Nghiên cứu tách dòng và thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa petase

Đó là PETase có bản chất là protein được phân lập từ vi khuẩn Ideonella sakaiensis 201-F6, có tác động phân huỷ lên bề mặt nhựa PET nên được ứng dụng trong việc tạo nguồn vật liệu để ph

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

- -

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU TÁCH DÒNG VÀ THIẾT KẾ VECTOR

BIỂU HIỆN GEN MÃ HOÁ PETASE

HÀ NỘI - 2023

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

- -

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU TÁCH DÒNG VÀ THIẾT KẾ VECTOR

BIỂU HIỆN GEN MÃ HOÁ PETASE

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan toàn bộ kết quả trong luận văn là do chính tôi trực tiếp thực hiện

Các số liệu và kết quả được công bố trong luận văn là hoàn toàn trung thực, chính xác và chưa được công bố ở bất kỳ công trình nào khác

Hà Nội, ngày tháng năm 2023

Sinh viên

Nguyễn Thuỳ Dung

Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ phòng Hoá sinh Protein đã giúp tôi

có những định hướng đúng và chính xác để thực hiện đề tài của mình và luôn động viên tôi cũng như có những đóng góp về chuyên môn quý báu để tôi hoàn thành luận văn này

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Bố, Mẹ, người thân trong gia đình cũng như bạn bè đã luôn ủng hộ, khuyến khích để tôi vững vàng trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 31 tháng 1năm 2023

Sinh viên

Nguyễn Thuỳ Dung

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN I LỜI CẢM ƠN II MỤC LỤC III DANH MỤC BẢNG VI DANH MỤC HÌNH VII DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT VIII TÓM TẮT IX

I MỞ ĐẦU 1

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1.2 MỤC ĐÍCH 2

1.3 YÊU CẦU 2

II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Nhựa 3

2.1.1 Khái niệm 3

2.1.2 Phân loại nhựa 3

2.1.3 Khái niệm nhựa PET 6

2.1.4 Lịch sử và quá trình thương mại hoá PET 6

2.1.5 Tính chất của nhựa PET 7

2.1.6 Ưu và nhược điểm của nhựa PET 8

2.1.7 Tình hình sử dụng nhựa trên thế giới và Việt Nam 9

2.1.7.1 Trên thế giới 9

2.1.7.2 Tại việt nam 11

2.1.7.3 Phân tích về ô nhiễm rác thải nhựa tại Việt Nam 12

2.1.8 Tái chế nhựa PET 13

2.2 PETASE 15

2.2.1 Tìm hiểu chung 15

2.2.2 Cấu trúc không gian của PETASE 16

2.3 Ảnh hưởng của petase đến bề mặt nhựa PET 18

2.4 Sự khác nhau giữa enzyme PETASE VÀ MHETASE 19

III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 22

3.1.1 Thời gian nghiên cứu 22

3.1.2 Địa điểm nghiên cứu 22

3.1.3 Đối tượng nghiên cứu 22

3.1.4 Nội dung nghiên cứu 22

3.1.5 Sơ đồ nghiên cứu chung 22

3.2 Vật liệu, hoá chất, thiết bị, máy móc 23

3.2.1 Vật liệu 23

3.2.2 Hoá chất, thiết bị, máy móc 23

3.3 Phương pháp 24

3.3.1 Định lượng DNA trong mẫu 24

3.3.3 Tách dòng gen mã hoá PETASE 26

3.3.4 Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E.coli bằng phương pháp sốc nhiệt 27

3.3.5 Tách chiết dna plasmid từ các tế bào E.coli 28

3.3.6 Điện di phát hiện DNA trên gel agarose 29

3.3.7 Tách chiết DNA ra khỏi gel agarose 29

3.3.8 Thiết kế vector biểu hiện gen mã hoá cho PETASE 30

3.3.9 Biểu hiện PETASE ở E.coli 31

IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

4.1 Tách dòng gen mã hoá cho PETASE 33

4.1.1 Nhân gen mã hoá cho PETASE bằng kỹ thuật PCR 33

4.1.2 Tách dòng gen mã hoá cho PETASE 34

4.1.3 Kết quả xác định trình tự gen mã hoá cho PETASE 37

4.2 Biểu hiện PETASE tái tổ hợp 39

4.2.1 Thiết kế vector biểu hiện PETASE – pET22b(+) 39

4.2.2 Biểu hiện PETASE tái tổ hợp 42

V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44

5.1 KẾT LUẬN 44

5.2 KIẾN NGHỊ 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO 45

PHỤ LỤC 48

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Mã nhận diện các loại nhựa 4

Bảng 3.1 Các hoá chất và enzyme 23

Bảng 3.2 Máy móc và thiết bị 24

Bảng 3.3 Thành phần phản ứng PCR 26

Bảng 3.4 Chương trình thực hiện phản ứng PCR 26

Bảng 3.5 Thành phần hỗn hợp phản ứng ghép nối 27

Bảng 3.6 Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật 28

Bảng 3.7 Thành phần dung dịch tách chiết DNA plasmid 28

Bảng 3.8 Thành phần hỗn hợp phản ứng ghép nối PETase – pET22b(+) 31

Bảng 3.9 Thành phần và các dung dịch đệm SDS-PAGE 32

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Công thức cấu tạo Polyethylene terephthalate 6

