VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Các nội dung nghiên cứu trong luận văn được tiến hành từ tháng 3/2021 đến tháng 8/2021
Phòng thí nghiệm thuộc Bộ môn Công nghệ sinh học Thực vật – khoa Công nghệ Sinh học
Đối tượng nghiên cứu
21 mẫu giống Hoàng tinh hoa trắng (Disporopsis longifolia Craib)
Bảng 3.1 Danh sách ký hiệu các mẫu
STT Kí hiệu mẫu Địa điểm thu nhận Ví trí lấy mẫu
(kinh độ và vĩ độ) Độ cao (m)
1 01 SP1 TC Sa Pả - Sa Pa 22 o 21’26’’N 103 o 51’35’’E 1.352
2 02 SP2 TC Sìn Hồ - Lai Châu 22 o 22’23’’N103 o 14’’03’’E 1.688
3 SP3 TC Hàm Rồng – Sapa 22 o 21’26’’N 103 o 51’44’’E 1.331
4 04 SP TC Tam Đường - Lai Châu 22 o 23’12’’103 o 25’30’’E 928
5 05 SP NL Thanh Kim – Sapa 22 o 17’16’’N 103 o 58’04’’E 969
6 06 SP NL Thanh Kim – Sapa 22 o 18’27’’N 103 o 58’01’’E 894
7 07 NL SP Thanh Phú –Sapa 22 o 16’07’’N 103 o 58’43’’E 675
8 08 NL SP Tả Phìn – Sapa 22 o 24’11’’N 103 o 50’11’’E 1.362
9 09 SP NL Trung Chải – Sapa 22 o 23’43’’N 103 o 53’07’’E 1.060
10 10 HC SP Mường Tè – Lai Châu 22 o 22’57’’N 102 o 47’42’’E 336
11 11 SP NL Mường Tè – Lai Châu 22 o 39’19’’N 102 o 27’49’’E 857
12 12 NL SP Tân Uyên - Lai Châu 22 o 10’42’’N 103 o 37’35’’E 1.711
13 13 NL Sp Chiêm Hóa –Tuyên Quang 22 o 16’03’’N 105 o 16’58’’E 476
14 14 NL Sp Chiêm Hóa – Tuyên Quang 22 o 20’00’’N 105 o 11’39’’E 403
15 15 NL SP Phong Thổ - Lai Châu 22 o 38’40’’N 103 o 22’19’’E 1.351
16 HTPXL1 Phăng Xô Lin – Sìn Hồ 22 o 23’40’’N 103 o 14’56’’E 1.764
17 HTPXL1 Phăng Xô Lin – Sìn Hồ 22 o 22’12’’N 103 o 16’03’’E 1.214
18 HTPXL1 Phăng Xô Lin – Sìn Hồ 22 o 21’37’’N 103 o 14’55’’E 1.519
19 HTTN1 Phăng Xô Lin – Sìn Hồ 22 o 17’20’’N 103 o 15’13’’E 1.609
20 HTLM1 Phăng Xô Lin – Sìn Hồ 22 o 13’03’’N 103 o 15’08’’E 1.396
21 HTTSC1 Phăng Xô Lin – Sìn Hồ 22 o 09’51’’N 103 o 15’45’’E 1.538
Nội dung nghiên cứu
Phân tích đa dạng di truyền của 21 mẫu giống hoàng tinh hoa trắng bằng chỉ thị ISSR.
