Phân lập, tuyển chọn và khảo sát một số đặc điểm của xạ khuẩn kháng nấm gây bệnh hại cây trồng (khóa luận tốt nghiệp)

TÓM TẮT Với mục đích nghiên cứu và tuyển chọn được các chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng với các chủng nấm gây bệnh hại cây trồng, chúng tôi đã tiến hành phân lập các chủng xạ khuẩn t

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Lớp

Giảng viên hướng dẫn

: K62CNSHA : PGS.TS Nguyễn Văn Giang

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong khoá luận này là trung thực và chưa hề sử dụng trong bất kỳ công bố nào

Tôi xin cam đoan mọi sự giúp dỡ cho việc thực hiện khoá luận đã được cảm

ơn và các thông tin trích dẫn đã được ghi rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày 16 tháng 02 năm 2021

Sinh viên

Đặng Thành Đạt

LỜI CẢM ƠN

Sau một thời gian thực tập tại Bộ môn Công nghệ Vi sinh, được sự quan tâm, giúp đỡ và hướng dẫn tận tình của các thầy, cô giáo và các cán bộ tại phòng thí nghiệm của Bộ môn, cùng với sự hỗ trợ của các bạn trong nhóm và bản thân, tôi

đã hoàn thành khoá luận tốt nghiệp của mình

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo trong Khoa Công nghệ sinh học

đã truyền đạt cho tôi những kiến thức vô cùng quý báu kết hợp với tính thực tiễn cao trong quá trình học tập, rèn luyện tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến PGS TS Nguyễn Văn Giang đã tận tình hướng dẫn, truyền tải những kiến thức, kinh nghiệm cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới PGS TS Nguyễn Xuân Cảnh, Th.S Trần Thị Đào, Th.S Nguyễn Thanh Huyền, Th.S Trần Thị Hồng Hạnh cùng toàn thể cán

bộ thuộc Bộ môn Công nghệ vi sinh, Ban chủ nhiệm Khoa và các thầy, cô giáo Khoa Công nghệ sinh học đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực tập

Tôi xin chân thành cảm ơn các bạn Lê Thị Phương Anh, Đỗ Thị Thuỳ Giang, Đoàn Thị Đặng Hà, Hoàng Thị Liễu, Lê Thị Thanh Mai trong nhóm làm khoá luận đã tận tình giúp đỡ, hỗ trợ tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Cuối cùng, với tất cả lòng kính trọng và biết ơn vô hạn, tôi xin gửi lời cảm

ơn tới bố, mẹ, chị gái và những người thân của tôi đã luôn động viên và tạo động lực cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 16 tháng 02 năm 2021

Sinh viên

Đặng Thành Đạt

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ii

LỜI CẢM ƠN iii

MỤC LỤC iv

DANH MỤC VIẾT TẮT vii

DANH MỤC BẢNG viii

DANH MỤC HÌNH ix

TÓM TẮT x

PHẦN I MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích nghiên cứu 2

1.3 Nội dung nghiên cứu 2

1.4 Ý nghĩa thực tiễn và khoa học của đề tài 2

1.4.1 Ý nghĩa khoa học 2

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn 2

PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Tổng quan về xạ khuẩn 3

2.1.1 Vị trí phân bố, vai trò của xạ khuẩn 3

2.1.2 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn 4

2.1.2 Đặc điểm sinh lý hoá của xạ khuẩn 5

2.1.3 Khả năng sinh enzyme của xạ khuẩn 6

2.2 Ứng dụng của xạ khuẩn trong thực tiễn 7

2.2.1 Trong lĩnh vực nông nghiệp 7

2.2.2 Trong lĩnh vực công nghệ thực phẩm 8

2.2.3 Trong lĩnh vực y học 8

2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng của xạ khuẩn 9

2.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ 9

2.3.2 Ảnh hưởng của pH 9

2.3.3 Ảnh hưởng của nồng độ muối 9

2.3.4 Nguồn carbon 10

2.4 Các bệnh thường gặp trên cây trồng trong nông nghiệp 10

2.5 Các biện pháp phòng trừ nấm bệnh gây hại cây trồng 11

PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

3.1 Vật liệu 12

3.1.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 12

3.1.2 Nguồn mẫu phân lập, sàng lọc 12

3.1.3 Nguồn mẫu nấm thử đối kháng 12

3.1.4 Hoá chất 12

3.1.5 Môi trường nuôi cấy 13

3.1.6 Dụng cụ và thiết bị 14

3.2 Phương pháp nghiên cứu 14

3.2.1 Pháp pháp phân lập xạ khuẩn 14

3.2.2 Phương pháp đáng giá khả năng đối kháng nấm 15

3.2.3 Khảo sát đặc điểm sinh học 15

3.2.3.1 Đặc điểm hình thái 15

3.2.3.2 Đặc điểm sinh lý-hoá 16

3.2.3.3 Đặc điểm nuôi cấy 18

3.2.4 Bảo quản giống 18

PHẦN IV KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 19

4.1 Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng nấm 19

4.1.1 Phân lập và hoạt hoá các chủng xạ khuẩn 19

4.1.2 Sàng lọc các các chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng nấm 21

4.2 Đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn 22

4.2.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc 22

4.2.2 Đặc điểm hình thái sợi khí sinh 23

4.3 Đặc điểm nuôi cấy của chủng xạ khuẩn trên các môi trường khác nhau 24 4.4 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng của chủng 4.4.1 Ảnh hưởng pH đến khả năng sinh trưởng của xạ khuẩn 26

4.4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng 27

4.4.3 Ảnh hưởng của nồng độ muối 28

4.4.4 Ảnh hưởng của nguồn carbon 31

4.4.5 Khả năng sinh enzyme ngoại bào 33

PHẦN V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35

5.1 Kết luận 35

5.2 Kiến nghị 35

TÀI LIỆU THAM KHẢO 36

PHỤ LỤC 42

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Một số chủng nấm thử hoạt tính đối kháng 12 Bảng 3.2 Cơ chất và thuốc thử của một số enzyme ngoại bào 17 Bảng 4.1 Các chủng xạ khuẩn phân lập từ các mẫu đất và hoạt hoá từ các chủng giống tại bộ môn Công nghệ vi sinh 19 Bảng 4.2 Phân bố xạ khuẩn được phân lập theo nhóm màu 20

Bảng 4.3 Khả năng ức chế nấm Fusarium oxysporum và Corynespora

cassiicola của chủng Tra và XK3.1 22

Bảng 4.4 Đặc điểm hình thái của chủng XK3.1 và chủng Tra trên các môi

trường khác nhau 25 Bảng 4.5 Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng của hai chủng xạ khuẩn Tra và XK3.1 27 Bảng 4.6 Nhiệt độ thích hợp của hai chủng xạ khuẩn XK3.1 và Tra 28Bảng 4.7 Nồng độ muối thích hợp của 2 chủng xạ khuẩn Tra và XK3.1 30 Bảng 4.8 Ảnh hưởng của nguồn carbon đến sinh trưởng của chủng xạ khuẩn XK3.1 và Tra 32Bảng 4.9 Khả năng sinh enzyme ngoại bào của chủng xạ khuẩn Tra và XK3.1 33