Hình 2.2 Polyethylene terephthalate 6

Hình 2.3 Biểu đồ cung cầu nhựa PET các châu lục năm 2018 và 2022 10

Hình 2.4 Sợi dệt tái chế từ lốp xe đã qua sử dụng 11

Hình 2.5 Sản lượng sản phẩm nhựa tiêu thụ giai đoạn 2015-2020 12

Hình 2.6 Rác thải nhựa tại các bãi sông của Việt Nam 13

Hình 2.7 Cấu trúc các sản phẩm thuỷ phân của PETase 16

Hình 2.8 Cấu trúc không gian của PETase 17

Hình 2.9 Kết quả bề mặt PET film chụp bởi kính hiển vi điện tử quét (SEM) 19

Hình 2.10 Bề mặt PET gần như bị phân huỷ hoàn toàn sau 6 tuần ở 30oC 19

Hình 2.11 Cấu trúc tinh thể của (A) PETase và (B) MHETase 20

Hình 2.12 Cấu trúc MHETase ( độ phân giải 1,6 Å) 21

Hình 3.1 Sơ đồ quy trình các bước tiến hành 22

Hình 3.2 Sơ đồ thiết kế vector biểu hiện PETase trong pET22b+ 31

Hình 4.1 Kết quả PCR nhân gen mã hoá cho PETase 33

Hình 4.2 Kết quả tách chiết DNA plasmid tái tổ hợp 35

Hình 4.3 Kiểm tra sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp bằng enzyme NdeI và BamHI 36

Hình 4.4 Phổ trình tự nucleotide của đoạn gen mã hoá cho PETase 37

Hình 4.5 Trình tự nucleotide của gen mã hoá cho PETase với trình tự gen trên ngân hàng Genbank 38

Hình 4.6 Hình ảnh điện di phản ứng cắt gen plasmid tái tổ hợp PETase-pBT 39

Hình 4.7 Hình ảnh điện di phản ứng cắt gen mở vòng vector pET22b(+) 40

Hình 4.8 Hình ảnh kiểm tra kết quả thôi DNA ra khỏi gel agarose 41

Hình 4.9 Biểu hiện protein dung hợp PETase – pET22b(+) 43

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

APS Ammonium persulfate Ammonium persulfate

DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic

E.coli Escherichia coli Escherichia coli

EDTA Ethylene diamine tetra acetic

acid

Axit tetraacetic ethylene diamine

IPTG Isopropyl-b-D-thiogalactoside Isopropyl-b-D-thiogalactoside

PCR Polymerase chain reaction Phản ứng trùng hợp chuỗi

SDS Sodium dodecyl sulfate Sodium dodecyl sulfate

SDS – PAGE Sodium dodecyl sulfate –

polyacrylamide gel electrophoresis

Đệm điện di biến tính SDS trên gel polyacrylamide

TEMED Tetramethyl ethylene diamine Tetramethyl ethylene diamine

TÓM TẮT

Polyethylene terephthalate (PET) là một trong những loại nhựa polyester được sử dụng phổ biến nhất trên toàn thế giới nhưng cực kỳ khó bị thuỷ phân trong môi trường tự nhiên Vào năm 2016, một nhóm nghiên cứu từ Đại học Keio đã xác định được một loại enzyme thuỷ phân PET mới có tên là PETase từ

vi khuẩn Ideonella sakaiensis 201-F6 hứa hẹn nâng cao khả năng tái chế nhựa

PET Đã có nhiều đề tài nghiên cứu về gen PETase và protein PETase tuy nhiên nghiên cứu biểu hiện của Protein còn khá ít Do đó đề tài “ Nghiên cứu tách dòng và thiết kế vector biểu hiện gen mã hoá PETase ” được thực hiện với mục đích tạo dòng và biểu hiện thành công gen PETase mã hoá protein PETase Vùng gen mã hoá được kiểm tra tính chính xác về trình tự sau đó được gắn vào

vector pET22b(+) và biến nạp vào chủng E.coli DH5α, sau đó, tiến hành biểu hiện gen PETase trong chủng E.coli BL21(DE3), được cảm ứng bằng IPTG Kết

quả cho thấy rằng gen PETase có kích thước khoảng 890 bp, mức tương đồng với trình tự gen được công bố trên Gen-Bank (mã số: BBYR01000074.1) là 79.26% Phân tích điện di SDS-PAGE trong điều kiện biến tính cho thấy protein dung hợp có khối lượng phân tử khoảng 28 kDa

I MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Hiện nay, vấn đề môi trường và bảo vệ môi trường không chỉ là vấn đề của riêng từng quốc gia mà còn là vấn đề chung của toàn cầu, đang thu hút sự quan tâm đặc biệt của khắp các quốc gia trên thế giới Tại các hội thảo quốc tế, nhiều biện pháp về bảo vệ môi trường đã được đưa ra và thu hút được sự quan tâm của những người tham dự Bởi nó không chỉ ảnh hưởng đến sự phát triển của một quốc gia, mà còn quyết định sự tồn tại của con người trên thế giới hôm nay và các thế hệ tương lai

