Luận văn Thạc sĩ Công nghệ thực phẩm: Phân lập và tuyển chọn chủng probiotic sinh tổng hợp bacteriocin từ ruột tôm nước mặn tỉnh Nam Định để ứng dụng trong sản xuất thức ăn chăn nuôi tôm

Việc tuyển chọn các chủng vi sinh vật probiotic phải dựa trên các tiêu chí là chọn ra chủng sinh ra enzyme ngoại bào có hoạt tính cao để phân hủy các chất hữu cơ protein, bột, xơ, khả

BÙI THỊ HƯƠNG GIANG

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG PROBIOTIC SINH TỔNG HỢP BACTERIOCIN TỪ RUỘT TÔM NƯỚC MẶN TỈNH NAM ĐỊNH ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT

THỨC ĂN CHĂN NUÔI TÔM

LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

HÀ NỘI, 2021

BÙI THỊ HƯƠNG GIANG

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG PROBIOTIC SINH TỔNG HỢP BACTERIOCIN TỪ RUỘT TÔM NƯỚC MẶN TỈNH NAM ĐỊNH ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT

THỨC ĂN CHĂN NUÔI TÔM

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm

Mã số: 8540101

HÀ NỘI – 2021

dẫn là PGS.TS Vũ Văn Hạnh và PGS.TS Hồ Tuấn Anh

Những thông tin trong luận văn có liên quan đến các công trình, tác giả, cơ quan, tổ chức khác được thể hiện trong phần Tài liệu tham khảo

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm theo quy định về nghiên cứu khoa học

và nội dung luận văn của mình

Hà Nội, ngày tháng năm 2021

HỌC VIÊN

Bùi Thị Hương Giang

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Vũ Văn Hạnh, PGS.TS Hồ Tuấn Anh đã trực tiếp hướng dẫn, động viên, quan tâm

và tạo mọi điều kiện giúp đỡ, chỉ bảo tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành công trình nghiên cứu này

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể các thầy cô giáo và cán bộ nhân viên khoa Công nghệ thực phẩm, trường Đại học Kinh tế - Kỹ thuật Công nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi xin cảm ơn các anh chị Phòng Các chất chức năng sinh học - Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Xin trân trọng cảm ơn !

Hà Nội, ngày tháng năm 2021

HỌC VIÊN

Bùi Thị Hương Giang

DANH MỤC HÌNH vi

DANH MỤC BẢNG vii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Probiotics trong chăn nuôi tôm 4

1.2 Bacteriocin trong chăn nuôi tôm 5

1.3 Nuôi tôm công nghệ cao 7

1.4 Tổng quan các công trình nghiên cứu, sản xuất bacteriocin trong và ngoài nước 11

1.5 Cơ sở thực tiễn 17

CHƯƠNG 2: MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 19

CHƯƠNG 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG 20

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

3.1 Đối tượng nghiên cứu 20

3.1.1 Vật liệu 20

3.1.2 Dụng cụ máy móc, thiết bị, hoá chất 20

3.1.3 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật 20

3.2 Nội dung nghiên cứu 21

3.3 Phương pháp nghiên cứu và kỹ thuật sử dụng 21

3.3.1 Phương pháp phân lập, làm thuần chủng và tuyển chọn vi sinh vật 21

3.3.2 Định danh chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin đã được tuyển chọn 25

3.3.3 Nghiên cứu xác định thành phần môi trường dinh dưỡng và điều kiện lên men phù hợp cho quá trình sinh tổng hợp bacteriocin 27

3.3.4 Nghiên cứu xây dựng phương pháp thu nhận sản phẩm bacteriocin qui mô phòng thí nghiệm 28

3.4 Phương pháp xử lý số liệu 29

4.3.1 Ảnh hưởng của hoạt tính kháng khuẩn qua các thế hệ nuôi cấy 42

4.3.2 Nghiên cứu đặc điểm nuôi cấy của chủng Bacillus subtilis N1.4 42

4.3.2.2.Nghiên cứu điều kiện lên men cho quá trình sinh tổng hợp bacteriocin của chủng Bacillus subtilis N1.4 44

4.4 Nghiên cứu xây dựng phương pháp thu nhận sản phẩm bacteriocin quy mô phòng thí nghiệm 46

4.4.1 Nghiên cứu quy trình thu nhận bacteriocin 46

4.4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của bacteriocin 49

4.4.3 Ảnh hưởng của pH đến độ bền của dịch bacteriocin và hoạt tính enzyme 51

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO 54

CMC Carboxymethylcellulose

nghiệp Liên Hợp Quốc

5 Hình 4.2 Khả năng kháng các chủng vi khuẩn kiểm định của các

chủng vi khuẩn phân lập từ ruột tôm

38

6 Hình 4.3 Trình tự đoạn gen của rARN 16S của chủng vi khuẩn chọn

lọc N1.4

40

7 Hình 4.4 Cây phát sinh chủng loại của chủng vi khuẩn chọn lọc N1.4

với các trình tự gen trên GenBank có mức độ tương đồng cao nhất

41

8 Hình 4.5 Khả năng kháng các chủng vi khuẩn kiểm định của các

chủng phân lập được qua các thế hệ từ 2 đến 5

42

9 Hình 4.6 Qui trình chiết tách bacteriocin từ chủng N1.4 48

10 Hình 4.7 Khả năng kháng các chủng vi khuẩn kiểm định của chủng

N1.4 trên môi trường LB và khả năng sinh tổng hợp enzyme trên các

môi trường chứa cơ chất đặc hiệu

50

11 Hình 4.8 Khả năng kháng các chủng vi khuẩn kiểm định của

chủng N1.4 trên môi trường ở 37°C

52

3 Bảng 3.3 Chu trình phản ứng PCR 27

4 Bảng 4.1 Mật độ vi sinh vật từ các mẫu tôm nước mặn 30

5 Bảng 4.2 Khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào của các

chủng phân lập từ ruột tôm

10 Bảng 4.7 Ảnh hưởng của thời gian lên men đến hoạt tính

enzyme thủy phân

46

11 Bảng 4.8 Khả năng chiết tách của các dung môi khác nhau đối

với bateriocins từ dịch nổi

47

12 Bảng 4.9 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính kháng khuẩn 49

13 Bảng 4.10 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính kháng khuẩn 51

14 Bảng 4.11 Ảnh hưởng của protease đến hoạt tính kháng khuẩn

của bacteriocin

52

vật nuôi tăng khả năng kháng bệnh [21]

De Vuyst đã nghiên cứu bacteriocin là những protein hoặc phức hợp protein

có hoạt tính kháng khuẩn [16] Khác với hầu hết các kháng sinh dùng trong y học, bacteriocin là các phân tử protein dễ bị phân hủy bởi enzyme protease trong hệ tiêu hóa người Chúng hoạt động chỉ cần một lượng nhỏ và không gây độc Bacteriocin không gây tác dụng phụ, không gây ra phản ứng dị ứng trong cơ thể người và các vấn đề về sức khỏe Các bacteriocin có hoạt tính kháng khuẩn cao thậm chí ở nồng độ thấp, có đặc tính diệt khuẩn trong các cơ quan của hệ tiêu hoá

ở pH thấp, bacteriocin tương đối bền ở nhiệt độ cao và không bị ảnh hưởng bởi các dung môi hữu cơ

