Phân tích đa dạng di truyền của một số mẫu giống hoàng tinh hoa trắng (disporopsis longifolia craib) bằng chỉ thị rapd

Sơ đồ quan hệ di truyền của 21 mẫu Hoàng tinh hoa trắng được phân tích bằng chỉ thị RAPD .... TÓM T ẮT Phân tích đa dạng di truyền của 21 mẫu giống Hoàng tinh hoa trắng Disporopsis longi

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS Đinh Trường Sơn

L ỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan khóa luận tốt nghiệp đại học: “Phân tích đa dạng di

truyền của một số mẫu giống hoàng tinh hoa trắng (Disporopsis longifolia

Trường Sơn không trùng với bất kỳ khóa luận nào khác Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là hoàn toàn trung thực, khách quan, theo sự nhận thức vấn đề

của riêng tác giả Nếu có gì sai sót tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm

Trong quá trình nghiên cứu và thực hiện khóa luận, tôi đã kế thừa những thành tựu của các nhà khoa học với sự trân trọng và biết ơn

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện khóa luận đã được cảm ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn

L ỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Đinh Trường Sơn đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài, cũng như trong suốt thời gian hoàn chỉnh khóa luận tốt nghiệp

Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô bộ môn Công nghệ sinh học Thực vật

đã tạo điều kiện tốt nhất giúp tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Tôi xin cảm ơn quý thầy cô giáo, gia đình, bạn bè đã luôn khích lệ tinh

thần và giúp đỡ tôi để tôi có được điều kiện tốt nhất trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp

Do thời gian và kiến thức có hạn nên khóa luận không tránh khỏi những hạn chế và thiếu sót nhất định Tôi xin cảm ơn và tiếp thu những ý kiến, đóng góp của các thầy giáo, cô giáo và các bạn sinh viên

Hà Nội, tháng 8 năm 2021

Sinh viên

M ỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT v

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH ẢNH vii

TÓM TẮT viii

PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.1.1 Mục đích nghiên cứu 2

1.1.2 Yêu cầu đề tài 2

PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu chung về cây Hoàng tinh hoa trắng 3

2.1.1 Nguồn gốc và phân loại 3

2.1.2 Đặc điểm hình thái và phân bố 3

2.1.3 Thành phần hóa học 5

2.1.4 Công dụng 5

2.2 Tình hình nghiên cứu về giống cây Hoàng tinh hoa trắng 5

2.2.1 Tình hình nghiên cứu về giống cây Hoàng tinh hoa trắng trong nước 5

2.2.2 Tình hình nghiên cứu về giống trắng trên thế Hoàng tinh hoa giới 6

2.3 Chỉ thị phân tử và ứng dụng của chỉ thị RAPD trong phân tích đa dạng di truyền 6

2.3.1 Khái niệm chỉ thị phân tử 6

2.3.2 Chỉ thị phân tử RADP 9

PHẦN 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11

3.1 Đối tượng nghiên cứu 11

3.2 Hóa chất 12

3.3.1 Dụng cụ 12

3.3.2 Hóa chất 13

3.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 15

3.3.1 Nội dung nghiêng cứu 15

3.3.2 Phương pháp nghiên cứu 15

PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 19

4.1 Tách chiết DNA tổng số 19

4.2 Kết quả phân tích đa dạng di truyền với chỉ thị RAPD 21

PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 28

5.1 Kết luận 28

5.2 Kiến nghị 28

TÀI LIỆU THAM KHẢO 29

DANH M ỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

T ừ viết tắt Diễn giải chữ viết tắt

CTAB : Cetyl trimethylammonium bromide DNA : Deoxyribonucleic Acid

dNTPs : Deoxynucleotide Solution Mix

EDTA : Etylen Diamine Tetra Acetic acid ISSR : Inter-Simple Sequence Repeats

RAPD : Random Amplified Phlymorphic DNA PCR : Polymerase chain reactin

TAE : Tris base, acetic acid and EDTA

PVPP : Poly Vinyl Poly Pyrrolidone

DANH M ỤC BẢNG

Bảng 3.1 Danh sách mẫu giống Hoàng tinh hoa trắng (Disporopsis

longifolia Craib.) thu thập được tại một số địa phương 11

Bảng 3.2 Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 13

Bảng 3.3 Trình tự nucleotide của mồi cho phản ứng RADP- PCR 14

Bảng 3.4 Thành phân cho mỗi phản ứng PCR 16

Bảng 3.5 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 17

Bảng 4.1: Kết quả đo OD 20

Bảng 4.2 Khả năng nhân bản của 17 mồi RAPD đối với 21 mẫu giống Hoàng tinh hoa trắng 21