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Sinh thái học của xạ khuẩn 3

Hình 2.2 Các loại khuẩn ty ở xạ khuẩn 4

Hình 2.3 Một số dạng hình thái của chuỗi bào tử ở xạ khuẩn 5

Hình 4.1 Hình ảnh một số chủng xạ khuẩn phân lập được 19

Hình 4.2 Khả năng đối kháng của chủng xạ khuẩn Tra với chủng nấm Corynespora cassiicola và Fusarium oxysporum 21

Hình 4.3 Khả năng đối kháng của chủng xạ khuẩn XK3.1 với chủng nấm Corynespora cassiicola và Fusarium oxysporum 21

Hình 4.4 Hình thái khuẩn lạc của chủng XK3.1 và chủng Tra 22

Hình 4.5 Khuẩn ty khí sinh của chủng xạ khuẩn XK3.1 và chủng Tra 23

Hình 4.6 Chuỗi sinh bào của chủng xạ khuẩn XK3.1 24

Hình 4.7 Cuống sinh bào tử chủng xạ khuẩn Tra 24

Hình 4.8 Khả năng sinh sắc tố melalin của chủng XK3.1 và chủng Tra 26

Hình 4.9 Khả năng sinh trưởng của chủng xạ khuẩn XK 3.1 ở nồng độ muối khác nhau 29

Hình 4.10 Khả năng sinh trưởng của chủng Tra trên nồng độ muối khác nhau 30 Hình 4.11 Hoạt tính enzyme của 2 chủng xạ khuẩn XK3.1 và Tra 33

TÓM TẮT

Với mục đích nghiên cứu và tuyển chọn được các chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng với các chủng nấm gây bệnh hại cây trồng, chúng tôi đã tiến hành phân lập các chủng xạ khuẩn từ các mẫu đất tại các địa điểm khác nhau cũng như hoạt hoá lại các chủng giống được lưu giữ tại Bộ môn Công nghệ vi sinh, khoa Công nghệ sinh học Kết quả sau khi phân lập và hoạt hoá đã thu được 26 chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng với nấm gây bệnh hại cây trồng, trong đó có 2 chủng

xạ khuẩn XK3.1 và Tra biểu hiện hoạt tính kháng mạnh nhất

Kết quả khảo sát và đánh giá các điểm sinh học của hai chủng xạ khuẩn Tra

và XK3.1 cho thấy chúng có thể sinh trưởng tốt nhất ở nhiệt độ 30℃, pH dao động trong khoảng từ pH 6 đến pH 9, tuy nhiên chủng Tra có dải pH rộng hơn chủng XK3.1 có thể sinh trưởng ở pH 10 và pH 11 Ngoài ra cả hai chủng xạ khuẩn có khả năng chịu được nồng độ muối là 1% Chủng XK3.1 có khả năng đồng hoá được các nguồn đường D-glucose, galactose, maltose, dextrin, sorbiton, mannitol, lactose và sucrose Chủng xạ khuẩn Tra có khả năng sử dụng tốt các nguồn đường maltose và dextrin Chủng xạ khuẩn Tra có khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase và protease, chủng xạ khuẩn XK3.1 có khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase

PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Sự gia tăng dân số trên toàn cầu là một trong những thách thức lớn nhất đối với ngành nông nghiệp Đồng thời sự biến đổi khí hậu và dịch bệnh bùng phát ngày một tăng đã tác động ít nhiều đến giá trị kinh tế, năng suất cây trồng cũng bị ảnh hưởng bởi các phytopathogens (vi khuẩn, nấm, sâu bệnh, tuyến trùng, v.v.) đặc biệt là các phytopathogens do các chủng nấm khác nhau (Talwinder Kaur,

2019) Ví dụ, chủng nấm Corynespora cassiicola và Fusarium oxysporum là hai loại nấm gây bệnh hại thực vật Nấm Corynespora cassiicola là chủng nấm gây bệnh vàng rụng lá trên cây cao su, đốm lá trên cây cà chua v.v Nấm Fusarium oxysporum là chủng nấm thường được gặp chủ yếu trên cây chuối, chúng gây ra

bệnh vàng chuối hay được gọi là bệnh Panama, một số còn sản sinh ra các độc tố gây nguy hiểm đến con người và động vật

Chính vì vậy để chống lại những ảnh hưởng nghiêm trọng của các vi sinh vật, các chủng nấm gây bệnh thì việc kiểm soát bệnh nấm, các chất chống nấm phân huỷ sinh học được ưu tiên sử dụng hàng đầu vì chúng không có dư lượng ô nhiễm

và giảm khả năng phát triển các chủng nấm kháng thuốc (Mustafa Oskay, 2009) Quá trình nghiên cứu các hoạt chất kháng sinh có khả năng đối kháng từ vi sinh vật khác nhau được coi là tác nhân kiểm soát sinh học kháng nấm tiềm năng của các bệnh gây hại thực vật Trong nhiều loại xạ khuẩn được biết đến thì các loài

thuộc chi Steptomycetes là một trong những tác nhân kiểm soát sinh học có tác

dụng ức chế hoặc kiểm soát một số nấm bệnh gây bệnh hại thực vật có nguồn gốc

từ đất (Mustafa Oskay, 2009) Tính đến nay có khoảng hơn 8000 chất kháng sinh được biêt đến trên thế giới có tới 80% là do xạ khuẩn sinh ra (Dhanasekaran và cộng sự, 2012) Ngoài ra, xạ khuẩn cũng đóng vai trò rất lớn trong việc phân giải các chất như: cellulose, lignin, phân giải photphat, chất vô cơ khó tan, cố định nitơ mạnh (Đỗ Thu Hà và cộng sự, 2013)

Từ xu hướng nghiên cứu hiện nay trên thế giới cũng như khai thác được sự đa

dạng và phong phú của các chủng xạ khuẩn, chúng tôi thực hiện đề tài “Phân lập,

tuyển chọn và khảo sát một số đặc điểm của chủng xạ khuẩn kháng nấm gây bệnh hại cây trồng”

1.2 Mục đích nghiên cứu

- Tuyển chọn được một số chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng với chủng nấm gây bệnh

- Khảo sát một số đặc tính học của chủng xạ khuẩn tuyển chọn

- Xác định những yếu tố ảnh hưởng: điều kiện nuôi cấy, nguồn dinh dưỡng đến khả năng sinh trưởng và đối kháng của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn

1.3 Nội dung nghiên cứu

- Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng xạ khuẩn với nấm gây bệnh

- Khảo sát một số đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn đã tuyển chọn

