Hóa Phân Tích, Thuốc Kháng Sinh, Dược Phẩm, Betalactam, Phương Pháp Phân Tích Hiện Đại..docx

ĐẠIHỌCQUỐCGIAHÀNỘITRƢỜN GĐẠIHỌCKHOAHỌCTỰNHIÊN * NGUYỄN THỊÁNHTUYẾT NGHIÊNCỨUPHÂNTÍCHĐÁNHGIÁHÀML ƢỢNGKHÁNGSINHHỌBETALACTAM TRONGĐỐITƢỢNGDƢỢCPHẨMVÀSINHHỌCBẰN GPHƢƠNGPHÁPPHÂNTÍCHHIỆNĐẠI LUẬNÁNTIẾNSĨHÓAHỌ[.]

ĐẠIHỌCQUỐCGIAHÀNỘITRƯỜN GĐẠIHỌCKHOAHỌCTỰNHIÊN

-* -NGUYỄN THỊÁNHTUYẾT

NGHIÊNCỨUPHÂNTÍCHĐÁNHGIÁHÀML ƯỢNGKHÁNGSINHHỌBETALACTAM

TRONGĐỐITƯỢNGDƯỢCPHẨMVÀSINHHỌCBẰN

GPHƯƠNGPHÁPPHÂNTÍCHHIỆNĐẠI

LUẬNÁNTIẾNSĨHÓAHỌC

HÀNỘI–2013

ĐẠIHỌCQUỐCGIAHÀNỘITRƯỜNG ĐẠIHỌCKHOAHỌCTỰNHIÊN

NGUYỄNTHỊÁNHTUYẾT

NGHIÊNCỨUPHÂNTÍCHĐÁNHGIÁHÀML ƯỢNGKHÁNGSINHHỌBETALACTAM

Tôixincamđoanđâylàcôngtrìnhnghiêncứucủariêngtôi.Cácsốliệu,kếtquảnêutrongluậnánlàtrungthựcvànộidungnàychưa

từngđượccôngbốtrongbấtkỳcôngtrìnhnghiêncứunàotrướcđó

HàNội,tháng2năm2013

Tácgiảluậnán

NguyễnThịÁnhTuyết

EmxinbàytỏlòngbiếtơnsâusắctớithầyPGS.TS.NGUYỄNVĂNRIvàG S TS.PHẠMHÙNG VIỆTđãgiaođềtàivàtận tìnhhướngdẫn,độngviên,giúpđỡ,tạođiềukiệnthuậnlợichoemtrongsuốtquátrìnhlàmluậnán

bộtrongBộmônHóaPhântích,KhoaHóahọc,TrườngĐạihọcKhoahọcTựnhiên,Trungtâmnghiêncứucôngnghệ môitrườngvàphát triểnbềnvững-ĐạihọcKhoahọcTựnhiênĐạih ọ c QuốcgiaHàNộiđãtậntìnhgiúpđỡvàtạomọiđiềukiệnthuậnlợiđểtôihoànthànhluậnán

Tôixin chân thành cảmơncác anh chị cánbộnghiêncứu, Ban Lãnh đạoViệnKh oa họccôngnghệmôitrường(INEST)đãtạođiềukiện,giúpđỡtôitrongquátrìnhthựchiệnluậnán