Xã hội ngày càng phát triển nên nhu cầu tiêu thụ hàng hoá tiêu dùng của mọi người cũng ngày càng tăng Điều đó làm cho lượng rác thải thải ra môi trường cũng ngày càng nhiều, đặc biệt là rác thải nhựa Tại Việt Nam, mức độ tiêu thụ nhựa bình quân đầu người là 81kg/người/năm trở thành rác thải và 23kg/người/năm được tái chế phục vụ cho các ngành công nghiệp Và hơn một nửa số rác thải nhựa phát sinh tại Việt Nam – khoảng 3,6 triệu tấn/năm vẫn chưa được thu gom và xử lý (Asia et al., 2020.) Còn trên thế giới, người ta ước tính rằng sản lượng nhựa thế giới gần đạt 350 triệu tấn trong năm 2017 và lĩnh vực ứng dụng lớn nhất là bao bì, đạt giá trị 39,7% tổng nhu cầu nhựa Polyethylene terephthalate (PET) là một trong những polyme nhựa nhiệt dẻo phổ biến nhất và được sử dụng rộng rãi cho chai nước giải khát và bao bì thực phẩm (Puspitasari

et al., 2021)

Việc tìm kiếm các phương án mới trong việc giải quyết vấn đề ô nhiễm từ rác thải nhựa vẫn đang là nỗ lực của các nhà khoa học trong nhiều năm qua Một vật liệu có khả năng phân huỷ rác thải nhựa, cụ thể là nhựa PET có nguồn gốc từ

vi khuẩn Ideonella sakaiensis 201-F6 đã và đang được đầu tư nghiên cứu trong

thời gian gần đây Đó là PETase (có bản chất là protein) được phân lập từ vi

khuẩn Ideonella sakaiensis 201-F6, có tác động phân huỷ lên bề mặt nhựa PET

nên được ứng dụng trong việc tạo nguồn vật liệu để phân huỷ rác thải nhựa, ngăn ngừa ô nhiễm môi trường…

Cho đến nay, PETase thường được tổng hợp bằng con đường hoá học Tuy nhiên phương pháp tổng hợp hoá học bị hạn chế bởi cách thức tổng hợp thường qua nhiều khâu và giá thành sản xuất cao Vì vậy PETase đang được chú trọng nghiên cứu, tạo ra bằng công nghệ DNA tái tổ hợp

Ở Việt Nam, hướng nghiên cứu về PETase tự nhiên và tái tổ hợp vẫn còn hạn chế và mới bắt đầu được triển khai tại Phòng Hoá sinh Protein., Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Chính vì vậy,

tôi đã thực hiện đề tài khoá luận tốt nghiệp “ Nghiên cứu tách dòng và thiết kế

vector biểu hiện gen mã hoá PETase ”

1.2 Mục đích

Tách được dòng và thiết kế được vector biểu hiện gen mã hoá PETase

1.3 Yêu cầu

(1) Tách dòng gen mã hoá PETase

(2) Thiết kế vector biểu hiện gen mã hoá PETase

II TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Nhựa

2.1.1 Khái niệm

Nhựa (hay còn gọi là chất dẻo) là một loại vật liệu được điều chế từ các nhóm cao phân tử, được sử dụng để sản xuất các vật liệu tiêu dùng hàng ngày hay các vật liệu phục vụ cho công nghiệp ( Phạm Văn Đan Thuỷ và cs, 2011)

2.1.2 Phân loại nhựa

Nhựa có thể được phân loại thành nhựa nhiệt rắn (thermoset) và nhựa nhiệt dẻo (thermoplast) (United Nations Environment Programme, 2009)

Nhựa nhiệt dẻo: Nóng chảy dưới tác dụng của nhiệt độ và đông đặc lại

khi làm nguội để tạo ra các hình dạng và sản phẩm mới Bao gồm các loại: Polyethylene terephthalate (PET); Poly Ethylene mật độ thấp (LDPE); Poly Vinyl Chloride (PVC); Poly Ethylene mật độ cao (HDPE); Polypropylene (PP); Polystyrene (PS); và các loại khác

Nhựa nhiệt rắn: Có thể làm mềm và tan chảy nhưng chỉ tạo hình một lần

Nếu tác động nhiệt lặp đi lặp lại thì chúng sẽ ở trạng thái rắn vĩnh viễn Nhựa nhiệt rắn được ứng dụng cho các sản phẩm điện tử và ô tô Bao gồm: Alkyd, Epoxy, Ester, Melamine formaldehyde, Phenol formaldehyde, Silic, Urea formaldehyde, Polyurethane, Nhựa kim loại và nhựa nhiều lớp, Polyurethane (PU), Phenolic, và các loại khác

Nhựa nhiệt dẻo chiếm đến 80% còn lại 20% là nhựa nhiệt rắn Điều này

có ý nghĩa quan trọng trong việc tái chế do tính chất của chúng khi chịu sự tác động của nhiệt độ Nhựa nhiệt dẻo có thể tái chế được còn nhựa nhiệt rắn thì không (ACRR, 2004)

Hiệp hội Công nghệ Nhựa (SPI) đã thiết lập một hệ thống phân loại vào năm 1988 để cho phép người tiêu dùng và các nhà tái chế xác định các loại nhựa khác nhau Các nhà sản xuất đã đặt một mã số trên mỗi sản phẩm nhựa, thường được đặt ở đáy

