Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh enzyme chitinase.. Khả năng sinh enzyme chitinase của các chủng vi khuẩn MT4 và MT5 phâ
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu
Các chủng vi khuẩn được phân lập từ nguồn nước thải của xưởng sản xuất chế biến thủy hải sản tại Xã Ngư Lộc-Huyện Hậu Lộc- Thanh Hóa
- Hóa chất nhuộm Gram: dung dịch tím gentian, thuốc nhuộm lugol, thuốc nhuộm fushin, thuốc nhuộm xanh methylen, nước cất vô trùng
- Nguồn carbon: D-glucose, fructose, α-lactose, saccarose, manltose, tinh bột
- Nguồn nitơ: Cao nấm men, peptone, KNO3, NH4NO3, NH4Cl, (NH4)2HPO4, (NH4)2SO4, NH4H2PO4
- Nguồn muối vô cơ: NaCl
- MT khoáng cơ bản (Thử nguồn Carbon): (NH4)2SO4 2 g; MgSO4.7H20 0,2g; NaH2PO4.H2O 0,5 g; CaCl2.H2O 0,1 g; KH2PO4 0,5 g; nước cất 1 lít
- MT khoáng cơ bản (Thử nguồn Nitơ): KH2PO4 1,36 g; CaCl2 0,03 g;
Na2HPO4 2,13 g; MgSO4.7H2O 0,2 g; FeSO4.7H2O 0,01 g; glucose 10 g, nước cất 1000ml
- Đĩa peptri, ống nghiệm, bình tam giác các kích cỡ khác nhau,ống đong, pipetman các loại, lam kính, lam men,…
- Cân phân tích ddienj tử
Phương pháp nghiên cứu
3.2.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn từ mẫu nước
Các chủng vi khuẩn được phâ lập dựa trên phương pháp của Hussein và cộng sự 2017
- Dùng pipet hút 1 ml mẫu cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước cất ta thu được nồng độ pha loãng là 10 -1
- Tiếp tục từ ống nghiệm 10 -1 hút tiếp 1 ml và cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng ta được độ pha loãng là 10 -2
- Tiếp tục như vậy cho đến nồng độ cần thiết
3.2.2 Phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch
Phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch theo Dhanasekaran và cộng sự,
Nuôi vi khuẩn lỏng lắc ở tốc độ 180 vòng/phút và nhiệt độ 30 °C trong 2 ngày, sau đó thu được dịch nuôi cấy Tiến hành ly tâm dịch nuôi cấy ở tốc độ 10.000 vòng/phút trong 10 phút để loại bỏ sinh khối, từ đó thu được enzyme thô.
- Dùng pipet vô trùng (d=7 mm) đục các lỗ thạch trên MT thử hoạt tính enzyme Chitinase
- Nhỏ 100 àl dịch enzyme thụ vào cỏc lỗ trờn vào mụi trường Sau đú để lạnh 4 o C trong 4-6 giờ, rồi chuyển sang tủ ấm 30 o C ủ từ 2 đến 3 ngày
Nhỏ thuốc thử lugol lên bề mặt thạch để đo đường kính vòng phân giải Hoạt tính enzyme chitinase được xác định bằng công thức: VH(mm) = D - d, trong đó D là đường kính vòng phân giải.
+ d: đường kính lỗ thạch(d=7mm) Quy ước: D-d > 25mm: hoạt tính enzyme mạnh
D-d ≥ 20mm: hoạt tính enzyme khá mạnh D-d ≥ 15mm: hoạt tính enzyme trung bình D-d ≤ 10mm: hoạt tính enzyme yếu
3.2.3 Phương pháp bảo quản chủng giống
Chủng giống vi khuẩn được bảo quản theo phương pháp của Lương Đức Phẩm (2004)
3.3.3.1 Bảo quản trên thạch nghiêng
Các khuẩn lạc sau khi được phân lập và thử nghiệm đối kháng sẽ được cấy truyền vào các ống thạch nghiêng LB và nuôi ở nhiệt độ 30 độ C trong khoảng 24 đến 48 giờ Sau đó, chúng sẽ được bảo quản trong tủ lạnh ở 4 độ C để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.