HàNội,tháng2năm2013

Nghiêncứusinh

NguyễnThịÁnhTuyết

LỜICAMĐOAN i

LỜICẢMƠN ii

MỤCLỤC iii

KÝHIỆUCÁC CHỮVIẾTTẮT TRONG LUẬN ÁN vi

KÝHIỆUĐƠNVỊĐOLƯỜNGCÁCĐƠNVỊĐOLƯỜNG viii

DANHMỤCCÁC BẢNG ix

DANHMỤCCÁC HÌNH xii

MỞĐẦU 1

CHƯƠNG1:TỔNGQUANTÀILIỆU 4

1.1 Giớithiệuchungvềchấtkhángsinh β-lactam 4

1.1.1 Tính chấtvậtlývàhoáhọc 7

1.1.2 Tácdụng 9

1.1.3 Tính chấtquanghọccủacácβ-lactam 10

1.2 TìnhhìnhlạmdụngkhángsinhởViệtNamvàtrênthếgiớihiệnnay 10

1.3 Mộtsốphươngphápđịnhlượng β-lactam 13

1.3.1 Phươngphápquanghọc 13

1.3.2 Phươngphápđiệnhóa 14

1.3.3 Sắckýlỏnghiệu năngcao(HPLC) 15

1.3.4 Phươngphápđiệndimaoquản-electrophoresis(CE) 19

CHƯƠNG2:PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU 25

2.1 Mụctiêunghiên cứu 25

2.2 Phương phápnghiêncứu 25

2.2.1 Kỹthuậtphântíchsắckýlỏnghiệu năngcao(HPLC) 25

2.2.1.1 PhươngphápRP-HPLC,detector UV 26

2.2.1.2 PhươngphápRP-HPLC,detectorhuỳnhquang 31

2.2.1.3 ỨngdụngphươngphápRP-HPLC,detectorhuỳnhquangđểphânt í ch mẫu 34

2.2.1.4 Phươngphápxửlýsốliệuphântích 36

2.2.2Kỹthuậtđiệndimaoquản(CE) 39

2.3 Hóachất,mẫuphântíchvàthiếtbị,dụng cụ 50

2.3.1 Hóachất 50

2.3.2 Mẫu phântích 52

2.3.3 Thiết bịvàdụngcụ 53

2.3.3.1 Thiếtbị 53

2.3.3.2 Dụngcụ 54

CHƯƠNG3:KẾTQUẢVÀTHẢOLUẬN 56

3.1 Táchvàxácđịnhđồngthờikhángsinh-lactambằngkỹthuậtsắckýlỏngh i ệu năngcao(HPLC) 56

3.1.1 KỹthuậtRP-HPLC,detectorUV 56

3.1.1.1 Chọncácthông sốmáyđo đểpháthiệnchấtphân tích 56

3.1.1.2 Hệdungmôiphađộng 57

3.1.1.3 Đánh giá thống kêphươngphápphântích-lactam bằng phươngphápRP-HPLC 64

3.1.1.4 Phântíchmẫu 70

3.1.2 KỹthuậtRP-HPLC,detectorhuỳnhquang 73

3.1.2.1 Khảosátcácđiềukiệntạodẫnxuấtgiữa-lactamvàthuốcthửNBD-F 73

3.1.2.2 Tốiưuhóacácđiềukiệntáchvàđịnhlượngmộtsốkhángsinhhọ-lactam 77

3.1.2.3 Đánhgiáphươngphápphântích 85

3.1.2.4 Phântíchmẫu 90

3.1.3KếtluậnvềphươngphápHPLC 94

3.2 Táchvàxácđịnhđồngthờikhángsinhβ-lactambằngkỹthuậtđiệndimaoquảnđiệnđộnghọckiểumixen(MEKC) 95

3.2.1 Chọncácthôngsốmáyđiệndi 95

3.2.2 Khảosátảnhhưởngcủadungdịchđiệngiảiđếnquátrìnhđiệndi 96

3.2.2.1 Ảnhhưởngcủathànhphầndungdịchđệm 96

3.2.2.2 ẢnhhưởngpHcủadungdịchđệmđiệndi 96

3.2.2.3 KhảosátảnhhưởngcủanồngđộchấtmixenSDS 99

3.2.2.4 Khảosátảnhhưởngcủanồngđộđệm 101

3.2.3 Khảosátảnhhưởngthờigianbơmmẫu 104

3.2.4 Khảosátảnhhưởngthếđiệndi 105

3.2.5 Khảosátảnhhưởngnhiệtđộcủamaoquản 107

3.2.6 Đánhgiáthốngkêphươngphápphântích-lactambằngMEKC 109

3.2.6.1 Khảosátkhoảngtuyếntínhvàlậpđườngchuẩn 109

3.2.6.2 Độchínhxác 112

3.2.6.3 Độlặplạicủaphépđo 116

3.2.6.4 GiớihạnpháphiệnvàgiớihạnđịnhlượngcủaphươngphápCE 116

3.2.7 Phântíchmẫu 117

3.2.7.1 Phântíchmẫudượcphẩm 117

3.2.7.2 Phântíchmẫunướctiểu 119

3.2.8 Kếtluậnvềphươngphápđiệndi(CE) 125

3.3S o s á n h k ế t q u ả p h â n t í c h c ủ a c á c p h ư ơ n g p h á p M E K C , HPLC-U V , HP L C- huỳnhquang 126

KẾTLUẬN 128

KIẾN NGHỊ 130

DANHMỤCCÔNG TRÌNHKHOA HỌCCỦATÁCGIẢLIÊNQUANĐẾNLUẬNÁN131 TÀILIỆU THAMKHẢO 132

PHỤLỤC 141

(HighperformanceLiquidChromatography)HPLC-MS :SắckýlỏnghiệunăngcaoghépnốikhốiphổMAX

:Giátrịcao nhất

1 , 3 - d i a z o l e OXA :Oxacillin

PENG :PenicillinG

:SắckílỏnghiệunăngcaophađảoRP-HPLC

µg :Microgam

µm :MicrometCal :Calo

Bảng1.1 Phânloạivàcấutrúcmộtsốpenicillin 5

Bảng1.2 Phânloạivàcấutrúcmộtsốcephalosporin 7

Bảng1.3 Hằngsốaxit củacáckhángsinhnghiêncứu 9

Bảng2.1.Cácđiềukiệntáchvàxácđịnh-lactam 33

Bảng2.2.Cácyếutốảnhhưởngtớiquátrìnhtáchcácβ-lactambằngCE 47

Bảng2.3 Cáchóachấtsửdụngtrongnghiêncứu 51

Bảng2.4 Thôngtin mẫuthuốcphântích 52

Bảng3.1 Sựphụthuộck’vàopHcủaphađộngchạysắcký 58

Bảng3.2.Sựphụthuộc củak’vàothànhphầnphađộngchạysắckí 60

Bảng3.3.Thờigianlưu(phút)vàdiệntíchpíc(mAu.s)củacácchấtphụthuộcvàonồng độđệm 61

Bảng3.4.Tómtắtcácđiềukiệnthựcnghiệmtốiưuđểtáchcácβ-lactam 63

Bảng3.5 SựphụthuộccủaSpicvàonồng độ chấtphântích 65

Bảng3.6.LODvà LOQcủaphươngphápHPLC-UVVis 66

Bảng3.7.ĐộchínhxáccủaphươngphápphântíchHPLC/UV(0,15µg/ml) 67

Bảng3.8.ĐộchínhxáccủaphươngphápphântíchHPLC/UV(0,40µg/ml) 68

Bảng3.9.ĐộchínhxáccủaphươngphápphântíchHPLC/UV(0,80µg/ml) 69

Bảng3.10.Độlặplạicủaphépđo ởcácnồngđộchấtphântíchkhác nhau 70

Bảng3.11.Kếtquảtínhhàmlượngkhángsinhtrongmẫudượcphẩm 71

Bảng3.12.Hiệusuấtthuhồicủamẫunướctiểu 72

Bảng3.13 SựphụthuộccủaSpícvàonhiệtđộphảnứng 74

Bảng3.14.SựphụthuộccủaSpícvàolượng dưthuốcthử 76

Bảng3.15.SựphụthuộccủathờigianlưuvàhệsốtáchcủacácchấtvàopHphađộng 78

Bảng3 1 6 S ự p h ụ t h u ộ c c ủ a t h ờ i g i a n l ư u v à o t ỉ l ệ giữad u n g môih ữ u c ơ vàđệm 79

Bảng3 1 7 T h ờ i g i a n l ư u v à d i ệ n t í c h p í c c ủ a c á c c h ấ t p h ụ t h u ộ c v à o n ồ n g

độđệm 82

Bảng3.18.Thờigianlưuvàdiệntíchpíccủacácchấtphântíchphụthuộcvào tốcđộphađộng 83

Bảng3.19.SựphụthuộccủaSpicvàonồngđộchấtphântích 85

Bảng3.20.CácgiátrịFtính,Fbảngvàphươngtrìnhđườngchuẩncủacáckhángsinhβ-lactam .87

Bảng3.21.Độchínhxáccủaphươngphápphântíchtạinồngđộcácchất0,15 µg/ml 88

Bảng3.22.Độchínhxáccủaphươngphápphântíchtạinồngđộcácchất0,40 µg/ml 88

Bảng3.23.Độchínhxáccủaphươngphápphântíchtạinồngđộcácchất0,80 µg/ml 89

Bảng3.24.Độlặplạicủaphépđoởcácnồngđộchấtphântíchkhácnhau 89

Bảng3.25.Thôngtinmẫuthuốcphântích 90

Bảng3.26.Kếtquảđộthuhồixácđịnhβ-lactamtheophươngphápthêmchuẩnt r o n g mẫuthuốc 91