Bảng 4.3: Giá trị PIC và Rp của các mồi RAPD nghiên cứu 22

Bảng 4.4: Bảng hệ số tương đồng di truyền của 21 mẫu giống Hoàng tinh hoa trắng trên chỉ thi RAPD 24

DANH M ỤC HÌNH ẢNH

Hình 2.1 Hình ảnh mô tả cây các bộ phân cây Hoàng tinh hoa trắng 4 Hình 4.1 Hình ảnh điện di kết quả DNA tổng số 19 Hình 4.2 Mồi OPB-03 23 Hình 4.3 Sơ đồ quan hệ di truyền của 21 mẫu Hoàng tinh hoa trắng được

phân tích bằng chỉ thị RAPD 26 Hình 4.4 Phân tích thành phần chính (PCA) về mối liên hệ di truyền của 21

mẫu giống hoàng tinh hoa trắng 27

TÓM T ẮT

Phân tích đa dạng di truyền của 21 mẫu giống Hoàng tinh hoa trắng

(Disporopsis longifolia Craib) bằng chỉ thị phân tử RAPD Tách chiết DNA tổng

số các mẫu có độ tinh sạch DNA cao và nồng độ của DNA cao Sau khi khảo sát

35 mồi RAPD, chỉ 17 mồi RAPD là được chọn do có sản phẩm PCR rõ ràng

Kết quả phát hiện được 2310 băng, tỷ lệ băng đa hình trên mỗi mồi thay đổi từ 40% - 100% Chỉ số đa hình PIC của 17 mồi RAPD dao động từ 0,11 - 0,33 Chỉ

số trung bình Rp của 17 mồi RAPD là 13,92 (dao động từ 7,9 – 25,71)

Hệ số tương đồng di truyền của mỗi cặp mẫu giữa 21 giống Hoàng tinh hoa trắng dao động từ 0,623 đến 0,895 Ở hệ số tương đồng di truyền 0,759 các

giống Hoàng tinh hoa trắng được chia thành 3 nhóm chính trên sơ đồ quan hệ

di truyền

PH ẦN 1: MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Hiện nay nhu cầu sử dụng các loại dược liệu làm thuốc ngày càng tăng Tuy nhiên, do khai thác liên tục không chú ý tới bảo vệ và tái sinh đã làm cho nguồn dược liệu ngày càng quý hiếm trong đó có loài cây Hoàng tinh hoa trắng Hoàng tinh nói chung và Hoàng tinh hoa trắng (Disporopsis longifolia Craib)

nói riêng là một trong những loại dược liệu quý được biết đến là một vị thuốc

với nhiều tác dung bổ âm ích khí, nhuận phế kiện tỳ, cường kiện gân cốt nên được đông y sử dụng nhiều trong các bài thuốc chữa ho ra máu, tiểu đường, ăn uống không ngon…Củ Hoàng tinh chính là vị thuốc được ghi đầu tiên trong Danh y biệt lục với nhiều công năng và tác dụng chữa bệnh rất hay và hữu ích

Hoàng tinh có phân bố tự nhiên tại Hà Giang, Lào Cai, Lai Châu, Hòa Bình… chủ yếu là các tỉnh miền núi bắc bộ của nước ta Vì là loại dược liệu có tác dụng lớn thêm vào đó là việc khai thác trộm lâm sản ở nước ta đang diễn ra

rất nhiều dẫn tới việc một lượng lớn cây hoàng tinh bị khai thác Hiện nay số lượng cây Hoàng tinh hoa trắng còn lại rất ít và đang trong tình trạng cạn kiệt và

đã được đưa vào sách đỏ Việt Nam với mục đích bảo tồn cao Hiện chỉ còn ở khu bảo tồn thiên nhiên Tát Kẻ - Bản Bung (Nà Hang - Tuyên Quang) và Vườn Quốc gia Ba Bể thỉnh thoảng gặp cây lớn Nạn phá rừng làm nương rẫy cũng

trực tiếp làm thu hẹp vùng phân bố (Văn Bàn và Mường Khương - Lào Cai; Tràng Định - Lạng Sơn) Loài đang được ghi trong Sách Đỏ Việt Nam (1996) với cấp đánh giá “sẽ nguy cấp” (Bậc V) và Danh mục Thực vật rừng, Động vật rừng nguy cấp, quý hiếm (nhóm 2) của Nghị định số 32/2006/NĐ - CP ngày 30/3/2006 của Chính phủ để hạn chế khai thác, sử dụng vì mục đích thương mại

