong thời gian tiếp theo

Báo cáo nghiên cứu thị trường này phân đoạn thị trường natto toàn cầu theo ứng dụng (thực phẩm và các loại khác) và khu vực địa lý (APAC, EMEA và Châu Mỹ) Khu vực APAC dẫn đầu thị trường trong năm 2018 với thị phần gần 71%, tiếp theo lần lượt là Châu Mỹ và EMEA

2.2.5.2 Tình hình sản xuất, tiêu thụ và chế biến Natto ở Việt Nam

Ở Việt Nam, Natto vẫn chưa được chú ý, rất ít người biết đến và có thể sử dụng được Natto Do là hàng nhập khẩu nên giá thành của Natto khá cao nên nhiều người dân Việt khó mà tiếp cận được

Tại Việt Nam thì việc sản xuất Natto còn hạn chế, chủ yếu vẫn là hàng nhập khẩu từ Nhật Bản Trên thị trường phổ biến là các viên uống Nattokinase được sản xuất tại Việt Nam khá nhiều

2.3 Tổng quan về vi sinh vật lên men Natto

2.3.1 Giới thiệu về các chủng vi sinh vật lên men Natto

2.3.1.1 Giới thiệu về các chủng

Bacillus subtilis

Bacillus subtilis ban đầu được đặt tên là Vibrio subtilis vào năm 1835 bởi

Christian Gottfried Ehrenberg; đến năm 1872, Ferdimand Cohn xác định thấy loài

trực khuẩn này có đầu vuông và đặt tên là Bacillus subtilis (Askos T Kovác,

2019)

Theo phân loại của Bergey (1974), Bacillus subtilis thuộc:

• Giới (Kingdom): Bacteria

• Ngành (Division): Firmicutes

• Lớp (Class): Bacilli

15

• Bộ (Order): Bacillales

• Họ (Family): Bacillaceae

• Giống (Genus): Bacillus

• Loài (Species): Bacillus subtilis

- Đặc điểm hình thái và sinh lý

B subtilis là loài trực khuẩn hình que, ngắn, nhỏ, kích thước khoảng (3-5) x

0,6 µm Gram (+) Các tế bào vi khuẩn đứng riêng rẽ hoặc nối với nhau thành

chuỗi (liên trực khuẩn) Bacillus subtilis là một loại vi khuẩn Gram dương, có khả năng hình thành nội bào tử Hình dạng tổng thể hình que của B subtilis được duy

trì trong cả quá trình sinh dưỡng và bào tử (Rut Carballido-Lo´ pez et al, 2007) Khuẩn lạc khô, không màu hoặc màu xám nhạt Bề mặt hơi nhăn hoặc tạo ra lớp màng mịn lan rộng trên bề mặt thạch, có mép nhăn bám chặt vào môi trường thạch Khuẩn lạc của giống vi sinh vật này rất lớn, có hình dạng bất định và đàn phát triển lan rộng (Lưu Thiện Tuấn, 2010)

Nó có thể hình thành lớp màng nhầy là một lớp nhầy lỏng, sền sệt, không rõ rệt bao quanh Thành phần chủ yếu của vỏ nhầy là polypeptide, chủ yếu là acid polyglytamic có chức năng bảo vệ, dự trữ, tích lũy và tăng cường khả năng bám

B subtilis thường được tìm thấy ở rơm, rạ và lớp trên cùng của đất cũng như

trong ruột của nhiều loài động vật Một nghiên cứu năm 2009 đã cho biết mật độ của quần thể này ở đất là khoảng 106 / gram; còn trong phân người là khoảng 104 / gram Số lượng bào tử được tìm thấy trong ruột của con người quá cao chỉ được

quy cho việc tiêu thụ thông qua ô nhiễm thực phẩm Mỗi cá thể B subtilis có thể

sinh sản theo cơ chế phân bào để tạo ra hai tế bào con hoặc tạo ra một nội bào

tử (endospore) duy nhất có thể tồn tại tới hàng chục năm và chịu được các điều kiện bất lợi như khô hạn, nhiễm mặn, bức xạ và dung môi có pH bất lợi Khi nơi ở thuận lợi, nó phân bào theo kiểu nguyên phân, trong đó nhiễm sắc thể của nó nhân đôi theo cơ chế nhân đôi của nhiễm sắc thể nhân sơ Khi nơi ở có nhiều bất thuận làm nó không thể phân bào, thì nó "sinh sản" theo cơ chế bào tử hóa (sporulation)