- Khảo sát ảnh hưởng của một số điều kiên như: nhiệt độ, pH, nguồn carbon đến khả năng sinh trưởng và đối kháng của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn

1.4 Ý nghĩa thực tiễn và khoa học của đề tài

1.4.1 Ý nghĩa khoa học

Kết quả nghiên cứu của đề tài là nguồn tài liệu tham khảo để nghiên cứu chuyên sâu về các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm cao nhằm mục đích nghiên cứu ra các chế phẩm sinh học từ các chủng xạ khuẩn được tuyển chọn

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ góp phần bổ sung thêm các nguồn xạ khuẩn

có hoạt tính đối kháng chủng nấm gây bệnh, khả năng sinh trưởng, khả nặng chịu mặn Việc nghiên cứu và tuyển chọn ra các chủng xạ khuẩn có khả năng đối

kháng với hai chủng nấm Corynespora cassiicola và Fusarium oxysporum sẽ làm

phong phú các chủng vi sinh vật có lợi cho cây trồng Nhờ đó mà các nhà nghiên cứu, công ty sản xuất về chế phẩm sinh học có thể ứng dụng các chủng đó trong việc sản xuất các chế phẩm sinh học trong nông nghiệp thay thế cho các sản phẩm phân bón hoá học với mục đích nâng cao năng suất cây trồng và bảo vệ môi trường

PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan về xạ khuẩn

2.1.1 Vị trí phân bố, vai trò của xạ khuẩn

Xạ khuẩn phân bố rộng rãi với sự đa dạng về quần thể trong các sinh cảnh khác nhau trong tự nhiên Ví dụ như trên cạn, biển, rừng ngập mặn, vùng cực, và trầm tích của hồ, sông, cửa sông và môi trường biển (Hemant Patil và cộng sự, 2011) Xạ khuẩn trải qua sự phân hóa hình thái phức tạp với sự phát triển của sợi nấm cơ chất trong giai đoạn đầu của chu kỳ sống, tiếp theo là sợi nấm khí sinh, sau đó tạo ra bào tử có khả năng chống lại các áp lực môi trường khác nhau Sự khác biệt đáng kể về hàm lượng tế bào chất trong sợi nấm cũng như dạng bào tử, cho thấy bào tử là dạng phân tán và có thể nảy mầm trong những điều kiện thuận lợi (Hemant Patil và cộng sự, 2011)

Hình 2.1 Sinh thái học của xạ khuẩn

(Nguồn: Anne van der Meij và cộng sự, 2017)

Xạ khuẩn đóng một vai trò quan trọng trong sinh thái với việc phân huỷ hợp chất hữu cơ Nhiều xạ khuẩn đã tiến hóa sống cộng sinh với thực vật, nấm, côn trùng và động vật Hầu hết các mối quan hệ, tương tác giữa xạ khuẩn và vật chủ như vậy đều có lợi, nhờ đó xạ khuẩn tạo ra các sản phẩm tự nhiên cho phép vật chủ của chúng tự bảo vệ chống lại mầm bệnh hoặc dịch hại, hoặc các enzyme

phân hủy các polyme tự nhiên có khả năng đàn hồi như lignocellulose (Anne van der Meij và cộng sự, 2017)

2.1.2 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn

Trong tự nhiên xạ khuẩn sống phổ biến như ở trong đất, nước biển… chúng

có nhiều đặc điểm giống vi khuẩn nhưng khác với nấm mốc với kích thước tế bào nhỏ, thành tế bào không chứa cenllulose hay kitin, phân chia tế bào theo kiểu vô

ti (Amytoz), không phân biệt giới tính Tuy nhiên, xạ khuẩn cũng có đặc điểm giống nấm mốc như có hệ sợi khuẩn ty phân nhánh, nhưng ở xạ khuẩn hệ sợi không có vách ngăn Sự phân hoá của khuẩn ty khí sinh bắt đầu từ những mấu lồi xuất hiện trên bề mặt của sợi khuẩn ty sau đó mấu lồi lớn lên thành chồi, chồi phát triển dài ra thành sợi, cuối cùng tạo thành hệ sợi dầy đặc

Hình 2.2 Các loại khuẩn ty ở xạ khuẩn

(Nguồn: Nguyễn Lân Dũng, 1967) Khuẩn ty khí sinh của xạ khuẩn phát triển ra bên ngoài không khí trên bề mặt môi trường rắn tạo thành khuẩn lạc xạ khuẩn; khuẩn lạc xạ khuẩn dạng hình tròn

do khuẩn ty phát triển theo hình phóng xạ tạo thành nhiều vòng tròn đồng tâm, khác với khuẩn lạc của nấm men, nấm mốc và vi khuẩn, khuẩn lạc của xạ khuẩn thường chắc, xù xì, bề mặt có mấu lồi, có nếp nhăn hoặc sần sùi Trường hợp không có sợi khí sinh khuẩn lạc có dạng màng dẻo Kích thước khuẩn lạc thay đổi tuỳ từng loài, điều kiện nuôi cấy như thành phần môi trường, pH, nhiệt độ Khuẩn

lạc của xạ khuẩn gồm ba lớp: lớp ngoài gồm các sợi bện chặt với nhau, lớp trong

tương đối xốp hơn và lớp giữa thì có cấu trúc tổ ong

Trong kết quả nghiên cứu của Nguyễn Lân Dũng (1967), xạ khuẩn sinh sản

vô tính bằng bào tử Bào tử được hình thành trên các nhánh phân hoá của xạ khuẩn

ty khí sinh gọi là cuống bào tử Đó là cơ quan sinh sản đặc trưng của xạ khuẩn,

chúng có dạng khác nhau như: thẳng, lượn sóng, xoắn Bào tử hình thành trên

cuống sinh bào tử theo hai phương pháp kết đoạn và cắt khúc và gồm nhiều hình

dạng khác nhau, thường có hình trụ, ovan, hình cầu, hình que với những kích

thước khác nhau Kích thước của bào tử cũng thay đổi theo từng loài, tuỳ cá thế

thậm chí ngay trên cùng một chuỗi bào tử

Hình 2.3 Một số dạng hình thái của chuỗi bào tử ở xạ khuẩn

(Nguồn: Anandan, 2016)

2.1.2 Đặc điểm sinh lý hoá của xạ khuẩn

Xạ khuẩn là vi khuẩn gram dương hiếu khí có tỷ lệ (G + C) trong DNA cao

hơn 55% Trong số khoảng 1000 chi và 5000 loài sinh vật nhân sơ đã công bố

có khoảng 100 chi và 1000 loài xạ khuẩn Xạ khuẩn phân bố chủ yếu trong đất

và đóng vai trò rất quan trọng trong chu trình tuần hoàn vật chất trong tự nhiên

Chúng sử dụng acid humic và các chất hữu cơ khó phân giải khác trong đất Mặc

dù xạ khuẩn thuộc nhóm sinh vật nhân sơ nhưng chúng thường sinh trưởng dưới

dạng sợi và thường tạo nhiều bào tử Thậm chí một số loại xạ khuẩn còn hình thành

túi bào tử như chi Streptosporangium, Micromonospora và bào tử di động như chi Actinoplanes, Kineosporia (Nguyễn Lân Dũng, 1967; Mason và cộng sự,