Bảo vệ các quần thể hiện có trong các Vườn quốc gia (Ba Vì, Tam Đảo, Ba Bể, Cúc Phương)

Hoàng tinh hoa trắng là loài có nhiều dòng giống khác nhau trong tự nhiên, việc đem vào sản xuất cần phải nghiên cứu để có thể thấy được hoạt tính

của các giống được trồng ở các khu vực khác nhau mới có thể có biện pháp nuôi nhân giống và bảo vệ nguồn gen phù hợp Vì vậy việc phân tích đa dạng di truyền của các dòng giống Hoàng tinh hoa trắng và tìm hiểu về trình tự gen là rất

1.1.2 Yêu c ầu đề tài

- Sử dụng quy trình tách chiết để DNA thu được đảm bảo độ tinh sạch, băng vạch sắc nét, rõ ràng

- Xác định được quan hệ di truyền và sự có mặt của các mẫu Hoàng tinh hoa trắng bằng phân tích chỉ thị RAPD

PH ẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Gi ới thiệu chung về cây Hoàng tinh hoa trắng

2.1.1 Ngu ồn gốc và phân loại

Nguồn gốc: Hiện nay vẫn chưa xác định cụ thể được trung tâm phát sinh của Hoàng tinh hoa trắng Hoàng tinh hoa trắng phân bố chủ yếu ở vùng Vân Nam, Quảng Tây Trung Quốc, vùng núi cao ở Việt Nam, Lào, Thái Lan

Hoàng tinh hoa trắng có tên khoa học là Disporopsis longifolia Craib

Bộ (ordo) Asparagales ( măng tây)

Họ (familia) Asparagaceae / Convallariaceae (Thiên

môn) Chi (genus) Disporopsis

Loài (species) D longifolia

2.1.2 Đặc điểm hình thái và phân bố

Hoàng tinh hoa trắng có tên khoa học là Disporopsis longifolia Craib,

thuộc họ Thiên môn Asparagaceae, là cây thân thảo, sống lâu năm, có thân rễ thành chuỗi Thân rễ nạc, gồm nhiều cục gắn với nhau thành chuỗi, phân nhánh, nằm ngang; đường kính 2 - 3 cm Thân mang lá nhẵn, lúc non có đốm tím hồng, sau xanh trắng, đường kính 0,3 - 0,6 cm Lá mọc so le, cuống ngắn; phiến lá thuôn hay mác dài, nhọn 2 đầu, 10 - 20 x 2,5 - 3,5 cm, 5 gân chính hình cung

Cụm hoa gồm 5 - 7 cái, mọc ở kẽ lá, có cuống dài 0,6 - 1cm Hoa màu trắng, bao hoa hình chén, đầu chia 6 thuỳ tam giác Nhị 6 thùy đính ở miệng ống; chỉ nhị dẹp, có tai ở đầu Quả thịt; hình cầu, đường kính 0,4 - 0,5 cm Khi chín từ màu xanh chuyển sang màu trắng Hạt nhỏ

Hình 2.1 Hình ảnh mô tả cây các bộ phân cây Hoàng tinh hoa trắng

Hoàng tinh hoa trắng là loài cây dạng thân thảo sống lâu năm, ưa ẩm và

ưa bóng, có chiều cao từ 0,5 đến 1,0 m hoặc hơn Thân rễ (củ) mập gồm nhiều đốt nối với nhau, có sẹo lõm ở đầu Thân khí sinh mọc đứng không phân nhánh,

nhẵn, có những đốm tía ở gốc, lá mọc so le, không cuống, tạo thành mặt phẳng trên thân Phiến lá hình bầu dục hai mặt nhẵn, hệ gân hình cung nổi rõ

Sinh h ọc và sinh thái:

Mùa hoa tháng 3 - 5, quả tháng 5 - 9 Nhân giống tự nhiên bằng hạt Cây con thường thấy xung quanh gốc cây mẹ Phần thân mang lá lụi hàng năm vào mùa đông, chồi mới mọc từ thân rễ vào đầu mùa xuân Thân rễ bị gẫy, phần còn lại vẫn có thể tái sinh Cây đặc biệt ưa ẩm và ưa bóng Thường mọc thành khóm trên đất ẩm nhiều mùn hay trên các hốc đá, dưới tán rừng kín thường xanh ẩm - đặc biệt là ở rừng núi đá vôi, ở độ cao khoảng 400 - 1500 m