và hoá thành bào tử

16

B subtilis phát triển được trong khoảng nhiệt độ khá rộng, nhiệt độ thích hợp

cho nó phát triển là 30°C đến 50°C, tối thích ở 37°C Khoảng pH thích hợp cho sự

sinh trưởng và phát trển của B subtilis là 9-11

Bacillus subtilis có kháng nguyên H và O, cấu trúc kháng nguyên dạng D và

L của acid glutamic Sản xuất kháng sinh subtilin va bacitracin có tác dụng ức chế

vi khuẩn Gram dương và Gram âm Tuy nhiên, đa số các chủng Bacillus subtilis

2.3.1.2 Giới thiệu về chủng Lactobacillus

Lactobacillus là chi lớn nhất trong nhóm vi khuẩn axit lactic Cho đến nay

(tháng 7 năm 2010), nó có 168 loài, một số được sử dụng trong sản xuất sữa lên men, bột chua, thịt, thực phẩm rau hoặc được sử dụng như chế phẩm sinh học Chi

Lactobacillus thuộc họ Firmicutes, lớp Bacilli, bậc II Lactobacillales, và họ

Lactobacillaceae Lactobacilli là vi khuẩn Gram dương, catalase âm tính, không

hình thành bào tử, hình que tạo ra axit lactic là sản phẩm cuối cùng chính của quá trình lên men Chúng lên men nghiêm ngặt, chịu được hiếu khí hoặc kỵ khí, ưa axit hoặc ưa axit và có yêu cầu dinh dưỡng phức tạp Các loài vi khuẩn Lactobacillus có thể được chia thành ba nhóm: Các loài đồng loại bắt buộc (Nhóm

I) bao gồm: L acidophilus, L delbrueckii, L helveticus, L salivarius Dị vật sinh trưởng (Nhóm II) bao gồm: L casei, L curvatus, L plantarum, L sakei và Dị vật sinh sản (Nhóm III) bao gồm: L brevis, L buchneri, L fermentum, L reuteri

Khuẩn lạc trên môi trường thạch thường nhỏ (2–5 mm) lồi, mịn, sáng lấp lánh và thường là mờ đục không có sắc tố Trong một số trường hợp hiếm, chúng

có màu hơi vàng hoặc hơi đỏ (Bergey, 1974)

Lactobacilli phát triển tốt nhất trong môi trường có tính axit nhẹ với độ pH ban đầu là 6,4–5,4 Tăng trưởng thường ngừng khi pH 3,6–4,0 đạt được, tùy thuộc

và một số chủng thậm chí dưới 5°C (Bergey’s Manual Trust, 2009)

2.3.2 Cơ sở khoa học sản xuất Natto nhờ lên men vi sinh vật

B subtilis còn có khả năng tiết ra nhiều loại enzyme tiêu hóa giúp cải thiện

khả năng hấp thụ thức ăn của vật chủ cũng như khả năng ức chế các vi khuẩn gây bệnh cho vật chủ (Westers et al., 2004; Stein, 2005)

Khả năng sinh bào tử là ưu thế vượt trội của các loài Bacillus, bào tử chịu nhiệt trong quá trình sấy khô của probiotic, mặc dù biện pháp đông khô ở nhiệt độ -20°C trong điều kiện chân không có thể áp dụng với hầu hết các loài vi khuẩn nhưng phương pháp này khiến cho chi phí sản xuất probiotic bị đẩy lên cao (Chávez, Ledeboer, 2007)

B subtilis sinh ra rất nhiều loại enzyme, đặc biệt là  amylase và protease

kiềm có giá trị cao; ngoài ra B subtilis có khả năng sinh ra riboflavin (tiền vitamin B2) (Nguyễn Lân Dũng và cs,1997)