2001)

Đa số xạ khuẩn thuộc nhóm vi sinh vật ưa ấm với nhiệt độ dao động từ 25℃ đến 30℃ Mặt khác, có một số chủng xạ khuẩn thích nghi được ở nhiệt độ trong khoảng 450C đến 550C Bên cạnh đó pH để xạ khuẩn phát triển từ dải pH

5 đến pH 10 và pH tối ưu là pH 7.5 (Gebreselema và cộng sự, 2013)

2.1.3 Khả năng sinh enzyme của xạ khuẩn

Enzyme là một chất xúc tác sinh học được tạo thành trong tế bào vi sinh vật,

nó đóng một vai trò quan trọng trong trao đổi chất của vi sinh vật, chúng không chỉ hoạt động trong quá trình xúc tác phản ứng chuyển hóa trong cơ thể mà còn xúc tác chuyển hóa bên ngoài môi trường

Xạ khuẩn là sinh vật sống hoại sinh nên chúng tiết ra nhiều enzyme quan trọng

và có ý nghĩa trong thực tiễn cao Một số enzyme đã được tách chiết từ xạ khuẩn như:

- Enzyme amylase: Amylase là enzyme có khả phân huỷ amylose và amylopectin và các polysaccharide Chúng có vai trò quan trong việc phân giải cơ chất tinh bột từ các phụ phẩm như bún, bánh đa, bánh cuốn, cơm… Từ các phụ phẩm trên kết hợp sự phân giải của enzyme amylase tạo ra nhiều tinh bột để sản xuất alcohol Một phần nhờ có các enzyme đường hoá α −amylase và glucoamylase từ các chế phụ phẩm có chứa tinh bột từ các dây truyền chế biến thức ăn có thể sản xuất màng bao gói có khả năng phân huỷ sinh học

- Enzyme cellulase: Enzyme cellulase có khả năng phân huỷ các chất phế phụ phẩm có chứa cellulase, chuyển hoá các hợp chất như: lignocellulose và cellulose trong rác thải tạo nên nguồn năng lượng thông qua các sản phẩm đường, ethanol hay các nguồn năng lượng khác

- Enzyme protease: Protease là enzyme có khả năng phân huỷ protein được ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực công nghiệp thực phẩm… Chúng được ứng dụng để sản xuất các dung dịch đặc hoặc các chất rắn khô có giá trị dinh dưỡng cho vật nuôi Quá trình phân giải protein không tan từ enzyme protease thông

qua nhiều bước khác nhau, ban đầu chúng hấp thụ lên các chất rắn, cắt chuỗi liên

kết polypeptit tạo thành các liên kết lỏng trên bề mặt Sau đó, quá trình hoà tan

các phần chất rắn được diễn ra rất chậm phụ thuộc vào độ khuếch tán enzyme

lên bề mặt cơ chất Với tính chất trên mà enzyme protease được sử dụng trong

việc xử lý các protein tồn đọng trong dòng chảy thành dung dịch rửa trôi không

còn mùi hôi thối ngoài môi trường…

- Enzyme chitinase: Đây là enzyme thuỷ phân chitin thành các đơn phân N-acetylglosamine, chitotriose hay chitobose thông qua sự xúc tác phân cắt liên

kết β − 1,4 − glycoside tại vị trí carbon số một và carbon số bốn của phân tử

N-acetylglosamine liên tiếp nhau trong chitin Enzyme này có mặt nhiều loài khác

nhau như: thực vật, động vật không sương sống, động vật có vú, côn trùng, chân

khớp… Hiện nay người ta sử dựng enzyme này trong sản suất ở các lĩnh vực

khác nhau với ý nghĩa thực tiễn như: thuốc trừ sâu sinh học, y học, v.v

Ngoài ra, thành phần dinh dưỡng của môi trường cũng ảnh hưởng đến sự

sinh trưởng và tổng hợp enzyme Để tăng sự tổng hợp enzyme thì môi trường

nuôi cấy phải có đầy đủ các thành phẩn dinh dưỡng đặc biệt cần bổ sung “chất

cảm ứng” tổng hợp enzyme, thường là cơ chất tương ứng của enzyme cần tổng

hợp, ví dụ, trong quá trình tổng hợp protease của Actinomyces cần chất cảm ứng

là protein đậu nành hay protein động vật

2.2 Ứng dụng của xạ khuẩn trong thực tiễn

2.2.1 Trong lĩnh vực nông nghiệp

Xạ khuẩn được ứng dụng trong việc sản xuất làm chế phẩm sinh học nông

nghiệp bởi chúng có khả năng tiết ra các hợp chất có hoạt tính kháng sinh có khả

năng kháng lại một bệnh gây hại trên cây trồng, gia cầm

Trong lĩnh vực trồng trọt xạ khuẩn được ứng dụng làm chế phẩm sinh học

thay thế cho các loạị thuốc bảo vệ thực vật hoá học giúp tiêu diệt các vi sinh vật

gây hại như nấm, vi khuẩn vì chúng là nguyên nhân gây bệnh phá hại mua màng

của người nông dân Ngoài ra, chúng cũng được nghiên cứu để sản xuất các sản

phẩm sinh học dùng làm chất kích thích sinh trưởng làm to quả, tăng năng suất

So với các sản phẩm thuốc hoá học thì chế phẩm sinh học có từ các chủng xạ

khuẩn có hoạt tính kháng sinh sẽ có tác dụng nhanh, dễ phân huỷ, có tính đặc hiệu cao, chỉ tiêu diệt một số loại vi sinh vật hoặc sâu nhất định nhưng không gây ảnh hưởng đến những sinh vật có ích khác, đồng thời cũng không gây ô nhiễm môi trường và có khả năng ức chế cả những loại vi sinh vật đã kháng lại thuốc hoá học (Ngô Đình Quang Bính, 2005)

2.2.2 Trong lĩnh vực công nghệ thực phẩm

Trong việc bảo quản các loại thực phẩm, các tác nhân vật lý (phương pháp đun nóng, đông lạnh, chiếu tia UV ) hoặc tác nhân hoá học (phương pháp lên men ) thường được sử dụng Với sự phát triển của xã hội và khoa học thì chúng

ta có thể sử dụng một liệu lượng chất kháng sinh từ các chủng xạ khuẩn có hoạt tính sinh kháng sinh với liều lượng nhỏ để bảo quản thực phẩm để tránh khỏi tác động của vi sịnh vật Các chất kháng sinh từ xạ khuẩn có phổ tác động rộng, không chỉ tác dụng lên vi khuẩn Gram dương, vi khuẩn Gram âm mà ngay cả với một số loại nấm cũng có thể bị tiêu diệt nhưng không làm mất đi mùi vị và chất lượng của thực phẩm Ngoài ra, việc sử dụng chất kháng sinh trong quá trình lên men thực phẩm tươi có khả năng ức chế một số vi sinh vật có khả năng sinh trưởng và làm hỏng thực phẩm (Ngô Đình Quang Bính, 2005; Lương Đức Phẩm, 2004)