(Ba Vì), Hoà Bình (Mai Châu), Ninh Bình (Cúc Phương)

Trên thế giới cây phân bố chủ yếu ở Nam Trung Quốc, Việt Nam, Lào và Thái Lan

Hoàng tinh hoa trắng có thân rễ chứa tinh bột, chất nhầy và đường Hiện nay đang nghiên cứu và tìm hiểu chính xác các hoạt tính có trong cây

2.1.4 Công d ụng

Trị chứng huyết áp thấp: Dùng Hoàng tinh 30g, Đảng sâm 30g, Chích

thảo 10g, sắc nước uống, ngày 1 thang

Trị chứng lipid huyết cao: Dùng viên hạ mỡ (Hoàng tinh, Hà thủ ô, Tang

ký sinh) uống liên tục trong 2 tháng

Trị nấm chân tay: Dùng Hoàng tinh 100g xắt nhỏ cho vào lọ thêm cồn 75% 250ml, bịt kín ngâm trong 15 ngày, lọc qua gạc 4 lớp, vắt hết nước bỏ xác, thêm dấm thường 150ml trộn đều

Trị suy nhược cơ thể sau khi mắc bệnh: Thường phối hợp với Kỷ tử, Sinh địa, Hoàng kỳ, Đảng sâm dùng bài: Hoàng tinh thang: Hoàng tinh 24g, Kỷ tử 12g, Sinh địa 20g, Hoàng kỳ 12g, Đảng sâm 12g, sắc nước uống

Trị chứng phế hư táo, ho ra máu: + Hoàng tinh 20g, Bắc Sa sâm 8g, Ý dĩ nhân 12g, sắc nước uống + Hoàng tinh 1 cân, Bạch cập, Bách bộ mỗi thứ 1/2 cân, thái sấy hoặc phơi khô, tán bột mịn, luyện mật làm hoàn, mỗi lần uống 8g, ngày 3 lần

Trị tiểu đường: Hoàng tinh 40g, sắc nước uống hoặc phối hợp với Câu kỷ

tử, lượng bằng nhau, tán bột mịn, làm thành bánh hoặc luyện mật làm hoàn, mỗi

lần uống 12g ngày 2 lần

Trị huyết áp cao, váng đầu, lưng gối mõi, ù tai, hoa mắt, tiểu đường

2.2 Tình hình nghiên c ứu về giống cây Hoàng tinh hoa trắng

2.2.1 Tình hình nghiên c ứu về giống cây Hoàng tinh hoa trắng trong nước

cứu trong việc nhân bản giống cây nhằm bảo tồn và phát triển cây Trong đó

việc nghiên cứu về chỉ thị phân tử của cây Hoàng tinh hoa trắng chưa được công

bố nghiên cứu trong nước ta Một số nghiên cứu về Hoàng tinh hoa trắng là nghiên cứu về việc nhân giống cây Hoàng tinh hoa trắng nhằm bào tồn nguồn gen loại cây có trong sách đỏ Việt Nam này Việc nuôi cấy mô được nghiên cứu khá phổ biến, đó là một bước tiếp cận lớn đến việc nghiên cứu và bảo tồn loại cây này

2.2.2 Tình hình nghiên c ứu về giống trắng trên thế Hoàng tinh hoa giới

Trong suốt quá trình tìm hiểu và nghiên cứu về giống Hoàng tinh hoa

trắng tôi đã tìm hiểu và tham khảo nhiều tài liệu nước ngoài để góp phần xây

dựng đề tài hoàn thiện hơn nhưng chưa có đề tài nào nghiên cứu về giống cây Hoàng tinh hoa trắng

2.3 Ch ỉ thị phân tử và ứng dụng của chỉ thị RAPD trong phân tích đa dạng di truy ền

mà không bị ảnh hưởng bởi điều kiện môi trường

 Một số đặc điểm của chỉ thị phân tử DNA

- Chỉ thị ADN rất phong phú, đa dạng và có tính ổn định cao

- Chỉ thị ADN có thể sử dụng để nghiên cứu ở các mô khác nhau ở bất kỳ giai đoạn phát triển nào của cá thể

- Chỉ thị có một bản copy: chỉ có ở vùng có trình tự duy nhất

- Chỉ thị có nhiều copy: là chỉ thị có trình tự được lặp lại trong gennome và

vì vậy có nhiều vị trí trong genome

- Chỉ thị DNA có thể là đồng trội hoặc trội/lặn

 Một số chỉ thị phân tử khác dựa trên kỹ thuật PCR

• Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism – Đa hình chiều dài các đoạn được nhận bản chọn lọc)

