TÓM TẮT KHÓA LUẬN Mục đích nghiên cứu Khảo sát tác dụng kháng khuẩn, hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxi hóa của dịch chiết các cây: rẻ quạt, lá chanh, sả, quế Phương pháp nghiê
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Khảo sát khả năng kháng khuẩn của cao rẻ quạt, lá chanh, tinh dầu sả, lá chanh, quế đối với tám vi khuẩn.
NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU
Dược liệu sử dụng trong y học bao gồm lá chanh, sả và quế, tất cả đều đã được sơ chế và thu mua từ công ty dược liệu cổ truyền Bình An, tọa lạc tại làng Nghĩa Trai, huyện Văn Lâm, tỉnh Hưng Yên.
Rẻ quạt được thu từ vườn dược liệu khoa thú y Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam
Trong nghiên cứu của tôi, tôi đã sử dụng tám chủng vi khuẩn, bao gồm: Escherichia coli ATCC 25922, Escherichia coli ATCC 35218, Escherichia coli ATCC 85922, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus aureus ATCC 25023, và Geobacillus stearothermophilus ATCC.
7953, Bacillus subtilis ATCC 6633, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027,
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.1.Phương pháp chiết xuất dược liệu
Dược liệu khô được nghiền nhỏ với kích thước dưới 0,5 mm và ngâm trong dung môi nước nóng, methanol, ethanol theo tỉ lệ 1/30 (g/ml), cụ thể là 10g dược liệu trong 300ml dung môi Đối với ethanol và methanol, cần vortex dung dịch trong 5 - 10 phút và ngâm sau 24 giờ, trong khi với nước nóng, vortex 30 phút rồi lọc qua vải lọc Dịch chiết được chứa trong ống tube 15 ml và li tâm ở tần số 3500 vòng/phút trong 10 phút để lắng cặn thảo dược Sau đó, sử dụng giấy lọc để loại bỏ cặn trong quá trình đổ dịch chiết Nhiệt độ chiết không vượt quá 45°C để bảo toàn hoạt tính sinh học của dược liệu Cuối cùng, dịch chiết được cô quay hút chân không bằng máy co quay chân không (RE-501 Rotary evaporator, công ty Zheng Keda, Trung Quốc) để loại bỏ dung môi trong áp suất thấp.
Sau khi chiết xuất, cao của 4 dược liệu được hòa tan bằng DMSO (dimethyl sulfoxide) và pha loãng thành 10ml với nồng độ 1g/ml Dược liệu gốc được pha loãng ở 4 nồng độ: 125, 250, 500 và 1000 mg/ml Để bảo quản hoạt tính của dược liệu trong thời gian dài, dịch chiết được đông lạnh.
Hình ảnh 4: Máy cô quay dược liệu
3.3.2 Phương pháp cất kéo hơi nước và chiết tách thu tinh dầu a) Phương pháp cất kéo hơi nước
Nguyên liệu được cắt nhỏ để tạo khoảng trống cho tinh dầu thoát ra nhanh chóng và dễ dàng cho vào nồi hấp Sau đó, đổ nước vào phần dưới của nồi chưng cất, đặt nguyên liệu đã cắt lên phần trên và đun sôi Cần cung cấp đủ nước cho hệ thống làm mát để ngưng đọng dung dịch chứa tinh dầu Trong quá trình chưng cất, vòi thu dung dịch nước bão hòa tinh dầu sẽ liên tục chảy vào bình kín để chiết tách Cần kiểm tra và bổ sung nước cho nồi hấp trong suốt quá trình chưng cất Khi hơi nước không còn mùi hương đặc trưng của tinh dầu dược liệu, cần loại bỏ nguyên liệu cũ và thay mới.