2.2.3 Trong lĩnh vực y học

Đối với lĩnh vực y học ngày nay, việc nghiên cứu và phát hiện để phát triển ra các loại chất kháng sinh mới từ các chủng xạ khuẩn cũng góp phần đang kể trong các công tác phòng chống bệnh tật, nhất là các bệnh nhiễm khuẩn của con người Nhờ có thuốc kháng sinh mà nhiều dịch bệnh được đẩy lùi như dịch hạch, thương hàn hay bệnh uốn ván Trong thời kỳ chiến tranh thế giới thứ II, việc nghiên cứu

ra penicillin đã cứu sống rất nhiều bệnh nhân quân đội bị nhiễm trùng máu Năm

1944, Waskman, Schatz, Bugie đã phát hiện ra steptomycin đã mang đến một kỷ

nguyên mới trong điều trị bệnh lao và đặc biệt là bệnh viêm màng não (De Lima Procópio và cộng sự, 2012) Tính đến nay, chưa có chất kháng sinh nào có thể điều trị các bệnh do virus gây ra một cách hiệu quả vì virus không chịu tác động của chất kháng sinh (Ngô Đình Quang Bính, 2005)

2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng của xạ khuẩn

2.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ là một trong những yếu tố rất quan trọng tác động đến khả năng sinh trưởng của các chủng xạ khuẩn nói chung và các vi sinh vật khác nói riêng Tuỳ thuộc vào từng loại xạ khuẩn mà chúng có nhiệt độ thích nghi khác nhau trong môi trường sống của chúng Trong một nghiên cứu của Muhammad (2016) sự phát triển tối ưu của xạ khuẩn nằm trong khoảng 25-35°C là nhiệt độ phù hợp cho

sự sinh trưởng của chúng Điều này cũng phù hợp với các giá trị của nghiên cứu khả năng sinh trưởng của xạ khuẩn cũng như khả năng đối kháng với nhiệt độ từ

28 đến 30°C (Risikat và cộng sự, 2020)

2.3.2 Ảnh hưởng của pH

Khả năng sinh trưởng của các chủng xạ khuẩn một phần cũng phụ thuộc đáng

kể vào độ pH của môi trường Việc điều chỉnh độ pH thích hợp cho việc sinh trưởng của xạ khuẩn tốt nhất là môi trường pH trung tính, môi trường có pH ở mức axit hoặc kiềm dẫn đến sự sinh trưởng, cơ chế sinh hóa và enzyme khác nhau (Pavitra, 2020)

2.3.3 Ảnh hưởng của nồng độ muối

Dựa vào khả năng sinh trưởng, phát triển của xạ khuẩn trong điều kiện nồng

độ muối khác nhau được phân loại thành các loài chịu mặn trung bình (15% NaCl)

và chịu mặn cao (30% NaCl) Chúng tồn tại thông qua hai cơ chế - “nồng độ muối cao” và “nồng độ muối thấp, chất hòa tan hữu cơ” - để bảo vệ các protein gian bào khi có các muối tương tự như clorua, kali và sản xuất axit hữu cơ, sẽ trực tiếp làm thay đổi nồng độ enzym nội bào Để điều chỉnh cho phù hợp với điều kiện giảm nồng độ muối, màng tế bào ưa muối được cấu tạo bởi các hệ thống thích ứng chính ngăn chặn NaCl xâm nhập vào tế bào, chẳng hạn như sự tích tụ của muối

vô cơ và các hợp chất hữu cơ trọng lượng phân tử thấp hòa tan trong nước Các muối vô cơ ở dạng (Na+, K+, Cl-) chủ yếu tham gia vào việc điều chỉnh điện thế thẩm thấu, còn các muối hữu cơ ở dạng chất tan nhỏ hoặc chất điện ly liên quan đến sự cân bằng nồng độ muối nội bào (Mariadhas Valan Arasu và cộng sự, 2016) Hai cơ chế này chủ yếu tham gia vào việc duy trì cấu trúc tế bào; do đó, các tế

bào phát triển trong điều kiện có các nồng muối khác nhau (Mariadhas Valan Arasu và cộng sự, 2016)

2.3.4 Nguồn carbon

Sinh trưởng và phát triển của xạ khuẩn cũng phụ thuộc vào môi trường có bổ sung các nguồn đường khác nhau thông qua đó mà chúng có thể sử dụng các nguồn carbon và tổng hợp các hoạt chất khác nhau làm nên sự đa dạng trong quá trình đánh giá Một số nguồn đường thường được sử dụng để khảo sát như: các loại đường đơn (glucose, mannitose,v.v.) hay các loại đường đôi (sucrose, lactose,v.v.) cũng có thể là các loại tinh bột hoặc các chất có thành phần không xác định như rỉ đường, đại mạch

2.4 Các bệnh thường gặp trên cây trồng trong nông nghiệp

Cây trồng ngày nay chịu tác động không nhỏ từ môi trường, con người và vi sinh vật Trong đó, sự tác động mạnh mẽ đến chất lượng và năng suất cây trồng

là các chủng vi khuẩn, virus và nấm bệnh Các bệnh gây hại trên cây trồng do nấm gây bệnh gây ra chiếm 80% (Someya, 2008) Nhìn chung, triệu chứng của nấm bệnh trên cây trồng chủ yếu là ba dạng hoại tử, thối nhũn và héo rũ, đó là những nhận định chính xác để xác định nấm bệnh (Pujari và cộng sự, 2015) Bệnh hoại tử là một trong những triệu chứng phổ biến thường gặp ở các tế bào và mô cục bộ ở lá, thân, quả của cây (Cohen và cộng sự, 2017) Trên các cây

bị bệnh thường xuất hiện các đốm hoặc bột, nó là những chất tạo nên trên bề mặt hoặc xung quanh các tổn thương với các hình dạng khác nhau về kích thước và màu sắc Nhiều bệnh gây hại đến cây trồng thì được đặt tên theo đặc điểm của

chủng nấm bệnh, chẳng hạn như bệnh mốc xám do nấm Botrytis cinerea (Jiang

và cộng sự 2018; Boukaew và cộng sự, 2017)

Bệnh thối nhũn là sự hoại tử của các tế bào hay mô trên thực vật do nấm bệnh gây ra, kèm theo sự xuất hiện của các lớp nấm mốc hoặc các chấm đen nhỏ tại vị trí bị bệnh, chẳng hạn như bệnh thối rễ và thân trên cây đậu tương do nấm