2.3.3 Tình hình nghiên cứu, sử dụng vi sinh vật lên men Natto trên thế giới

và Việt Nam

2.3.3.1 Tình hình nghiên cứu, sử dụng vi sinh vật lên men Natto trên thế giới

Tháng 10 năm 1987 - Nattokinase, một enzym tiêu sợi huyết trong natto, được đề cập lần đầu tiên bởi Sumi và cộng sự Nattokinase được phát hiện vào năm 1980 bởi Tiến sĩ Hiroyuki Sumi khi đang làm việc tại Trường Y Đại học Chicago

Năm 1998, Hidehiro Miyamura và các cộng sự đã nghiên cứu lên men Bacillus subtilis trên bã đậu nành ở điều kiện thích hợp là nhiệt độ 37°C, độ ẩm 80%, thời gian 24 giờ

18

Tháng 4 năm 2001 - Một bài báo của M Kaneki et al trên tạp

chí Nutrition là người đầu tiên chỉ ra rằng Natto là một trong những nguồn tập

trung nhiều nhất của vitamin K1 (MK-7) Kết luận: " tiêu thụ natto có thể góp phần làm giảm nguy cơ gãy xương ở phụ nữ Nhật Bản

Năm 2010, Xiaoyan Zu và các cộng sự đã khảo sát cho thấy: sản lượng enzyme sản xuất từ bã thãi đậu nành cao hơn và có hoạt tính không thấp hơn so với lên men natto hạt đậu nành

Năm 2013, Rohit Kapoor và Bibhu Prasad Panda đã nghiên cứu lên men B subtilis với cơ chất là hạt đậu nành bổ sung 1% khối lượng sữa bột, 30% nước (v/w) thu được enzyme protease có hoạt độ cao nhất khi thu nhận enzyme bằng đệm Tris pH 9 Bên cạnh đó, một số nghiên cứu được thực hiện theo hướng tận dụng những nguồn cơ chất rẻ tiền, sẵn có khác (Văn Thị Diệu Linh, 2017)

2.3.

3

Năm 2012, Lê Thị Bích Phượng và cộng sự đã phân lập thành công hai chủng Bacillus sp.7.2 và Bacillus sp.NP3 sinh tổng hợp enzyme nattokinase trên môi trường đậu nành hấp chín nuôi cấy trên đĩa Petri và khay hoạt tính chiếm khoảng 85% so với protease toàn phần, tương đương với một số thực phẩm chức năng đang được bán trên thị trường Năm 2013, Bùi Thị Nhung và cộng sự đã nghiên

cứu thu được kết quả điều kiện lên men bề mặt Bacillus subtilis với cơ chất là bột

đậu nành và cám mì thu enzyme nattokinase có hoạt lực cao nhất ở pH 9, độ ẩm từ 50-60% và thời gian lên men 48h Năm 2016, Nguyen Nhut Huy và Nguyen Thuy Huong đã thực hiện lên men bề mặt vi khuẩn Bacillus subtilis natto với cơ chất là hạt đậu nành ở điều kiện nhiệt độ 37°C; pH 7,5; thời gian lên men 36h thu nhận được enzyme nattokinase có hoạt lực cao nhất Năm 2016, Nguyễn Thị Minh Nguyệt đã phân lập và định danh được 2 chủng vi khuẩn Bacillus subtilis natto từ natto thương phẩm của Nhật Bản

19

III ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU 3.1 Đối tượng nghiên cứu

Môi trường thạch dinh dưỡng (Bảng 2- phụ lục)

-Môi trường nuôi cấy nấm men

Môi trường Hansen (Bảng 3- phụ lục)

3.1.3 Nguyên liệu và thiết bị

- Nguyên liệu: các chủng vi sinh vật có khả năng lên men Natto

- Hóa chất: K2HPO4, KH2PO4, NH4NO3, NaCl, KCl, MnCl2, CaCl2, Casein, Albumin, Fibrin, NaOH, HCl, Agar

- Thuốc nhuộm: Tím gelatin, lugol, xanh metylen, đỏ trung tính, fuchsin, phenolphtalein

- Thiết bị: tủ cấy vô trùng, cân phân tích, kính hiển vi, tủ giữ giống, nồi hấp,

- Dụng cụ: que cấy nhọn, bình tam giác, ông nghiệm, bình định mức, pipet, ống đong, đèn cồn, que trang, đĩa petri,