Hình ảnh 5: Nồi chưng cất b) Phương pháp chiết tách tinh dầu
Dung dịch nước bão hòa tinh dầu được cho vào bình chiết để tinh dầu ổn định và nổi lên trên bề mặt Các tinh dầu có khối lượng riêng nhỏ hơn nước như tinh dầu sả, quế sẽ nổi lên, trong khi những tinh dầu có khối lượng riêng lớn hơn sẽ chìm xuống hoặc lơ lửng Để chiết tách, cần sử dụng muối NaCl sạch pha vào dung dịch nhằm tăng khối lượng riêng của nước, giúp tinh dầu nổi lên và phân lớp Khi tinh dầu và nước đã phân lớp ổn định, tiến hành xả van bình chiết để loại bỏ nước bên dưới và thu giữ phần tinh dầu bên trên Đối với những loại tinh dầu khó phân lớp, sau khi pha muối, có thể sử dụng ethanol hoặc hexan để hòa tan tinh dầu, sau đó chiết tách và ủ ở nhiệt độ 35-40 độ C cho đến khi ethanol và hexan bay hơi hết, thu được tinh dầu.
Hình ảnh 6: Bình chiết tách
3.3.3 Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết dược liệu trên vi khuẩn
Hoạt hóa vi khuẩn là quá trình cần thiết để đảm bảo khả năng sinh hóa hoạt động tốt trước khi sử dụng Sau khi bảo quản lạnh trong thời gian dài, vi khuẩn sẽ được cấy trên đĩa thạch cứng ở nhiệt độ 37 độ C trong 24 giờ, sau đó được bảo quản lạnh trong 1 tuần.
Do hạn chế về nguyên vật liệu thí nghiệm, tôi đã tiến hành khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết dược liệu đối với các chủng vi khuẩn E coli.
ATCC 25922, B subtilis ATCC 6633, G stearothermophilus ATCC 7953, D:
Việc kiểm tra tác dụng ức chế của các dịch chiết được thực hiện theo nguyên lý khuyếch tán trên thạch Kirby-Bauer Phương pháp này giúp xác định hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết đối với vi khuẩn.
Khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn được xác định theo phương pháp khuyếch tán trên thạch
Các khuẩn lạc mới nuôi 24 giờ trên thạch Muller Hinton được điều chỉnh đến nồng độ 9x10^8 cfu/ml bằng cách so sánh với dung dịch Mc Farland standard 3.0 Để tạo các đĩa thạch có hàm lượng vi khuẩn 10^6 cfu/ml, chúng tôi sử dụng 25 ml thạch lỏng Muller Hinton đã vô trùng, trộn với 27,8 µl dịch vị khuẩn nồng độ 9x10^8 cfu/ml, sau đó đổ ra đĩa petri Sau khi bề mặt thạch khô, chúng tôi đục 4 giếng cách nhau 2-3 cm và nhỏ 100 µl dịch chiết dược liệu vào mỗi giếng Các đĩa thạch được để trong tủ mát ở 15 °C trong 3 tiếng, sau đó nuôi ở 37 °C trong 24 tiếng Tác dụng ức chế sự phát triển của vi khuẩn được đánh giá qua đường kính vòng vô khuẩn xung quanh giếng, xác định bằng máy đo độ lớn vòng vô khuẩn.
Hình ảnh 7: Vi khuẩn phát triển làm nước thịt bị đục b) Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết dược liệu
Khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn được xác định thông qua phương pháp khuyếch tán trên thạch, sử dụng ống khâu bằng đồng có đường kính 1cm Quá trình này bao gồm việc đục 4 giếng, với khoảng cách giữa các giếng là 2cm.
Sau khi tiến hành đục 4 giếng trên bề mặt thạch với độ sâu 3 cm, chúng tôi đã nhỏ vào mỗi giếng 100 µl dịch chiết dược liệu ở các nồng độ khác nhau Sau 24 giờ cấy nuôi đĩa thạch ở điều kiện 37 °C, chúng tôi tiến hành quan sát Tác dụng ức chế sự phát triển của vi khuẩn được đánh giá thông qua việc đo đường kính vòng vô khuẩn xung quanh ống khâu, sử dụng máy đo độ lớn vòng vô khuẩn (Haloes Caliper – Zone Reader).
