VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu nghiên cứu
3.1.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian: từ tháng 08/2020 đến 02/2021 Địa điểm: phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Vi sinh – Khoa Công nghệ Sinh học – Trường Học viện Nông nghiệp Việt Nam
Mẫu đất dùng để phân lập xạ khuẩn được lấy tại các địa điểm: Cúc Phương, Đắk Lắk, Thanh Hoá, Thái Nguyên
Vi sinh vật kiểm định: Xanthomonas axonopodis, Rastonia solanacearum, Clavibacter michiganensis, Xanthomonas sp., Bacillus subtilis và Fusarium oxysporum được cung cấp bởi Viện Hóa học Công nghiệp Việt Nam
3.1.3 Hoá chất, dụng cụ và thiết bị
− Các loại đường chuẩn: D-glucose, maltose, D-sorbito, L-rhamnose, D- galactose, L-arabinose, dextrin, D-xylose và D-fructose
− Các loại muối: KH2PO4, KI, MgSO4.7H2O, KNO3, NaCL, FeSO4.7H2O, (NH4)2SO4, CaCl2, MnCl2.4H2O, ZnSO4.7H2O, K2HPO4.3H2O, CuSO4.5H2O, MnCl2.7H2O
− Các loại cao: cao thịt, cao nấm men, cao malt, peptone, triptone
− Các loại hoá chất khác: agar, tinh bột, carboxymethyl cellulose (CMC), gelatin, chitin, L – asparagin, L – tyrosin, xitrat sắt, bột yến mạch, glycerol
− Hoá chất sinh học phân tử:CTAB, EDTA, tris base, 2-mercaptoethanol (βME), Phenol:Chloroform:Isoamylalcohol (25:24:1), ethanol 100%, ethanol 70%, TE, TAE, master mix, Chloroform:Isoamylalcohol (24:1)
− Mồi xuôi: 27F: 5’- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ và mồi ngược 1492R: 5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’
Dụng cụ và thiết bị
Các thiết bị và máy móc được sử dụng trong nghiên cứu thuộc phòng thí nghiệm của Bộ môn Công nghệ Vi sinh, Khoa Công nghệ Sinh học tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
− Máy khuấy từ gia nhiệt
3.1.4 Thành phần môi trường thí nghiệm
− Môi trường PDA (Potato dextrose agar) (g/l): dịch chiết của 200g khoai tây, dextrose 20g, agar 20 g, pH 5.6 – 5.8
Quy trình chuẩn bị môi trường PDA như sau:
• Chuẩn bị dịch khoai tây: đun sôi 200g khoai tây cắt nhỏ trong 1 lít nước cất trong 30 phút Sau đó lọc qua vải thưa để lấy dịch lọc
• Bổ sung vào dịch lọc 20g dextrose
• Hấp tiệt trùng ở 121℃ trong 15 phút
• Để nguội và bảo quản môi trường trong tủ lạnh ở 4℃
− Môi trường LB (Luria – Bertani) (g/l): cao nấm men 5g, peptone 10g, NaCl 10g, agar 20g, pH = 7.5
− Môi trường Gause I (g/l): tinh bột tan 20g, K2HPO4 0.5g, MgSO4.7H2O 0.5g, NaCl 0.5g, KNO3 1g, FeSO4 0.01g, agar 20g, pH 7 – 7.2
− Môi trường Gause II (g/l): nước chiết thịt 30ml, pepton 5g, NaCl 5g, glucose 10g, agar 20g, pH 7 – 7.2
− Môi trường ISP1 (g/l): tryptone 5g, cao nấm men 3g, agar 20g, pH = 7.0 – 7.2
− Môi trường ISP2 (g/l): cao nấm men 4g, dịch chiết malt 10g, glucose 4g, agar 20g, pH = 7.3
− Môi trường ISP3 (g/l): bột yến mạch 20g, agar 20g, dung dịch muối vi lượng 1.0 ml, pH = 7.2
− Môi trường ISP4 (g/l): tinh bột 10g, K2HPO4 1g, MgSO4.7H2O 1g, NaCl 1g, (NH4 )2SO4 2g, CaCO3 2g, dung dịch muối vi lượng 1.0 ml, agar 20, pH = 7.0 – 7.4
− Môi trường ISP5 (g/l): L - asparagin 1g, glyxerin 10g, K2HPO4 1g, dung dịch muối vi lượng 1.0 ml, agar 20g, pH = 7.0 – 7.4
− Môi trường ISP6 (g/l): peptone 10g, cao nấm men 1g, xitrat sắt 0.5g, agar 20g, pH = 7.0 – 7.2
− Môi trường ISP7 (g/l): glycerin 15g, L - tyrosin 0.5g, L - asparagin 1g, K2HPO4
0.5g, MgSO4.7H2O 0.5g, NaCl 0.5g, FeSO4.7H2O 0.01g, dung dịch muối vi lượng 1.0 ml, agar 20g, pH = 7.2 – 7.4
− Môi trường ISP9 (g/l): (NH4)2SO4 2.64g, KH2PO4 2.38g, K2HPO4.3H2O 5.65g, MgSO4.7H2O 1g, dung dịch B 1.0 ml, agar 20g, pH = 7,0
− Dung dịch muối vi lượng: FeSO4.7H2O 0.01g, MnCl2.4H2O 0.1g, ZnSO4.7H2O 0.1g, nước cất 100ml
− Dung dịch muối B (%): CuSO4.5H2O 0.64g, FeSO4.7H2O 0.11g, MnCl2.4H2O 0.79g, ZnSO4.7H2O 0.15g, nước cất 100ml
− Nguồn carbon: D-glucose, maltose, D-sorbito, L-rhamnose, D-galactose, L- arabinose, dextrin, D-xylose và D-fructose
Nội dung nghiên cứu
▪ Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng khuẩn từ các mẫu đất khác nhau
▪ Tuyển chọn 1 – 2 chủng có khả năng đối kháng mạnh, nghiên cứu một số đặc điểm hình thái, sinh lý – sinh hoá của chủng xạ khuẩn đã tuyển chọn
▪ Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng và đối kháng của các chủng xạ khuẩn được tuyển chọn.
Phương pháp nghiên cứu
Phân lập xạ khuẩn được thực hiện theo phương pháp của Dong-sheng Wang và cộng sự (2014) bằng cách bổ sung 1g đất nghiền mịn vào 99 ml nước cất vô trùng Sau khi lắc trên máy lắc với tốc độ 200 vòng/phút trong 30 phút, để lắng, ta thu được nồng độ pha loãng 10^-2 Tiếp theo, sử dụng pipet hút 100 µl từ dịch đất sang ống Eppendorf.
Pha loãng 900 µl nước cất với độ pha loãng 10^{-3}, sau đó tiếp tục pha loãng đến 10^{-4}, 10^{-5} và 10^{-6} Từ mỗi nồng độ pha loãng từ 10^{-3} đến 10^{-6}, lấy 100 µl cho vào đĩa petri chứa môi trường Gause I Sử dụng que trang vô trùng để trải đều trên bề mặt thạch cho đến khi cảm thấy rít, sau đó nuôi ở 30℃ trong 7 ngày.
Từ mỗi mẫu đất phân lập, các khuẩn lạc được hình thành với nhiều đặc điểm khác nhau như rắn chắc, xù xì, và có thể có dạng da, phấn, nhung, hoặc vôi với màu sắc đa dạng trên đĩa thạch Những khuẩn lạc này sau đó được cấy chuyển sang đĩa petri chứa môi trường Gause I để thuần hóa Sau khi thuần, chúng được chuyển sang ống thạch nghiêng với môi trường Gause I và nuôi trong 10 – 14 ngày trước khi được bảo quản trong tủ lạnh (Nguyễn Thành Đạt, 2000).
3.3.2 Khảo sát khả năng kháng khuẩn của các chủng xạ khuẩn
Phương pháp khếch tán đĩa thạch
Chủng vi khuẩn được kiểm định từ ống thí nghiệm chứa chủng gốc cấy trên môi trường LB đặc Một khuẩn lạc được chuyển sang 5 ml môi trường LB lỏng và nuôi lắc ở 200 vòng/phút tại nhiệt độ 30℃ trong 1 ngày Các chủng xạ khuẩn cũng được lấy từ một khuẩn lạc và cấy chuyển sang 5 ml môi trường Gause I lỏng để nuôi lắc.
200 vòng/phút ở 30℃ trong 7 ngày Cấy trang vi khuẩn kiểm định trên môi trường
LB đã phát triển dụng cụ đục đĩa thạch để tạo ra các giếng trên đĩa Sau đó, pipet nhỏ 100 µl được sử dụng để dịch nuôi cấy xạ khuẩn vào các giếng đã đục và được ủ ở điều kiện 30℃ trong khoảng thời gian từ 6 đến 12 giờ (Mounyr Balouiri et al., 2015).
Hoạt tính ức chế khuẩn được xác định thông qua việc đo đường kính vòng ức chế vi sinh vật, được tính bằng công thức: ĐK (mm) = D - d, trong đó D là đường kính vòng vô khuẩn và d là đường kính lỗ thạch.
Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu
Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) là nồng độ thấp nhất có thể ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh Để xác định giá trị MIC, dịch nuôi cấy xạ khuẩn sau 7 ngày cần được ly tâm ở tốc độ 8.000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ 4℃ Sau đó, dịch trong sau khi ly tâm sẽ được pha loãng nối tiếp hai lần với tỷ lệ 1:100.
Vi khuẩn gây bệnh được cấy trên môi trường LB với các nồng độ 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.562 và 0.781 àl Sử dụng dụng cụ đục lỗ thạch để tạo các giếng thạch trên môi trường đã cấy vi khuẩn Dịch ly tâm với các nồng độ khác nhau được nhỏ vào các giếng này Các đĩa được ủ ở nhiệt độ 30℃ và kết quả được quan sát sau 6 – 12 giờ (Dhanasekaran et al., 2012).
3.3.3 Khảo sát khả năng kháng nấm của các chủng xạ khuẩn
Khả năng đối kháng của các chủng xạ khuẩn với nấm bệnh được thực hiện bằng cách đồng nuôi cấy theo mô tả của Dhanasekaran và cs (2012)
Lấy một vòng que cấy chủng xạ khuẩn cần xác định hoạt tính cấy trên môi trường PDA, cách mép đĩa khoảng 1,2 – 1,5 cm Nuôi ở điều kiện 30℃ trong vòng
Lấy một vòng que cấy nấm kiểm định hoặc miếng thạch nuôi nấm có đường kính khoảng 5 mm và cấy ở vị trí đối diện với khuẩn lạc xạ khuẩn, cách mép đĩa khoảng 1,2 – 1,5 cm Đồng thời, cấy một lượng nấm tương tự ở trung tâm của đĩa đối chứng chứa môi trường PDA.
Nuôi ở điều kiện 30℃ trong khoảng 7 ngày, phần trăm ức chế (PI) được tính theo công thức: PI = \(\frac{(C - T)}{C} \times 100\), trong đó C là bán kính của nấm bệnh (mm) ở đĩa đối chứng và T là bán kính của nấm bệnh (mm) tại phần tiếp giáp với xạ khuẩn.
Các chủng xạ khuẩn được cấy trong ống thạch nghiêng với môi trường Gause I ở nhiệt độ 30℃ trong 10 – 14 ngày Sau khi xạ khuẩn phát triển tốt, các ống giống được bảo quản ở 4 - 6℃ và cần được cấy chuyển lại sau 2 – 3 tháng (Nguyễn Thành Đạt, 2000) Để bảo quản giống, chúng được lưu giữ trong parafin lỏng vô trùng, giữ lạnh sâu trong glycerin hoặc đông khô, có thể bảo quản từ 6 tháng đến 2 năm.
3.3.5 Khảo sát đặc điểm sinh học và phân loại xạ khuẩn
Màu sắc của hệ sợi khí sinh được phân loại dựa trên bảng màu của Tresner và Backus (1963), chia thành 8 nhóm màu: nhóm xám (gray - GY), nhóm đỏ (red - R), nhóm vàng (yellow - Y), nhóm xanh da trời (blue - B), nhóm xanh lá cây (green - GN), nhóm tím (violet - V), nhóm trắng (white - W), và nhóm không xác định (X).
Màu sắc khuẩn ty khí sinh, khuẩn ty cơ chất
Xạ khuẩn được nuôi cấy trong các môi trường Gause I, Gause II, ISP1 đến ISP7 ở nhiệt độ 30℃ Sau 7, 14 và 21 ngày, màu sắc của KTKS, KTCC và sắc tố tiết ra môi trường được quan sát theo phương pháp của Shirling và Gottlieb (1966).
Sự hình thành sắc tố melanin
Xạ khuẩn được nuôi cấy trong môi trường ISP6 ở nhiệt độ 30℃ Sau 24 giờ đến ngày thứ 21, màu sắc của môi trường sẽ được quan sát Nếu xạ khuẩn sinh melanin, màu của môi trường sẽ chuyển từ vàng sang nâu đậm và cuối cùng là màu đen (Shirling và Gottlieb).
Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường Gause I với lamen nghiêng 45° trên bề mặt môi trường, mỗi đĩa chứa 5 – 7 lamen và được ủ trong tủ ấm ở 30℃ Sau 24 giờ, một lamen được đặt trên lam kính để quan sát hệ sợi khí sinh của xạ khuẩn bằng kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần Nếu chủng xạ khuẩn chưa sinh bào tử, quá trình nuôi cấy sẽ tiếp tục trong tủ ấm và quan sát sẽ được thực hiện sau mỗi 12 giờ (Nanjwade Basavaraj et al., 2010).