Bảng 2.1 Mã nhận diện các loại nhựa

Mã Mô tả

Polyethylene Terephthalate (PET)

PET thường được sử dụng để sản

xuất các vật phẩm tiêu dùng như

chai nước ngọt, nước uống, màng

bao bì thực phẩm và khay chế biến

thức ăn Nhựa PET có thể tái chế và

được sử dụng ngày càng nhiều trong

Nhựa HDPE được ứng dụng để sản

xuất bao bì cho sản phẩm sữa, dầu

gội đầu, nước giặt, mỹ phẩm,…

Vinyl (Polyvinyl Chloride, V hay

PVC)

Nhựa PVC có độ bền, dẻo, có khả

năng chống chịu rất tốt với hoá chất,

thời tiết Nhựa PVC được sử dụng

rộng rãi trong ngành xây dựng như

sản xuất ống nước, vật liệu ốp

tường Ngoài ra nhựa PVC mềm dẻo

còn được ứng dụng sản xuất dây cáp

điện, túi đựng máu, ống y tế Loại

nhựa này không được tiếp xúc gần

với thực phẩm vì nó có thể gây hại

khi ăn phải

Có khả năng chịu được hoá chất, dễ

uốn, chống ẩm, chống nhiệt do vậy

rất phù hợp để chứa chất lỏng nóng

PP được sử dụng để sản xuất chai,

hộp sữa chua, phụ tùng ô tô Nắp

chai nhựa được làm từ nhựa PP

Mã 7 được sử dụng để chỉ loại nhựa

khác với 6 loại nhựa còn lại Loại

nhựa này được làm từ 1 loại nhựa

khác 6 loại liệt kê trên hoặc do sự

kết hợp giữa các loại nhựa

2.1.3 Khái niệm nhựa PET

PET là viết tắt của Polyethylene terephthalate, là một loại nhựa trong, bền, nhẹ thuộc họ polyester Nhựa PET được hình thành từ các acid trung gian terepthalic (TPA) và ethylene glycol (EG) Nhựa PET được sử dụng rộng rãi để đóng gói thực phẩm và đồ uống, đặc biệt là nước ngọt và nước trái cây Hầu hết các chai nước ngọt có ga đều được làm từ nhựa PET (Phạm Văn Đan Thuỷ và

cs, 2011)

Hình 2.1 Công thức cấu tạo Polyethylene terephthalate (Thuy et al., 2011)

Hình 2.2 Polyethylene terephthalate (Crawford & Quinn, 2017)

2.1.4 Lịch sử và quá trình thương mại hoá PET

Lịch sử của polyester tổng hợp bắt đầu từ những khám phá của nhà hoá học người Mỹ Wallace H Carothers (1896–1937) về các polyme nhựa nhiệt dẻo được thực hiện tại phòng thí nghiệm của công ty DuPont Tuy nhiên sự ra đời của nhựa PET là do công lao của nhà hoá học người Anh John R Whinfield (1901–1966) và trợ lý của ông là James T Dickson vào năm 1941 tại Hiệp hội các nhà in Calio ở Manchester (Anh) Cả hai nhà khoa học đã tổng hợp PET

bằng cách thực hiện các quá trình ngưng tụ liên quan đến hai monome (là axit terephthalic và EG) Ngoài ra, trong cùng năm đó, khám phá này đã được ứng dụng vào sản xuất sợi PET đầu tiên với tên gọi Terylene ( quyền sáng chế được cấp bởi Imperial Chemical Industry, ICI) (Nisticò, 2020)

Vào những năm 1950, PET cũng được Công ty DuPont sản xuất cho thị trường Mỹ bằng cách cải tiến công nghệ đã được khai thác để sản xuất polymide, phát triển sợi PET cho ngành dệt có tên là Darcon Ngoài ra Liên Xô

đã sản xuất PET vào những năm 1949 trong các phòng thí nghiệm của Viện Hàn lâm Khoa học Liên Xô dưới nhãn hiệu Lavsan Việc khai thác PET trong lĩnh vực đồ uống là do công trình của kỹ sư người Mỹ Nathaniel C Wyeth (1911–1990) tại Công ty DuPont Wyeth đã phát minh và cấp bằng sáng chế cho 25 sản phẩm/ quy trình, và đã đạt bằng Nghiên cứu sinh kỹ thuật cao cấp tại Công ty DuPont Đóng góp lớn nhất của Wyeth là ý tưởng lưu trữ CSD (chất lỏng có áp suất) thành khuôn thổi PET định hướng 2 chiều (được cấp bằng sáng chế năm 1973), mở ra hướng phát triển vượt bậc của PET trong phân khúc đồ uống đóng chai (Wyeth et al., 1973) Cuối cùng, những tiến bộ gần đây đạt được trong quy trình tái chế PET đã ủng hộ sử dụng R-PET cũng trong ngành công nghiệp nước giải khát Đầu những năm 1990, R-PET đã được chấp thuận cho tiếp xúc với thực phẩm ở Hoa Kỳ và Công ty Coca-Cola bắt đầu sản xuất nhựa chai nước giải khát giới thiệu R-PET trong công thức của họ (Welle, 2011)

2.1.5 Tính chất của nhựa PET

Polyetylen terephthalate (PET) là một trong những polyme nhiệt dẻo phổ biến nhất và được sử dụng chủ yếu để sản xuất sợi quần áo, chai lọ, cũng như một số vật liệu xây dựng