Bảo quản sinh học thực phẩm với việc sử dụng các vi sinh vật đối kháng hay các sản phẩm trao đổi chất của chúng (chất bảo quản sinh học) để ức chế hay tiêu diệt các vi sinh vật không mong muốn là giải pháp có nhiều tiềm năng Ưu điểm của bacteriocin trong bảo quản sinh học thực phẩm là tăng thời hạn sử dụng, hạn chế sự truyền mầm bệnh trong chuỗi thức ăn, giảm thiệt hại kinh tế do hư hỏng thực phẩm, hạn chế sử dụng chất bảo quản hóa học cũng như những xử lý nhiệt Bacteriocin giúp bảo quản giá trị dinh dưỡng và vitamin, thỏa mãn nhu cầu công nghiệp và người tiêu dùng Một xu hướng trong công nghiệp thực phẩm ở Châu Âu là hạn chế sử dụng chất phụ gia và thành phần nhân tạo, đảm bảo an toàn, giữ nguyên chất lượng Những yêu cầu này có thể được đáp ứng nhờ sử dụng bacteriocin

Ngành thuỷ sản của Việt Nam phát triển rất nhanh chóng, có định hướng đảm bảo nhu cầu tiêu dùng trong nước và ổn định chất lượng cho xuất khẩu Nuôi tôm công nghệ cao đã phát triển tại nhiều tỉnh ven biển trong đó có Nam Định

thực vật và động vật trong đầm nuôi do mật độ nuôi thả tôm cá cao Thành phần các chất hữu cơ này rất đa dạng chứa hàm lượng rất cao các thành phần protein, tinh bột, kitin, xenlulose và muối phốt phát Ngoài ra, trong đầm nuôi cũng tồn tại nhiều loài vi sinh vật gây bệnh đối với tôm cá Việc tuyển chọn các chủng vi sinh vật probiotic phải dựa trên các tiêu chí là chọn ra chủng sinh ra enzyme ngoại bào

có hoạt tính cao để phân hủy các chất hữu cơ (protein, bột, xơ), khả năng chuyển hóa khí độc (NO2, H2S, NH3) sang dạng không độc và bacteriocin với khả năng

ức chế được với nhiều chủng vi sinh vật gây bệnh trong đường ruột và môi trường

ao nuôi Việc sử dụng bacteriocin kết hợp với enzyme và các chủng probiotic trong nuôi trồng thuỷ sản và chăn nuôi là xu hướng đúng đắn hiện nay, góp phần làm giảm việc sử dụng chất hóa học và kháng sinh độc hại trong nuôi trồng thuỷ sản cũng như trong bảo quản thực phẩm

Chế phẩm bacteriocin với hoạt tính sinh học có thể ứng dụng trong quy trình nuôi tôm công nghệ cao mang lại hiệu quả vượt trội, đóng góp cho cộng đồng thực phẩm an toàn, chất lượng dinh dưỡng và an toàn vệ sinh thực phẩm Nghiên cứu bacteriocin là hướng đi đúng với định hướng phát triển bền vững theo chủ trương, chính sách của Nhà nước và phù hợp với xu thế phát triển của thế giới

Nhằm góp phần khai thác nguồn vi sinh vật có lợi (probiotics) từ nguồn tôm sống trong tự nhiên có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin, đề tài luận văn thạc sĩ

này được xác định là: “ Phân lập và tuyển chọn chủng probiotic sinh tổng hợp bacteriocin từ ruột tôm nước mặn tỉnh Nam Định để ứng dụng trong sản xuất thức ăn chăn nuôi tôm”

Kết quả nghiên cứu là sản phẩm bacteriocin mang lại ý nghĩa thực tiễn và đặc biệt quan trọng đối với nhu cầu cấp bách hiện nay là giảm và bỏ sử dụng kháng

nhức nhối của ngành thuỷ sản Tôm với dư lượng hoá chất và kháng sinh cao phải bán giá thấp, không thể xuất khẩu được, người nuôi tôm không có lợi nhuận, thêm nữa, lại bán cho chính người dân nội địa tiêu dùng, ảnh hưởng tiêu cực đến sức khoẻ cộng đồng

chiếm thức ăn, đồng thời có thể sinh ra các chất có khả năng kháng khuẩn trực tiếp như bacteriocin hay enzymes có khả năng phân huỷ các chất hữu cơ trong tiêu hoá thức ăn hay xử lý ô nhiễm nước ao nuôi tôm

Thức ăn bổ sung vi sinh vật sống ảnh hưởng có lợi đến động vật chủ bằng cách cải thiện sự cân bằng đường ruột của nó [21] Probiotic là các chế phẩm tế bào vi sinh vật hoặc các thành phần của tế bào vi sinh vật có tác dụng có lợi cho sức khỏe và tinh thần của vật chủ [37] Tuy nhiên, không có định nghĩa nào nêu trên phù hợp với nuôi trồng thủy sản vì động vật thủy sản có mối quan hệ chặt chẽ hơn với môi trường của chúng so với động vật trên cạn Thực tế, trong nước nuôi thủy sản, mầm bệnh sinh sôi độc lập với vật chủ, sinh vật cơ hội có thể đạt mật độ cao xung quanh động vật thủy sinh [31] Hơn nữa, vi khuẩn hiện diện trong môi trường nước ảnh hưởng đến thành phần của hệ vi sinh vật đường ruột [14] Do sự tương tác tích cực giữa môi trường và động vật thủy sản nuôi, chế phẩm sinh học phải được điều chỉnh cho phù hợp với nuôi trồng thủy sản: “vi sinh vật sống bổ sung với tác dụng có lợi đối với vật chủ bằng cách thay đổi cộng đồng vi sinh vật liên quan đến vật chủ hoặc môi trường xung quanh, đảm bảo cải thiện việc sử dụng thức ăn hoặc nâng cao giá trị dinh dưỡng của nó, tăng cường phản ứng của vật chủ

đối với dịch bệnh, cải thiện chất lượng môi trường xung quanh” [46]

Sử dụng chế phẩm probiotic trong nuôi trồng thuỷ sản cho kết quả ưu việt hơn hẳn sử dụng hóa chất cũng như thuốc kháng sinh Hóa chất chỉ làm sạch nước tạm thời và giết chết hàng loạt tảo trong đầm Hơn nữa, thay vì cần phải làm sạch chất hữu cơ và lắng cặn bùn thì hóa chất lại góp phần hình thành nên lớp bùn dày hơn ở đáy đầm tạo điều kiện cho các vi sinh vật gây hại phát triển Bên cạnh đó, nhiều loài tôm, cá và động vật thủy sinh khác cũng có thể bị chết bởi hóa chất

Việc sử dụng probiotic trong nuôi trồng thủy sản còn giúp đối động vật hấp thụ thức ăn dễ dàng hơn, giảm hệ số tiêu thụ thức ăn, tăng năng suất thu hoạch từ

20 – 30% [40] Probiotic được dùng cho nuôi trồng thủy sản phải có khả năng ảnh hưởng tích cực đến sức khỏe vật chủ như loại trừ cạnh tranh [10], bổ sung enzyme vào quá trình tiêu hóa và tăng cường phản ứng miễn dịch [11]

1.2 Bacteriocin trong chăn nuôi tôm

Bacteriocin là một nhóm không đồng nhất của các peptit hoặc protein của

vi khuẩn có hoạt tính sinh học, được tổng hợp từ ribosom, có hoạt tính kháng khuẩn Bacteriocin có tính chất sinh hóa khá đa dạng về KLPT, cơ chế hoạt động, phổ hoạt động, vị trí và trình tự của axit amin trong chuỗi Bacteriocin từ vi khuẩn