Phytophthora sojae (Mustafa Oskay, 2009) Nguyên nhân làm cho cây bị héo là

do rễ bị hoại tử bởi nhiễm nấm trên cây trồng Các bó mạch của thực vật bị tắc nghẽn và nước không thể vận chuyển lên trên dẫn đến cành và lá cây bị rủ xuống,

chẳng hẳn như bệnh héo Fusarium ở cà chua do nấm Fusarium oxysporum

(Ploetz, 2015)

2.5 Các biện pháp phòng trừ nấm bệnh gây hại cây trồng

Hiện trạng chung về việc kiểm soát nấm gây bệnh với chủng nấm Fusarium oxysporum, Corynespora cassiicola và các chủng nấm gây bệnh khác trên các

đồng ruộng và trên cây trồng gặp nhiều khó khăn Nguyên nhân chính là người nông dân xử lý các tác nhân gây bệnh từ các chủng nấm bằng những phương pháp thủ công hoặc sử dụng các sản phẩm thuốc hoá học để phun khử trùng và

sử dụng các giống cây trồng có khả năng kháng bệnh là phổ biến Tuy nhiên, kết quả đem lại từ những phương pháp này thường thấp, không triệt để mà còn tác động đến ô nhiễm môi trường xung quanh cũng như sự an toàn của con người

Để khắc phục những vấn đề trên việc nghiên cứu các phương pháp, kỹ thuật mới trong việc kiểm soát các chủng nấm gây bệnh hại cây trồng càng được nâng cao Ngày nay người ta đã nghiên cứu về việc kiểm soát sinh học và kháng bệnh cho cây trồng cũng như các cách giải khác để thay thế các phương pháp cũ nhằm tăng năng suất, chất lượng cây trồng

* Biện pháp canh tác:

- Luân canh cây trồng khác họ

- Sử dụng giống kháng

- Xử lý hạt giống bằng nước nóng 50℃ trong 25 phút

- Bón vôi trước khi trồng

- Dùng phân hữu cơ hoai mục, có nhiều vi sinh vật đối kháng làm hạn chế nguồn bệnh, bón phân cân đối để cây khỏe

- Tránh tạo vết thương cho cây

- Nên chọn đất có điều kiện thoát nước tốt

* Biện pháp cơ giới vật lý: Nhổ bỏ cây bị bệnh

* Biện pháp sinh học: Dùng các chế phẩm Trichoderma bón vào đất trước khi trồng

PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu

3.1.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian: từ tháng 08 năm 2020 đến tháng 02 năm 2021

Địa điểm: phòng thí nghiệm bộ môn Công nghệ Vi sinh – Khoa Công nghệ Sinh học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam

3.1.2 Nguồn mẫu phân lập, sàng lọc

Các chủng xạ khuẩn được phân lập từ các mẫu đất tại Cao Bằng, Hải Dương

và một số chủng được hoạt hoá từ bộ chủng xạ khuẩn được giữ trong tủ -20oC của Bộ môn Công nghệ vi sinh – Khoa Công nghệ sinh học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam được sử dụng để đánh giá khả năng đối kháng

3.1.3 Nguồn mẫu nấm thử đối kháng

Hai chủng nấm thử đối kháng là chủng nấm gây bệnh trên thực vật được cung cấp bởi Viện hoá học Công nghiệp Việt Nam và Bộ môn Bệnh cây đại cương – Khoa Nông học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam được sử dụng để sàng lọc các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm

Bảng 3.1 Một số chủng nấm thử hoạt tính đối kháng

1 Corynespora cassiicola Gây bệnh vàng rụng lá trên cây cao su

2 Fusarium oxysporum Gây bệnh héo vàng trên chuối

- Các loại cao: cao thịt, cao nấm men, cao malt, peptone, triptone

- Các loại hoá chất khác: agar, tinh bột, carboxymethyl cellulose (CMC), gelatin, chitin, L – asparagin, L – tyrosin, xitrat sắt, bột yến mạch, glycerol

3.1.5 Môi trường nuôi cấy

a Môi trường nuôi cấy xạ khuẩn

v Môi trường Gause I (g/l): 20g tinh bột, 0.5g K2HPO4; 0.5g MgSO4.7H2O; 0.5g NaCl; 1g KNO3; 0.018g FeSO4.7H2O; 20g Agar; pH 7.0 – 7.2

v Môi trường Gause II (g/l): 30ml nước chiết thịt; 5g peptone; 5g NaCl; 10g glucose, 20g agar; pH 7.0 – 7.5

b Môi trường thử đối kháng

v Môi trường khoai tây (PDA) (g/l): dịch chiết 200g khoai tây; 20g glucose; 20g agar; pH 5.2 – 5.8

D-c Các môi trường phân loại theo ISP

v ISP 1 (g/l): 5g tryptone; 3g cao nấm men; 20g agar; pH = 7.0

v ISP 2 (g/l): 4g cao nấm men; 10g cao Malt; 4g glucose; 20g agar;

* Dung dịch muối B (%): 0.64g CuSO4.5H2O; 0.11g FeSO4.7H2O; 0.79g MnCl2.4H2O; 0.15g ZnSO4.7H2O; nước cất 100ml

Dong-và để lắng, thu được độ pha loãng 10-2 Lấy pipet hút 100 μl từ ống có nồng độ

10-2 sang ống eppendorf chứa 900 μl nước cất sẽ được nồng độ 10-3 Tiếp tục pha loãng thành đến nồng độ 10-4, 10-5, 10-6 Từ nồng độ pha loãng 10-3 đến 10-6, dùng pipet hút 50 μl đến 100μl cho vào đĩa petri có chứa môi trường Gause I Dùng que trang vô trùng chang mẫu đều đến khi nào dít thì dùng lại, sau đó nuôi ở tủ 30oC

từ 4-7 ngày

Xạ khuẩn được lữu giữ tại bộ môn Công nghệ vi sinh được hoạt hoá bằng cách cấy ria lại trên đĩa petri có chứa môi trường Gause I và nuôi trong tủ 30oC từ 4-7 ngày

Sau khi phân lập và hoạt hoá, các khuẩn lạc đứng riêng rẽ, rắn chắc, bề mặt khô và có thể có dạng da, dạng phấn, dạng nhung, dạng vôi và có màu sắc khác nhau trên đĩa thạch được tiến hành cấy chuyển sang các đĩa petri có chứa môi trường Gause I để làm thuần Các khuẩn lạc đã thuần sẽ được cấy chuyển sang

ống thạch nghiêng chứa môi trường Gause I và tiếp tục nuôi trong 10 đến 14 ngày, sau đó bảo quản mẫu trong tủ lạch 4oC (Nguyễn Thành Đạt, 2000)