Về tính chất quang học, mức độ kết tinh của nhựa PET ảnh hưởng đến tính chất quang học của nhựa PET Cụ thể, PET vô định hình (amorphous) trong suốt, trong khi PET bán tính thể (semi-Crystalline) mờ đục hoặc có màu trắng sữa Sự mất độ trong suốt như vậy trong các vật liệu polyme kết tinh là do

sự hình thành các quả cầu tinh thể làm tán xạ ánh sáng (Saleh A.Jabarin, 1982)

Hơn nữa, tính trong suốt của PET vô định hình giúp ngành công nghiệp chế biến

đồ uống có thể thiết kế các bao bì đựng trong suốt, giúp người tiêu dùng nhìn thấy nội dung mong muốn

Do các yếu tố như tính chất vật lý tốt (chống ăn mòn, độ bền cao, dễ gia công) ngay cả khi ở nhiệt độ thấp (< 70oC) (Aging et al 2021) và có khả năng chống lại các hoá chất vô cơ, PET được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp (máy móc, ô tô, điện tử) Khả năng chống chịu cao với các yếu tố môi trường khác nhau nên PET được ứng dụng để phục vụ cho ngành công nghiệp thực phẩm

PET được sử dụng rộng rãi trong ngành bao bì còn do tính thấm thích hợp của nó đối với một số loại khí (oxy, hydro, nitơ) (Nisticò, 2020) PET trơ về mặt hoá học đối với một số dung môi và chất phản ứng Tuy nhiên, PET dễ tan trong axit và bazơ mạnh, bazơ yếu và hydrocacbon (Nisticò, 2020) Độ hoà tan trong dung môi hữu cơ của PET là rất nhỏ và PET không thấm nước, khá bền nhiệt, có thể bị biến dạng co rút màng khi nhiệt độ ở 70oC

2.1.6 Ưu và nhược điểm của nhựa PET

Mặc dù PET có nhiều công dụng và được sử dụng phổ biến, nhưng vẫn có những hạn chế nhất định đối với nó Dưới đây là bảng so sánh những ưu và nhược điểm của nhựa PET

Trong suốt, chịu lực tốt, trọng lượng

nhẹ

Khả năng chịu nhiệt thấp

Có khả năng chống ẩm tốt Dễ bị oxi hoá, khó phân huỷ

Có thể dễ dàng tái chế Nguyên liệu sản xuất hạn chế, nhu cầu

năng lượng cao và lượng khí thải carbo dioxide cao

2.1.7 Tình hình sử dụng nhựa trên thế giới và Việt Nam

2.1.7.1 Trên thế giới

Polyethylenen terephthalate (PET) là một trong những loại polyme được

sử dụng rộng rãi nhất để sản xuất bao bì do đặc tính bền, trong suốt và kháng khí Khoảng 583 tỷ chai nhựa đựng đồ uống bằng sẽ được sản xuất vào năm

2021 (Benavides et al., 2018), trong đó 62% sẽ được làm từ PET (Zhang et al., 2020)

Trong năm 2015, khoảng 7% nhu cầu nhựa được tạo thành bởi PET trên toàn thế giới, đạt 18,8 triệu tấn (Taniguchi et al., 2019) Các báo cáo cho thấy rằng 62% chai sản xuất được làm từ PET, và chai PET chiếm 62% tổng số chai được thu gom để tái chế (Zhang et al., 2020) Trong năm 2017, tổng sản lượng nhựa toàn cầu đạt 348 triệu tấn, 29,4% đến từ Trung Quốc Tuy nhiên, một nửa

số nhựa được sản xuất để dùng một lần (Zhang et al., 2020) Tính đến năm

2018, sản lượng nhựa toàn cầu hàng năm đạt 359 triệu tấn và có khả năng tiếp tục tăng khoảng 3,5% mỗi năm (Ket Academic Repository School of Biosciences, 2021)

Sản phẩm PET tiêu dùng ở Liên minh Châu Âu tăng từ 1,9 lên 2,9 triệu tấn từ năm 2001 đến 2008 và tăng từ 42 triệu tấn (2014) lên 73 triệu tấn vào

2020 Hơn thế nữa, chất thải nhựa tích tụ trong các bãi chôn lấp và môi trường sống tự nhiên khi lượng tiêu thụ nhựa tăng lên là vấn đề rất đáng quan tâm Năm

2012, lượng PET thải trong chất rắn đô thị tại Hoa Kì là 4,1 triệu tấn, trong tổng

số trong đó 1,3 triệu tấn, trong đó 1,3 triệu tấn PET, hay 31% PET phế thải Vật liệu PET là vật liệu có nhu cầu tiêu dùng tăng trưởng tương đối nhanh Châu Á là khu vực có lượng tiêu thụ nhựa PET lớn nhất thế giới và gấp đôi các khu vựa khác với sản lượng 10 triệu tấn/năm vào năm 2018 Nhu cầu về lượng tiêu thụ nhựa PET được dự đoán sẽ phát triển nhanh chóng với mức tăng trưởng 30% ở Châu Á và 20 % ở Châu Âu từ năm 2018 đến năm 2022, còn ở khu vực Trung Đông và Châu Phi là 33% Sản xuất PET ở Nam Mỹ chỉ có thể