- Phân tích AFLP được kết hợp cả RFLP và PCR bằng việc gắn các chuỗi nhận biết (chuỗi tiếp hợp/ adapter) vào mồi để tiếp nhận chọn lọc các đoạn DNA được cắt hạn chế

- Kỹ thuật này có độ nhạy cao, dễ phát hiện đa hình trong toàn bộ hệ gen

- Cho phép phân tích nhanh, ổn định, đáng tin cậy, có khả năng ứng dụng trong lập bản đồ hệ gen (Thomas và cs 1995) và chọn giống (Vos và cs 1995)

- Nhược điểm là kĩ thuật chỉ thị di truyền trội do đó không có khả năng phân biệt được các cá thể đồng tử hợp và cá thể dị hợp tử

- Kỹ thuật phức tạp, đòi hỏi phải có các phương pháp xử lý số liệu tự động trong quá trình phân tích, giá thành tương đối cao

• Chỉ thị ISSR (Inter Simple Sequence Repeat - ISSR):

- ISSR là những chỉ thị được nhân bản bằng PCR một mồi bổ trợ với tiểu

vệ tinh (microsatellite) đích

- ISSR - PCR là kỹ thuật đánh giá kiểu gen nhanh, không đắt, sự đa hình

dựa trên sự thay đổi trong các vùng nằm giữa các tiểu vệ tinh

- Kỹ thuật này không cần thông tin về trình tự, tạo được nhiều locus, có tính

đa hình cao và tạo ra chỉ thị trội

- Kỹ thuật ISSR là kỹ thuật nhân bản đoạn DNA nằm giữa hai vùng lặp lại

giống hệt và ngược chiều nhau

- Kỹ thuật này sử dụng các tiểu vệ tinh như các mồi trong phản ứng PCR với một mồi cho nhiều locus đích để nhân bản chủ yếu các chuỗi lặp lại đơn

- Kỹ thuật ISSR sử dụng mồi dài (15 đến 30 nucleotide) vì vậy nhiệt độ bắt

mồi cao dẫn đến độ ổn định cao của phản ứng Sản phẩm có độ dài 200-2000 bp nên có thể phân tách trên cả gel agarose và polyacrylamide

- Kỹ thuật ISSR được sử dụng rất rộng rãi trong nghiên cứu đa dạng di truyền, nghiên cứu đặc điểm di truyền trong quần thể, lấy dấu di truyền, đánh

dấu gen, xác định cây trồng, phân tích nguồn gốc, xác định sự thay đổi genome

và đánh giá con lai

• Chỉ thị SSR (Microsatelite Simple Sequence Repeat - SSR):

- Trong cơ thể thực vật, hiện tượng lặp lại của một trật tự nucleotide đơn

giản và khá phổ biến Tuy nhiên, tùy thuộc và từng loài mà số lượng nucleotide trong mỗi đơn vị lặp lại có thể ít hay nhiều

- Phương thức lặp lại phong phú được chia làm 3 kiểu lặp lại : lặp lại hoàn toàn, lặp lại không hoàn toàn và lặp lại phức tạp

- Chuỗi lặp lại đơn giản(SSR) là sự lặp lại các chuối ngắn từ 2-6 nucleotide

- SSR trở thành kỹ thuật chỉ thị phân tử quan trọng trong cả động vật và thực vật

- SSR rất đa hình do đột biến tác động lên số đơn vị lặp lại

- Sự thay đổi hay sự đa hình của SSR là kết quả của sự khác nhau về độ dài các đoạn lặp lại trong genome do quá trình trao đổi chéo không cân hoặc do sự giảm nucleotide trong quá trình sao chép

- SSR không những phổ biến mà còn biến động mạnh về số lượng kiểu lặp

lại trong genome sinh vật nhân thực

- Sự khác nhau allele của SSR là kết quả của sự thay đổi số lượng đơn vị

lặp lại trong cấu trúc tiểu vệ tinh Các chuỗi lặp lại thường đơn giản và cấu tạo bởi 2, 3 hoặc 4 nucleotide

- Kỹ thuật SSR được thực hiện bằng phản ứng PCR với mồi SSR xuôi và ngược Sản phẩm PCR được phân tách trên gel polyacrylamide kết hợp nhuộm