Gram dương (Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Enterococcus, Leuconostoc, Pediococcus và Propionibacterium) và vi khuẩn Gram âm (Escherichia coli, Shigella, Serratia, Klebsiella và Pseudomonas) Trong cơ sở dữ

liệu truy cập mở của Bactibase có hơn 200 bacteriocin Bacteriocin và vi sinh vật tạo ra bacteriocin đang được quan tâm hơn trong y học và trong bảo quản thực phẩm [24] Bacteriocin ổn định hơn và hiệu quả hơn ở pH axit, ở nhiệt độ cao hơn hoặc nhiệt độ thấp hơn Bacteriocin đóng vai trò như các rào cản diệt khuẩn, ví dụ bacteriocin (Lysozyme) là protein có nguồn gốc động vật, phân giải tế bào vi khuẩn Gram dương và được dùng để ngăn chặn sự hình thành khí phomát Lysozyme và nisin có tác động hiệp đồng để làm bất hoạt chủng Listeria monocytogenes Một số bacteriocin (lactocin S) có tốc độ tiêu diệt chậm hơn nhiều

so với những loại khác Kết hợp các bacteriocin hoạt tính nhanh và chậm trong thực phẩm có thể cho phép thực phẩm an toàn lâu hơn Ngoài ra, bacteriocin được

sử dụng như một biện pháp xử lý cùng với các phương pháp phát hiện nhanh khác

để loại bỏ tạp nhiễm trong sản xuất bia [44]

Bacteriocin là sản phẩm sinh học sinh ra trong quá trình lên men tăng sinh khối probiotic với tác dụng kháng khuẩn, là yếu tố mang lại lợi ích trực tiếp cho nuôi tôm Vì vậy có thể sử dụng trực tiếp bacteriocin đã được sản xuất từ một quy trình chuẩn, bổ sung vào quy trình chăn nuôi theo liều lượng chuẩn đã được tính toán khoa học (cho ăn và cho vào xử lý nước) So với bổ sung sinh khối probiotic,

bổ sung bacteriocin không bị phụ thuộc vào điều kiện nuôi tôm có thể làm thay đổi sự tăng sinh khối của probiotic ảnh hưởng tới hoạt tính, liều lượng của bacteriocin

Việc sử dụng chế phẩm bacteriocin được sản xuất trong điều kiện nuôi cấy tiêu chuẩn và có hoạt lực sinh học cao bổ sung trực tiếp vào ao nuôi ngay lập tức tiêu diệt các hại khuẩn, các mầm bệnh trong ao nuôi, đảm bảo có tác dụng kháng khuẩn tốt nhất thậm chí trong ngày (24 giờ) trước khi thay nước là giải pháp đột phá và có ý nghĩa quan trọng, phù hợp với tình hình nuôi tôm thực tế tại Việt nam

và đúng với khoa học, mang lại hiệu quả thành công, an toàn, bảo vệ sức khoẻ người tiêu thụ sản phẩm và bảo vệ môi trường

Bacteriocin có hoạt tính kháng khuẩn Bacteriocin có tính chất sinh hóa khá

đa dạng về khối lượng phân tử, cơ chế hoạt động, phổ hoạt động, vị trí và trình tự của axit amin trong chuỗi Sinh tổng hợp bacteriocin diễn ra dưới sự kiểm soát của các gen trên plasmid hoặc ADN chứa các yếu tố di truyền

Bacteriocin được sinh tổng hợp từ các loại vi khuẩn Gram dương

(Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Enterococcus, Leuconostoc, Pediococcus và Propionibacterium) và vi khuẩn Gram âm (Escherichia coli, Shigella, Serratia, Klebsiella và Pseudomonas)

Bacteriocin có các đặc điểm lí tưởng trong bảo quản sinh học thực phẩm Nhiều bacteriocin bền trong điều kiện nhiệt độ chế biến cao và hoạt động trong phạm vi pH rộng Bacteriocin không mùi, không màu, không vị, ít ảnh hưởng đến

hệ vi sinh vật đường ruột, có phổ kháng khuẩn, mầm bệnh và vi khuẩn gây hỏng

thực phẩm tương đối rộng Một số bacteriocin có hiệu quả cao khi sử dụng phối hợp với các yếu tố kháng khuẩn khác như hợp chất phenolic tự nhiên cũng như những protein kháng khuẩn khác Ngoài ra, sự kết hợp bacteriocin với xử lý vật lí như áp suất cao hay xung điện trường giúp bảo quản thực phẩm hiệu quả hơn, nhất

là đối với những dạng có khả năng sống sót cao như vi khuẩn sinh bào tử Tính hiệu quả của bacteriocin thường bị ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường như pH, nhiệt độ, thành phần thực phẩm và cấu trúc, cũng như vi khuẩn thực phẩm Do đó, cần xác định hiệu quả của bacteriocin cho mỗi hệ thống thực phẩm Những năm gần đây đã có những nghiên cứu phát triển phương pháp mới trong bảo quản thực phẩm, đặc biệt là các bacteriocin Tuy nhiên đến nay, tác dụng của các bacteriocin trong thực phẩm còn tương đối hạn chế Chủng sản xuất phải có dạng GRAS (Generally regarded as safe - vi sinh vật an toàn), phải được thử nghiệm tính độc, không có rủi ro về sức khỏe qua quá trình xác định các mặt như ảnh hưởng tích lũy, điều phối và tiềm tàng Hiện nay có hai bacteriocin được thương mại là nisin

từ Lactococcus lactis và pediocin PA-1/AcH từ Pediococcus acidilactici, chúng

đều được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm Nisin và pediocin PA-1/AcH có tên thương mại tương ứng là Nisaplin, ALTA)

1.3 Nuôi tôm công nghệ cao

Những năm gần đây mô hình nuôi tôm công nghệ cao được áp dụng rộng rãi ở nhiều khu vực, nhiều tỉnh thành và mang lại thành công lớn cho bà con nuôi trồng thủy sản Mô hình nuôi tôm công nghệ cao mang lại hiệu quả cao gấp nhiều lần so với các mô hình truyền thống Nuôi tôm công nghệ cao là một mô hình nâng cao năng suất và chất lượng của tôm nuôi nhờ vào sự kiểm soát toàn bộ quá trình nuôi tôm, phân tích, lưu trữ và kiểm soát các tiêu chí, chỉ số của nước Ngoài ra

mô hình nuôi tôm công nghệ cao còn là sự kết hợp của hệ thống bao gồm ao nuôi,

ao lắng, ao trữ nước, ao xử lý chất thải, hệ thống xử lý nước phù hợp với từng giai đoạn Việc kiểm soát chế độ dinh dưỡng và an toàn sinh học trong nuôi tôm công nghệ cao rất quan trọng và được ưu tiên hàng đầu với việc đầu tư trang thiết bị và vận hành hệ thống tự động hoá, ao lót bạt, sục khí tự động, thay nước thường

xuyên Việc thay nước hàng ngày khi tôm đạt kích thước lớn (sau 30 ngày) để hạn chế ô nhiễm làm cho chi phí vận hành tăng cao, hệ vi sinh vật không có đủ thời gian cần thiết để có thể phân giải chất hữu cơ trong ao nuôi hoặc tăng sinh khối