đáp ứng 50% nhu cầu tiêu dùng trong khu vực, phần sản lượng thiếu hụt được Châu Á cung cấp Đặc biệt Trung Quốc là nước xuất khẩu vật liệu PET lớn nhất thế giới do có có lợi thế về chi phí sản xuất từ nguyên liệu than đá (Tạ Việt Phương, 2019)

Hình 2.3 Biểu đồ cung cầu nhựa PET các châu lục năm 2018 và 2022

Nguồn: Nexant, Bloomberg, FPTS tổng hợp

Mức độ tiêu thụ nhựa PET tăng nhanh làm nảy sinh nhiều vấn đề khác nhau Chúng bao gồm ô nhiễm môi trường, lo ngại về sức khoẻ cho người dân Mối quan tâm về bảo vệ môi trường, bảo tồn tài nguyên trở thành yếu tố quan trọng trong chuỗi cung ứng nhựa PET Phân huỷ và tái chế nhựa PET giúp làm giảm thiểu việc sử dụng năng lượng và khí thải nhà kính

Nguồn PET phế thải có thể được phân loại thành ba nhóm chính (Sulyman

et al., 2016): (i) chai lọ - khi tái chế sẽ gặp các vấn đề liên quan đến tạp chất (ví dụ: keo trên nhãn), các loại phụ gia khác nhau được sử dụng trong quá trình sản xuất ( ví dụ: chất ổn định, chất màu), trọng lượng phân tử của PET, ảnh hưởng đến độ lặp lại của sản phẩm thu được (ii) lá (kim loại) – gặp các vấn đề liên quan đến chất phụ gia được sử dụng trong quá trình sản xuất ( ví dụ: chất ổn định, chất tạo màu) làm ảnh hưởng đến độ lặp lại của sản phẩm thu được (iii) sợi dệt từ lốp xe – là nguồn nguyên liệu quan trọng và rẻ tiền poly có giá trị (ethylene terephthalate)

Hình 2.4 Sợi dệt tái chế từ lốp xe đã qua sử dụng (Sulyman et al., 2016) 2.1.7.2 Tại Việt Nam

Tại Việt Nam, các sản phẩm nhựa được sử dụng rộng rãi trong mọi lĩnh vực như thực phẩm, xây dựng, viễn thông,…Số kg nhựa sử dụng tính trên đầu người tại Việt Nam đã tăng từ 33kg/người/năm năm 2010 lên 41kg/người/năm năm 2015, điều đó cho thấy nhu cầu sử dụng nhựa của người dân ngày càng gia tăng (Trần Thị Thu Trang, 2017)

Theo một khảo sát của WWF trên 10 tỉnh thành, từ năm 2019 đến năm

2020, mỗi hộ gia đình ở Việt Nam sử dụng trung bình 2-4 túi nylon và 2-4 chai nhựa mỗi ngày trở lên Riêng tại Thành phố Hồ Chí Minh, lượng rác thải nhựa ước tính khoảng 1800 tấn/ngày, trong đó có khoảng 1000 tấn đền từ các hộ gia đình (Trần Thu Hương, 2020) Tuy nhiên, chỉ hơn 900 tấn được thu gom tại các bãi chôn lấp, còn số lượng còn lại được xử lý và đốt tại chỗ, một phần được sử dụng cho các mục đích khác

Ngành nhựa Việt Nam vẫn phụ thuộc chủ yếu vào nguyên liệu nhập khẩu

từ nước ngoài Không giống như một số ngành công nghiệp khác như dệt may, dược phẩm, sản lượng nhập khẩu nguyên liệu nhựa hàng tháng của Việt Nam trong năm 2020 vẫn được duy trì ổn định so với năm 2019 (Trần Thu Hương, 2020) Mức tiêu thụ sản phẩm nhựa của Việt Nam năm 2020 ước tính đạt 9,1 triệu tấn, tăng 5,3 % so với năm 2019 Mặt khác, mức tăng trưởng thấp hơn nhiều so với tốc độ tăng trưởng sản lượng trung bình của các năm trước

Hình 2.5 Sản lượng sản phẩm nhựa tiêu thụ giai đoạn 2015-2020

Nguồn: Tổng cục thống kê, FPTS ước tính

2.1.7.3 Phân tích về ô nhiễm rác thải nhựa tại Việt Nam

Việt Nam hiện đang là một trong những quốc gia có lượng tiêu thụ nhựa cao hàng đầu thế giới Khoảng 2,8 đến 3,1 triệu tấn rác thải nhựa trên đất liền mỗi năm (Jambeck et al., 2015) Theo thống kê của Bộ Tài nguyên và Môi trường, mỗi năm Việt Nam thải ra môi trường khoảng 1,8 triệu tấn rác thải nhựa, trong đó 280.000 – 730.000 tấn là thải ra biển ( chiếm khoảng 6% tổng lượng rác thải nhựa ra biển của toàn thế giới) Điển hình như Hà Nội và Thành phố Hồ Chí Minh thải ra khoảng 80 tấn nhựa và nylon mỗi ngày (Nguyễn Thị Thu Hiền

và cs, 2021) Tại các địa điểm khảo sát, tỷ lệ các loại nhựa được tìm thấy là bao

bì và chai PET (18%), nắp cốc, nắp và nhựa nhỏ (19%), Polystyrene, bao gồm hộp đựng thực phẩm (40%) (Asia et al., 2020)