Bảng3.27.Kếtquảphântíchcácβ-lactamtrongmẫunướctiểu 92

Bảng3.28.HiệusuấtthuhồicủaCEP,CECvàAMPtrongmẫuhuyếtthanh 93

Bảng3.29.ẢnhhưởngcủapHđếnthờigiandichuyểncủaβ-lactam 97

Bảng3.30.ẢnhhưởngnồngđộSDSđếnthờigianlưucủaβ-lactam 99

Bảng3.31.Ảnhhưởngcủanồngđộđệmtớithờigianlưu(phút) 102

Bảng3.32.Ảnhhưởngcủathờigianbơmmẫutớithờigianlưu(phút) 104

Bảng3.33.Ảnhhưởngcủathếđiệnditớithờigianlưu(phút) 106

Bảng3.34.Ảnhhưởngcủanhiệtđộtớithờigiandichuyểnβ-lactam 107

Bảng3.35.Tổngkếtcácđiềukiệntốiưu 109

Bảng3.36.Chiềucaopícβ-lactamtạicácnồngđộkhácnhau 110

Bảng3.37.Độchínhxáccủaphươngphápphântích(1µg/ml) 113

Bảng3.38.Độchínhxáccủaphươngphápphântích(5µg/ml) 114

Bảng3.39.Độchínhxáccủaphươngphápphântích(10 µg/ml) 115

Bảng3.40.Đánhgiáđộlặplạicủa phươngphápphântích 116

Bảng3.41 Giớihạnpháthiệncủaphươngpháp 117

Bảng3.42.Thông tinvàđặcđiểmtừng loạithuốc 117

Bảng3.43.Kếtquảtínhhàmlượngkhángsinhtrongmẫuthuốc 118

Bảng3.44.HiệusuấtthuhồiởcácnồngđộCH3OHkhácnhau 120

Bảng3.45.Hiệusuấtthuhồiởcácthểtíchrửagiảitạpchấtkhácnhau 121

Bảng3.46 KếtquảphântíchnồngđộAMOvàCEPtrongmẫunướctiểungườitìnhnguyện .124

Bảng3.47.SosánhLOD,LOQ,kếtquảphântíchmẫudượcphẩmcủaphươngph áp ME KCvàHPLC 126

Bảng3.48.KếtquảphântíchcácmẫusinhhọcbằngphươngphápHPLC 127

Hình1.1.Côngthứccấutạocáckhángsinhpenicillin 5

Hình1.2.Côngthứccấutạocáckhángsinhcephalosporin 6

Hình1.3.Độbềnkhungcephalosporin 8

Hình1.4.Axitcephalosporoic 8

Hình1.5.Sơđồcácbướctrongquátrìnhchiếtpharắn 21

Hình1.6.CơchếSPEphântíchcácmẫunước 21

Hình1.7.CấutrúccủaphatĩnhcộtSPEdùngchocácmẫusinhhọc 22

Hình1.8.Sosánhyếutốlưugiữ(k’)giữacộtC18vàcộtOasis®HLB 22

Hình1.9.SơđồtổngquátchiếtSPEvớicộtOasis®HLB 23

Hình2.1.SơđồchitiếthệthốngmáyHPLC 26

Hình2.2.SơđồphântíchmẫudượcphẩmtheokỹthuậtHPLC,detectorUV 29

Hình2.3.PhântíchmẫunướctiểubằngRP-HPLC,detetorUV 30

Hình2.4.Sơđồcấutạocủadetectorhuỳnhquang 31

Hình2.5.Sơđồxửlýmẫudượcphẩm 34

Hình2 6 S ơ đồp h â n t í c h mẫunước ti ểu bằn g phươngpháp HP LC , detector h uỳnhquang 35

Hình2.7.SơđồxửlýmẫuhuyếtthanhphântíchHPLC-huỳnhquang 36

Hình2.8.SơđồnguyêntắccấutạocủahệCE 41

Hình2.9.CấutrúccủacácMixenvàdòngEOFtrongMEKC 43

Hình2.10.SơđồphântíchmẫudượcphẩmtheophươngphápCE 48

Hình2.11.HệthốngCEModel1602A–Agilent 54

Hình2.12.HệthốngHPLCmodelLC-20ADcủahãngShimadzu 54

Hình3.1.Sựphụthuộcki’vàopHcủaphađộngchạysắcký 59

Hình3.2.Sựphụthuộcki’vàothànhphầnphađộngchạysắcký 60

Hình3.3.Sựphụthuộcdiệntíchpicsắckývàotốcđộphađộng 62

Hình3.4.Sắcđồsắckýcủa5chấtkhángsinhhọβ-lactamtạiđiềukiệntốiưu:đ ệ m axetat10mMpH3,50;tỷlệACN/MeOH/ đệmlà10/20/70(v/v/v);

phút;nhiệtđộcộttách300C;thểtíchmẫu20µl;detectorđơnbướcsóng225

nm 64

Hình3.5.Đườngchuẩncủacácβ-lactamtrongkhoảngnồngđộ0,10µg/mlđến2,0µg/ ml 66

Hình3.6.Đồthịxácđịnhcácchấtβ-lactamtheophươngphápthêmchuẩn 72

Hình3.7 ĐồthịsựphụthuộcSpícvàonhiệt độphảnứng 74

Hình3.8.ĐồthịbiểudiễnsựphụthuộcSpícvàothờigianphảnứng 75

Hình3.9.ĐồthịbiểudiễnsựphụthuộcSpícvàolượngdưthuốcthử(NBD-F) 76

Hình3.10 Sựphụthuộcki’vàopHcủaphađộng 78

Hình3.11.Sắckýđồcủa3khángsinhβ-lactam(1)làCEP, (2)làCECvà(3)làAM P tạicáctỉlệdungmôihữucơ/đệm(v/v)khácnhau 80

Hình3.12 Sựphụthuộcki’vàotỉlệACN/MeOH 81

Hình3.13.Sắcđồsắckýcủa3khángsinhβ-lactam:(1)làCEP;(2)CEC; (3)AMPởcácnồngđộđệmkhácnhau 83

Hình3.14.Sắcđồsắckýcủa3khángsinhβ-lactamởđiềukiệntốiưu 84

Hình3.15 Đườngchuẩn của cácβ-lactamtrong khoảngnồng độ0,05µg/mlđến2µg/ml .86

Hình3.16 Phổhấpthụ củacác β-lactam(nồngđộ10µg/ml) 95

Hình3.17.ẢnhhưởngpHdungdịchđệmđiệndiđếnđộđiệndihiệudụngcủa β-lactam 97

Hình3.18.ẢnhhưởngcủanồngđộSDStrongdungdịchđệmđiệndiđếnđộđ iện dihiệudụngcủa β-lactam 99

Hình3.19.Sắcđồđiệndicủaβ-lactamtạinồngđộđệm20mM,25mM,30mM và35mM 102

Hình3.20.Ảnhhưởngcủanồngđộđệmđếnđộđiệndihiệudụngcủaβ-lactam 103

Hình3.21.Ảnhhưởngcủathờigianbơmmẫutớichiềucaopícsắcký 104

Hình3.22.Sắcđồđiệndicủacácbetalactamởcácthếđiệndikhácnhau 106

Hình3.23.Ảnhhưởngcủathếđiệndiđếnđộđiệndihiệudụngcủaβ-lactam 106

Hình3.24.Ảnhhưởngnhiệtđộtớiđộđiệndihiệudụngcủaβ-lactam 107

Hình3.26 Sắcđồ điện dicủaβ-lactamtạinồngđộ15ppm 110

Hình3.27.Đườngchuẩncủa7loạiβ-lactamcónồngđộ1-10ppm 112

Hình3.28.Ảnhhưởng nồngđộCH3OHđếnhiệuquảchiếtSPE 120

Hình3.29.ẢnhhưởngthểtíchrửagiảitạpchấtbẩnđếnhiệuquảchiếtSPE 121

Hình3.30.Sơđồphântíchβ-lactamtrongmẫunướctiểukếthợpcộtchiếtpha rắnOasis®HLB vàMEKC 122

Hình3 3 1 S ắc đ ồ đ i ệ n d i c ủ a mẫun ướ c tiểul ấ y từn g ư ờ i t ì n h n g u yệ n u ố n g AM OvàCEP 125