3.2 Phạm vi nghiên cứu

- Địa điểm nghiên cứu: Bộ môn vi sinh vật khoa môi trường, bộ môn quản lý chất

lượng và an toàn thực phẩm khoa công nghệ thực phẩm

- Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 3-8/2021

3.3 Nội dung nghiên cứu

1) Xác định đặc điểm của các chủng vi sinh vật dùng lên men Natto

2) Xác định khả năng nhân sinh khối tối ưu của vi sinh vật

3) Điều kiện sản xuất chế phâm vi sinh

20

4) Đánh giá tiềm năng sản xuất Natto từ vi sinh vật theo các điều kiện đã xác định

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Xác định đặc điểm của các chủng vi sinh vật lên men Natto

3.4.1.1 Kỹ thuật pha loãng mẫu

Cân chính xác 10g mẫu sau đó cho vào 90ml nước vô trùng, nồng độ pha loãng là 10-1 Lắc đều hút 1ml dung dịch cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước vô trùng hoặc nước muối sinh lý 0,9% , ta được dung dịch có nồng độ 10-2 Tiếp tục pha loãng như mẫu trước thu được nồng độ pha loãng mong muốn

3.4.1.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn

-Phương pháp tạo khuẩn lạc đơn:

Kỹ thuật hộp ria:

Khử trùng bề mặt bàn và tay bằng cồn 70°, chờ khô đốt đèn cồn Đĩa môi trường mới đổ hoặc bảo quản lạnh từ 4°C – 8°C, trước khi dùng đặt vào tủ ấm 37°C khoảng 30 phút cho mặt thạch thật khô ráo

Thực hiện các bước như sau:

- Dùng bút ghi lên đáy hộp petri tên mẫu (bệnh phẩm, thực phẩm), ngày cấy, người cấy

- Ước lượng hoặc úp đĩa xuống rồi dùng bút và thước chia đĩa thành 4 phần bằng nhau - Đốt que cấy trên ngọn lửa đèn cồn và thao tác lấy mẫu trong ống nghiệm

- Dùng ngón giữa và ngón cái (bàn tay trái) ấn vào tâm đĩa petri, các ngón còn lại xoay và hơ mép nắp đĩa trên đèn cồn trước khi cấy

- Cầm đĩa lọt vào lòng bàn tay trái, ngón cái và ngón út tỳ vào nắp để đẩy nắp lên sao cho nắp và đáy tạo một góc khoảng 45°

- Đưa đầu que cấy vào phết một góc nhỏ, sát thành đĩa

- Thực hiện cấy ria chữ T và ria bốn góc

- Sau khi cấy đặt úp petri lại, gói lại đặt vào tủ ấm ở nhiệt độ và thời gian thích hợp

Chú ý:

3.4.1.3 Xác định hoạt tính của enzyme Nattokinase

• Phương pháp lên men đậu tương

Đậu tương được bổ sung nước sau đó hấp chín (121°C, 1atm, 30 phút), để nguội ở 36-39°C rồi lên men

Cách tiến hành: Cân 100g đậu tương ngâm trong vòng 9-12 giờ, 2-3 tiếng thay nước một lần Bổ sung nước đem hấp chín nhừ, cho thêm vi sinh vật có hoạt tính enzyme (10ml dịch) Ủ trong vòng 24 giờ ở 40°C

• Phương pháp thu nhận dịch chiết enzyme thô

Hỗn hợp sau lên men được giữ ở nhiệt độ 4°C trong 10 phút Thêm dần dần dung dịch NaCl 0,9% ở nhiệt độ 4°C vào hỗn hợp sau lên men đồng thời khuấy đều, để yên trong 40 phút Tiến hành lọc và ly tâm 4000 vòng/phút, 20 phút để thu dịch chiết enzyme thô

• Phương pháp kết tủa enzyme nattokinase bằng dung môi ethanol 96%

Dịch chiết enzyme được giữ ở nhiệt độ 4°C và ethanol ở nhiệt độ -4°C trong 1 giờ Thêm dần dần ethanol vào dịch chiết enzyme với tỷ lệ nghiên cứu và dùng đũa khuấy nhẹ để dịch enzyme hòa đều với ethanol, xuất hiện kết tủa để yên trong 15-24 giờ để dung dịch phân lớp Tiến hành li tâm với tốc độ 15000 vòng/20 phút