Theo kết quả khảo sát tổng hợp của World Bank tại các địa điểm thu gom như một số bờ sông, ven biển của các tỉnh thành thấy rằng số lượng rác thải nhựa đang chiếm ưu thế trong tổng thành phần Hơn 50% lượng nhựa tiêu thụ hàng ngày là các sản phẩm nhựa dùng một lần Điều đó có nghĩa là hàng triệu tấn đồ nhựa được sản xuất mỗi năm, hơn một nửa trong số đó chỉ mang lại cảm giác tiện lợi như cốc nhựa, ống hút, túi nhựa (Nguyễn Đạt Minh và cs, 2019)

Hình 2.6 Rác thải nhựa tại các bãi sông của Việt Nam (Chau et al., 2020)

Mười loại rác nhựa thường thấy nhất ở địa điểm ven sông, ven biển chiếm 83% tổng số lượng và 73% tổng khối lượng các vật dụng nhựa Ở các khu vực sông, nhựa sử dụng một lần chiếm 72% số lượng, còn ở các khu vực ven biển, tỷ

lệ này là 52% (Asia et al., 2020) Hiện tại hiểu biết của người dân Việt Nam về rác thải nhựa còn hạn chế Do giá thấp và thuận tiện cho sửu dụng nên các sản phẩm nhựa ngày nay được sử dụng rất rộng rãi nhưng vẫn chưa có chế tài quản

lý, tái chế và tái sử dụng Các chính sách và quy định về quản lý sản xuất, kinh doanh và sử dụng sản phẩm nhựa còn thô sở, chưa đủ để giảm thiểu thiệt hai do chất thải nhựa gây ra một cách hiệu quả Dự báo với sự phát triển kinh tế - xã hội, nếu không có biện pháp kịp thời để ngăn ngừa thì lượng chất thải nhựa ở Việt Nam sẽ gia tăng chóng mặt, gây ra những thiệt hai nghiêm trọng không chỉ đối với môi trường, hệ thống sinh thái, đa dạng sinh học mà còn đối với sự phát triển kinh tế, đặc biệt là phát triển kinh tế biển

2.1.8 Tái chế nhựa PET

Mặc dù có vẻ như các giải pháp để loại bỏ nhựa là tái chế, nhưng chỉ có 10% tổng số nhựa được sản xuất đã được tái chế, do đó, một lượng lớn nhựa

được sản xuất vẫn còn trong môi trường và hệ sinh thái (Kent Academic Repository School of Biosciences, 2021) Với nhận thức ngày càng tăng về ô nhiễm nhựa, một số doanh nghiệp nhỏ và cá nhân đã cố gắng tái chế nhựa, đặc biệt là nhựa sử dụng một lần

Các phương pháp đang được sử dụng để tái chế nhựa bao gồm cả nhựa PET là phương pháp hoá học và cơ học Phương pháp tái chế rác thải nhựa cơ học ( gồm có thu gom, phân loại, làm sạch và nghiền) (Ragaert et al., 2017) gặp phải khó khăn lớn là sự có mặt của các chất không tinh khiết vô cơ và hữu cơ trong rác thải nhựa sau khi sử dụng (Drzyzga & Prieto, 2019) Còn tái chế hoá học đã được sử dụng như một biện pháp thay thế để cải tiến quy trình xử lý rác nhựa, trong đó các polyme nhựa có thể chuyển đổi thành các vật liệu thô để sử dụng cho tổng hợp các chất hoá học, các loại nhiên liệu hoặc các nhựa mới (Drzyzga & Prieto, 2019) Tuy nhiên phân huỷ nhựa bằng phương pháp hoá học đòi hỏi các điều kiện về nhiệt độ, áp suất (Al-Sabagh et al., 2016) và tiêu tốn nhiều năng lượng Mặc dù còn tồn tại nhiều bất lợi nhưng cho đến nay, PET vẫn đang được tái chế theo phương pháp hoá học hoặc cơ học Bắt đầu từ những năm 1990, nghiên cứu phân huỷ sinh học các polymer tổng hợp đã được thúc đẩy mạnh mẽ do liên quan đến vấn đề môi trường toàn cầu Từ đó, phương pháp tái chế sinh học với các tác động nhẹ nhàng và thân thiện với môi trường hơn nhờ sử dụng các chất xúc tác sinh học như các enzyme thuỷ phân (Drzyzga & Prieto, 2019) đã được quan tâm ngày càng nhiều Hiện nay đã có một số ứng dụng của enzyme vi khuẩn và nấm được phân loại là polyesterase cho thấy khả năng phân huỷ PET Sự hiện diện của các liên kết este trong chuỗi polyme của PET liên kết các monome trong chuỗi Các enzyme thuỷ phân đã được nghiên cứu được phân loại là cutinase hoặc lipase (Joo et al., 2018)