Trang thiết bị, dụng cụ, hóa chất phòng thí nghiệm
Trang thiết bị, dụng cụ, hóa chất và các dung dịch đệm cần pha dùng trong thí nghiệm của đề tài được trình bày trong các bảng sau:
Bảng 3.2 Trang thiết bị dụng cụ và hóa chất
5 Hệ thống máy điện di
6 Hệ thống buồng chụp UV
13 Tủ lạnh sâu –25 º C - Tủ lạnh 4 º C
14 PCR tốc độ cao Eppendorf
29 Ethidium Bromide b Danh sách mồi đã sử dụng
Bảng 3.3 Danh sách mồi ISSR
STT Tên mồi Trình tự mồi Nhiệt độ gắn mồi
Phương pháp nghiên cứu
3.5.1 Phương pháp tách chiết DNA a Chuẩn bị đệm chiết
Hòa tan CTAB (0,5g), EDTA (1g), Tris base (2,5g) và NaCl (5g) trong 100ml nước cất hấp khử trùng b Các bước tiến hành
1 Nghiền mẫu (50-100mg) trong 1ml đệm chiết, chuyển dịch nghiền vào ống 2ml, trộn đảo đều Bổ sung 5àl RNase
2 Ủ mẫu ở 65 ̊C trong 30 phút, cứ 1p-2p đảo trộn đều trong quá trình ủ mẫu
3 Bổ sung 100 àl SDS 20% ủ trong 20 phỳt ở 65°C, cứ 1-2 phỳt đảo đều trong quá trình ủ mẫu
4 Bổ sung hỗn hợp Phenol: Chloroform: Isomamyl alcohol (25:24:1) theo tỷ lệ 1:1 (tính theo thể tích đệm thu được ở bước 2 so với hỗn hợp P:C:1)
6 Bổ sung hỗn hợp Chloroform: Isoamylalcohol (24:1) theo tỷ lệ 1:1 (tính theo thể tích đệm thu được ở bước 4 so với hỗn hợp C:1), trộn đều bằng vortex
7 Ly tâm 13700g, 4 ̊C trong 10 phút Chuyển dịch nổi vào ống mới 1,5ml
8 Thêm isopropol theo tỷ lệ 1- isopropol: 2 đệm (thu được ở bước 7) để kết tủa DNA rồi đảo ống 6-8 lần để trộn đều dung dịch
10 Đổ dịch nổi, rửa kết tủa DNA/RNA với 500μl dung dịch 70% EtOH, lắc mạnh vài lần
11 Ly tâm ở 5400g, 4 ̊C, 5 phút, loại bỏ dịch nổi, để khô trong không khí ly tâm 10 giây rồi để khô trong không khí
12 Hòa tan kết tủa trong 100μl đệm 1∕4 TE
Bảng 3.4 Thành phần các chất dùng cho mỗi phản ứng PCR với mồi ISSR
STT Thành phần Thể tích (l)
Phản ứng PCR dược thực hiện theo chu trình trên bảng 3.5
Bảng 3.5 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
Bước Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ
3 Nhiệt độ gắn mồi 30 giây
3.5.3 Điện di trên gel Agarose
1 Cân 1 gam agarose cho vào lọ thủy tinh chịu nhiệt
2 Đổ 100 ml dung dịch TAE 1X vào lọ, lắc đều
3 Cho vào lò vi sóng, đun cho agarose tan hoàn toàn
4 Chuẩn bị khuôn và lược, đặt thăng bằng
5 Để agarose nguội từ từ đến 60˚C, bổ sung 5àl RedSafe (20.000X) cho 100ml agarose, lắc nhẹ cho đều rồi đổ nhẹ nhàng và liên tục vào khuôn tránh tạo bọt
6 Để cho agarose đông lại, tháo bỏ lược, cho khuôn gel vào bể điện di
7 Đổ đầy đệm TAE 1X ngập gel điện di
8 Tra mẫu sản phẩm PCR vào các giếng
9 Đậy nắp bể điện di sao cho dòng điện chạy từ cực (-) sang (+), giếng điện di ở phía cực (-) của bể điện di
10 Mẫu được chạy điện di với hiệu điện thế 80V trong 45 phút
11 Sau đó lấy bản gel ra, quan sát bản gel và chụp ảnh trong hệ thống máy chụp UVP Biodoc-it
3.5.4 Phương pháp đánh giá, xử lý số liệu
Dữ liệu được lưu trữ và xử lý bằng Microsoft Excel, trong đó các băng vạch sáng rõ được ghi điểm 1, còn băng vạch không có ghi điểm 0 Sau đó, hệ số tương đồng của Sokal và Michener (1958) được áp dụng cùng với phần mềm NTSYSpc 2.1 theo phương pháp UPGMA để tính toán hệ số tương đồng giữa các loài và vẽ cây thể hiện mối quan hệ di truyền giữa chúng.
Chỉ số PIC (polymorphism information content) là chỉ số đa hình di truyền hay còn gọi là thước đo độ đa hình (Botstein và cộng sự, 1980)
PIC(i) = 1- 𝑝𝑖 - 𝑞𝑖 Trong đó: i là thứ tự locus được tính, pi là tần số băng xuất hiện của locus, qi là tần số băng không xuất hiện
Kết quả chỉ số PIC của mỗi mồi sẽ là chỉ số PIC trung bình cộng của tất cả các locus được tính theo công thức trên
Chỉ số Rp (Resolving power) là chỉ số sai khác của mỗi cặp mồi theo Prevost và Wilkinson (1999) chỉ số này được tính theo công thức:
Rp = ∑Ib Trong đó Ib = 1 – [2 x (0.5 – p)] với p là tần số xuất hiện băng của locus.