- Cấy truyền giữ giống trên ống thạch nghiêng 4 tuần một lần
3.3.3.2 Bảo quản trong dung dịch glyxerol 30%
Lấy 1 ml mẫu đã tăng sinh cho vào effendoft 2ml chứa 1ml glyxerol 30% đã tiệt trùng, lắc đều trên máy vortex Mẫu được giữ lạnh ở tủ âm -80 o C
3.2.4.Phương pháp xác định hoạt độ của enzyme chitinase
Hoạt độ enzyme chitinase được xác định bằng phương pháp so màu thuốc thử DNS (3,5-dinitrosalic acid)(Muhamad và cộng sự, 2012)
Phương pháp so màu là kỹ thuật phân tích dựa trên việc so sánh cường độ màu của dung dịch nghiên cứu với dung dịch tiêu chuẩn có nồng độ xác định Phương pháp này chủ yếu được sử dụng để xác định lượng nhỏ các chất, mang lại kết quả chính xác cao và tiết kiệm thời gian so với các phương pháp khác.
3,5-dinitrosaliccylic + đường khử acid 3-amino-5-nitrosalicylate + đường oxi hóa
Khi enzyme chitinase phân hủy chitin huyền phù, sản phẩm tạo thành là N-acetyl-β-D-Dlucosamine Sản phẩm này được xác định bằng thuốc thử DNS (3,5-dinitrosalic acid) và đo mật độ quang phổ ở bước sóng 535nm.
• Dung dịch đệm phosphate 0,2M, pH=6,5
- Dung dịch NaH2PO4 0,2M: cân 31,2g NaH2PO4 hòa tan và thêm nước cất đến 1000ml
- Dung dịch Na2HPO4 0,2M: cân 71,6g Na2HPO4.12H2O hòa tan và thêm nước cất đến 1000ml
❖ Chuẩn bị dịch huyền phù chitin
Do chitin không hòa tan trong nước nên để tiến hành xác định hoạt tính enzyme chitinase cần huyền phu hóa chitin: Lấy 1 gam chitin hòa tan trong
10 ml H3PO4 đậm đặc để ở 4 o C Sau đó, chitin sẽ tạo huyền phhuf màu trắng sữa
Huyền phù sẽ được lọc qua giấy lọc hoặc ly tâm (3500 vòng/phút/7 phút)
❖ Dựng đường chuẩn N-acetyl-β-D-Glucosamine
Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm dựng đường chuẩn Glucosamine Ống nghiệm số 0 1 2 3 4 5 6 7
Thể tích dung dịch N- acetyl-β-D-
Thể tích nước cất (ml) 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3
Lắc đều, đun sôi 5 phút
Lắc đều, để yên 5 phút, đo OD ở bước sóng 535 nm
Chuẩn bị dung dịch N-acetyl-β-D-Glucosamine chuẩn 10àmol/ml: Cõn chính xác 0,0221g N-acetyl-β-D-Glucosamine, cho nước cất vào đủ 10ml
Dựng đường chuẩn biểu diễn sự tương quan giữ nồng độ N-acetyl-β-D-Glucosamine và giá trị OD
❖ Xác định hoạt độ enzyme chitinase
Hoạt độ enzyme chitinase được xác định thông qua việc định lượng glucosamine trong quá trình phân giải chitin Số lượng glucosamine tạo ra được đo lường bằng phương pháp Elson-Morgan.
• Đối với enzyme làm thí nghiệm
- Chọn các ống nghiệm có cùng kích cỡ, cùng độ dày
- Cho vào các ống nghiệm hỗn hợp phản ứng gồm: 1ml huyền phù chitin 1% và 1 ml dịch enzyme chitinase Hỗn hợp này được ủ ở 37 O trong 60 phút
- Ngừng phản ứng bằng 1ml NaOH 1N và đun sôi cách thủy trong 5 phút
- Ly tâm 4000 vòng/phút trong 5 phút hoặc lọc, thu dịch nổi
- Cho 1 ml dịch nổi và 1 ml DNS 1%, lắc đều, đun sôi cách thủy trong 5 phút, làm lạnh nhanh trong bồn làm lạnh
- Thêm 5 ml nước cất, lắc đều và đo OD với bước sống 535nm
• Đối với enzyme làm đối chứng
Cho 1ml dịch enzyme vào ống nghiệm, sau đó thêm 1ml NaOH 1N và 1ml dịch huyền phù chitin 1% Tiếp tục thực hiện các bước tương tự như đã mô tả.
Một đơn vị hoạt tính enzyme chitinase (đvht) được định nghĩa là lượng enzyme cần thiết để giải phóng 1 µg N-acetyl-β-D-Glucosamine (NAG) từ chitin huyền phù trong 1 phút ở nhiệt độ 40 °C.
Hoạt tính chung (đvht/g.CP.E) = (a.n.v’)/v.t.m
Trong đó: a: hàm lượng glucosamine (àg/ml) trong dịch thớ nghiệm đó pha loóng n: hệ số pha loãng
V: thể tích môi trường nuôi cấy (ml) v: thể tích enzyme thí nghiệm (ml) t: thời gian phản ứng (phút) m: khối lượng enzyme (g)
3.2.5 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá của các chủng vi khuẩn được nghiên cứu theo phương pháp của Nguyễn Lân Dũng (2011)
3.3.5.1 Nhuộm gram quan sát hình thái vi khuẩn
Nguyên lý nhuộm Gram dựa trên sự khác biệt trong cấu trúc vách tế bào của vi khuẩn Vi khuẩn Gram dương giữ được màu của phức hợp tím gentian và không bị tẩy màu bởi ancol, trong khi vi khuẩn Gram âm không giữ được phức hợp này.
Bước 1: Làm vết bôi và cố định tiêu bản
Cho một giọt nước cất lên lam kính và phân bố sinh khối vi khuẩn đều trong giọt nước Sử dụng tăm vô trùng để dàn đều vết bôi Sau đó, hơ mặt dưới của lam kính trên ngọn lửa đèn cồn, chú ý không để quá nóng.
- Nhuộm tiêu bản bằng dung dịch tím getian trong 1 phút, rửa nước
Nhuộm mẫu bằng dung dịch Lugol trong 1 phút, sau đó rửa sạch bằng nước Tiếp theo, rửa bằng cồn trong khoảng 10 giây, nhỏ từ từ giọt cồn cho đến khi màu sắc hoàn toàn biến mất, rồi rửa lại bằng nước.
- Nhuộm bổ sung bằng dung dịch fushin trong khoảng 30 giây, rửa nước
- Đợi đến khi tiêu bản khô, nhỏ 2-3 giọt nước cất lên láng qua hết tiêu bản sau đó đặt nhẹ lamen lên, tránh tạo bọt khí
- Quan sát tiêu bản ở vật kính dầu 100x
- Nếu là vi khuẩn Gram dương sẽ bắt màu tím của getian Nếu là vi khuẩn Gram âm sẽ bắt màu hồng của thuốc nhuộm fucshin
3.2.5.2 Xác định khả năng di động
➢ Nguyên tắc: Dựa vào sự quan sát khả năng tăng trưởng và di động của vi sinh vật trong môi trường thạch
➢ Tiến hành: Dùng que cấy thẳng thu lấy sinh khối từ khuẩn lạc thuần cấy đâm sâu xuyên vào môi trường thạch mềm 0,5% trong ống nghiệm Ủ ở
Kết quả cho thấy vi sinh vật phát triển lan tỏa ra khỏi đường cấy, làm đục môi trường xung quanh, được coi là dương tính Ngược lại, nếu sinh vật chỉ phát triển quanh đường cấy mà môi trường xung quanh vẫn trong, thì được xem là âm tính.
➢ Mục đích: Kiểm tra khả năng phân hủy H2O2 tạo ra O2 của vi sinh vật nhờ sản sinh ra enzyme catalase
Nhỏ vài giọt H2O2 3% trực tiếp lên bề mặt khuẩn lạc vi khuẩn và quan sát sự xuất hiện bọt khí Sự xuất hiện bọt khí cho thấy kết quả dương tính, trong khi không có bọt khí là kết quả âm tính.
3.2.6 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố đến sự sinh trưởng của vi khuẩn
Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố đến sự sinh trưởng của vi khuẩn theo Nguyễn Lân Dũng (2011)
Thí nghiệm được lặp lại 3 lần
3.2.6.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ
- Cấy vi khuẩn vào môi trường thạch LB đặt ở điều kiện nhiệt độ khác nhau Các chủng vi khuẩn được kiểm tra với thang nhiệt độ 30 o C, 37 o C, 50 o C
- Quan sát khả năng sinh trưởng của vi khuẩn sau 3 ngày nuôi cấy
3.2.6.2 Khả năng đồng hóa các nguồn Carbon
Bổ sung carbon vào môi trường khoáng cơ bản với nồng độ 0,5% và khử trùng ở 121 °C trong 2 giờ Sau đó, cấy vi khuẩn lên môi trường đĩa thạch đã được bổ sung nguồn carbon.
- Theo dõi sự phát triển để đánh giá khả năng đồng hóa nguồn carbon sau
3.2.6.3 Khả năng đồng hóa các nguồn Nitơ