Tại Việt Nam, việc nghiên cứu tái chế nhựa PET đã được chú trọng từ lâu chủ yếu vẫn bằng các phương pháp hoá học và cơ học Một số công trình nghiên cứu về tái chế PET đã được công bố như phản ứng cắt mạch PET bằng dietylen glycol (Võ Thị Hai, 2008), chế tạo phụ gia chống cháy từ nhựa PET thải (Hoàng

chỉ có một số cutinase từ một số loài Thermobifida fusca (Müller et al., 2005), Fusarium solani pisi (Silva et al., 2011) và các cutinase này có thể phân rã PET

đến một vài mức độ nhưng phải thực hiện ở 50oC

Năm 2016, một phát hiện mới của Yosida và cộng sự về một loài vi khuẩn

Ideonella sakaiensis 201-F6 có khả năng PET làm năng lượng và nguồn carbon

Loài vi khuẩn này được phân lập từ rác thải nhựa tại một nhà máy nhỏ ở Nhật Bản Chúng đã sản sinh ra hai loại enzyme là polyethylene terephthalate hydrolase (được đặt tên là PETase) và mono-2-hydroxyethyl terephthalate hydrolase (được đặt tên là MHETase) có thể phân rã PET thành các sản phẩm đơn phân (monomer) là terephthalate (TPA) và ethylene glycol (EG) ở nhiệt độ

từ 20 – 40oC (Yoshida et al., 2016) PETase có hoạt tính phân giải cấu trúc polymer của film PET cao hơn rất nhiều (từ 5 – 120 lần) ở điều kiện sinh lý

30oC so với các enzyme phân giải PET ưa nhiệt tương đồng trước (Joo et al., 2018; Yoshida et al., 2016) Chính vì vậy, PETase đang thu hút được rất nhiều

sự quan tâm và được nhìn nhận như một công cụ đầy hứa hẹn cho phân huỷ rác thải nhựa PET

Ideonella sakaiensis 201-F6 tiết ra enzyme PETase để thuỷ phân PET

thành các monome như bis hydroxyetyl) terephthalate (BHET), mono hydroxyetyl) terephthalate (MHET) và TPA (Chen et al., 2018; Han et al., 2017; Joo et al., 2018)

(2-Hình 2.7 Cấu trúc các sản phẩm thuỷ phân của PETase (Chen et al., 2018) 2.2.2 Cấu trúc không gian của PETase

PETase thông qua một nếp gấp α/β- hydrolase điển hình, có chứa vòng xoắn β trung tâm bao gồm 9 chuỗi β được kẹp bởi 6-α-helices Do sự đồng nhất cao về trình tự với các cutinases, nên có thể dễ dàng xác định được vị trí của bộ

ba xúc tác enzyme bao gồm S131-H208-D177 (Chen et al., 2018; Han et al., 2017) được tìm thấy trên bề mặt protein S131 đóng vai trò là nucleophile và nằm trong khoảng liên kết hydro để được phân cực bởi bazơ H208, và được ổn định bởi axit D177 (Han et al., 2017)

Enzyme PETase hình thành hai cầu nối disulfua trong phân tử (DS1 và DS2) trong khi các enzyme tương đồng khác chỉ có một Cầu nối disulfua DS2 liên kết vòng cuối C và vòng xoắn cuối cùng, được bảo vệ nghiêm ngặt trong các cấu trúc tương đồng (Chen et al., 2018) Bên cạnh đó, DS1 nằm gần vị trí hoạt động và kết nối các vòng β7 – α5 và β8 – α6 chứa axit xúc tác D177 và gốc xúc tác H208 DS1 có thể ảnh hưởng tới khoảng cách giữa các gốc của bộ ba

xúc tác và do đó ảnh hưởng đến tính toàn vẹn của vị trí hoạt động

Hình 2.8 Cấu trúc không gian của PETase (Chen et al., 2018)

Những đặc tính cấu trúc duy nhất của PETase so sánh với cấu trúc của các cutinase khác (có 1 liên kết disulfide) gồm có thêm một liên kết disulfide để nâng cao tính ổn định ở vị trí hoạt động của histidine, cho phép tăng khả năng linh hoạt của vùng loop mở rộng liền kề (Fecker et al., 2018) tạo điều kiện thuận lợi cho sự tương tác của enzyme với polyme Ngày nay, các nhà khoa học đã phát hiện ra các vị trí acid amin và các vùng chức năng có ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme PETase từ đó nhiều dạng đột biến khác nhau của PETase đã được tạo ra bằng công nghệ DNA tái tổ hợp, thiết kế các hệ thống biểu hiện protein ngoại bào và sản lượng lớn để sử dụng trong tái tạo môi trường (Seo et al., 2019) Các đột biến enzyme này cũng có thể làm tăng hoạt tính phân giải

PET gấp 3 lần so với enzyme gốc

2.3 Ảnh hưởng của PETase đến bề mặt nhựa PET

Để xác định mức độ ảnh hưởng hoạt tính của PETase lên bề mặt nhựa PET các nhà khoa học đã tiến hành thí nghiệm với các mảnh PET film có kích thước 2cm x 1cm Các mảnh PET này sẽ được ủ trong dịch chứa enzyme PETase ở điều kiện 30oC từ 2 – 4 tuần (Kim et al., 2020) Sau khi ủ, bề mặt của các mảnh PET film sẽ được phân tích bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM) để khảo sát sự thuỷ phân của enzyme PETase Hoạt tính của PETase được đặc trưng bởi việc định lượng giảm trọng lượng của PET film (Ma et al., 2018)