Cáckhángsinhlàthuốcthiếtyếutrongyhọchiệnđại,nhờcácthuốckhángsi

n h màyhọccóthểloạibỏđượccácdịchbệnhnguyhiểmđốivớiconngườivàđộngvậtnhưdịchhạch,dịchtả,thươnghànvàđiềutrịhiệuquảnhiềuloạibệnhgâyrabởivikhuẩn.TừkhiAlexanderFlemingtìmrapenicillin(1928)thìviệcđiềutrịc ác bệnhnhiễmkhuẩncónhữngtiếnbộrấtlớn,khángsinhđãgiúpđiềutrịđượcn h i ều bệnhhiểmnghèo,manglạisựsốngchoconngườimàtrướcđóyhọckhôngcó khảnăngchữatrị

Đốivớicácnướcđangpháttriển,thuốckhángsinhlạigiữmộtvịtrírấtquantrọng,vìcácnướcnàydođiềukiệnvệsinhkémvàmứcsốngcònthấpnênthườngx ảy racácdịchtả,kiếtlị,nhiễmkhuẩnđườnghôhấp…

Ởnướctacómộtsốtàiliệucô n g

bốcáckhángsinhchiếm25-30%tổngsốthuốcsửdụnghàngnămmàhiệnchưacó mộttà il iệu ch í n h xác nàocôn gb ố v ề vi ệcđ iều tr ac hi tiếtvấ nđ ề này,nhưngchắcchắncácthuốckhángsinhlàcácthuốcđượcsửdụngnhiềunhấtởnướcta vàởcácnướcđangpháttriển,cònởcácnướcChâuÂuvàNhậtBản…

thìcácnhómthuốcđượcsửdụngnhiềunhấtlạilàthuốcđiềutrịtimmạch,cácthuốcđiềutrịcácbệnhthầnkinh-tâmthần,cácthuốcchốngviêmvàcácthuốcgiảmbéo

kiểmsoátvàphântíchthuốckhángsinhđốivớingườibệnhlàbiệnphápcầnthiếtđ ển â

n g c a o h i ệ u q u ả s ử d ụ n g c h ú n g M ặ t k h á c b ằ n g v i ệ c p h â n t í c h h à m l ư ợ n g kháng sinhtrongmáu,haytrongnướctiểutacóthểbiếtđượchàmlượngkhángsi

nh nó tồn tại trongcơthểlà baonhiêu,cóđủhàmlượngđể tiêudiệt vikhuẩnhaykhông,từđócóđượcphácđồđiềutrịhợplý

Córấtnhiềuphươngphápphântíchhàmlượngkhángsinhtrongcácmẫusinhh ọ cnhưquangphổhấpthụphântửUV-Vis,phươngphápvon-

ampehòatan,sắckýlỏnghiệunăngcaovớinhiềudetectorkhácnhau,đặcbiệtlàphươngphápđiệndimaoquảnmớiđượcpháttriểngầnđây.Vìvậyviệcnghiêncứulựachọnphươngphápphântíchđảmbảođộđ ún g, độchọnlọc, chiphíphântíchkhôngcao,đơng iản , cóthểápdụngđểkiểmtrasonghànhvớicácphươngpháptrongdượcđiểnlàcần thiết vàcó ýnghĩathực tiễn Trongsốcác phươngphápphântích côngcụhiệnđ ại

đ ó t h ì p h ư ơn g p há p sắckýlỏnghiệunăngcaovà điện dimaoquản có nhiềulợithế,cóthểđápứngđượcyêucầuđặtra,vìvậychúngtôichọnphương

phápsắckýlỏ lactam.Hơnnữaởnướctaphươngphápđiệndimaoquảnchưađượcnghiêncứunhiều.Xétvềhiệ

nghiệunăngcaovàđiệndimaoquảnđểtáchvàxácđịnhkhángsinhβ-u qnghiệunăngcaovàđiệndimaoquảnđểtáchvàxácđịnhkhángsinhβ-uảtách và thờigian phân tích,phương pháp điệndimaoqnghiệunăngcaovàđiệndimaoquảnđểtáchvàxácđịnhkhángsinhβ-uảncó rấtnhiềnghiệunăngcaovàđiệndimaoquảnđểtáchvàxácđịnhkhángsinhβ-ulợithếnêngầnđâycácnhàkhoahọc bắt đầu quantâmtới phương phápnày.Do

lactamtrongđốitượngdượcphẩmvàsinhhọc,nhằmtìmphươngphápphùhợpđểphântíchβ-lactamtrongcácmẫusinhhọc,đặcbiệtlàtrongnướctiểu

(1) Nghiêncứuvàchọncácđiềukiệntốiưunhưcácthôngsốcủamáy,phatĩ n h, phađộng…đểtáchvàxácđịnhđồngthời5khángsinhhọbetalactam bằngkỹthuậtRP-HPLCvớidetectorUV.Đánhgiáphươngphápphântíchvàứngdụngp hântíchcácmẫudượcphẩm,mẫunướctiểu

(2) Nghiênc ứ u đ i ề u k i ệ n t ố i ư u t ạ o d ẫ n x u ấ t p h á t huỳnhq u a n g c ủ

a c á c bet ala ct am F)đểtáchvàxácđịnhđồngthời3khángsinhbetalactambằngkỹthuậtRP-HPLC/detectorhuỳnhquang,đánhgiáphươngphápphântích

vớithuốcthử7-Fluoro-4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole(NBD-(3) ỨngdụngphươngphápRP-HPLC/

detectorhuỳnhquangcóđộnhạyvàđ ộ chọnlọccaođểphântíchcácmẫudượcphẩmvàđặcbiệtlàphântíchcácmẫusinhhọc:nướctiểuvàmẫuhuyếtthanh

(4) Nghiêncứutìmvàchọnnhữngđiềukiệntốiưunhưthôngsốmáyđiệndimaoquản,kíchthướcmaoquản,thếápvào2đầumaoquản,dungdịchđệmđiệndiđểtáchvàxácđịnhđồngthời7chấtkhángsinhbetalactambằngkỹthuậtđiệndimaoquảnđiệnđộnghọcmixen

(5) Ứngdụngphươngphápđiệndimaoquảnđiệnđộnghọcmixenxácđịnhh àmlượngkhángsinhbetalactamtrongmẫudượcphẩmvàmẫunướctiểu

Điểmmớivềkhoahọccủaluậnán:Phươngpháptáchvàxácđịnhđồngthờikhángs

inhhọbetalactamđâylànghiêncứuđầutiênởViệtNamcótínhchấthệth ốn g,phươngphápsắckýlỏnghiệunăngcaovớidetectorhuỳnhquangđểphântíchkháng sinh betalact amtrongmẫusinh học ởnướcta chưa có công trình nàođềcập tới,đặcbiệtphươngphápđiệndimaoquản(MEKC)tiếnhànhphântíchđồngthời7chấtkhángsinhbetalactamtrongmẫudượcphẩmvànướctiểucũngchưacócôngtrìnhnàocôngbố

CHƯƠNG1TỔNG QUAN TÀILIỆU

*Khángsinhβ-lactamlactam

-Địnhnghĩa:

cácnhóm:penicillin,cephalosporin,monobactam,cacbapenemtrongđóhainhómsửdụngphổbiếnvàl ớ n nhấtlàpenicillinvàcephalosporin

N H

O CH 3

6-[(5-methyl-3-phenyl-1,2- carbonyl)amino]

oxazole-4-LàcácPenicillinbántổnghợp.PhổhẹpnhƣnhómI.Khángpenicillinase,khôngtácđộngvàovòng

O CH 3

methyl-oxazole-4- carbonyl]amino}

phenylacetyl]amino)

6-([(2R)-2-amino-2-Phổrộng, tác d ụ n g c ả khuẩngram(+)và(-).Khôngkhángβ-

HO

hydroxyphenyl)-acetyl]amino}

6-{[(2R)-2-amino-2-(4-+Nhómcáccephalosporin[9,13]

Cáccephalosporincấutrúcchunggồm2vòng:vòngβ-Lactam4cạnhgắnv ớ i 1dịvòng6cạnh,nhữngcacbonbấtđốicócấuhình6R,7R.Khácnhaubởicácgốc-R

phầnc h ứ a đ ồ n g t h ờ i n h ó m – COOHvà–

NH2.C ự c đ ạ i h ấ p t hục h ủ yếud o n h â n phenyl,tùyvàocấutrúckhácnhaulàmdạngphổthayđổi(đỉnhphụ,vai,sựdịchchuyểnsangbướcsóngngắnhoặcdài,giảmđộhấpthụ)

+C á c c e p h a l o s p o r i n cóv ò n g

β-l a c t a m đ ề u k é m b ề n d o c ộ n g h ư ở n g amidk h ô n g tồntại.Cộnghưởngamitmấtđichủyếucòndocócộnghưởng“en-amin”.CộnghưởngnàymạnhlênkhiR3hútđiệntử

Tênkhángsinh pKa1 Tênkhángsinh pKa1 Tênkhángsinh pKa1

Penicillin(PEN) 2,74 Amoxicillin(AMO) 2,8 Cloxacillin(CLO) 2,7Ampicillin(AMP) 2,7 Cephalexin(CEP) 2,6 Cefixim(CEF) 2,75Oxacillin(OXA) 2,72

1.1.2 Tácdụng

- Cơchế

CácpenicillincókhảnăngaxylhóacácD-alanintranpeptidase,làmchoquátr ì n h tổnghợppeptidoglycankhôngđƣợcthựchiện.Sinhtổnghợpváchtếbàobịngừnglại.Íttácdụngtrênvikhuẩngram(-).Mặckhác,cácpenicillincònhoạthóaenzymtựphângiảimureinhydroxylaselàmtăngphânhủyváchtếbào,kếtquảlàvik h u ẩ n bịtiêudiệt[11]

lactamaseđểthựchiệngọilàkhánggiántiếp(đƣợcgọilàkhángmethicillin)

- Độctính:

Cáckhángsinhβ-lactamđộctínhthấp,nhƣngcũngdễgâydịứngthuốc:dịứng,màyđay,vàngda,gâyđộcvớithận,rốiloạntiêuhóa…nguyhiểmnhấtlàsốcp h ả n vệ

Thuốckhôngdùngchotrẻsơsinhvàbàmẹtrongthờikỳchoconbú.Chốngch ỉ địnhdịứngvớithànhphầncủathuốc.

- Đánhgiátácdụngkhángsinh

Hoạtlựccủakhángsinhchínhlàtácdụngứcchếsựpháttriểncủakhángsinhđốivớimộtchủngvikhuẩnnhạycảmvàđượcđánhgiábằngđơnvịsinhhọc(UI).Cóhaikiểutínhhoạtlựccủacácthuốckhángsinh:

+Tínhbằngđơnvịquốctế(UI:uniteinternational)vídụ:penicillinGthửtrênmộtchủngtụcầuvàngthì1UIbằng0,6µgpenicillinGnatritinhkhiết,hay1mgpenicillinGtươngđương1667UI;1UIbằng0,627µgpenicillinGkalitinhkhiết

+Tínhbằngđơnvịkhốilượng(mg,g…)đốivớinhiềukhángsinhthiênnhiênvàbántổnghợp[9,13]

Hungary( 1 1 , 8 % ) T i ế p t h e o , c h ư ơ n g t r ì n h A l e x a n d e r n ă m 1 9 9 8

-2000[ 60t h ự c h i ệ n trên26quốcgiachothấytỷlệkhángpenicillincaonhấtcũnglàHồngKông(69,9%),kếđólàPháp(40,5%),Israel(29,7%),NhậtBản(28,5%),TâyBanNha(26,4%),Mỹ(25%),NamPhi(17,9%),BồĐàoNha(10,9%)vàAnh(10%).Tổng

nhiềuquốcgiachâuÁ.Theonghiêncứu2000-2001trênS.pneumoniaexâml ấ n p h â n l ậ p đ ư ợ c t ừ l â m s à n g đ ã g h i n h ậ n mộttỷl ệ

đ ề k h á n g r ấ t c a o đ ố i v ớ i p en icilli nởViệtNam(71%),Hàn Quốc (55%), HồngKông(43%), và ĐàiLoan( 3 9 %) TỷlệđềkhángcaovàcókhuynhhướngchungngàycànggiatăngđốivớimacrolidescũngđượcANSORPghinhậntạihầuhếtcácquốcgiathamgianghiêncứ u [49,đặcbiệttạiViệtNam(65%năm1996-

1997,đến88%năm1998-2001),H à n Quốc(từ75%lên85%),TrungQuốc(từ35%lên76%),Singapore(từ28%lên53

%),hayĐàiLoanluôngiữởmứcđộcao(89%và87%)

TạiViệtNam,theobáocáocủaNguyễnKimPhượngnăm1997tại23trạmyt ế ởHảiphòng,69%bệnhnhânđượcuốngkhángsinh,71%bệnhnhânkhôngdùngk h á n g sinhđúngliềulượngvàđúngthờigiandưới5ngày

Theo [12,qua thốngkêtại khoaDịứng-MiễndịchlâmsàngBệnhviệnBạchMaichothấy,hơn70%bệnhnhândịứngdodùngkhángsinh,trongđócókhôngítt r ẻ em.Sốcphảnvệdodùngkhángsinhlà taibiếnnghiêmtrọngnhất,dễgâytửvong.Nhiềutrườnghợpdịứngthuốcgâygiảmhồngcầu,bạchcầu,thiếumáuhuyếttán,xuấthuyếtgiảmtiểucầu,tổnthươngtếbào gan PhógiámđốcBệnhviệnNhiTr un gươngNguyễnVănLộcthừanhận,tiềnmuakhángsinhđangchiếmtới60%

viênthuộc93quốcgianhằmchốnglạisựlantràncủacácbệnhdovitrùngkhángthuốctạicácnướcđangpháttriển

đềra“Kếhoạchtoàncầuđểkiểmsoátsựđềkhángkhángsinh”.Kếhoạchđềcậpđếnmọihoạtđộngytếcủatấtcảcácquốcg ia đãpháttriểncũngnhưđangpháttriển:phòngthínghiệmphảităngcườngkhảnăngchẩnđoáncácbệnhnhiễmtrùng,giúpchẩnđoánnhanhchóngvàchínhxác,đolườngđộnhạycủakhángsinh,đonồngđộkhángsinhtrongmáu.Ngànhdượccầncungcấpđầyđủthuốcthiếtyếu,ngănngừasựlưuhànhcủacácthuốcgiả,5%l ượn g thuốclưuhànhtạicácnướcđangpháttriểnlàthuốcgiảmạo,khôngđúngphẩmchất,hàmlượnghoặckhôngcóhoạtchất

Nếungănngừađượcsựpháttriểncủacácvitrùngkhángthuốcchúngtasẽbảovệđượcmôitrườngsống,duytrìđượcsựhữuhiệucủakhángsinh,hạnchếđượcchiphívềytếvàcứuđượcnhiềusinhmạng

TheonghiêncứucủaPhạmHùngVânvàcộngsự,204chủngS.pneumoniaeb a

lấnđượcthunhậntừ10bệnhv i ệ n khácnhautạiViệtNam,baogồmhaibệnhviệnlớntạiHàNội,mộtbệnhviệnlớntạiĐàNẵng,và7bệnhviệntạithànhphốHồChíMinh.CácchủngvikhuẩnnàyđượclàmthửnghiệmE-

testđểpháthiệnđềkhángpenicillinvàamox icilli n/

cl avu lan i c axitvàthửnghiệmkhángsinhđồphươngphápkhuếchtánkhángsinhtrongthạchmộtsốkhángsinhkhácnhưmacrolides,s u l f a m e t h o x a z o l /

t r i m e t h o p r i m , chloramphenicolvàfluoroquinolones.Kếtquảcho

penicillin42%,72%đềkhángerythromycin,86%khángclarithromycin,74%khángazithromycin,75%khángsulfamethoxazol-

trimethoprimvà29%khángchloramphenicol;vik h u ẩ n hãycònnhạycảmcaov ớ

i l i n e z o l i d e , các fluoroquinolonesvàamoxicillin/

clavulanicaxitvớitỷlệđềkhángkháthấptừ0%đến2%.Kếtquảnghiêncứucũngchothấyvikhuẩnkhángpenicillincótỷlệđềkhángcáckhángsinherythromycin,clarithromycin,a z i

c l a v u l a n i c a x i t , 34%đốivớicefepime,28%đốivớiticarcillinclavulanicaxit,38%đốivớichlor amph en ico l , 25%đốivớicotrimoxazol,17%đốivớilevofloxacin,vàchỉ8%đốivớirifampicine

lactamhấpthụUVn h ư n g độhấpthụkhôngcao,chúngcũngtạophứcvớimộtsốionkimloạigiúpnâng caođộnhạycủaphépđo.Trongnhiềutrườnghợp,cácβ-lactamđượcthủyphânthànhcácchấtđơngiảnhơnđểphântích

Phươngphápquangphổhấpthụphân tửUVdựavàophảnứng giữa nhómacetylcủa cephalexinvớianhydritaxetictrongdungdịchnướctạipH= 11,5đểtạot h à n h α -acetamidocephalexinv à s a u đ ó đ o q u a n g t ạ i b ư ớ c s ó n g 3 3 5 nmc ủ a α-

acetamidocepha lexinmercuricmercaptide,khoảngnồngđộtuântheođịnhluậtBeer

ml[20.Mộtsốthuốcthửkhácđượcsửdụngđểđịnhlượngcephalexincótrongthuốcđãđượccôngbố[21,45,54,67]

Theo[29,AMOvàAMPđượcxácđịnhtrongthuốcuốngbằngphươngphápphổhấpthụphântử.DungdịchphântíchcópH=7,KCl50mM,PdCl21 0mMtạoph ứcmàuvàngđượcpháthiệnởbướcsóng335nm,giớihạnpháthiệnthuđượclầnlượtlà0,76μg/g/mlvà0,76μg/g/ml

Cácchấtmàcókhảnăngpháthuỳnhquangkhôngnhiều,đặcbiệtlà lactam khôngcótínhchấtphátquangnênđểđođượccácβ-

cácβ-lactamtheohướngnàycầnphảidẫnxuấthóađểtạosảnphẩmcótínhchấtphátquang,sửdụngdetectorhuỳnhquangđểđịnhlượngchúng.TheoA.Fernández-

Gonzálezvàcộngsự[43]d ù n g Cu2+t h ủ yphânvàtạophứcvớiAMP,vớibướcsóngkíchthích343nm,phát

ịn hsẽ kémchính xác.Ngoàira,trongnhiềutrườnghợpchấtphântíchcầnthủyphânmớipháthiện đượccũnglàsựhạnchếcủaphươngphápnày

1.3.2 Phươngphápđiệnhóa

Mộtsốphươngphápđiệnhóađãđượcứngdụngđểphântíchcácβ-lactamnhưngkhôngphổ b iế n TheoDa ni ela P Sa nt os và cộn gsự[39,sửd ụ n gsensorđ i ện thếphântíchAMO,đạtgiớihạnphát hiện0,92μg/M(0,39μg/g/ml)trongmôitr ường đệmaxetat0,1MpH=5,2

TácgiảLivàChen[56đã xácđịnhcephalexintrongmôitrườngkiềm.CònYetBennerthìxácđịnhcephalexintrongmôitrườngaxítH2SO40 , 1 2 5M,sóngcựcphổtạithế-1,25V,khoảngtuyếntínhgiữacườngđộdòngvànồngđộcephalexintừ1-70μg/g/

ml.MặtkháccũngxácđịnhcephalexinnhưngtácgiảFogg[44đãxácđịnhbằngphươngphápđocựcphổmộttrongsốcácsảnphẩmthủyphânsaukhihydrohóaởpH=7,4ở10

00Ctrong1giờ

TácgiảXuvàcáccộngsự[79đãnghiêncứutínhchấtđiệnhóacủacephalexintrongđiềukiệncómặtvàkhôngcómặtH2O2,tácgiảcũngđãtốiưuhóacácđiềukiệnxác

địnhcephalexintrongmẫuthuốcvàmẫuhuyếtthanhvớikỹthuậtc ự c phổquétthếtuyếntính.Cụthể,cephalexinchosóngkhửtrongmôitrườngHCl0,03Mtạithế-

Vớiphươngphápđiệnhóathìhầuhếtcáctácgiảđềutậptrungnghiêncứucephalexin,Chailapakul[37đãsửdụngđiệncựcmàngmỏngkimcươngcóthêmlượngnhỏBođểnghiêncứutínhchấtđiệnhóacủaglutathionevàcephalexintrongmôitrườngđệmcacbonat0,1MpH=9,2.Khoảngđộnghọctuyếntínhchoglutathionelà0,1-

5,0mMvớigiớihạnpháthiệnlà10μg/M.Đốivớicephalexinthìgiớihạnpháthiệnlà5,0mM.Mộtsốtácgiảkhácđã xác địnhhọcephalosporinbằngphươngphápcựcphổ,phươngphápvon-ampehòatan[46,48,63,64,72]

1.3.3 Sắckýlỏnghiệunăngcao(HPLC)

Trongnhữngnămgầnđây,phươngphápHPLCđãđóngmộtvaitròvôcùngq uan trọngtrongviệctáchvàphântíchcácchấttrongmọilĩnhvựckhácnhau,nhấtlà t r o n g

v i ệ c t á ch và phântích lượng vếtcácchất Phương phápHPLCvớicộttáchph ađảođượcsửdụngrấtrộngrãiđểxácđịnhcáckhángsinhβ-

lactamtrongcác

loạimẫukhácnhaudocónhiềuưuthếsovớicácphươngphápkhác

vìcóđộchínhxác,độnhạy,độlặplạicao,khoảngtuyếntínhrộng…

DetectorghépnốitrongmáyHPLCchophéppháthiệnsựxuấthiệnchấtsaukhirửagiải.Hiệnnaycórấtnhiềuloạidetectorđượcsửdụngchomụcđíchnàyđãm ở rộngkhảnăngphântíchđượcrấtnhiềuloạichấtbằngphươngphápHPLC.Đốivớiphântíchdưlượngkhángsinhβ-

lactam,detectorkhốiphổ(MS)làmộtsựlựachọnưutiêndocóthểpháthiệnvàphântíchchấttrongcácđốitượngphứctạp.T heodượcđiểnViệtNam,hàmlượngcephalexinđượcxácđịnhbằngphươngphápHP L C vớithànhphầnphađộng:metanol-acetonitril-dungdịchkalidyhidrophotphat0,136%-nước(2:5:10:83),phatĩnhđượcnhồiC-

18(5µm),detectortửngoạiđặtt ạ i bướcsóng254nm,thểtíchtiêm20µl,tốcđộdòng1,5ml/phút[9]

Theot à i l i ệ u [55cũngx á c đ ị n h c e p h a l e x i n t h ì t h à n h

acetonitril-metanol-đệmaxetatpH4,2(10:10:80%v/v/v),giớihạnpháthiệnc e p h a l e x i n là1μg/g/mltrongmẫuhuyếttươngvà5μg/g/mltrongmẫunướctiểu

PhươngphápHPLCchophépxácđịnhđượcđồngthờihọcephalosporinsvớicộ t táchC-18,thànhphầnphađộnglàmetanol-tetrahydrofuran-

nướctheotỉlệ1 6 :4:80,giớihạnpháthiệnlà0,5μg/g/ml[61,74]

J.M.Chavàcộngsự[35dùngphươngphápHPLC/MSđểphântíchβ-lactamtrongn ư ớ c s ô n g v à n ư ớ c t h ả i Đ i ề u k i ệ n chạys ắ c k ý : c ộ t X t e r r

a M S R P C18( 2 , 1 m m × 5 0 m m ,2,5μg/m);phađộng:A=axitfocmic0,1%,B=metanol(MeOH),C = A c e t o n i t r i l ( A C N ) ; chạyg r a d i e n t : b ắ t đ ầ u A / B /

C =9 0 : 5 : 5 ( v / v / v ) , 8 p h ú t A/ B /C = 5 0 : 4 0 :1 0 , 20phútA/B/

C=90:5:5;tốcđộphađộng0,25ml/

phút;nhiệtđộcột450C;thờigian20phút.ÁpdụngphântíchAMO,AMP,oxacillin(OXA),CLO,ceph ap ir in cógiớihạnpháthiệncủaphươngpháplà8–10ng/lvớinướcbềmặt,1 3–18ng/lvớinướcthảitrướcxửlý,8–15ng/lvớinướcthảisauxửlý

TheodượcđiểnViệtNam[9,

hàmlượngcácβ-lactamđượcxácđịnhbằngphươngphápHPLCnhưamoxicillinicvớithànhphầnphađộng:metanol– natri dy hidr oph ot phat monohydrat0,78%

(pH=4,4)theotỷlệthểtích(5:95),phatĩnhC-18(5µm),detectortửngoạiđặttạibướcsóng220nm,cònhàmlượngcephalexin

đượcx á c đ ị n h b ằ n g p h ư ơ n g p h á p H P L C v ớ i t h à n h p h ầ n p h a đ ộ n g :metanol- acetonitril-dungdịchkalidyhidrophotphat 0,136%-nước(2:5:10:83),phatĩnhđ ư ợ c nhồiC-18(5µm),detectortửngoạiđặttạibướcsóng254nm.

TácgiảBlanchflowerWJvàcộngsự[32],dùngHPLC/

MSphântíchpenicillinV,PEN,oxacillin,CLO,dicloxacillintrongthịt,thậnvàsữa.Điềukiệnchạys ắ c k ý : c ộ t I n e r t s i l O D S 2 ( 4 , 6 m m × 1 5 0 mm,5

( C2H5)3N0,5%(45/55),dùngnafcillinlàmnộichuẩnđạtgiớihạnpháthiệntrong

sữ a 2-10μg/g/kg,trongthịt25-100μg/g/kg

MộtdetectorquantrọngtrongphươngphápHPLClàdetectorhuỳnhquang,cóư u điểmđộnhạy,độchọnlọccao.TheotácgiảC.Y.WAngvàcộngsự[22]dùngcột

nồngđộứcchếtốithiểucủamộtkhángsinhlàn ồ n g đ ộ thấpnhấtmàkháng

chếsựpháttriểncủavikhuẩnsaukhoảng24giờnuôicấy)làmộttrongcácthôngsốquantrọngnhấtđểđiềutrịcóhiệuquả[17,34.NóthườngcótácdụngkìmkhuẩnkhiT>MICđượcduytrì30%c ủ a khoảngthờigiandùngthuốcchopenicillin,40%đốivớicephalosporinvà20%đốivớicarbapenems,vàdiệtkhuẩnkhiT>MICvượtquá50%củakhoảngthờigiandùngthuốckhángsinhpenicilin,60-

70%chocáccephalosporinvà40%chocarbapenems[38,70.Nhữngpháthiệnnàyđãdẫnđếnviệctốiưuhóacácphácđồliềulượngđểtănghiệu

quảđiềutrịvàgiảmcácthếhệcủanhữngchấtđềkhángvớicáckhángsinh[41,71.Vìvậy,theodõinồngđộkhángsinhtronghuyếtthanhlàv iệc vôcùngquantrọng.NhiềutácgiảdùngphươngphápHPLC/UVđãphântíchk h án g s i n h β -

lactamt r o n g c á c d ị c h s i n h h ọ c , b a o gồmc ả h u y ế t t ư ơ n g n g ư ờ i [ 41,78.Ngoàira,LC/MS/

MSđượccoilàkỹthuậtưathíchđểxácđịnhlượngvếtcácchấttrongmẫusinhhọcnhưmáu,huyếtthanh,nướctiểuvàcácmô[80.Nhưtrong[ 68,t á c g i ả

để phântíchcácβ-lactam

Nóichung,khiphântíchkhángsinhtron gcácđốitượngmẫuphứctạpnhưthựcphẩm,mẫusinhhọc,mẫunướcthải,việcxửlýmẫuđốivớicácphươngphápđềuđòihỏiquitrìnhxửlýphứctạpdocáckhángsinhliênkếtchặt chẽvớinềnmẫuvàcónhiềuchấtnhiễucầnloạitrừ.Quitrìnhxửlýchủyếusửdụngchiếtlỏnglỏnghaychiếtpharắn(SPE)…

1.3.4 Phươngphápđiệndimaoquản-lactamelectrophoresis(CE)

Gầnđây,phươngphápCEđượcsửdụngrộngrãidotínhchấtưuviệtvềhiệuquảtáchcao, thời giantách ngắn, lượngmẫutiêu tốn ít Phương phápđãđượcứngdụngđểtáchvàxácđịnhcáckhángsinhβ-

lactamtrongnhiềuđốitượngmẫukhácn h a u HầuhếtcáccôngtrìnhđềuquantâmđếnviệcápdụngmodelMEKCđểtáchv àxácđịnhcácpenicillintrongmẫumôitrường[72,hoặctrongmẫudượcphẩm[47,57,65]

BiyangDengvàcộngsự[31đ ã sửdụngphươngphápđiệndivớidetectorđiệnquanghóaxácđịnhAMOtrongnướctiểungườivớigiớihạnpháthiệnthấp0,31μg/g/l,khoảngtuyếntínhrộng1μg/g/l–8mg/

lcùngđộthuhồicao95,77%,độlệchchuẩntươngđốikhônglớnhơn2,2%vàthờigianphântíchngắn6phút/mẫu

L.Nozal,L.Arce1,A.R

´ıos,M.Valcárcel[62s ử dụngphươngphápđiệndimaoquảnđiệnđộnghọckiểumixen(MEKC)vớithànhphầndungdịchđệmđiệndigồm40 mMđệmborat,100mMSDSpH8,5.Tiếnhành

phântíchtạithếđiệndi10kV,nhiệtđộ200C,thờigianbơmmẫu10s.Phươngphápchophéptách6khángsinhgồm:AMO,AMP,PENG, OXA,penicillinVvàCLOđãđượcứngdụngphântí c h trongmẫunướcthảicủatrangtrạichănnuôi.Giớihạnpháthiệntừ0,14đến0,27mg/l,độlệch chuẩntương đốitừ0,25đến 0,86%,diệntíchpic1,3đến4,15%.Đ ộ thuhồitrên96%

AttilaGasparvàcộngsự[24đãtáchvàxácđịnhthànhcông14khángsinhhọcephalosporinb ằ n g p h ư ơ n g p h á p đ i ệ n dimaoq u ả n v ù n g ( c a p i l l a r y z o n e electrophoresis–

C Z E ) Q u á t r ì n h t á c h d ù n g đ ệ m p ho tp ha t 2 5 m M c ó p H = 6 , 8 Phươngphápnàytáchđược14khángsinhtrongvòng20phút,giớihạnpháthiện

14 kháng sinh cefalosporin, cefoxitin, cefazolin, cefadroxil, cefoperazon,

l.Trongđócefalexinvàcefiximcóg i ớ i hạnpháthiệntươngứng1,62và0,89mg/l;khoảngtuyếntính5–200mg/

l.Mục đíchcủaphươngphápđượcứngdụngđểnghiêncứuđộbềncủakhángsinhhọcephalosporinstrongnướctạinhiệtđộkhácnhau(+25,+4và-

180C).Kếtquảchothấycáckhángsinhgiảmnồngđộkhônglớnhơn20%tạinhiệtđộphòngsaukhiph aloãng

M.I.Bailon-Perezvàcộngsự[28sửdụngphươngphápCZEvàdetectorUV–

DA D , phađộngdùnghệđệmtris175mMpH8,0và20%(v/

v)ethanol,dùngkĩt h u ậ t chiếtpharắnlàmsạchvàlàmgiàumẫuứngdụngphântíchđồngthờiAMP,AMO ,dicloxacillin,CLO,OXA,PEN,nafcillintrongnềnmẫunước(nướcsông,nướcthải…).Giớihạnpháthiệntươngứng0,8;0,8;0,25;0,30;0,30;0,9;0,08μg/g/lcùng độthuhồiđạt94–99%vớiđộlệchchuẩntươngđốithấphơn10%

PhươngphápMEKC cũngđượcM.I.Bail´onP´erez,L.Cuadros Rodr´ıguez,C.Cruces-Blanco[26táchvàxácđịnh9loạikhángsinhβ-

lactamgồmcloxacillin,d i cl o x a c i l l i n , O X A , P E N G , p e n i c i l l i n V , A M P , n a f c i

l l i n , p i p e r a c i l l i n , A M O t r o n g mẫudượcphẩm.Cácđiềukiệntốiưuđượcchọnlà26mMđệmBorat,100mMS DS pH8,5làmchấtnềnđiệndivàthếđiệndi25kV.GiớihạnpháthiệnLOD0,35 đến1,42mg/

l,giớihạnđịnhlượng2,73đến5,74mg/

l,độlệchchuẩntươngđ ốithờigianlưutừ1,5đến1,7%.Độthuhồitừ91–95,6%

*Chiếtpharắn(solidphaseextraction-SPE)

Chiếtpharắn(SPE)làmộtphươngphápchuẩnbịmẫuđểlàmgiàuvàlàm sạchchấtphântíchtừdungdịchbằngcáchhấpphụlênmộtcộtchiếtpharắn,sauđó chấtphântíchđượcrửagiải(giảihấp)bằngmộtdungmôithíchhợp.ƯuđiểmcủaphươngphápSPElàhiệusuấtthuhồicao,khảnănglàmsạchchấtphântíchlớn,dễtựđộnghóa,lượngdungmôisửdụngítvàcóthểkếthợptốtvớiphươngphápđiệndimaoquản(CE).SPErađờitừnhữngnăm1970vàdầndầnthaythếphươngphápchiếtlỏng-lỏng[35]

Quátrìnhchiếtpharắngồm4bướcchínhnhưsau:

B 1 Hoạthóa cột B 2 Nạpmẫu B 3 Rửagiải

Rửa giải các tạp chất

Mẫu nước

Không có tính ion, phân cực Không phân cựcIon, phân cực

Trao đổi ion

ân cực,thìviệcchọnphađảovớichấthấpphụC8hoặcC18làphươngántốiưu

Hình1.6CơchếSPEphântíchcácmẫunước

*Kỹthuậtchiếtpharắn(SPE)sửdụngchochấtphântíchtrongcácđốitượngmẫusinhhọ c[75]

Chiếtpharắn(SPE)vớiphatĩnhkếthợpgiữacơchếchiếtphađảovàtươngt á c ư a

n ư ớ c( h y d r o p h i l i c l y p o p h i l i c w a t e r

-wettabler e v e r s e d p h a s e ) đ ã đ ư ợ cá p

dụngrấthiệuquảtrongphântíchcácđốitượngmẫusinhhọcnóichungvàmẫun ướctiểunóiriêng.

Hình1.7.CấutrúccủaphatĩnhcộtSPEdùngchocácmẫusinhhọc

Oasis®HLB

(hydrophilic-lipophilicbalance)làmộtchấthấpphụkếthợpcơchếtươngtácphađảovàtươngtácưanước.PhatĩnhnàyđượctrùnghợptừhaimonomecótỷlệbằngnhaulàN-

vinylpyrolidoncótínhưanướcvàdivinylbenzencó tínhkỵnước.ChấthấpphụOasiscócấutrúckhônggianlớn(thểtíchlỗrỗnglà1,3cm2/