để sinh tổng hợp các kháng khuẩn hay enzyme để làm sạch nước

Đầm nuôi tôm là những hệ sinh thái nước không đặc trưng do chịu nhiều tác động của con người Hệ sinh thái đầm nuôi tôm được cấu thành bởi nước, khoáng chất, các hợp chất hữu cơ hòa tan và sinh vật thuỷ sinh Vi sinh vật là một thành phần quan trọng của hệ thủy vi sinh vật ở đây vì chúng không những đóng vai trò chủ đạo trong các chu trình chuyển hóa các nguyên tố cơ bản cấu tạo nên hợp chất hữu cơ mà tác động trực tiếp hoặc gián tiếp lên nguồn lợi thủy sản [2] Các hợp chất hữu cơ trong ao có nguồn gốc khác nhau: thức ăn dư thừa, phân tôm, chất tiết ra từ mọi quá trình trao đổi chất của thủy sinh vật, xác động vật, thực vật phù du… Do đó, nếu nồng độ của chúng trong nước quá cao sẽ gây ô nhiễm nguồn nước, gây ra các hội chứng sốc ở tôm Nấm, động vật nguyên sinh và một

số vi khuẩn là vi sinh vật dị dưỡng nên chúng cần chất hữu cơ từ bên ngoài môi trường Chúng sử dụng những chất này để thu nhận các tiền chất cho việc xây dựng nên tế bào và thu nhận năng lượng cho các quá trình sống Vật chất hữu cơ được vi sinh vật biến đổi thành tế bào và trong điều kiện phù hợp thì chuyển hóa ngược lại thành những chất vô cơ ban đầu Bên cạnh khả năng phân giải chất hữu

cơ, nhóm vi khuẩn có ích còn có khả năng cạnh tranh sinh học, ức chế sự phát

triển của các vi khuẩn gây bệnh ở tôm là Vibrio và Aeromonas [47]

Đối với dinh dưỡng trong nuôi tôm, hàm lượng dinh dưỡng trong công thức cám tôm rất cao (thậm chí rất cao so với các loại vật nuôi xác lớn khác) Thành phần nguyên liệu của thức ăn viên cho tôm thường gồm 35% bột cá, 25% bánh dầu nành, 25% bột mì và 15% chất phụ gia bổ sung khác Tôm là loài thủy sản ăn

và bắt mồi chậm nên sau khi thức ăn được đưa vào nước thì có tới 20% thức ăn là không được tôm ăn vào mà còn lại trong môi trường ao Thức ăn vào ruột tôm chỉ thực sự hấp thu 30% vào cơ thể, còn lại 70% là vào môi trường nước Như vậy với 20% thức ăn thức ăn thất thoát và 50% phân tôm sẽ tồn tại trong ao nuôi ở

dạng chất thải hữu cơ là nguồn ô nhiễm cho ao nuôi Ruột tôm rất ngắn, hệ cơ quan nội tạng rất đơn giản, hoạt động của hệ tiêu hoá, gan tuỵ và hệ thống các enzymes đường ruột rất yếu kém Lượng thức ăn vào hệ thống tiêu hoá là quá tải đối với hệ tiêu hoá tôm, tạo sức ép, gánh nặng lên hoạt động tiêu hoá, gan tuỵ, (tôm dễ mắc bệnh gan tuỵ) Ngoài việc lãng phí thức ăn làm tăng chi phí cao, tôm rất nhạy cảm với các điều kiện bất lợi và sức khoẻ tôm dễ bị ảnh hưởng Lượng thải ra môi trường ao nuôi trong ngày là rất lớn gây ô nhiễm, đặc biệt trong điều kiện nuôi tôm với mật độ dày đặc

Trong khoảng thời gian gần đây nghề nuôi tôm đang đối mặt với rất nhiều thách thức, dịch bệnh, môi trường ô nhiễm và hiện tượng tôm chết hàng loạt gây

ra thiệt hại lớn về kinh tế Đáng quan tâm nhất là hội chứng hoại tử gan tụy cấp tính [19] hay còn gọi là hội chứng chết sớm (early mortality syndrome – EMS) [28] Hội chứng hoại tử gan tụy cấp tính xuất hiện ở Trung Quốc vào năm 2009,

ở Việt Nam vào năm 2010 rồi đến Thái Lan và Mã Lai vào năm 2011 [28], [19] Bệnh này xuất hiện và gây chết hàng loạt trên tôm nuôi ở các Tỉnh Sóc Trăng, Bạc Liêu, Trà Vinh, Bến Tre và Kiên Giang Bệnh xuất hiện ở tôm sú và tôm thẻ khoảng 10 - 45 ngày sau khi thả giống, tỉ lệ chết có thể lên đến 100% ở những ao nhiễm nặng Tác nhân gây ra hội chứng hoại tử gan tụy cấp tính là do vi khuẩn

Vibrio parahaemolyticus mang thể thực khuẩn (Bateriophage) [29] Hiện nay có nhiều biện pháp được đề xuất để ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây hội chứng hoại tử gan tụy cấp như: dùng hóa chất diệt

khuẩn, sử dụng kháng sinh, áp dụng biện pháp sinh học, Tuy nhiên, biện pháp

sử dụng hóa chất, kháng sinh dễ gây ra nguy cơ phát sinh nhiều loài vi khuẩn gây bệnh kháng với kháng sinh Thêm vào đó, sự tồn dư thuốc trong thực phẩm cũng

là chỉ tiêu quan trọng trong kiểm định nhập khẩu sản phẩm nông nghiệp tại nhiều quốc gia trên thế giới Vì thế, cách tốt nhất là sử dụng biện pháp sinh học, dùng vi khuẩn có lợi probiotic có khả năng đối kháng với vi khuẩn gây bệnh Biện pháp này không những có thể kiểm soát được mật độ vi khuẩn gây bệnh mà còn đảm

bảo an toàn vệ sinh thực phẩm và có lợi cho môi trường do chỉ sử dụng các loài vi khuẩn hữu ích [3]

Với tác dụng kháng khuẩn, tiêu diệt được nhiều vi khuẩn có hại, bacteriocin giúp tôm khoẻ, hạn chế được lượng kháng sinh dùng trong chăn nuôi tôm, góp phần cho bảo vệ môi trường và tạo ra nguồn thực phẩm là tôm an toàn, không bị

dư lượng kháng sinh, đảm bảo sức khoẻ người tiêu dùng và tăng tỷ lệ thành công trong nuôi tôm cao sản bằng công nghệ cao Bacteriocin phát triển ngành nuôi tôm, giúp xuất khẩu tôm sạch ra thế giới, mang lại ý nghĩa quan trọng cho ứng dụng công nghệ sinh học hiện đại vào sản xuất và chế biến thực phẩm

Việc sử dụng probiotic trong nuôi trồng thuỷ sản (NTTS) còn giúp đối động vật hấp thụ thức ăn dễ hơn giảm hệ số tiêu thụ thức ăn tăng năng suất 20 – 30% [40] Probiotic được dùng cho NTTS có ảnh hưởng tích cực đến sức khỏe vật chủ [41] như loại trừ cạnh tranh [10] bổ sung enzyme vào quá trình tiêu hóa [11]và tăng cường phản ứng miễn dịch