Hình ảnh 8: Ống khâu bằng đồng có đường kính 1cm
Hình ảnh 9: Các giếng có đường kính 10 mm được sử dụng để chứa chất kháng khuẩn (kháng sinh hoặc dịch chiết dược liệu)
Hình ảnh 10: Đường kính vòng vô khuẩn tạo ra sau 24 giờ nuôi cấy của dịch chiết rẻ quạt
3.3.4 Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol
Hàm lượng polyphenol trong dịch chiết được xác định theo phương pháp của Suda et al (2005) Trong các ống thí nghiệm, 0.2 ml chất chuẩn hoặc dịch chiết pha loãng đến nồng độ 20 mg/ml sẽ được trộn với 1 ml.
Reagent phenol Folin-Ciocalteu (Merck, Đức) được sử dụng trong thí nghiệm Sau khi để yên ở nhiệt độ phòng trong 3 phút, mỗi ống được thêm 10% Na2CO3 và 5 ml nước cất, sau đó ủ trong 60 phút để phản ứng hoàn tất Mức độ hấp phụ của các ống được đo tại bước sóng 750 nm bằng máy quang phổ kế 720 (Ultra Violet - Visibility Spectrum, Trung Quốc) Acid Chlorogenic (Merck, Đức) được sử dụng làm chất chuẩn để tính toán hàm lượng polyphenol, với hàm lượng polyphenol trong mỗi 100 mg bột dược liệu được quy đổi sang số mg acid Chlorogenic tương ứng.
Hình ảnh 11: Cơ chế của phản ứng chuyển màu trong xác định hàm lượng polyphenol tổng số, sử dụng thuốc thử Folin-Ciocalteu's phenol reagent
3.3.5 Phương pháp xác định hoạt tính chống oxi hóa
Hoạt tính chống oxi hóa được xác định bằng các phân tích sử dụng chất DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl), theo phương pháp của Masuda et al
Dung dịch DPPH trong thí nghiệm được pha chế bằng cách hòa trộn 0,1 g DPPH với 50 ml ethanol 96% Mẫu thử được chuẩn bị bằng cách trộn 0,2 ml chất chuẩn hoặc dịch chiết pha loãng đến nồng độ 20 mg/ml với 0,1 ml DPPH và 4,8 ml nước cất Mức độ hấp phụ ánh sáng của các ống nghiệm được đo tại bước sóng 515 nm Các ống đối chứng chỉ chứa dịch chiết và dung môi DMSO (không có DPPH), trong khi ống đối chứng khác chỉ bao gồm 0,1 ml DPPH và dung môi Khả năng chống oxi hóa của mẫu thí nghiệm được tính toán theo công thức.
Ac= A control = Giá trị mật độ quang (OD) của ống đối chứng
As= A sample = Giá trị mật độ quang (OD) của ống thí nghiệm
Ab= A blank = Giá trị mật độ quang (OD) của ống blank
Chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm sử dụng VTM E (alpha-Tocopherol, Merck, Đức) làm chất chuẩn để xác định hoạt tính chống vi khuẩn Hoạt tính chống oxi hóa của 100 mg bột dược liệu sẽ được quy đổi tương đương sang số mg VTME.
Hình ảnh 12: Cơ chế của phản ứng chuyển màu trong xác định hoạt tính chống oxi hóa sử dụng chất thử nghiệm DPPH
3.3.6 Phương pháp khảo sát tác dụng của hơi tinh dầu lên sự phát triển của vi khuẩn
Hoạt tính kháng khuẩn của hơi được thực hiện theo phương pháp của Edwards-Jones (2004) Mỗi đĩa nuôi cấy vi khuẩn có đường kính 8 cm được đổ 15 ml thạch Muller Hinton agar với vi khuẩn ở nồng độ 10^6 cfu/ml Các miếng giấy lọc 6 mm được đặt vào tâm đĩa thạch và nhỏ 20 µl tinh dầu quế, sả, và lỏ chanh, trong khi đĩa đối chứng sử dụng 20 µl dung môi DMSO Các đĩa thạch được nuôi ở 37 độ C trong 24 tiếng, sau đó kết quả được đọc và mức độ ức chế vi khuẩn của các loại tinh dầu được quan sát.
Hình ảnh 13: Miếng giấy thấm 6 mm được đặt vào tâm của nắp đĩa petri nuôi vi khuẩn
3.3.7 Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu thu được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học trên phần mềm Excel.