để thu tủa enzyme Thu hoạch kết tủa và làm lạnh đông kết tủa enzyme ở nhiệt độ thấp (-150C đến -100C); sau đó cho mẫu vào thiết bị sấy thăng hoa Quá trình sấy thực hiện ở nhiệt độ < 50°C trong thời gian 10-14 giờ Sản phẩm sau khi sấy được nghiền mịn, cho vào lọ kín và bảo quản (Văn Thị Diệu Linh, 2017)

22

3.4.1.4 Xác định hoạt tính của enzyme protease và amylase

-Xác định hoạt tính của enzyme protease và amylase theo phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch (William, 1983)

Nuôi dịch chiết: Nuôi cấy vi sinh vật trên 9ml dung dịch môi trường chuyên tính với 1 vòng que cấy chứa vi sinh vật, lắc ở 150 vòng/phút Sau 96 giờ, dịch nuôi cấy được đánh giá khả năng phân giải enzyme

Chuẩn bị môi trường: Môi trường hấp ở 121°C, 1atm trong 20 phút, đỗ ra đĩa petri với độ dày 2mm để nguội Dùng miệng ống nghiệm đã được khử trùng đục 3 lỗ trên đãi thạch

Hút 0.2ml dung dịch nhỏ vào các lỗ thạch đã đục sẵn Để đĩa petri vào tủ lạnh trong 6 giờ để ezyme khuếch tán trên đĩa thạch, sau đó đặt vào tủ nuôi ở 28°C trong 48 giờ rồi đem nhuộm màu bằng lugon Sau khi xuất hiện còng phân giải thì

đo đường kính và khả năng phân giải cơ chất được tính bằng hiệu giữa đường kính vòng phân giải và đường kính lỗ thạch

Phân giải protease Phân giải Amylase

Bảng 2.4: Bảng thành phần môi trường phân giải enzyme amylase, protease

V: là dung dịch huyền phù tế bào (ml)

3.4.1.5 Phương pháp quan sát hình thái khuẩn lạc

* Nguyên tắc: Quan sát, mô tả hình dạng, kích thước và màu sắc khuẩn lạc của các chủng phân lập được để xác định hình dạng tế bào, khả năng di động và khả năng bắt màu qua phương pháp nhuộm Gram

23

- Đặt mẫu ở nhiệt độ 37°C trong 1-2 ngày để chọn ra các khuẩn lạc mọc riêng rẽ

- Tiến hành quan sát các khuẩn lạc này từ các phía (từ trên xuống, từ bên cạnh), chú ý về hình dạng khuẩn lạc, hình dạng mép, bề mặt, độ dày, có núm hay không,

độ trong, màu sắc (trên, dưới, có khuếch tán ra môi trường không) (Bùi Thị Nhung, 2013)

3.4.1.6 Xác định hình thái vi sinh vật

Phương pháp nhuộm Gram theo Hans Christian Joachim Gram, 1884

Dụng cụ: đèn cồn, que cấy, kính hiển vi, lam kính,

Hóa chất: Pha thuốc nhuộm tím gentians: Tím gentians nồng độ 1/10 trong cồn

ethylic 950 10ml + Acid phenic 1ml + Nước cất 100ml Lắc đều, lọc qua giấy lọc Pha dung dịch lugol: hòa tan Iod 1g và Kali iodid (KI) 2g vào 5ml nước cất

Nghiền tan trong cối sứ rồi cho thêm nước cất cho đủ 200ml

Pha thuốc nhuộm Fucshin kiềm: Fucshin kiềm nồng độ 1/10 trong cồn ethylic

950 10ml + Acid phenic 5ml + Nước cất 100ml Lắc đều, lọc qua giấy lọc

Cách tiến hành:

Bước một, dàn tiêu bản và cố định tiêu bản:

Dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ ống giống thạch nghiêng (hoặc dịch

cơ thể, mẫu sinh thiết bị nghi ngờ nhiễm khuẩn) Hoà vào 1 giọt nước muối sinh lý

ở giữa phiến kính, để khô trong phòng thí nghiệm

Cố định tiêu bản bằng cách hơ nhanh trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần để gắn chặt vi khuẩn vào phiến kính Việc cố định nhằm 3 mục đích: giết chết vi khuẩn, gắn chặt

vi khuẩn vào phiến kính và làm vết bôi bắt màu tốt hơn vì các tế bào chết bắt màu tốt hơn các tế bào sống

Bước hai, nhuộm màu:

– Thứ nhất, nhuộm bằng dung dịch tím gentians trong 30 giây đến 1 phút, rửa nước;

– Thứ hai, nhuộm thêm dung dịch lugol và giữ trong 1 phút, rửa nước;

– Thứ ba, khử màu: nhỏ dung dịch alcohol 90%, giữ khoảng 30 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa nước;

24

– Thứ tư, nhuộm tiếp bằng dung dịch Fucshin trong 1 phút, rửa nước, để khô

* Kết quả: quan sát ở vật kính dầu 100x Nếu nhuộm đúng vi khuẩn Gram dương

bắt màu tím, Gram âm bắt màu hồng

3.4.1.7 Phương pháp xác định đặc tính vi sinh vật

• Khả năng thích ứng nhiệt độ

Cấy chủng vi sinh vật trên môi trường chuyên tính tương ứng sau đó đem đi nuôi cấy trong mức nhiệt độ 300C, 400C, 500C và 600C để xác định nhiệt độ thích hợp Sau 3 – 5 ngày quan sát, đếm số khuẩn lạc tạo thành

Sau đó chuẩn bị 2 bình (cho một ống giống), mỗi bình chứa 150 ml môi trường , cấy giống với tỉ lệ 3% Cho vòi sục khí vào bình với thời gian và chế độ sục khí khác nhau: bình 1 sục khí liên tục, bình 2 không sục khí Lấy mẫu vào các thời điểm 24h, 48h Thí nghiệm được thực hiện trong 48 giờ và ở nhiệt độ phòng, sau

đó đọc kết quả Kiểm tra hoạt độ enzyme vào các thời điểm 24h, 48h ở 2 chế độ nuôi cấy khác nhau Thí nghiệm được lặp lại 2 lần

3.4.1.8 Khả năng tạo catalaza

Một lượng nhỏ sinh vật được thu thập từ một khuẩn lạc được phân lập tốt trong

18 đến 24 giờ bằng vòng cấy vô trùng hoặc que bôi bằng gỗ và đặt lên lam kính hiển vi Tuy nhiên, không được lấy thạch cùng với khuẩn lạc, đặc biệt là khi mẫu cấy được lấy từ thạch máu Nhỏ 3% H2O2 lên sinh vật trên lam kính hiển vi bằng cách sử dụng ống nhỏ giọt hoặc pipet Pasteur Sự hình thành các bong bóng được

25

quan sát trên nền tối để tăng cường khả năng đọc Thử nghiệm dương tính được chứng minh bằng sự xuất hiện ngay lập tức của bong bóng Sự xuất hiện của một hoặc hai bong bóng chứng tỏ phản ứng yếu Phép thử âm tính được biểu thị bằng không có bọt khí hoặc một vài bọt khí sau 20s

3.4.1.9 Khả năng đối kháng với vi sinh vật gây bệnh

Hút 0,1 ml chủng vi sinh vật gây bệnh E coli, Samonella, Staphylococcas đã

pha loãng ở nổng độ 10-3 nhỏ vào hộp peptri có chứa môi trường nuôi cấy vi khuẩn, chang đều Đợi 30 phút, khoan lỗ thạch Hút tiếp 0.1 ml dịch cấy vi sinh vật kiểm định nhỏ vào lỗ khoan Sau 2-3 ngày nuôi cấy, kiểm tra kết quả, xung quanh lỗ thạch xuất hiện vòng vô khuẩn thì chúng đối kháng và ngược lại

