Tạp chí khoa học công nghệ thủy sản , số 4, 2012

Vì vậy, nghiên cứu này đã đánh giá hoạt tính chống oxy hĩa của chitosan thủy phân bằng acid sulfuric ở các nồng độ và trong các khoảng thời gian khác nhau để làm cơ sở thiết lập quy trìn

Trang 1

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ❖3

THÔNG BÁO KHOA HỌC

HÀM LƯỢNG ĐỘC TỐ GÂY LIỆT CƠ PSP (Paralytic Shellﬁ sh Poisoning)

TRONG CÁC LỒI HAI MẢNH VỎ Ở NHA TRANG

PSP (Paralytic Shellﬁ sh Poisoning) CONTENTS IN BIVALVES IN NHA TRANG

Nguyễn Thuần Anh1

Ngày nhận bài: 14/01 /2012; Ngày phản biện thơng qua: 14/8/2012; Ngày duyệt đăng: 15/12/2012

TĨM TẮT

Mục đích của nghiên cứu này nhằm cung cấp những thơng tin cĩ giá trị cho việc đánh giá phơi nhiễm và đánh giá nguy cơ của người dân thành phố Nha Trang đối với độc tố gây liệt cơ PSP (paralytic shellﬁ sh poisoning) do tiêu thụ các lồi hai mảnh vỏ Hàm lượng độc tố gây liệt cơ PSP trong các lồi hai mảnh vỏ thu từ tháng 8 đến tháng 12 năm 2009 ở thành phố Nha Trang được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) Hàm lượng PSP trung bình trong mẫu

sị (Anadara granosa), nghêu (Meretrix meretrix) và hàu (Crassostrea belcheri) lần lượt là 0,022; 4,549 và 0,019 µg/100g, trong khi PSP khơng phát hiện thấy trong mẫu vẹm xanh (Perna viridis) và điệp (Comptopallium radula) Các giá trị này đều thấp hơn giới hạn tối đa cho phép được qui định bởi Việt nam và quốc tế

Từ khĩa: Độc tố gây liệt cơ, Nhuyễn thể, PSP

ABSTRACT

The aim of this study was to provide valuable information for exposure evaluation and risk assessment of Nha Trang population to paralytic shellfi sh poisoning (PSP) due to bivalves consumption The PSP (paralytic shellfi sh poisoning) contents in some bivalves sampled from August to December 2009 in Nha Trang city have determined by the High Performance Liquid Chromatography (HPLC) The mean PSP contents in cockle (Anadara granosa), clam (Meretrix meretrix), tropical oyster (Crassostrea belcher) are 0,022; 4,549 and 0,019 µg/100g, respectively, while PSP was not detected in green musel (Perna viridis) and scalop (Comptopallium radula) These results are lower than the maximum limit permitted fi xed by the Vietnamese and international regulations

Keywords: Paralytic Shellﬁ sh Poisoning, Shellﬁ sh, PSP

1 TS Nguyễn Thuần Anh: Khoa Cơng nghệ Thực phẩm - Trường Đại học Nha Trang

I ĐẶT VẤN ĐỀ

Nhuyễn thể hai mảnh vỏ cĩ khả năng tích lũy

PSP (Paralytic Shellﬁ sh Poisoning), một loại độc

tố tảo nguy hiểm và được coi là vấn đề của tồn

cầu (Martínez & Lawrence, 2003) với 2000 ca ngộ

độc được thống kê trên tồn thế giới mỗi năm (Van

Dolah, 2000; Chateau-Degat, 2003; Yan và cộng sự,

2003) và tỷ lệ tử vong từ 8 đến 10% (Sierra-Beltran

và cộng sự, 1998) Nhĩm độc tố PSP gồm khoảng

30 độc tố, trong đĩ độc nhất là saxitoxin (STX) Các

độc tố PSP được sinh ra chủ yếu trong giai đoạn nở

hoa của tảo Alexandrium spp Vì PSP cĩ tính tích

lũy nên chúng cĩ thể gây độc cho người ngay cả khi

khơng cĩ hiện tượng nở hoa của tảo (Van Egmond

và cộng sự, 2004) Dấu hiệu đầu tiên của sự nhiễm độc xuất hiện sau khoảng 5 đến 30 phút sau khi ăn nhuyễn thể bị nhiễm với các triệu chứng: cảm giác kim châm hoặc tê nhẹ đến liệt cơ hơ hấp hồn tồn Trường hợp nặng sẽ dẫn đến tử vong do liệt cơ hơ hấp, xảy ra trong vịng từ 2 đến 12 giờ sau khi ăn các lồi hai mảnh vỏ cĩ hàm lượng PSP cao Nhĩm nhuyễn thể cĩ chứa PSP gồm chủ yếu là động vật thân mềm hai mảnh vỏ, nhĩm này gồm vẹm,nghêu, hàu, điệp và sị (Dao, 2004; Van Egmond và cộng sự, 2004; Dao, 2003; Do và cộng sự, 2002;Dao, 2001)

Nghiên cứu này được thực hiện nhằm mục tiêu xác định hàm lượng PSP trong các lồi hai mảnh

Trang 2

vỏ ở thành phố Nha Trang - một thành phố đại diện

cho khu vực ven biển có mức tiêu thụ nhuyễn thể

cao (Nguyễn và cộng sự, 2009) - để cung cấp các

thông tin có giá trị cho việc đánh giá nguy cơ của

người tiêu dùng đối với PSP do tiêu thụ nhuyễn thể

hai mảnh vỏ

II ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

1 Đối tượng và địa điểm thu mẫu

Năm loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ (vẹm xanh

(Perna viridis), điệp (Comptopallium radula), hàu

(Crassostrea belcheri), sò (Anadara granosa) và

nghêu (Meretrix meretrix)) được thu ở các địa

điểm mua bán nhuyễn thể phổ biến: Nhà hàng

Biển Ngọc, chợ Tạm và chợ Xóm mới của thành

phố Nha Trang (tổng số là 25 mẫu) từ tháng 8 đến

tháng 12 năm 2009 (đại diện cho các tháng trong

hai mùa mưa và mùa khô) Việc lấy mẫu được

thực hiện theo phương pháp xác suất và tuân thủ

nguyên tắc lấy mẫu ở nơi mua bán theo qui định

2002/63/EC và 333/2007/EC (WHO, 1985; EC,

2002; EC, 2007)

Mẫu đồng nhất (600g) để xác định PSP được

tập hợp từ 6 mẫu thành phần (100g) bao gồm các

phần ăn được (gồm cả nội tạng) (EFSA, 2009b) của

một loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ ở cùng một tháng

(một thời điểm) từ 6 nơi bán và được đồng hóa

Sáu mẫu thành phần ở 6 nơi bán có nguồn gốc và được phân bố như sau: 1, 2 và 3 mẫu thành phần được lần lượt lấy ở Nhà hàng Biển Ngọc, chợ Tạm

và chợ Xóm mới của thành phố Nha Trang (Nguyễn

và cộng sự, 2009)

2 Phương pháp xử lý mẫu

Trước khi phân tích, các mẫu được chiết theo phương pháp AOAC (1990): 100g mẫu đã đồng hóa được trộn với 100ml HCl 0,1N trong một ống đựng mẫu; kiểm soát và điều chỉnh pH nếu thấy cần thiết (pH<4); đậy ống chứa mẫu bằng một nút có gắn nhiệt kế, đặt ống mẫu vào trong nồi chứa nước sôi, khi nhiệt độ mẫu đạt 950C thì duy trì ở nhiệt độ này trong 5 phút; làm nguội và điều chỉnh pH xuống 3 - 4 (pH ổn định tối ưu cho PSP); sau đó ly tâm lấy dịch

ở trên đi xác định PSP

3 Phương pháp phân tích

Hàm lượng PSP được xác định bằng phương pháp HPLC của Oshima (1995) Hệ thống HPLC (Shimadzu LC 20 A) với đầu dò huỳnh quang(RF - 10AXL), 1 bơm LC-20AD cho pha động và hai bơm LC-20AD để phân phối dung dịch phản ứng sau cột (Walkosil 250 mm x 4.6 mm)

4 Đảm bảo chất lượng

Giới hạn phát hiện (LOD: Limit of Detection) và giới hạn định lượng (LOQ: Limit of Quantiﬁ cation) cho mỗi độc tố riêng biệt được trình bày ở bảng 1:

Bảng 1 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) cho mỗi độc tố

Các mẫu trắng và phân tích đôi được thực hiện để kiểm soát chất lượng của quá trình phân tích Độ chính xác được khảo sát bằng cách xác định hiệu suất thu hồi (Thompson và cộng sự, 2002)

Các chất chuẩn được sử dụng là NeoSTX dcSTX, STX, GTX1,4 và GTX2,3, GTX5 và GTX6 (hình 1)

Trang 3

Năm mẫu hàu khơng nhiễm độc tố được làm

nhiễm bằng cách thêm các độc tố chuẩn Sau đĩ

định lượng và tính hiệu suất thu hồi Độ lệch chuẩn

tương đối (RSD-Relative Standard Deviation)

Hình 1 Sắc ký đồ của phương pháp HPLC với các chất chuẩn STXs và GTXs

Bảng 2 Hiệu suất thu hồi trung bình và độ lệch chuẩn tương đối của mỗi độc tố

(với chất nền là hàu)

Trang 4

5 Tính kết quả

Hàm lượng từng độc tố PSP ((mM/l) trong dịch

chiết được tính toán bằng công thức như sau:

Cti : Hàm lượng từng độc tố PSP trong dịch chiết

(mM/l)

ToxSt : Lượng độc tố tiêu chuẩn đã tiêm vào (mM)

HpSt : Chiều cao của peak độc tố chuẩn trên sắc

ký đồ

HpE : Chiều cao của peak độc tố trong mẫu

Độc tính của các độc tố thành phần trong mẫu

được tính toán sau đó tất cả các giá trị này được

cộng lại để có độc tính PSP tổng số trong dịch chiết

(Tox) theo công thức sau:

Tox(µg/100g)= ∑Cti.PMi.0,2

PMi : khối lượng phân tử của các độc tố thành phần

0,2 : hệ số pha loãng

III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

Kết quả định lượng trên các mẫu cho thấy

không phát hiện PSP trên các mẫu vẹm xanh,

điệp PSP chỉ xác định được ở 3 mẫu: sò, hàu và

nghêu được lấy vào thời điểm tháng 11/2009 trong

số 25 mẫu phân tích (88% mẫu không phát hiện

thấy PSP) Tuy nhiên, hàm lượng PSP xác định được rất thấp, cụ thể là: 0,109µg GTX1/100g trong

sò, 0,096µg GTX2/100g trong hàu; và 11,783µg GTX1/100g và 10,963µg GTX4/100g trong nghêu vào tháng 11/2009

Theo ANZFA (2001), hàm lượng PSP thường thấp hơn giới hạn phát hiện hoặc phát hiện được nhưng với hàm lượng rất thấp, ngoại trừ trường hợp có sự nở hoa của tảo Kết quả thống kê các

số liệu về hàm lượng các độc tố thuộc nhóm STX trong nhuyễn thể từ năm 2000 đến năm 2008 được các nước Châu Âu cung cấp đã cho thấy

tỷ lệ các kết quả không phát hiện được (<DL) thay đổi theo quốc gia và theo năm Cụ thể, tỷ

lệ các kết quả không phát hiện được là 45,7%

ở Na-Uy, 54,8% ở Tây Ban Nha, 63% ở Bồ Đào Nha, 84% ở Đức, 89,8% ở Pháp, 96% ở Anh và 99,5% ở Ý (EFSA, 2009) Trong nghiên cứu này,

tỷ lệ các kết quả không phát hiện được là 88%,

vì vậy theo hướng dẫn của GEMS/Food-EURO (1995) thì các kết quả không định lượng được coi là bằng không hoặc bằng giới hạn phát hiện Sau khi chọn gán giá trị 0 cho các kết quả không định lượng được, thì hàm lượng PSP trung bình (mg/100g) trong các loài hai mảnh vỏ (vẹm, sò, điệp, sò và hàu) được tính toán và trình bày ở bảng 3:

Bảng 3 Hàm lượng PSP trung bình (mg/100g) trong các loài hai mảnh vỏ

(giá trị 0 được gán cho các kết quả không định lượng được)

Tháng 8T háng 9 Tháng 10

Nhìn chung, khả năng tích luỹ các độc tố phụ

thuộc vào các đặc tính sinh học và cơ chế chuyển

hoá của mỗi loài và mỗi cá thể trong loài Mặt

khác, nhiều yếu tố môi trường có thể tác động đến

sự biến đổi nồng độ PSP trong loài nghiên cứu

(Bricilj & Shumway, 1997) Trong khi đó tốc độ thải

loại độc tố lại phụ thuộc vào bộ phận tích lũy độc tố

của nhuyễn thể hai mảnh vỏ Ví dụ, các độc tố tích

lũy trong tuyến tiêu hóa bị thải loại nhanh hơn các

độc tố tích lũy trong cơ (Bricilj & Shumway, 1997)

Mẫu phân tích trong nghiên cứu này bao gồm cả

phần cơ lẫn nội tạng theo hướng dẫn của EFSA,

(2009b), đồng thời theo thói quen ăn cả nội tạng

động vật hai mảnh vỏ của đa số người tiêu dùng

(Nguyễn và cộng sự, 2009) nên kết quả hàm lượng

độc tố trong mẫu nghiên cứu thể hiện lượng độc tố

có nguy cơ đưa vào cơ thể và giá trị này không cần phải xử lý khi tính toán phơi nhiễm

Nghêu là loài hai mảnh vỏ ăn lọc và sống ở đáy biển vì vậy nguồn dinh dưỡng không chỉ là vi tảo (bao gồm cả vi tảo độc) mà còn bao gồm cả các chất hữu cơ của quá trình xáo trộn lớp trầm tích

ở đáy biển (Defossez & Hawkins, 1997) Mặt khác, nghêu là loài hai mảnh vỏ có khả năng tích lũy độc

tố của vi tảo khá lâu (Shumway & Cembella, 1993) Hai lý do này có thể giải thích sự tồn tại một hàm lượng PSP trong nghêu ở nghiên cứu

Vẹm xanh Perna viridis sống ở tầng nước giữa

và dinh dưỡng chủ yếu của chúng là vi tảo (bao gồm

cả vi tảo độc) Thực tế, vẹm xanh là loài hai mảnh

Trang 5

vỏ nhạy cảm nhất với việc tích lũy độc tố vi tảo

Chúng tích lũy nhanh nhưng thải loại cũng nhanh

(Shumway và cộng sự, 1990; 1995) Chúng thường

được sử dụng như sinh vật chỉ thị cho hiện tượng

nở hoa của tảo độc Trong nghiên cứu này, PSP

khơng phát hiện được trong vẹm, vì vậy cĩ thể giả

thiết rằng trong thời gian lấy mẫu nghiên cứu khơng

cĩ PSP xuất hiện trong mơi trường, hoặc cĩ khả

năng vẹm đã tích lũy PSP ở các đợt tảo nở hoa

nhưng PSP tồn tại trong vẹm một thời gian ngắn và

chúng bị thải loại rất nhanh (Shumway và cộng sự,

1990; 1995) nên đã khơng phát hiện thấy PSP trong mẫu vẹm vào thời điểm nghiên cứu Ngược lại hàu khơng tích lũy các độc tố dễ như vẹm nhưng chúng thải loại độc tố chậm vì thế chúng giữ độc tố khá lâu

(3 năm) (Shumway và cộng sự, 1990; 1995) nên

trong nghiên cứu này đã phát hiện thấy PSP trong các mẫu hàu

Kết quả so sánh hàm lượng PSP được xác định trong nghiên cứu này với các nghiên cứu khác được thực hiện ở Việt nam và Châu Á được trình bày ở bảng 4

Bảng 4 Hàm lượng PSP trong các lồi hai mảnh vỏ (mg/100g) của nghiên cứu này

và các nghiên cứu khác ở Việt Nam và Châu Á

(giá trị 0 được gán cho các kết quả khơng định lượng được)

Trang 6

Việc so sánh kết quả của nghiên cứu này với

các nghiên cứu khác ở Việt Nam và Châu Á (bảng

4) gặp khó khăn do sự khác biệt trong phương pháp

phân tích bởi mỗi phương pháp có độ nhạy và độ

chính xác khác nhau cũng như mục đích và phương

pháp lấy mẫu khác nhau Tuy nhiên có thể nhận thấy

ngoài các kết quả không phát hiện được PSP thì hàm

lượng PSP xác định được trong nghiên cứu này và

các nghiên cứu khác ở Việt Nam và các nước Châu

Á đều thấp hơn giới hạn tối đa được phép có của

PSP trong các loài hai mảnh vỏ (80 μg STX eq/100g)

theo quy định của Việt Nam và của các nước Châu

Âu, Canada, Mỹ, Argenina, Chilé, Guatemala,

Venezuela, Trung Quốc, Nhật, Singapor, Hàn Quốc,

Úc, New Zealand (Van Egmond và cộng sự, 2004)

IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Hàm lượng PSP trong các loài hai mảnh vỏ ở thành phố Nha Trang thấp và dưới giới hạn tối đa theo qui định (80 μg STX eq/100g) Đây là các dữ liệu có giá trị cho việc đánh giá phơi nhiễm và đánh giá nguy cơ của người dân thành phố Nha Trang đối với PSP do ăn các loài hai mảnh vỏ Tuy nhiên, cần

có các nghiên cứu thường niên để xem xét đến ảnh hưởng của các thời gian khác nhau đến hàm lượng PSP trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Anderson DM, 1996 Bloom dynamics of toxic Alexandrium species in the northeastern U.S., Limnology and Oceanography,

5 Bricelj VM, Shumway SE, 1997 An overview of the occurence and transfer kinetics of paralytic shellﬁ sh toxins in bivalve molluscs In The VIII International Conference Proceeding on harmful algae Vigo, VIII, 431-436

6 Chateau-Degat ML, 2003 Les toxines marines problèmes de santé en émergence Vertigo- La revue en sciences de

l’invironnement, 4, 1, 11p.

7 Dao VH, 2004 Hàm lượng một số độc tố vi tảo trong nghêu và vẹm xanh tại một số khu vực nuôi trọng điểm miền trung Việt nam Trong: Đề tài cấp nhà nước KC-09-19: Điều tra nghiên cứu tảo độc, tảo gây hại ở một số vùng nuôi trồng thủy sản tập trung ven biển, đề xuất giải pháp phòng ngừa, giảm thiểu những tác hại do chúng gây ra

8 Dao VH, 2003 The contamination of Paralytic shellﬁ sh poisoning in Meretrix meretrix in Can gio Proceedings of the

third national workshop on marine molluscs 11-12 September 2003, Nha Trang, Vietnam, Agronomic Publishing House

p 250-254

9 Dao VH, 2001 The contamination of Paralytic shellﬁ sh poisoning in some bivalve species from Vietnamese coastal water The 5th IOC/WESTPAC conference, 2001

10 Defossez JM & Hawkins AJS, 1997 Selective feeding in shellﬁ sh: Size-dependednt rejection of large particles within

pseudofaeces from Mytilus edulis, Ruditapes philippinarum and Tapes decussatus Journal of Marine Biology, 129, 1, 139-149.

11 Do TN, Cao PD, Luu TH, Dao VH, Phan XK, 2002 Following the variation of PSP and DSP toxins in some bivalves species collected in the coastal of Vinh Truong, Nha Trang In Collection of Marine research Works Science and Technique Publish-ing House, 12 p.273 - 280

12 EC (European Community), 2002 Commission Directive 2002/63/EC of 11 July 2002 establishing Community methods of sampling for the ofﬁ cial control of pesticide residues in and on products of plant and animal origin and repealing Directive

79/700/EEC Ofﬁ cial Journal of the European Union, 16 July 2002, p.30-43.

13 EC (European Community), 2007 Commission Regulation (EC-European Community)No 333/2007/EC of 28 March 2007 laying down the methods of sampling and analysis for the ofﬁ cial control of the levels of lead, cadmium, mercury, inorganic

tin, 3-MCPD and benzo(a)pyrene in foodstuffs Ofﬁ cial Journal of the European Union, 29 March 2007, p.29-38.

Trang 7

14 EFSA (European Food Safety Authority), 2009 Scientiﬁ c Opinion of the Panel on Contaminants in the Food Chain

on a request from the European Commission on Marine Biotoxins in Shellﬁ sh - Saxitoxin Group (Question NoEFSA-Q-2006-065E) The European Food Safety Authority Journal, 1019, 76p

15 EFSA (European Food Safety Authority), 2009b Scientiﬁ c Opinion of the Panel on Contaminants in the Food Chain on a request from the European Commission on Marine Biotoxins in Shellﬁ sh - Saxitoxin Group (Question No

EFSA-Q-2006-065E) The European Food Safety Authority Journal, 2009b, 1019, 76p.

16 GEMS/Food-EURO (Global Environmental Monitoring System/Food Europe), 1995 Second Workshop on Reliable

Evaluation of Low-Level Contamination of Food Report on a Workshop in the Frame of GEMS/Food-EURO; document EUR/ICP/EHAZ.94.12/WS04, Kulmbach, Federal Republic of Germany, 26 - 27 May 1995, 8p http://www.who.int/food-safety/publications/chem/en/lowlevel_may1995.pdf

17 Jen HC, Yen JY, 2008 Identiﬁ cation of species and paralytic shellﬁ sh poisons in an unknown scallop meat implicated in food

poisoning in Taiwan The Rafﬂ es Bulletin of Zoology, 19, p 115-122

18 Martínez AG, Lawrence JF, 2003 Shellﬁ sh Toxins Food Safety: Contaminants and Toxins In: JPF D’Mello (ed), Scottish Agricultural College, Edinburgh, UK, p 47-63

19 Nguyen TA, Tran TL, Carpentier F-G, Roudot A-C, Parent Massin D, 2009 Survey of shellﬁ sh consumption in south coastal Vietnam (Nha Trang) Proceedings of the 7th International conference on Molluscan Shellﬁ sh Safety, Nante, France, 14th-19th

24 Sierra-Beltrána AP, Cruza A, Núđeza E, Del Villarb LM, Cerecerob J, Ochoa JL, 1998 An overview of the marine food

poisoning in Mexico Toxicon, 36, 11, p.1493-1502.

25 Sunarya, Achmad KS, 1998 Analysis of paralytic shellfi sh poison (PSP) using mouse bio-assay to support the sian shellfi sh sanitation program In: James, D.G (ed.) Fish utilization in Asia and the Pacifi c Proceedings of the APFIC Symposium, Beijing, People’s Republic of China, 24-26 September 1998, p 272-281 Disponible sur: http://www.apfi c.org/Archive/symposia/1998/32.pdf

Indone-26 Thompson M, Eliison SLR, Wood R, 2002 Harmonized guidelines for single-laboratory validation of methods of analysis

Pure and Applied Chemistry, 74, 5, p 835–855.

27 Van Dolah FM, 2000 Marine algal toxins: origins, health effects, and their increased occurrence Environmental Health

Perspectives, 108, 1, p.133-141

28 Van Egmond HP, Van Apeldoorn ME, Speijers GJA, 2004 Paralytic shellﬁ sh poisoning (PSP), p 5-52 In: Van Egmond HP, Van Apeldoorn ME and Speijers GJA (Eds.) Marine biotoxins FAO Food and Nutrition Paper 80 Food and Agriculture Organization of the United Nations, Rome, 2004

29 WHO (World Health Organization) Guidelines for the study of dietary intakes of chemical contaminants Geneva, WHO, Offset publication n° 87, 1985, 102p

30 Wu JY, Zheng L, Wang JH, 2005 Contamination of shellfi sh from Shanghai seafood markets with paralytic shellfi sh poisoning and diarrhetic shellfi sh poisoning toxins determined by mouse bioassay and HPLC Food Additives & Contaminants, 22, 7, p 647 - 65

31 Yan T, Zhou M, Tan Z, Li J, Yu R, Wang Y, 2003 A survey for paralytic shellﬁ sh poisoning (PSP) in Vancouver Harbour Marine Environmental Research, 57, p.137-143

Trang 8

HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA CỦA CHITOSAN THỦY PHÂN

BẰNG ACID SULFURIC

ANTIOXIDATIVE ACTIVITY OF CHITOSAN HYDROLYSATE PREPARED

BY USING SULFURIC ACID

Huỳnh Nguyễn Duy Bảo1, Phan Đình Thụy2

Ngày nhận bài: 12/9/2012; Ngày phản biện thơng qua: 22/11/2012; Ngày duyệt đăng: 15/12/2012