Vi sinh vật là một thành phần quan trọng của hệ thủy vi sinh vật ở đây, nó tác động trực tiếp hoặc gián tiếp lên nguồn lợi thủy sản [2],[8] Các vi sinh vật có lợi làm giảm ô nhiễm nguồn nước, bổ sung vào nguồn dinh dưỡng cần thiết cho thủy sản [12] Trong môi trường nước nuôi tôm và cá chứa các loại hợp chất hữu

cơ thường chứa hàm lượng cao: protein, cacbonhidrate, kitin,… Sự phân hủy

protein bởi nhiều loại vi khuẩn như Pseudomonas, Clostridium, Bacillus và

Enterobacteriaceae trong nước nuôi [6] Nhóm vi sinh vật hữu ích chuyển hóa các

hợp chất cacbonhydrate bao gồm các chi Bacillus, Lactobacillus, Streptococus, Cellulomonas, Aerobacter … Bên cạnh khả năng phân giải chất hữu cơ, nó còn

có khả năng cạnh tranh sinh học, ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh

ở tôm là Vibrio và Aeromonas ở cá [47] Do đó, phân lập và chọn lựa được chủng

vsv tiềm năng sinh tổng hợp bacteriocin, có tính chất probiotic định hướng dùng trong NTTS là rất cần thiết

1.4 Tổng quan các công trình nghiên cứu, sản xuất bacteriocin trong và ngoài nước

Các vi sinh vật như Bacillus, Lactobacillus, nhóm vi khuẩn quang dưỡng,

hóa dưỡng… được sử dụng chủ yếu để sản xuất các chế phẩm sinh học Chúng không độc hại, dễ nuôi cấy, dễ tồn tại trong môi trường nước và đất nghèo dinh dưỡng Chúng có khả năng phân huỷ thức ăn thừa, chất thải hữu cơ và làm sạch môi trường nhờ các enzyme do chúng tạo ra Ngoài ra chúng còn có khả năng sinh các chất kháng khuẩn như bacteriocin được dùng trong chăn nuôi, bảo quản thực phẩm, nâng cao hiệu suất tăng trưởng, hiệu suất sử dụng thức ăn của động vật nuôi, làm giảm sự sinh sôi và phát triển của những vi sinh vật có hại Nhờ những đặc điểm này mà chúng được sử dụng để cải thiện môi trường nước, nâng cao hiệu quả kinh tế, hạn chế dịch bệnh cho tôm

Nhóm vi khuẩn Bacillus tiềm năng sản sinh bacteriocin, sinh enzyme ngoại bào Các chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus phân bố rất rộng trong tự nhiên (đất,

nước, không khí, thực phẩm…) và gồm nhiều nhóm sinh thái khác nhau (ưa ấm,

ưa nhiệt, ưa lạnh…), với khoảng gần 500 loài và dưới loài Các hoạt chất sinh học của chúng cũng vô cùng phong phú: các enzyme ngoại bào, các chất kháng khuẩn, bacteriocin và kháng nấm, các chất kích thích sinh trưởng thực vật, các chất hoạt động bề mặt [5]

Bacillus là những vi khuẩn Gram dương, sinh trưởng trong điều kiện hiếu

khí hoặc kỵ khí không bắt buộc, có khả năng tạo nội bào tử khi gặp điều kiện bất lợi như cạn kiệt nguồn dinh dưỡng, điều kiện bất lợi về nhiệt độ cao, tia bức xạ, hóa chất… Bào tử có thể tồn tại trong nhiều năm, khi gặp điều kiện thuận lợi có

thể nảy mầm, phát triển thành tế bào dinh dưỡng Bacillus là những vi khuẩn hóa

tự dưỡng hữu cơ tùy tiện có khả năng sử dụng nhiều các hợp chất hữu cơ như các

loại đường, axit amin, các axit hữu cơ Một số ít loài như B megaterium lại không

cần đến các yếu tố sinh trưởng hữu cơ, một số khác sinh trưởng lại cần có vitamin

B hoặc các axit amin Phần lớn Bacillus là các vi khuẩn ưa ấm, tối ưu 30 – 45oC, một số loài có thể sinh trưởng ở nhiệt độ 65oC Một số loài ưa lạnh có thể sinh

trưởng và hình thành nội bào tử ở 0oC, pH sinh trưởng từ 2-11 Đa số Bacillus sinh trưởng tốt ở pH 7 như B alcalophillus, hay pH 2 - 6 như B acidocaldrius

[5]

Hầu hết các Bacillus là không độc hại cho người (ngoài B anthracis gây bệnh than cho người) Bacillus làm sạch môi trường nước nhờ khả năng sinh

enzyme ngoại bào phân hủy chất hữu cơ có nguồn gốc từ thức ăn thừa, chất thải

từ tôm cá: protease phân hủy protein, amylase phân hủy tinh bột, xenlulase phân hủy xenlulose, kitinase phân giải kitin Ngoài chức năng phân giải các hợp chất

hữu cơ làm sạch môi trường thì Bacillus còn có tác dụng kiểm soát sự phát triển

quá mức của vi sinh vật gây bệnh do cơ chế cạnh tranh nguồn dinh dưỡng, giữ cho môi trường luôn ở trạng thái cân bằng sinh học

Bacillus thường sản sinh ra các hợp chất có hoạt tính sinh học, enzymes,

được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực Các sản phẩm cuối cùng của sự phân hủy chất hữu cơ là nguồn dinh dưỡng cho nhiều loại vi sinh vật có ích, giúp cho chúng phát triển mạnh và cải thiện chất lượng nước [5]

Bacteriocin được sinh tổng hợp từ Bacillus subtilis được xác định là một

loại thuốc mới chống lại các vi khuẩn gây bệnh loét chân do tiểu đường (Baby,

J., 2013) Một số chủng Bacillus subtilis cũng được coi là vi khuẩn probiotic,

tồn tại trong sinh phẩm ở trạng thái bào tử, nhờ vậy khi vào dạ dày nó không bị axit cũng như các men tiêu hóa ở dịch vị phá hủy Ở ruột, bào tử nảy mầm và

phát triển thành thể hoạt động Giai đoạn này, B subtilis tổng hợp nhiều chất có

hoạt tính sinh học có lợi cho cơ thể như các enzym thủy phân, các vitamin, axit amin …Một số enzyme như protease, α-amylase, β-glucanase và một số enzyme

khác hoạt động mạnh có lợi cho tiêu hóa ở ruột Bacillus subtilis thuộc nhóm vi

sinh vật hiếu khí hay kỵ khí tùy nghi Nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn phát triển

là 30 – 50oC Nhiệt độ tối ưu là 37oC, pH thích hợp khoảng 7,0 – 7,4 Bacillus subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, bắt màu tím Gram (+), kích thước 0,5 –

0,8µm x 1,5 – 3µm, đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn, có khả năng di động, có 8 –

12 lông, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn nằm giữa hoặc lệch tâm tế bào, kích

thước từ 0,8 – 1,8µm Bacillus subtilis cần các nguyên tố C, H, O, N và một số

nguyên tố vi lượng để phát triển; quan trọng nhất là carbon và nitơ; có khả năng

dùng các hợp chất vô cơ làm nguồn carbon B subtilis có thể phân chia đối xứng

để tạo ra hai tế bào con (phân hạch nhị phân) hoặc không đối xứng, tạo ra một endospore duy nhất có thể tồn tại trong nhiều thập kỷ và chịu được các điều kiện môi trường bất lợi như hạn hán , nhiễm mặn, pH cao, bức xạ và dung môi Các endospore được hình thành tại thời điểm căng thẳng dinh dưỡng cho phép vi sinh vật tồn tại trong môi trường cho đến khi điều kiện trở nên thuận lợi

Nuôi cấy vi khuẩn B subtilis chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố như nhiệt

độ, thời gian nuôi cấy, pH môi trường… Khoảng nhiệt độ tối thích cho sự phát triển là 35 – 37oC Khi nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường rắn thì pH môi trường gần như không có sự thay đổi nhiều nên sự ảnh hưởng của pH cũng không lớn tới

vi khuẩn B subtilis Nhưng ngược lại nếu nuôi chìm, pH môi trường có ảnh hưởng rất lớn tới vi khuẩn B subtilis pH môi trường thích hợp nhất để vi khuẩn B subtilis

sinh trưởng là 6,8 – 7,5

Một trong những nhóm vi khuẩn điển hình có ích đối với môi trường đầm nuôi tôm cá là nhóm vi khuẩn lactic Các vi khuẩn lactic thuộc họ Lactobacteriacae Chúng không đồng nhất về mặt hình thái, các giống khác nhau

có hình dạng và kích thước khác nhau, được chia thành hai loại hình cầu và hình que

Vi khuẩn lactic (LAB) bao gồm một số chi: Carnobacterim, Enterococcus, Lactpbacillus, Lactococcus, Lactosphaera, Leuconostoc, Melissococcus, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus và Weissella thuộc ngành Fermicute

Streptococcus có tế bào hình cầu hoặc hình ovan, đường kính khoảng 0,5

-1,0 µm, cặp đôi hoặc thành chuỗi dài Tuy nhiên, một số chủng thuộc loài này có thể có dạng hơi giống trực khuẩn vì có kích thước chiều dài lớn hơn chiều rộng,

như Streptococus lactic [7]

Leuconostoc có hình dạng hơi dài hoặc hình ovan, đường kính từ 0,5 -

0,8µm và chiều dài khoảng 1,6µm Đôi khi chúng có dạng hơi tròn, chiều dài 3µm, sắp xếp thành chuỗi và không tạo thành đám [7]

1-Lactobacillus có hình que, là loại vi khuẩn phổ biến nhất, hình dạng của chúng thay đổi từ hình cầu cho đến hình que dài, chẳng hạn như L plantatum

Nhóm vi khuẩn lactic có khả năng kiểm soát vi sinh vật gây bệnh trong môi trường nhờ sinh tổng hợp chất đối kháng như axit lactic, bacteriocin và một số acid hữu cơ khác Chúng làm giảm mùi hôi của ao nuôi thủy sản Quan trọng hơn

cả, sử dụng nhóm vi khuẩn này còn có tác dụng hạn chế việc sử dụng kháng sinh, đảm bảo tiêu chuẩn vệ sinh thực phẩm cho sản phẩm thủy sản Khi sử dụng nhóm

vi khuẩn lactic để bổ sung vào thức ăn tôm cá, ngoài mục đích làm cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột, ngăn cản sự xâm nhập của vi sinh vật có hại, tăng khả năng phòng ngừa một số bệnh đường ruột thì chúng còn có tác dụng tăng khả năng tiêu hóa và hấp thụ thức ăn, giúp cho tôm cá nuôi phát triển khỏe mạnh, tăng trưởng nhanh [4]

Những năm gần đây những nghiên cứu trên thế giới đã xác định được bản chất của bacteriocin đồng thời xác định được một số loại bacteriocin do LAB sinh

ra và khả năng ứng dụng của nó Những công trình này đã có những đóng góp tích cực, nâng cao chất lượng cuộc sống con người Đã có những nghiên cứu trong và ngoài nước quan tâm dến việc sử dụng bacteriocin do LAB tổng hợp để bảo quản thực phẩm, thay thế các loại hoá chất bảo quản độc hại đồng thời tạo ra các sản phẩm có chất lượng cao Tuy nhiên để có thể thu nhận bacteriocin, cần thiết phải chọn lựa những chủng vi khuẩn có khả năng cao sinh tổng hợp bacteriocin tiến tới

có thể tạo dựng bằng kỹ thuật sinh học và khẳng định những chủng mới thích hợp phục vụ cho sản xuất công nghiệp Bacteriocin được A Gratia tìm thấy đầu tiên năm 1925, kết quả của công trình này tác động mạnh đến sự phát triển của chất kháng sinh và chất kháng khuẩn được sinh ra từ vi khuẩn Bacteriocin đa dạng về cấu trúc, chức năng, sinh thái Bacteriocin có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn khác

do sự tạo thành các kênh làm thay đổi tính thấm của màng tế bào, nhiều loại

bacteriocin còn có khả năng phân giải ADN, ARN và tấn công vào peptidoglycan

để làm suy yếu thành tế bào, được dùng nhiều trong bảo quản thức ăn, xử lý môi trường, chế biến thức ăn chăn nuôi

Bacteriocin được chia thành ba nhóm chính: lantibiotics, non-lantibiotics

và những peptide lớn (KLPT> 30 kDa) L plantarum NCDO 1193 tạo ra

bacteriocin (plataricin B) hoạt tính ức chế vi khuẩn Gram âm và Gram dương [10]

Chủng L sakei 2a sản sinh ra một loại bacteriocin (plataricin sakacin) ức chế đáng kể sự tăng trưởng của các vi sinh vật gây thối [34] Lactobacillus phân lập

từ thịt lên men tự nhiên có một số thuộc tính probiotics, Lactobacilli từ thực phẩm

lên men truyền thống của Thái Lan, với khả năng sống sót cao ở điều kiện acid và

muối, ức chế vi khuẩn gây bệnh, nhạy cảm với nhiều loại kháng sinh Lactobacilli

có nhiều lợi ích cho vật chủ bởi chúng có khả năng bám vào tế bào; ngăn chặn hoặc giảm sự bám vào tế bào của các tác nhân gây bệnh; cạnh tranh dinh dưỡng; kích thích miễn nhiễm, tồn tại và tăng mật độ, tạo ra acid, H2O2 và bacteriocin,

cân bằng vi sinh đường ruột [45] Bacteriocin thô từ L sake có khả năng ức chế

L monocytogenes Bacteriocin từ L fermentum và L acidophilus được phân lập

từ yogurt, phân gà ức chế E.coli kháng lại kháng sinh cephalosporin [36]

Loài Streptococcus sinh ra bacteriocin ở dạng nisin, có tính kháng sinh Leconostoc mesenteroides tạo ra bacteriocin (mesenterocin 5) chống lại vi khuẩn

L monocytogenes gây ngộ độc trên thực phẩm Pediococcus pentosaceus FBB61 tạo ra bacteriocin (Pedicin A) ức chế Lactobacillus, Listeria và Clostridium Bifidobacterium infantis BCRC 14602 tạo ra bacteriocin (Bifidin I) ức chế sự phát

triển của nhiều loại vi khuẩn gây thối

Bacteriocin hay những chất giống bacteriocin từ LAB mà đặc biệt là chi

Lactobacillus có khả năng ức chế lại nhiều loài vi khuẩn gây bệnh đã được nghiên

cứu và công bố bởi nhiều tác giả Bên cạnh đó nhiều nghiên cứu cho thấy rằng thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy có ảnh hưởng đến sự tạo ra bacteriocin Todorov và Dicks nghiên cứu bacteriocin ST712BZ – một bacteriocin

được tạo ra bởi Lactobacillus pentosus ST712BZ được phân lập từ Boza (một thức

uống truyền thống của Bulgaria được tạo ra từ sự lên men của nhiều loại ngũ cốc) Kết quả nghiên cứu cho thấy bacteriocin ST712BZ ức chế được nhiều loài vi

khuẩn như Lactobacillus casei, Escherichia coli, bên cạnh đó thì việc thay đổi

khối lượng của một số thành phần môi trường nuôi có ảnh hưởng tới hoạt tính của bacteriocin này [42] Karthikeyan và Santosh đã phân lập và mô tả một loại

bacteriocin được tạo ra từ Lactobacillus plantarum, loài vi khuẩn được phân lập

từ ruột tôm sú (Penaeus monodon), bacteriocin này đã kháng lại được một vài vi

khuẩn gây bệnh như Salmonella typhimurium, Vibrio cholerae, Staphylococcus aureus, [25]