3.4.1.10 Khả năng đối kháng tương ứng của tổ hợp vi sinh vật được chọn

Các vi sinh vật được chọn nuôi cấy trên môi trường thạch đĩa thep phương pháp cấy vạch, các chủng có điểm tiếp xúc Theo dõi hiện tượng ức chế phát triển cảu các vi sinh vật tại điểm tiếp xúc Nếu tại điểm tiếp xúc, không có vùng ức chế tức là các chủng này có thể phát triển trên cùng nhau trên cùng một môi trường, nếu có vùng ức chế thì kết quả là ngược lại (Nguyễn Thu Hà và Cs, 2012)

3.4.1.11 Khả năng kháng kháng sinh của các chủng vi sinh vật

Bổ sung Streptomyxin ở các mức 300, 500, 800, 1000 mg/l vào môi trường

chuyên tính đã hấp khư trùng ở 121°C, 1atm, 20 phút Cấy các chủng vi sinh vật

và nuôi cấy ở 28°C, 3-5 ngày quan sát và đếm khuẩn lạc

3.4.1.12 Đánh giá mức độ an toàn sinh học của các chủng vi sinh vật tuyển chọn

Mẫu rau, củ, quả (cà rốt, khoai tây, hành tây, …) lấy từ các mẫu cây khỏe sau khi được rửa sạch ngâm trong dung dịch nước NaClO 1% trong 1 phút, rửa lại bằng nước vô trùng, làm khô mẫu bằng giấy hút ẩm và đặt trong các đĩa petri Dùng kim tiêm cấy trích chủng vi sinh vật thử nghiệm lên mô thực vật và để ở nhiệt độ phòng Theo dõi sự hình thành vết bệnh sau 24h

26

3.4.1.13 Phương pháp xác định mật độ tế bào

Pha loãng dung dịch sau nhân giống bằng dung dịch NaCl 0,9% ở các nồng

độ thích hợp như: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 Chuẩn bị môi trường đĩa thạch vô trùng Cho 0,1ml dung dịch sau nhân giống đã pha loãng vào mỗi đĩa Petri Dùng que gạt

vô trùng trải đều mẫu trên mặt thạch Đặt đĩa Petri vào tủ ấm ở 37°C Sau 24h, tiến hành đếm khuẩn lạc và tính số lượng tế bào trong 0,1ml mẫu

Mật độ tế bào là: Mi (CFU/ml) = Ai x Di / V

Trong đó: Ai: số lượng tế bào

Di: là độ pha loãng

3.4.2 Xác định nhân sinh khối tối ưu của vi sinh vật

3.4.2.1 Điều kiện sản xuất chế phẩm vi sinh

• Xác định chất mang bột gạo và bột đậu nành

Tiến hành nuôi vi sinh vật trên các môi trường với 10g môi trường trong bình tam giác 250ml có bổ sung bột gạo và bột đậu nành với các tỉ lệ khác nhau theo Bảng 3.1

Bảng 3.1 Tỉ lệ bột gạo và bột đậu nành trong môi trường nuôi cấy

3.5 Đánh giá chất lượng chế phẩm vi sinh trong lên men

- Sử dụng chủng vi sinh vật được chọn để sản xuất chế phẩm vi sinh:

Sản xuất chế phẩm dạng dịch thể thoe quy trình của bộ môn Vi sinh vật – Khoa Môi trường – Học viện Nông nghiệp Việt Nam

- Kiểm tra mật độ tế bào:

+ Pha loãng mẫu đến nồng độ 10-8 Chọn 3 nồng độ 10-6, 10-7, 10-8 Tại mỗi nồng

độ cấy lặp lại 3 lần trên môi trường chuyên tính, mỗi lần cấy 0,01ml dịch Nuôi cấy ở 29oC từ 2-3 ngày Đếm số lượng khuẩn lạc mọc trên các đĩa hộp lồng

+ Số lượng vi sinh vật được tính bằng công thức:

Trong đó:

N: số vi sinh vật trong một đơn vị kiểm tra (được tính bằng CFU/g hoặc CFU/ml);

C: tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa petri được giữ lại;

n1: số đĩa được giữ lại ở độ pha loãng thứ nhất;

n2: số đĩa được giữ lại ở độ pha loãng thứ hai;

d: hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thứ nhất

- Kiểm tra vi sinh vật tạp: