Nghiên Cứu Để Xác Định Hàm Lượng Tannin Của Cây Trang (Kandelia Obovata Sheue, Liu & Yong) Và Cây Đước (Rhizophora Stylosa Griff) Ở Một Số Độ Tuổi Khác Nhau Tại Rừng Ngập Mặn Huyện Giao Thuỷ, Tỉnh Nam Định.docx

MỞ ĐẦU 1 Khãa luËn tèt nghiÖp Trêng §HSP Hµ Néi MỞ ĐẦU 1 Lý do chọn đề tài Rừng ngập mặn (RNM) là một hệ sinh thái độc đáo về các nhân tố vô sinh (nhiệt độ, ánh sáng, thuỷ triều ) và hữu sinh (thực vậ[.]

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài.

Rừng ngập mặn (RNM) là một hệ sinh thái độc đáo về các nhân tố

vô sinh (nhiệt độ, ánh sáng, thuỷ triều ) và hữu sinh (thực vật, động vật,

vi sinh vật)

RNM có vai trò hết sức to lớn với việc phòng chống thiên tai, điềuhoà khí hậu trong vùng Theo tài liệu của Phan Nguyên Hồng (1999) [8] đãviết, Blasco (1975) nghiên cứu khí hậu và vi khí hậu rừng đã có nhận xét:các quần xã rừng ngập mặn là một tác nhân làm cho khí hậu dịu mát hơn,giảm nhiệt độ tối đa và biên độ nhiệt đồng thời RNM còn có vai trò quantrọng trong việc bảo vệ môi trường

Bên cạnh vai trò to lớn về sinh thái, RNM còn có vai trò quan trọng

về kinh tế-xã hội RNM là nơi cung cấp cho người dân các nguồn lợi như:thuỷ hải sản vừa có giá trị kinh tế vừa là nguồn thức ăn giàu dinh dưỡng,cung cấp các loại lâm sản có giá trị ví dụ: gỗ dùng làm vật liệu xây dựnghoặc là củi đun Không chỉ có thế RNM là nguồn cung cấp thực vật làmdược liệu Nhân dân Việt Nam và các nước có rừng ngập mặn từ lâu đã sửdụng cây ngập mặn làm thuốc nam chữa các bệnh thông thường, đặc biệt làtrong hai cuộc chiến tranh Đông Dương vừa qua Là vùng căn cứ địa khángchiến bị địch bao vây, điều kiện khí hậu ẩm ướt, vệ sinh kém nên có nhiềubệnh tật Nhưng nhờ sử dụng thuốc từ các cây trong vùng RNM nên đãphát hiện nhiều loài cây chữa bệnh có giá trị như: cây ráng chữa bỏng, mụnnhọt; cui biển chữa ỉa chảy, kiết lị; sài hồ nam chữa đau đầu, giảm sốt…[8]

Tuy có vai trò to lớn như vậy nhưng hiện nay RNM đang giảm sútnhanh chóng do các nguyên nhân như: phá rừng làm đầm nuôi tôm, khaithác quá mức, phá rừng lấy đất sản xuất nông nghiệp, khai thác khoáng sản,

đô thị hoá, làm đường xá

Diện tích RNM được công bố vào các năm 1943, 1962, 1982 và

2000 Theo số liệu năm 2000 diện tích rừng ngập mặn chỉ bằng 38% so vớinăm 1943 Điều này cho thấy tốc độ mất rừng ngập mặn Việt Nam là rấtcao, khoảng 4.400ha/năm [4] Với nhịp điệu phát triển không ngừng của xãhội về mọi mặt thì nhu cầu của con người về ăn, ở, mặc, giải trí ngày càngtăng lên Cùng với sự phát triển đó kéo theo hàng loạt các vấn đề toàn cầuphải lo lắng như: ô nhiễm môi trường ngày càng tăng, bệnh tật pháttriển, gây sức ép cho xã hội trong đó có ngành y tế Nước ta hầu như phảinhập nguyên liệu sản xuất thuốc hoặc thuốc đã thành phẩm từ nước ngoàivới giá rất cao Trong khi đó nguồn nguyên liệu nước ta rất nhiều trong đó

có tanin là nguồn nguyên liệu có giá trị to lớn trong y học như: chữa tiêuchảy, viêm ruột, chữa ngộ độc tiêu hoá, chữa trĩ, và có giá trị trong một sốngành khác như: thuộc da, nhuộm vải, kỹ nghệ in, chế tạo mực, Một trongnhững nguồn nguyên liệu giàu tanin có thể tiến hành khai thác đó là nhữngcây rừng ngập mặn với diện tích lớn chủ yếu là các cây họ Đước Nhưngkhi khai thác cây ngập mặn người ta mới chỉ chú trọng đến việc lấy gỗ thânphục vụ nhu cầu chất đốt và xây dựng còn các phần khác thì bỏ phí Hiệnnay, các đề tài nghiên cứu về tanin ở các cây rừng ngập mặn là rất ít, trongkhi nước ta có diện tích rừng ngập mặn khá lớn khoảng hơn 200.000ha vớithành phần loài tuy không nhiều nhưng số loài cây có khả năng cung cấptanin thì có số lượng rất lớn như: trang, đước, vẹt

Xuất phát từ lí do trên cùng với lòng say mê nghiên cứu và yêu thíchkhoa học và để góp phần xác định khả năng cung cấp tanin từ các cây rừngngập mặn phục vụ cho nghiên cứu, chiết xuất được dễ dàng hơn chúng tôi

chọn đề tài: “Nghiên cứu để xác định hàm lượng tannin của cây trang

(Kandelia obovata Sheue, Liu & Yong) và cây đước (Rhizophora stylosa

Griff) ở một số độ tuổi khác nhau tại rừng ngập mặn huyện Giao Thuỷ,

tỉnh Nam Định”.

2 Mục đích nghiên cứu.

- Nghiên cứu hàm lượng tanin trong các bộ phận khác nhau của cây

đước vòi (R stylosa) và cây trang (K obovata) ở các độ tuổi khác nhau.

- Nghiên cứu hàm lượng tanin để chiết xuất

- Cung cấp số liệu, cơ sở khoa học cho các ngành khác như y học,công nghệ thuộc da khai thác tanin

3 Nội dung nghiên cứu.

- Định tính tanin trong các mẫu nguyên liệu nghiên cứu

- Xác định hàm lượng và sự biến động tanin trong một số cơ quancủa cây trong các mẫu nguyên liệu nghiên cứu

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Những nghiên cứu về tanin

Từ “tanin” được dùng đầu tiên vào năm 1976 để chỉ những chất cómặt trong dịch chiết từ thực vật có khả năng kết hợp với protein của dasống động vật làm cho da biến thành da thuộc không thối và bền [2]

Năm 1879 Pronst đã chế được tanin tinh khiết và từ năm 1978 đã chiếtxuất được tanin

Tanin có cấu trúc phức tạp, dựa vào cấu trúc hoá học người ta chiatanin thành 2 loại chính tanin thuỷ phân (tanin pyrogallic) và tanin khôngthuỷ phân được (tanin pyrocatechic)

Người ta thấy nhóm tanin này phổ biến trong thiên nhiên có hoạt tínhdược lý cao nên ngày càng được chú ý [5]

Chúng tôi tìm thấy một số công trình nghiên cứu về tanin chủ yếu là

từ năm 1995 trở lại đây Các công trình này chủ yếu nghiên cứu trên câynước ngọt, đối với cây ngập mặn chúng tôi tìm được một công trình duynhất của Hoàng Thị Oanh năm 2008

Năm 1995, Triệu Duy Điệt [5] khi nghiên cứu thành phần hoá học

cây xoan trà (Choerospondias axillaceris Burttet et Hill) bằng các phản

ứng định tính đã xác định trong cây xoan trà có chứa tanin catechic là hợpchất chủ yếu có tác dụng chữa bỏng, phần đơn phân tử có tác dụng làm bềnvững thành mạch, thải chất phóng xạ ra khỏi cơ thể và có tác dụng chốngoxy hoá mạnh Và tác giả cũng đã xác định được hàm lượng tanin trong vỏthân là cao nhất đạt 29,26%, trong lá thấp nhất đạt 14,65% và hàm lượngtanin trong vỏ thân ở các độ tuổi có sự khác nhau, theo tác giả cây càng giàhàm lượng tanin càng cao, vỏ cây 7 tuổi hàm lượng tanin là thấp nhất đạt17,55%, vỏ cây 20 tuổi đạt 24,5%, vỏ cây 35 tuổi là cao nhất đạt 31,54%

Cũng vào năm 1995, Phùng Thị Vinh [20] khi nghiên cứu về thành

phần hoá học và tác dụng sinh học của cây chè dây (Ampelopsis cantoniensis Planch) đã xác định được tanin trong chè dây là tanin catechic

và định lượng được hàm lượng tanin trong cây chiếm từ 10,82% - 13,3%.Đến năm 1998, Hà Viết Quý [14] khi nghiên cứu thành phần

falavonoid và tanin có trong cây Geranium thunbergii Sieb Et zucc, đã tiến

hành nghiên cứu chung toàn bộ phần trên mặt đất của cây, bằng các phản

ứng định tính đã xác định được trong dịch chiết của cây có tanin pyrogallic

và cũng đã xác định được hàm lượng tanin trong cây là tương đối cao(14,30%), theo tác giả đây có thể là một trong những hợp chất chính củacây

Đến 2001, Phạm Thị Thanh [15]cũng đã xác định được trong đơn lá

đỏ (Excoecaria cochinchinensis Lour) có chứa tanin pyrogallic và xác định

hàm lượng tanin trong cây theo phương pháp bột da chiếm 10,64%

Năm 2002, Vương Thị Hồng Vân [18] khi nghiên cứu chè dây Sapa (

Ampelopsis cantoniensis Planch) cũng đã xác định được trong chè có chứa

tanin catechic giống như nghiên cứu của Phùng Thị Vinh năm 1995, đặcbiệt tác giả đã xác dịnh và so sánh hàm lượng tanin trong cây chè dây ởSapa và Cao Bằng, theo tác giả hàm lượng tanin trong lá chè dây thu hái ởCao Bằng (11,71%) cao hơn ở Sapa (8,02%)

Năm 2003, Nguyễn Thái An [1] nghiên cứu cây đơn lá đỏ () cũng xácđịnh được trong cây có chứa tanin pyrogallic giống với kết quả của PhạmThị Thanh 2001 và tác giả tiến hành nghiên cứu trên các mẫu thu hái ở thờigian khác nhau, bộ phận khác nhau và cách xử lý mẫu khác nhau đã đi đếnkết luận: Hàm lượng tanin có trong các mẫu nghiên cứu đều khá cao từ 9%

- 11%, hàm lượng này có sự thay đổi theo thời gian, đạt cao nhất vàokhoảng thời gian tháng 4, 5, 6 khi cây đang trong thời kỳ ra hoa, đặc biệtvào tháng 5 hàm lượng tanin có thể đạt là 11,68%

Năm 2004, Phạm Thuỳ Dương [6] lại tiếp tục nghiên cứu tanin trong

chè dây (Ampelopsis cantoniensis Planch), tác giả không đơn thuần tiến

hành định tính và định lượng hàm lượng tanin trong cây mà đã đề ra cácphương pháp chiết xuất tanin từ lá chè dây, so sánh hàm lượng chiết đượctác giả đã xác định được phương pháp chiết xuất đạt hiệu quả cao

Năm 2008, Nguyễn Thuý Hằng [7] khi nghiên cứu thành phần hoá

học của cây cườm rụng hoa dài (Ehretia Longiflorachamp) đã đề cập đến

tanin nhưng mới chỉ mang tính chất định tính, chỉ xác định được trong cây

có chứa tanin mà chưa phân loại được tanin và chưa xác định được hàmlượng tanin trong cây

Cũng vào năm 2008, Hoàng Thị Oanh [12] nghiên cứu nguồn nguyênliệu dùng để chiết xuất tanin ở khu vực rừng ngập mặn Giao Thuỷ, Nam

Định Tác giả đã tiến hành nghiên cứu trên ba đối tượng là cây trang (K cadel L Durce), cây đước vòi (R stylosa Griff) và cây vẹt dù (B gymnorrhiza (L.) Lamk) Khi định lượng bằng phương pháp bột da đã xác

định được hàm lượng tanin trong rễ, thân, cành và lá của các đối tượngnghiên cứu Đây là công trình duy nhất tiến hành trên cây ngập mặn chúngtôi tìm thấy nhưng tác giả mới chỉ định lượng trên các cây chung chung màchưa phân ra các độ tuổi khác nhau Chính vì vậy chúng tôi cũng tiến hànhnghiên cứu trên cây đước vòi và cây trang nhưng ở một số độ tuổi khácnhau và tiến hành định lượng bằng phương pháp khác (PP oxy hoá)

1.2 Khái niệm về tanin.

Tanin là những hợp chất của polyphenol có trong thực vật, có vị chátđược phát hiện dương tính với thí nghiêm thuộc da

Định nghĩa này không bao gồm những chất phenol đơn giản hay gặpcùng tanin như acid gallic, các chất catechic, acid chlorogenic…; mặc dùnhững chất này ở điều kiện nhất định có thể cho kết tủa với gelatin và mộtphần nào được giữ trên bột da sống chuẩn Chúng được gọi là pseudotanin

Cơ chế thuộc da: do tanin có nhiều nhóm –OH phenol, tạo nhiều dâynối hydro với mạch polypeotid của protein, do đó da sống động vật biếnthành da thuộc không thối và bền

Phân tử tanin càng lớn thì sự kết hợp với protein càng chặt

Phân tử lượng tanin phần lớn từ 500 – 5000

Dây nối hydro giữa tanin và protein [2]

1.3 Cấu trúc hoá học của tannin.

Cấu trúc của tanin phức tạp được chia làm 2 loại:

- Tanin thuỷ phân được (tanin pyrogallic)

- Tanin không thuỷ phân được (tanin pyrocatechic)

1.3.1 Tanin thuỷ phân được

Khi thuỷ phân bằng acid hoặc bằng enzyme tanase thì giải phóng raphần đường là glucose, đôi khi cũng gặp những loại đường đặc biệt.Phần không phải đường là các acid, acid hay gặp là acid gallic Cácacid gallic nối với nhau băng dây nối depsid tạo thành acid digallic,acd trigallic:

Acid digallicNgoài acid gallic còn có các acid khác như acid ellagic, acid luteolic…

OH

OH

HO

COOH

Khãa luËn tèt nghiÖp Trêng §HSP Hµ Néi

Acid ellagicAcid luteolic Phần đường và phần không đường nối với nhau theo dây nối ester nênngười ta gọi loại này là Pseudoglycosid

- Khi cất khô ở 180 – 2000C thì thu được pyrogalol

- Cho tủa màu xanh đen với muối sắt III

- Thường dễ tan trong nước

1.3.2 Tanin ngưng tụ.

Được hình thành từ những đơn phân cơ bản là catechin vàepicatechin, đó là hai chất đồng phân của nhau Phân tử cơ bản thuộcloại flavan có cacbon số 4 là nhóm methylen (-CH2-) dễ ngưng tụthành các polymer

HO

O

O HO

OH

OH OH

OH

O HO

OH

OH

OH OH

Epicatechin- (4β-8)-catechin

- Cho tủa xanh với muối sắt III

- Khi cất khô thì cho pyrocatechin

- Khó tan trong nước hơn tanin thuỷ phân

Có thể dựa vào kết tủa với muối sắt để xác định tanin trên vi phẫu

1.5 Tác dụng và công dụng của tanin

O HO

OH

OH OH

OH OH

OH

OH

OH

* Trong cây:

- Tanin tham gia vào quá trình trao đổi chất, các quá trình oxy hoá khử

- Là những chất đa phenol, tanin có tính kháng khuẩn nên có vai trò bảo

vệ cho cây

* Trong y học:

- Dung dịch tanin kết hợp với protein tạo thành trên màng niêm mạc nên

có tác dụng làm thuốc săn da

- Tanin là thành phần chính có tác dụng chữa bỏng, vết thương do tínhchất của nó khi tác dụng với protein của huyết tương tạo thành tủa tanatprotein Lớp tủa này sau 10-15 phút se khô thành màng mỏng che phủ kínvết thương, vết bỏng, ngăn không cho dịch huyết tương thoát ra và ngăncách vết thương với môi trường bên ngoài, đến khi liền sẹo, màng thuốc tựbong ra [5]

- Tanin còn có tác dụng kháng khuẩn nên dùng làm thuốc súc miệng khiniêm mạc miệng, họng bị viêm loét hoặc ổ loét do nằm lâu ngày; tanin cóthể dùng để chữa tiêu chảy

- Tanin kết hợp tạo tủa với muối kim loại nặng và với alcaloid nên dùngchữa ngộ độc đường tiêu hoá

- Tanin có tác dụng làm đông máu nên dùng đắp lên vết thương cầmmáu, chữa trĩ, rò hậu môn

- Có thể dùng tanin tinh chế pha trong nước thành dung dịch 1-2% hoặcthuốc bột, thuốc mỡ 10-20% Khi dùng trong (uống) nên dùng chế phẩmtanalbumin hay tanalbin; đây là dạng kết hợp tanin và albumin Tanalbumin

có màu vàng nhạt, không mùi, không vị, chứa 50% tanin, không hoà tantrong nước và trong cồn, không bị dịch vị phân huỷ; khi vào đến ruột gặpmôi trường kiềm, tanin mới giải phóng, tránh được tác dụng của tanin trênniêm mạc thực quản, dạ dày, gây khó chịu và rối loạn tiêu hoá Ngoài ra

còn có dạng tanatgelatin dùng như tanalbumin, tanoform (tanin + formol)dùng bôi ngoài [2].

* Trong ngành khác:

- Tanin tạo màu với muối sắt (II) do đó người ta sử dụng tanin để sảnxuất mực viết, dùng trong kỹ nghệ in

- Làm thuần khiết rượu bia

- Tanin dùng làm hoá chất thuộc da trong công nghệ thuộc da

- Dùng nhuộm vải sợi, lưới đánh cá…[12]

Chương 2

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu.

- Đối tượng nghiên cứu là cây trang Kandelia obovata Sheue, Liu &

Yong và cây đước vòi Rhizophora stylosa Griff được trồng vào năm 1997

(11 tuổi), 1998 (10 tuổi) và 1999 (9 tuổi)

- Đặc điểm hình thái của đối tượng nghiên cứu:

2.1.1 Đước vòi (đước chằng)

Tên khoa học: Rhizophora stylosa Giff

3-có lông mịn, 8 nhị Bầu hạ, vòi nhuỵ hình sợi, dài 4-6mm, đầu nhuỵ chẻthành hai thuỳ.

Quả có hình quả lê nhỏ khi còn non, trơn, màu nâu, trụ mầm dài 45cm Trụ mầm chín rộ vào tháng 7-8

30-Phân bố: ở cả 3 miền Bắc, Trung, Nam

Công dụng: gỗ thường được dùng làm củi, cây được trồng để chắnsóng bảo vệ đê điều Trụ mầm và vỏ cây có thể làm thuốc chữa các bệnhđường tiêu hoá, ngoài ra còn có thể khai thác tanin để nhuộm lưới [16]

2.1.2 Trang

Tên khoa học: Kandelia obovata Sheue, Liu & Yong.

Họ Đước: Rhizophoraceae

Hình 2.2: Cây trang Kandelia obovata Sheue, Liu & Yong.

Chi Trang (Kandelia) hiện có 2 loài: K candel (L.) Druce phân bố ở

các nước Đông Nam Á, Brunei, Ấn Độ, Malaysia,…không chịu được lạnh

và loài K.obovata Sheue, Liu & Yong chịu được lạnh về mùa đông, phân

bố ở Trung Quốc (Hải Nam, Phúc Kiến, Đài Loan), Nam Nhật Bản và Bắc Việt Nam.

Quả thai sinh, trụ mầm dài 15-35cm, trụ mầm hình trụ không đều [9].Công dụng: gỗ được dùng làm củi, cây trồng để bảo vệ đê biển, nuôiong lấy mật

2.2 Đặc điểm tự nhiên khu vực thu mẫu.

2.2.1 Vị trí địa lí.

Giao Thuỷ là một huyện ven biển của tỉnh Nam Định Huyện Giao Thuỷgồm 22 xã và thị trấn, trong đó có 9 xã giáp biển là: Giao Thiện, Giao An, GiaoLạc, Giao Xuân, Giao Hải, Bạch Long, Giao Phong, Giao Long, 9 xã này chạydài trên 32km bờ biển thuộc 2 cửa sông: cửa Ba Lạt thuộc sông Hồng và cửaNinh Cơ thuộc sông Ninh Cơ Trong 9 xã giáp biển thì 4 xã Giao Thuỷ, Giao

An, Giao Lạc và Giao Xuân có hệ thống rừng ngập mặn phát triển

Xã Giao Lạc có diện tích 840,7ha, nằm giữa 20013’-20015’ vĩ độBắc, 106015’-106033’ kinh độ Đông, phía bắc giáp xã Giao An, phía namgiáp xã Giao Xuân, phía đông giáp biển

Diện tích rừng ngập mặn xã Giao Lạc chiếm gần 400 ha Do nằmgiữa vùng cửa sông Hồng và cửa sông Ninh Cơ, hệ thống RNM ở đây hàngnăm tiếp nhận được một lượng lớn phù sa do 2 con sông mang tới (114triệu tấn/năm), nên địa hình ở đây tương đối bằng phẳng, ít cồn cát, lớptrầm tích phù sa dày

2.2.2 Khí hậu

Xã Giao Lạc nói riêng và huyện Giao Thuỷ nói chung nằm trong khuvực khí hậu nhiệt đới gió mùa Mùa đông lạnh, khô hơn, mùa hè nóng vàmưa nhiều Mùa mưa kéo dài từ tháng 4 đến tháng 11 Theo số liệu của Đàikhí tượng trạm thuỷ văn khu vực đồng bằng Bắc bộ năm 2007-2008, nhiệt

độ trung bình tại Giao Thuỷ là 240C

Lượng mưa trung bìmh hàng năm từ 1700-2000mm

Độ ẩm trung bình hàng năm là 85%, cao nhất vào tháng 2 và thấpnhất vào tháng 12

Độ mặn nước biển biến đổi theo mùa, theo chế độ thuỷ triều Theokết quả của đợt ghi độ mặn đặc trưng năm 2006-2007 tại trạm Phú Lễ, sôngNinh Cơ thì độ mặn cao nhất là 21,73‰ vào tháng 12/2006, độ mặn thấpnhất là 3,035‰ vào tháng 5 Nói chung độ mặn ổn định theo năm

(Đài khí tượng thuỷ văn khu vực đồng bằng Bắc bộ năm 2007-2008) [21]

2.2.3 Thuỷ văn

Chế độ thuỷ triều ở Giao Thuỷ là chế độ nhật triều, nghĩa là connước lên xuống một lần trong ngày (24 giờ) Vì vậy thời gian ngập nướccủa cây ngập mặn kéo dài

Biên độ triều khá lớn, dao động trong khoảng 1,9-4,1m Mức triềulớn nhất là 3,9m (tổng cục khí tượng thuỷ văn) Chế độ thuỷ triều của vùngchịu ảnh hưởng trực tiếp của lượng mưa và lưu lượng nước sông Hồng vàsông Ninh Cơ vào mùa lũ từ tháng 6 đến tháng 10

Hướng của dòng chảy là hướng Đông Bắc-Tây Nam

2.2.4 Đặc điểm rừng trồng

Hầu hết RNM tự nhiên ở xã Giao Lạc đã bị chặt phá từ trước năm1900-1991 Hiện nay, RNM ở đây chủ yếu là rừng trang được trồng tại các

thời kỳ khác nhau từ năm 1997 cho đến nay Theo số liệu của hội chữ thập

đỏ xã Giao Lạc, năm 1997 trồng được 165ha, năm 1998 trồng 100ha, năm

1999 và 2000 trồng được diện tích RNM lần lượt là 61ha và 21ha, đến năm

2001 trồng được 4,5ha Như vậy, cây ngập mặn được trồng chủ yếu ở đây

là cây trang (Kandelia obovata Sheue, Liu &Yong) Ngoài ra còn trồng xen lẫn bần chua (Sonneratia caseolaris) và đước vòi (Rhizophora stylosa

Griff) nhưng với số lượng ít hơn

2.3 Phương tiện nghiên cứu và hóa chất.

2.3.1 Phương tiện nghiên cứu

- Tủ sấy khô phòng thí nghiệm thực vật trường Đại học Sư phạm Hà Nội

- Cân “PRECISA B220A” tại bộ môn Dược liệu trường Đại họcDược Hà Nội

- Cân “PRECISA B320C” tại bộ môn Dược liệu trường Đại hocDược Hà Nội

2.5 Phương pháp nghiên cứu

2.5.1 Phương pháp thu và xử lý mẫu.

2.5.1.1 Phương pháp thu.

Cây trang và cây đước ở ba độ tuổi: 9tuổi, 10 tuổi, 11 tuổi đượcchúng tôi tiến hành dóc vỏ thân trong khoảng chiều cao 1m 3 tính từ mặt đấtlên, rồi bỏ vào túi riêng có ghi tên loài, độ tuổi

Đồng thời trên các cây vừa dóc vỏ chúng tôi thu toàn bộ các cànhmang lá cách ngọn khoảng nửa mét Cũng đem mẫu bỏ vào các túi riêng cóghi tên loài, độ tuổi

Thời gian thu mẫu: tháng 10/2008

Mẫu sau khi sấy xong được bảo quản, bọc kín trong các túi nilong

2.5.3 Định tính tanin trong dược liệu.

Định tính tanin trong các mẫu nghiên cứu bằng các phản ứng hoá học [3]

2.5.3.1 Chiết tanin từ dược liệu.

Lấy khoảng 1,00g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 50ml,thêm 20ml nước cất, đun sôi trong 2 phút Để nguội, lọc Dịch lọc đượcdùng để định tính

Ống 3: lấy 2ml dịch lọc, thêm 5 giọt dung dịch gelatin 1% sẽ xuấthiện tủa bông trắng.

2.5.3.3 Phản ứng Stiasny (phân biệt tanin pyrogallic và tanin

Bảng 2.1 Các phản ứng định tính tanin

1 Phản ứng thuộc da Dung dịch gelatin 1% pha trong

NaCl 0,9%

2 Phản ứng tạo kết tủa với

muối kim loại

-6 Dung dịch Pb (CH3COO)2 10%-7 Dung dịch FeCl3 5%

Từ kết quả phản ứng xác định sự có mặt của tanin trong các mẫunguyên liệu nghiên cứu

2.5.4 Định lượng tannin.

Khi căn cứ vào hàm lượng tanin để đánh giá chất lượng thuốc vàmuốn chiết xuất được nhiều tanin sử dụng trong công nghệ thuộc da thì cầnkhảo sát, thăm dò hàm lượng tanin có trong vỏ cây, hoặc các bộ phận kháccủa cây, các cây có độ tuổi khác nhau, theo các phương pháp định lượng,chế biến và bảo quản khác nhau nhằm giúp cho việc khai thác và sử dụnghợp lý

Định lượng tanin bằng phương pháp oxy hoá [3].

Nguyên tắc: chiết kiệt tanin bằng nước Pha loãng rồi chuẩn độ bằngdung dịch KMnO4 0,1N, chỉ thị màu là dung dịch sulfo-indigo Song songtiến hành định lượng một mẫu kiểm tra trắng, 1ml KMnO4 0,1N tương ứngvới 0,004157g tanin Dược điển Việt Nam và Liên Xô quy định định lượngbằng PP này

Cách tiến hành: Cân chính xác 2g dược liệu đã tán nhỏ qua dây số

355 cho vào 1 bình nón Đổ thêm 50ml nước sôi và đun cách thuỷ, vừađun vừa khuấy trong 30 phút Để yên vài phút rồi lọc qua bông vào mộtbình định mức 250ml Tiếp tục chiết như trên vài lần cho tới khi dịch chiếtkhông cho phản ứng của tanin (thử với dung dịch FeCl3) Để nguội rồi chothêm nước vào bình định mức tới vạch

Lấy 25ml dung dịch trên vào một bình nón 1000ml, thêm 750mlnước và 25ml dung dịch sunfo-indigo Định lượng bằng dung dịch Kalipecmanganat 0,1N cho tới khi chuyển sang màu vàng

Song song tiến hành định lượng 1 mẫu kiểm tra trắng gồm 25mldung dịch sunfo-indigo và 750ml nước

1ml dung dịch KMnO4 0,1N tương ứng với 0,004157g tanin tinh khiết.Hàm lượng phần trăm tanin trong dược liệu được tính theo công thức:Mỗi mẫu định lượng 3 lần, xử lý số liệu thống kê theo công thức:

(a-b) x 0,004157 x 250 x100Tanin =

2 x 25

Rây qua rây 355

Cân chính xác 2g nguyên liệu

50ml nước sôi

Đun cách thủy và khuấy trong 30 phút

Lọc Nước cất đủ 250mlDịch lọc

Nghiền dược liệu

25ml dịch lọc

25ml Sunfoindigo

750 ml nước cất

Chuẩn độ bằng KMnO4 0,1N

Chuyển từ mầu xanh sẫm sang màu vàng

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ định lượng cho mẫu thử

750ml nước cất

25ml Sunfoindigo

Chuẩn độ bằng KMnO4 0,1N

Sơ đồ 2.2 Sơ đồ định lượng cho mẫu trắng

Sơ đồ định lượng tanin theo phương pháp oxy hoá

2.6 Xử lý số liệu.

Tính kết quả theo phương pháp thống kê toán học:

Kết quả trung bình:

n i i=1

1 X= X (1)

X X S

Với p = 0.95 ( = 0.05); t, k = 4,303 [10]

Các bước xử lý và vẽ đồ thị được thực hiện trên phần mềm Excel 2003

Chuyển từ mầuxanh sẫm sangmàu vàng

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

Ống 2 (phản ứng với dung dịch Pb (CH3COO)2 10%): Dịch chiết nướccủa từng mẫu nguyên liệu tiến hành thí nghiệm đều cho kết tủa bông vớichì acetat 10% (TT) (phản ứng dương tính)

Ống 3 (phản ứng với dung dịch gelatin 1%): Dịch chiết nước của từngmẫu nguyên liệu tiến hành thí nghiệm đều cho kết tủa bông trắng với dungdịch gelatin1% (phản ứng dương tính)

3.1.2 Phản ứng Stiasny (phân biệt tanin pyrogalic và tanin pyrocatechic).

Cho 10ml dịch lọc vào ống nghiệm, thêm vào đó 2ml formol và 1ml HClđâm đặc

Kết quả:

Với các mẫu lá, vỏ cành, vỏ thân cây trang không thấy kết tủa (phản ứng

âm tính) Nghĩa là trong các mẫu không có tanin thủy phân

Với các mẫu lá, vỏ cành, vỏ thân cây đước phản ứng có tạo kết tủa (phảnứng dương tính).

Bảng 3.1 Kết quả mầu kết tủa của các phản ứng định tính tanin trong cácmẫu nguyên liệu nghiên cứu

10%

Gelatin 1% Stiasny Dấu hiệu

phát hiệntaninpyrogallic

-Vỏ

thân

Nâunhạt

Vỏ

thân

Nâunhạt

Ghi chú: (-): không có kết tủa

Bảng 3.2 Bảng tóm tắt kết quả định tính tanin trong các mẫu nguyên liệunghiên cứu.

10%

Gelatin1%

Stiasny Dấu hiệu

phát hiệntaninpyrogallicCây

trang

-Vỏcành

Ghi chú: (+ +): phản ứng dương tính rõ rệt

(+): phản ứng dương tính hơi rõ

Trong cây đước vòi có chứa tanin thủy phân được là loại tanin khithủy phân bằng acid hoặc bằng enzyme tanase thì ngoài việc giải phóng rađường glucose, đôi khi có gặp những loại đường đặc biệt còn thu được cácacid, acid hay gặp là acid gallic, acid ellagic…Đây là các acid polyphenolicthường gặp trong hệ thực vật bậc cao với những tác dụng sinh học có giá trịnhư: tác dụng chống oxy hóa, chống viêm, kháng khuẩn, tác dụng ức chế