1.5 Tình hình nuôi tôm tại tỉnh Nam định

Thời tiết diễn biến phức tạp cùng với môi trường bị ô nhiễm, luôn tiềm ẩn nguy cơ bùng phát dịch bệnh đã làm ảnh hưởng trực tiếp đến nghề nuôi tôm ở các địa phương trong tỉnh Nam Định Thời gian qua, nhiều hộ nuôi tôm đã mạnh dạn đầu tư cơ sở hạ tầng, cải tiến quy trình kỹ thuật, đưa những mô hình mới vào sản xuất nhằm tăng năng suất, chất lượng và hiệu quả kinh tế Chi cục Quản lý chất lượng nông lâm sản và thủy sản (Sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn) đã cấp giấy chứng nhận VietGAP cho hàng loạt trang trại nuôi tôm tại tỉnh Nam Định [1]

Hiện nay, toàn tỉnh có 75 vùng nuôi trồng thủy sản tập trung với diện tích khoảng 7.000ha và có trên 6.000 hộ chăn nuôi ở cả khu vực nước mặn, lợ và nước ngọt Phương thức nuôi chuyển từ nuôi quảng canh và quảng canh cải tiến sang nuôi thâm canh và siêu thâm canh, áp dụng theo quy trình VietGAP, nuôi công nghệ cao Đối tượng con nuôi phát triển khá đa dạng và đang từng bước hình thành sản phẩm thủy đặc sản của địa phương Các vùng nuôi tập trung áp dụng khoa học công nghệ cao ở khu vực nuôi tôm thẻ chân trắng Các tiến bộ khoa học kỹ thuật đang được các hộ nuôi ứng dụng như công nghệ nuôi tôm 2, 3 giai đoạn, công nghệ biofloc, nuôi ít thay nước, nuôi tuần hoàn nước, ứng dụng công nghệ vi sinh thay cho các sản phẩm kháng sinh, hóa chất phục vụ nuôi thủy sản Việc nuôi trồng thủy sản theo hướng tập trung ứng dụng khoa học công nghệ không chỉ đẩy mạnh sản lượng cũng như chất lượng sản phẩm thủy hải sản mà còn là tiền đề hình

thành các tổ hợp tác, hợp tác xã sản xuất thủy, hải sản trên địa bàn tỉnh Để có được những kết quả trên, tỉnh đã chỉ đạo quyết liệt, hỗ trợ kinh phí để các địa phương khảo sát, lập và hoàn thành các quy hoạch nông nghiệp, nông thôn đến năm 2020, tầm nhìn đến năm 2030 ở cấp tỉnh, cấp xã, trong đó có quy hoạch phát triển thủy sản tập trung Việc dồn điền, đổi thửa, tích tụ ruộng đất để phát triển các vùng nuôi thủy sản tập trung được tỉnh, các huyện quan tâm, khuyến khích tạo điều kiện thuận lợi Tôm thẻ chân trắng được coi là có giá trị kinh tế cao, được người dân lựa chọn để phát triển nhanh thành các vùng nuôi tập trung theo phương thức thâm canh, siêu thâm canh và ứng dụng công nghệ cao tạo sản lượng thủy sản hàng hóa với quy mô lớn để hình thành chuỗi liên kết giá trị từ sản xuất đến tiêu dùng gắn với quản lý và truy xuất nguồn gốc kết hợp xây dựng thương hiệu sản phẩm Bên cạnh các thuỷ sản nuôi trồng truyền thống, những năm qua tỉnh đặc biệt coi trọng phát triển một vài loại đặc sản trong đó có tôm thẻ chân trắng

Thời gian tới Chi cục Thủy sản tỉnh Nam Định tăng cường khảo sát và tuyên truyền đến các hộ nuôi trồng thủy sản trên địa bàn tỉnh căn cứ vào điều kiện thực tiễn để áp dụng những thành tựu khoa học công nghệ vào sản xuất Phối hợp với các ngành chức năng, các đơn vị có liên quan khuyến khích các nhà khoa học nghiên cứu các ứng dụng mới, các biện pháp cải tiến kỹ thuật giúp nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm thủy, hải sản, tạo sức bật mới trong chăn nuôi thủy sản của tỉnh

1.6 Cơ sở thực tiễn

Hiện nay đã có nhiều các công trình nghiên cứu về bacteriocin đã được báo cáo trong các tài liệu tham khảo, tuy nhiên trình tự các amino acide đối với hầu hết các bacteriocin còn chưa được xác định Trong số các loại vi sinh vật được coi

là an toàn (GRAS), nhóm vi khuẩn lactic acid bacteria (LAB) và Bacillus thường

được ứng dụng rộng rãi trong thực phẩm và chăn nuôi

Phòng thí nghiệm của Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học

& Công nghệ Việt Nam có đầy đủ các máy móc, thiết bị, dụng cụ đảm bảo cho các nghiên cứu của đề tài được thực hiện Các chuyên gia hàng đầu về nghiên cứu

khoa học có thế mạnh trong kỹ thuật phân lập và tuyển chọn vi sinh vật, đánh giá khả năng sinh tổng hợp các hoạt chất sinh học ngoại bào của vi sinh vật, định danh bằng kỹ thuật sinh học phân tử, tạo chế phẩm sinh học

Phân lập và tuyển chọn chủng probiotic sinh tổng hợp bacteriocin từ ruột tôm nước mặn tỉnh Nam Định có nhiệm vụ tìm ra vi sinh vật bản địa từ quá trình chăn nuôi tôm, có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin làm tiền đề cho việc tạo ra chế phẩm phù hợp với các điều kiện tự nhiên của địa phương để ứng dụng trong sản xuất thức ăn chăn nuôi tôm

CHƯƠNG 2: MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài bao gồm:

Mục tiêu chung:

Tuyển chọn được 1-2 chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin từ ruột tôm nước mặn tỉnh Nam Định

Mục tiêu cụ thể:

- Tuyển chọn được 1-2 chủng probiotic sinh bacteriocin

- Định danh chủng được tuyển chọn bằng kỹ thuật sinh học phân tử

- Xây dựng được phương pháp thu nhận bacteriocin quy mô phòng thí nghiệm

CHƯƠNG 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU 3.1 Đối tượng nghiên cứu

3.1.2 Dụng cụ máy móc, thiết bị, hoá chất

- Kính hiển vi Nikon YS100, máy ly tâm Hittich MIKRO 185, tủ nuôi lắc Wise Cube, nồi khử trùng Tomy ES 315, bốc cấy, cân điện tử, tủ ủ, buồng đếm

3.1.3 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật

- Môi trường phân lập:

Môi trường Luria-Bertani (LB-agar): peptone 10 g, cao nấm men 5 g, NaCl

5 g, agar 20g, pH 7, nước cất vừa đủ 1 lít

Nutrient Broth (NB-agar): peptone 10 g, cao thịt bò 5 g, NaCl 5 g, agar 20g,

pH 7, nước cất vừa đủ 1 lít

- Các môi trường nuôi cấy vi sinh vật được khử trùng ở 121°C trong 20

phút, để nguội trước khi sử dụng

- Hoá chất: Kit E.Z.N.A ® Bacterial của hãng OMEGA, Master Mix (Invitrogen, Mỹ)