3.2.2 Phương pháp đáng giá khả năng đối kháng nấm

Khả năng đối kháng nấm của các chủng xạ khuẩn được xác định bằng

phương pháp đồng nuôi cấy (Dhanasekaran et al., 2012) trên môi trường Potato

Dextrose Agar (PDA) Dùng dao cấy vô trùng cắt một miếng thạch có xạ khuẩn với kích thước 5x5 mm đặt sang đĩa petri có chứa môi trường PDA, cách mép đĩa 1.5 -2 cm Nuôi ở điều kiện 30oC trong vòng 2 đến 3 ngày

Lấy dao cấy vô trùng cắt miếng thạch chứa nấm gây bệnh, đường kính 5x5

mm và đặt vào vị trị đối diện với vị trí đặt xạ khuẩn (cách mép đĩa từ 2 cm) Tương tự, đặt một miếng thạch nuôi nấm ở trung tâm của đĩa đối chứng có chứa môi trường PDA

Nuôi mẫu ở điều kiện 30oC, pH = 7, trong khoảng 4-7 ngày Phần trăm ức chế (precent of inhibition/PI) được tính bằng công thức của Dhanasekaran và cộng

sự (2012):

PI = 𝐂"𝐓

Trong đó: C-là bán kính của nấm bệnh (mm) ở đĩa đối chứng

T-là bán kính của nấm bệnh (mm) phần tiếp giáp với xạ khuẩn

3.2.3 Khảo sát đặc điểm sinh học

3.2.3.1 Đặc điểm hình thái

a Màu sắc của hệ sợi ký sinh

Màu sắc của hệ sợi ký sinh được phân loại theo bảng màu của (Tresner và Backus, 1963) Người ta căn cứ vào mắc sắc khuẩn ty của các chủng xạ khuẩn

mà chia thành 8 nhóm màu sau: White (W) nhóm màu trắng, Gray (Gry) nhóm màu xám, Red (R) nhóm màu đỏ, Yellow (Y) nhóm màu vàng, Green (G) nhóm màu xanh, Blue (B) nhóm màu xanh da trời, Violet (V) nhóm màu tím và nhóm màu không xác định (X)

b Hệ sợi cơ chất

Hệ sợi cơ chất của xạ khuẩn được quan sát trực tiếp trên môi trường thạch đĩa hoặc thạch nghiêng và mô tả theo bảng màu chuẩn của Bondarsew (1953), Tresner và cộng sự (1963)

c Cuống sinh bào tử

Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường Gause I có găm lamen nghiêng một góc 45o trên bề thạch, môi đĩa găm 5 đến 7 lamen nuôi trong tủ ấm 30℃ Sau 7-

10 ngày nuôi cấy lấy lamen ra quan sát hình thái của chuỗi sinh bào tử trên lam kính dưới kính hiển vi quang học (Nanjwade Basavaraj et al., 2010) Chuỗi sinh bảo tử có các dạng thẳng hay dạng lượn song ký hiệu là RF (Rectiflexibiles), hình móc câu hay hình xoắn không hoàn toàn ký hiệu là RA (Rectinaculiapetri)

và xoắn hoàn toàn ký hiệu là S (Spirales) (Newman và cộng sự 2003; Robert và Thomas, 1988)

3.2.3.2 Đặc điểm sinh lý-hoá

a Khả năng sinh enzyme ngoại bào

Xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng xạ khuẩn được thực hiện theo phương pháp khuếch tán đĩa thạch của ông Dhanasekaran (2012)

Các chủng xạ khuẩn được nuôi trong ống nghiệm chứa 5ml môi trường Gause I lỏng ở 30oC trong 7 ngày Sau 7 ngày dịch nuôi sẽ được ly tâm 6000 vòng/phút trong 15 phút, chiết dịch trong thu được enzyme thô

Chuẩn bị môi trường gồm: dung dịch đệm phosphate (pH = 7) + 1% cơ chất + 2% agar Trong đó, nguồn cơ chất: tinh bột (xác định hoạt tính amylase), gelatin (xác định hoạ tính protease) và CMC (xác định hoạt tính cellulase)

Dùng pipet hút 100 µl dịch chiết enzyme thô đã ly tâm và nhỏ vào các giếng thạch được đục lỗ trên đĩa petri có đổ môi trường agar pha trong dung dịch đệm

có bổ sung 1% các cơ chất tương ứng (bảng 3.2), sau đó đặt vào tủ ấm 30℃ trong 24 giờ Hoạt tính enzyme được xác định bằng cách quan sát vùng không bắt màu sau khi nhuộm bằng thuốc thử (bảng 3.2)

Bảng 3.2 Cơ chất và thuốc thử của một số enzyme ngoại bào

Protease Gelatin Amino đen và dung dịch tẩy amino đen Cellulase Carboxymethyl cellulose (CMC) Lugol

b Khả năng chịu muối

Các chủng xạ khuẩn được tuyển chọn được cấy ria trên môi trường Gause I

có bổ sung thêm NaCl với các nồng độ muôi khác nhau: 0; 0.5; 1; 3; 5; 7 (%) Sau 7 ngày ủ trong tủ nuôi 30℃, lấy ra quan sát sự sinh trưởng của chúng (Jangan Moahan, 2013)

c Xác định khoảng pH thích hợp cho sự sinh trưởng của xạ khuẩn

Các chủng xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường Gause I ở các điều kiện

pH ban đầu khác nhau là: 4; 5; 6; 7; 8; 9; 11; 12 và được nuôi ở tủ 30oC, quan sát sự sinh trưởng sau 7 ngày

d Xác định nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng của xạ khuẩn

Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường Gause I ở các điểu kiện nhiệt độ khác nhau: 30oC, 37oC, 40oC Sau 7 ngày nuôi cấy quan sát khả năng sinh trưởng của chúng

e Khả năng đồng hoá nguồn carbon

Mẫu xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường ISP 9 có bổ sung thêm 1% các nguồn đường khác nhau như: D-glucose, galactose, fructose, maltose, dextrin, sorbiton, mannitol, lactose, sucrose

Xạ khuẩn được tuyển chọn được cấy ria trên đĩa petri có chứa môi trường ISP 9 và bổ sung 1% các nguồn đường khác nhau, sau đó ủ trong tủ nuôi ở nhiệt

độ 28-30oC Sau 7-10 ngày nuôi cấy quan sát sự sinh trưởng của các chủng xạ khuẩn và so sánh với mẫu đối chứng Trong đó môi trường có glucose được coi

là đối chứng dương và môi trường không có đường được coi là đối chứng âm (Shirling và Gottlieb, 1966)

Nếu xạ khuẩn sinh trưởng mạnh bằng hoặc kém hơn đối chứng dương, mạnh hơn đối chứng âm: có khả năng sử dụng nguồn đường đó được ký hiệu là (+)

Nếu xạ khuẩn sinh trưởng mạnh hơn đối chứng dương được ký hiệu là (++) Nếu xạ khuẩn sinh trưởng bằng đối chứng âm hoặc không mọc: không có khả năng sử dụng nguồn đường đó được ký hiệu là (-)