- Việc phát triển chỉ thị SSR được tiến hành theo một số bước như: xây

dựng thư viện SSR, xác định locus SSR, xác định vùng phù hợp để thiết kế mồi, PCR với các 11 mồi được thiết kế, đánh giá và phân tích mẫu băng, đánh giá đa hình của sản phẩm PCR

2.3.2 Ch ỉ thị phân tử RADP

Vào đầu thập niên 90 của thế kỷ trước, một kỹ thuật phân tử mới dựa trên nguyên tắc PCR với tên gọi RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) đã

ra đời một cách độc lập tại hai phòng thí nghiệm khác nhau

Cơ sở của kỹ thuật RAPD là sự nhân bản DNA genome bằng phản ứng PCR với các mồi ngẫu nhiên để tạo ra sự đa hình DNA do sự tái sắp xếp hoặc

mất nucleotide ở vị trí bắt mồi Mồi sử dụng cho kỹ thuật RAPD là các mồi ngẫu nhiên, thường là 10 nucleotide và có nhiệt độ kéo dài mồi thấp Mặc dù trình tự mồi RAPD là ngẫu nhiên nhưng phải đạt được hai tiêu chí là: tỷ lệ GC tối thiểu

phải là 40% (thường là 50% - 80%) và không có trình tự bazơ đầu xuôi và ngược giống nhau Kỹ thuật RAPD không cần thông tin về genome của đối tượng nghiên cứu và có thể ứng dụng cho các loài khác nhau với các mồi chung

Kỹ thuật RAPD đã được ứng dụng trong lập bản đồ gen, di truyền quần

thể, di truyền tiến hóa phân tử và nhân giống cây trồng và động vật Điều này do

kỹ thuật RAPD đơn giản và dễ thực hiện Kỹ thuật RAPD thường được sử dụng kết hợp với những kỹ thuật cao cấp khác để đánh giá đa dạng di truyền và nhận diện chỉ thị phân tử có độ tin cậy cao

• Kỹ thuật RAPD đã được sử dụng rộng rãi vì những ưu điểm sau:

- Không yêu cầu thông tin trình tự DNA cho việc thiết kế các đoạn mồi cụ thể

- Kỹ thuật nhanh chóng, đơn giản, hiệu quả và cho đa hình cao

- Chỉ cần một lượng nhỏ DNA (khoảng 10ng mỗi phản ứng) và quy trình có thể được tự động hóa

- Chi phí đơn vị cho mỗi xét nghiệm thấp so với các công nghệ khác

• Những hạn chế của kỹ thuật RAPD:

- Có tính trội, do đó không thể phân biệt được một đoạn DNA được khuếch đại từ một locus dị hợp tử hay đồng hợp tử

- PCR là một phản ứng enzyme, do đó, chất lượng và nồng độ của DNA mẫu, nồng độ của các thành phần PCR và điều kiện chu trình PCR có thể ảnh hưởng lớn đến kết quả Do đó, kỹ thuật RAPD phụ thuộc vào phòng thí nghiệm

- Độ tin cậy tùy thuộc vào kỹ thuật của cá nhân

- Điện di trên gel có thể phân tách DNA một cách định lượng, không thể tách các mảnh có kích thước bằng nhau một cách định tính Do đó độ tin cậy không cao

- Sự phù hợp giữa mồi và mẫu có thể dẫn đến sự không xuất hiện hoặc lượng sản phẩm bị giảm

• Chỉ thị RAPD đã được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu về:

- Đa dạng di truyền / đa hình,

- Đặc tính tế bào mầm

- Cấu trúc di truyền của quần thể

- Nhận dạng giống cây trồng

- Bản đồ gen

- Phát triển các dấu hiệu di truyền

- Di truyền quần thể và tiến hóa

- Nhân giống cây trồng và vật nuôi

- Nghiên cứu pháp y

PH ẦN 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng nghiên cứu

Gồm 21 mẫu giống cây Hoàng tinh hoa trắng được thu nhận tại một số tỉnh phía bắc Việt Nam như: Sa Pa, Lai Châu, Tuyên Quang và đưa về tại phòng thí nghiệm bộ môn Công nghệ Sinh học Thực vật – Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam

longifolia Craib.) thu thập được tại một số địa phương

STT Kí hiệu mẫu Địa điểm thu nhận Ví trí lấy mẫu

- Cối, chày sứ vô trùng, khay đá,…

- Pipets, đầu tip các loại

- Máy li tâm, máy đo OD

- Máy PCR, bản gel, máy điện di