- Môi trường LB với các thành phần như trên có bổ sung các cơ chất tinh

bột (0,2%, w/v), Carboxymethyl cellulose (CMC) (0,2%, w/v) và casein (0,2%, w/v), được sử dụng trong nghiên cứu hoạt tính của các enzyme ngoại bào tương ứng amylase, celluase, protease bằng phương pháp khuếch tán

3.2 Nội dung nghiên cứu

Các nội dung nghiên cứu bao gồm:

Nội dung 1: Phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng sinh

tổng hợp bacteriocin từ ruột tôm nước mặn tại vùng biển Nam Định

Nội dung 2: Định danh đến loài chủng vi sinh vật được tuyển chọn bằng

kỹ thuật sinh học phân tử

Nội dung 3: Nghiên cứu xác định thành phần môi trường dinh dưỡng và

điều kiện lên men phù hợp cho quá trình sinh tổng hợp bacteriocin

Nội dung 4: Nghiên cứu xây dựng phương pháp thu nhận bacteriocin quy

mô phòng thí nghiệm

3.3 Phương pháp nghiên cứu và kỹ thuật sử dụng 3.3.1 Phương pháp phân lập, làm thuần chủng và tuyển chọn vi sinh vật

- Phân lập vi khuẩn từ các mẫu tôm: Tiến hành mổ tách lấy ruột của tôm

nước mặn Mẫu ruột tôm được cho vào ống eppendoft có chứa nước muối sinh lí Mẫu được pha loãng đến nồng độ 10-4, hút 100 µl dịch đã pha loãng cấy trải trên môi trường LB-agar và bọc kín, ủ ở 37ᵒC Sau 2 ngày quan sát các khuẩn lạc, cấy chuyển để tách các dòng vi khuẩn thuần Chọn khuẩn lạc đặc trưng và tiến hành làm thuần bằng cách cấy ria trên môi trường LB-agar cho tới khi quan sát thấy chỉ

có một dạng khuẩn lạc duy nhất trên môi trường Khi các khuẩn lạc đã thuần sau nhiều lần cấy chuyển sàng lọc, tiến hành giữ giống và bảo quản ở -20oC trong glycerol 30% Các khuẩn lạc riêng rẽ được nhặt ra để kiểm tra một số hoạt tính kháng khuẩn và sinh tổng hợp enzyme theo các sơ đồ thể hiện trên hình 3.1 và 3.2

Hình 3.1 Sơ đồ phân lập và làm thuần các chủng vi khuẩn thu được từ ruột tôm

Hình 3.2 Sơ đồ kiểm tra hoạt tính enzyme ngoại bào của các chủng vi sinh vật

phân lập

- Phương pháp xác định số lượng tế bào:

Số lượng vi khuẩn tổng số được xác định bằng phương pháp cấy trải trên đĩa thạch: 1 g mẫu được pha loãng từ 10-1 đến 10-7, hút 100µl dung dịch mẫu đã pha loãng ở nồng độ (10-4- 10-7) cấy trang trên đĩa môi trường LB, ủ ở 37oC, sau 48h, đếm khuẩn lạc trên các đĩa và xác định số CFU/g (i);

- Số lượng khuẩn lạc (cfu/g) của Bacillus được xác định theo phương pháp như mô tả ở (i) sau khi đã định danh đến loài chủng chọn lọc thuộc chi Bacillius

bằng kỹ thuật sinh học phân tử

- Phương pháp thử hoạt tính enzyme ngoại bào (protease, xenlulase,

amylase)

Phương pháp này được thực hiện theo cách nuôi cấy trên môi trường sinh enzyme và khuyếch tán dịch nuôi trên đĩa thạch chứa cơ chất tương ứng 0,2% cazein, 0,1% CMC hoặc 0,2% tinh bột tan) Lên men trên môi trường cơ bản LB, nuôi lắc 200 rpm ở 37oC trong 36-48 giờ, thu dịch lên men để xác định hoạt tính kháng khuẩn và khả năng thủy phân cơ chất bột, cellulose và casein

Hoạt tính enzyme được kiểm tra bằng phương pháp đục lỗ thạch trên nền môi trường LB có chứa cơ chất cho từng loại enzyme amylase, cellulase và protease lần lượt là tinh bột, CMC và casein Dịch nuôi vi khuẩn (100 µl) được cho vào giếng đúc trên đĩa thạch, ủ qua đêm ở 37oC, nhuộm màu bề mặt đĩa petri

và đo kích thước đường kính vòng thủy phân cơ chất (∆=D-d) (mm), trong đó D

là đường kích vòng thủy phân, d là đường kính giếng đúc trên đĩa thạch (6 mm),

∆ hoạt tính phân giải cơ chất thực

- Amylase: Môi trường xác định hoạt tính amylase là tinh bột tan, agar 2%,

ủ ở 37°C qua đêm Sau đó nhuộm màu bằng thuốc thử Iodide 1% và đo đường kính vòng thủy phân

- Cellulase: Môi trường xác định hoạt tính cellulase là CMC, agar 2%, ủ ở 37°C qua đêm Sau đó nhuộm màu bằng thuốc thử Lugol và đo đường kính vòng thủy phân

- Protease: Môi trường xác định hoạt tính protease là casein, agar 2%, ủ ở 37°C qua đêm Sau đó nhuộm màu bằng TCA 25% và đo đường kính vòng thủy phân

- Phương pháp xác định hoạt tính kháng các chủng vi khuẩn kiểm định

bằng phương pháp đục lỗ thạch:

Khả năng ức chế các vi khuẩn gây bệnh trên động vật thủy sản như E.coli,

S.aureus, V.harveyi, V.paraheamolyticus, Salmonella typhi của vi khuẩn tuyển

chọn được thực hiện theo phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch Các vi khuẩn gây bệnh được nuôi trong môi trường LB lỏng 24h /37oC Sau đó tiến hành hút và cấy trang vi khuẩn kiểm định trên môi trường LB chứa 3,5% NaCl Để khô tự nhiên và tiến hành khoan lỗ thạch, kích thước lỗ thạch (d=6mm)

Nhỏ 30 𝜇𝑙 dịch nổi nuôi vi khuẩn đã loại bỏ tế bào (sau ly tâm) vào mỗi giếng Sau khi nhỏ dịch để khô tự nhiên Để đĩa thạch vào tủ nuôi 37oC trong 24h Căn cứ vào việc xuất hiện vòng ức chế vi khuẩn gây bệnh để xác định khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh Hoạt tính được đánh giá bằng hiệu số D – d (mm) Trong đó: D là đường kính vòng kháng khuẩn (mm), d là đường kính lỗ thạch Đối chứng dương (PC) là giếng có bổ sung 30 𝜇𝑙 0,1g/L Streptomycin, đối chứng âm (NC)

là giếng có chứa 30 𝜇𝑙 NaCI 0,9%

Vi sinh vật kiểm định: Các chủng vi khuẩn kiểm định bao gồm E.coli, S.aureus,

V.harveyi, V.paraheamolyticus, Salmonella typhimurium với mật độ 107 CFU/ml của Phòng Các chất chức năng sinh học - Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Hình 3.3 Sơ đồ kiểm tra hoạt tính ức chế vi khuẩn gây bệnh của các chủng vi

sinh vật phân lập