3.2.3.3 Đặc điểm nuôi cấy

a Màu sắc khuẩn ty khí sinh, khuẩn ty cơ chất

Các chủng xạ khuẩn được nuôi cấy trên các loại môi trường ISP được ký hiệu là: ISP-1, ISP-2, ISP-3, ISP-4, ISP-5, ISP 6 Sau 14 và 21 ngày, lấy ra quan sát màu sắc khuẩn ty khí sinh và khuẩn ty cơ chất, sắc tố tiết ra môi trường (Newman và cộng sự, 2003; Shirling và Gotilieb, 1996)

b Sự hình thành sắc tố melanin

Xạ khuẩn được tuyển chọn nuôi cấy trên môi trường ISP 6 trong tủ nuôi

30oC Bắt đầu quan sát màu của môi trường sau 24 giờ nuôi cấy cho đến ngày thứ 21 Nếu chủng xạ khuẩn sinh sắc tố melanin thì màu môi trường sẽ chuyển

từ màu vàng nhạt sang màu nâu đậm cho đến màu đen (Newman và cộng sự, 2003)

3.2.4 Bảo quản giống

Các chủng xạ khuẩn đã được tuyển chọn được cấy trong ống thạch nghiêng chứa môi trường Gause I ở điều kiện 30℃ trong 10 – 14 ngày Khi xạ khuẩn mọc tốt ở các ống giống được bảo quản trong tủ lạnh ở 4 - 6℃, sau 2 – 3 tháng cấy chuyển lại một lần

Để bảo quản giống được lưu giữ trong parafil lỏng vô trùng, giữ lạnh sâu trong glycerin hoặc đông khô, bảo quản được 6 tháng đến 2 năm

PHẦN IV KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 4.1 Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng nấm 4.1.1 Phân lập và hoạt hoá các chủng xạ khuẩn

Các mẫu xạ khuẩn được phân lập từ các mẫu đất, bùn được thu thập tại Hải Dương, Cao Bằng Ngoài ra một số chủng xạ khuẩn được hoạt hoá từ bộ lưu trữ các chủng xạ khuẩn của Bộ môn Công nghệ vi sinh, khoa Công nghệ sinh học Các chủng xạ khuẩn được phân lập và hoạt hoá trên môi trường Gause I Kết quả thu được 26 chủng xạ khuẩn khác nhau

XK 4.1 XK 3.1 HD 6.3

Hình 4.1 Hình ảnh một số chủng xạ khuẩn phân lập được

Bảng 4.1 Các chủng xạ khuẩn phân lập từ các mẫu đất và hoạt hoá từ các

chủng giống tại bộ môn Công nghệ vi sinh

Địa điểm lấy mẫu Các chủng xạ khuẩn phân lập

được và hoạt hoá Tổng số

Cao Bằng

CB1.1, CB1.2, CB1.4, CB1.7, CB2.1, CB2.2, CB2.4, CB3.1, CB4.2, CB4.5, CB4.6

Sự đa dạng về màu sắc của các chủng xạ khuẩn được phân lập tại các vị trí địa

lý khác nhau cũng như các chủng được hoạt hoá từ nguồn mẫu của bộ môn sau 7

ngày nuôi cấy trên môi trường Gause I Trerner và Buckus (1963) người ta dựa vào màu sắc của khuẩn ty khí sinh mà xạ khuẩn được phân loại thành 8 nhóm màu khác nhau: Gray (GY) nhóm xám, red (R) nhóm đỏ, yellow (Y) nhóm vàng, blue (B) nhóm xanh da trời, green (GN) nhóm xanh lá cây, violet (V) nhóm tím, white (W) nhóm trắng, và nhóm không xác định (X) 26 chủng xạ khuẩn được phân lập được chìa thành 5 nhóm màu với số lượng và tỷ lệ khác nhau (bảng 4.1)

Bảng 4.2 Phân bố xạ khuẩn được phân lập theo nhóm màu

STT Nhóm màu Chủng phân lập được Tổng số Tỷ lệ (%)

1 Trắng (White)

CB1.1, CB1.2, CB1.4, CB2.1, CB2.2, CB2.4, CB3.1, CB4.2, CB4.5, HD3.1, HD6.2, HD6.4 HD7.1, HD7.2, HD7.3, HD7.4, XK2.3, XK8.2

Kết quả thống kê (bảng 4.2) cho thấy tỷ lệ màu trắng và màu hồng là chiếm

ưu thế hơn các màu còn lại lần lượt là 69.23% và 11.53% Cùng với hướng nghiên cứu trên, Amadou Hamadoun Dicko và cộng sự (2013) cho thấy các chủng xạ khuẩn phân lập từ mẫu đất tại Mali tỷ lệ màu xám là màu chiếm ưu thế Trong một số báo cáo nghiên cứu của các tác giả Trần Thị Trinh và cộng sự (2018) phân lập xạ khuẩn biển tại Hải Phòng, Thanh Hoá, Nghệ An; Hoàng Thị Hồng và cộng

sự (2013) phân lập xạ khuẩn từ rừng ngập mặn Cần Giờ; Huỳnh Thị Phụng và Đỗ Thu Hà (2013) phân lập xạ khuẩn từ đất nông nghiệp của thành phố Hội An, Quảng Nam cho thấy kết quả phân lập các chủng xạ khuẩn có tỷ lệ màu trắng và màu xám là nhiều hơn so với các màu còn lại Trong một nghiên cứu khác của Anupama Sapkota và cộng sự (2020) cho thấy trong tất cả các chủng khuẩn phân lập từ mẫu đất tại Nepan thì xạ khuẩn có màu vàng chiểm tỷ lệ cao nhất Điều này chứng tỏ rằng khác biệt về màu sắc của các chủng xạ khuẩn này có thể phụ thuộc

vào nhiều yếu tố như: môi trường, pH, nhiệt độ tại vị trí lấy mẫu phân lập khác nhau

4.1.2 Sàng lọc các các chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng nấm

26 chủng xạ khuẩn được đánh giá khả năng đối kháng với hai chủng nấm gây

bệnh: Corynespora cassiicola và Fusarium oxysporum là các chủng nấm thường

gây bệnh trên thực vật thường gặp Dựa vào đường kính vòng kháng nấm mà tôi chọn ra được 2 chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng mạnh so với các chủng còn lại đó là chủng XK 3.1 và chủng Tra đã được chọn

(A) (B)

Hình 4.2 Khả năng đối kháng của chủng xạ khuẩn Tra với chủng nấm

Corynespora cassiicola (A) và Fusarium oxysporum (B)

(C) (D)

Hình 4.3 Khả năng đối kháng của chủng xạ khuẩn XK3.1 với chủng nấm

Corynespora cassiicola (C) và Fusarium oxysporum (D)