TĨM TẮT

Hoạt tính chống oxy hĩa của chitosan thủy phân bằng acid sulfuric được đánh giá thơng qua khả năng khử gốc tự

do DPPH và tổng năng lực khử Kết quả nghiên cứu cho thấy nồng độ acid sulfuric và thời gian thủy phân cĩ ảnh hưởng đáng kể đến hoạt tính chống oxy hĩa, độ deacetyl và hiệu suất thu hồi chitosan thủy phân Chitosan thủy phân bằng acid sulfuric 250 mM trong 24 giờ ở 30 ± 2 o C cĩ độ deacetyl là 89,1 ± 0,3%, hiệu suất thu hồi là 67 ± 3% và hoạt tính chống oxy hĩa cao nhất.

Từ khĩa: Chitosan, Chống oxy hĩa, Độ deacetyl, Thủy phân

ABSTRACT

The antioxidative activity of chitosan hydrolyzed by sulfuric acid was evaluated by the DPPH radical scavenging activity and total reducing capacity The results showed that sulfuric acid concentration and hydrolysis time signiﬁ cantly affected the antioxidant activity, degree of deacetylation and recovery of chitosan hydrolysate Chitosan hydrolyzed by using 250 mM sulfuric acid for 24 hours at 30 ± 2°C had the highest antioxidative activity The degree of deacetylation and recovery of chitosan hydrolysate prepared under this condition were 89.1 ± 0.3% and 67 ± 3%, respectively.

Keywords: Chitosan, Antioxidant, Degree of deacetylation, Hydrolysis

1 TS Huỳnh Nguyễn Duy Bảo: Khoa Cơng nghệ Thực phẩm - Trường Đại học Nha Trang

2 Phan Đình Thụy: Sinh viên Khĩa 49 Ngành Cơng nghệ Chế biến Thủy sản - Trường Đại học Nha Trang

Chitosan là sản phẩm deacetyl hĩa chitin, một

polymer hữu cơ phổ biến trong thiên nhiên được tạo

ra trung bình 20 g trong 1 năm/1 m2 bề mặt trái đất

Chitosan và dẫn xuất của chúng cĩ rất nhiều ứng

dụng trong các lĩnh vực khác nhau như nơng nghiệp,

cơng nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm, y dược, Nhờ

cĩ hoạt tính chống oxy hĩa, kháng khuẩn và khả

năng tạo màng nên chitosan được ứng dụng để bảo

quản trái cây, rau quả, thịt, cá, trứng, sữa và một số

sản phẩm thực phẩm khác (Jeon và cộng sự, 2002)

Nhiều nghiên cứu cho thấy chitosan cĩ khả năng

ức chế một số lồi vi sinh vật như Staphylococcus

aureus, Bacillus cereus, Escherichia coli, Proteus

vulgaris, Alternaria sp., Penicillium sp và Cladosporium sp.

(Balicka-Ramisz và cộng sự, 2005) Thời hạn bảo quản của một số loại trái cây, rau quả như lê, đào, kiwi, vải, dưa chuột, bí, ớt chuơng, dâu tây, cà chua,… tăng lên khi chúng được phủ lớp màng chitosan bên ngồi Trong trường hợp này, màng chitosan khơng chỉ cĩ tác dụng ức chế sự phát triển của vi sinh vật mà nĩ cịn cĩ tác dụng làm chậm quá trình chín, kiểm sốt sự chuyển ẩm, hạn chế tiếp xúc với oxy và ngăn ngừa phản ứng nâu hĩa Chất lượng cá hồi phi lê đơng lạnh và thịt bị được cải thiện đáng kể khi được bọc bởi màng baochitosan Nghiên cứu của Darmadji và Izumimoto (1994) cho thấy chitosan cĩ thể ngăn chặn quá trình oxy hĩa ở thịt bị trong quá trình bảo quản lạnh Tác dụng chống oxy hĩa của chitosan cũng đã được thử

Trang 9

nghiệm trên cá trích (Clupea harengus) nấu chín,

đối chứng sử dụng butylated hydroxyanisol (BHA)

và butylated hydroxytoluene (BHT) (Kamil và cộng

sự, 2002) Kết quả nghiên cứu của Jeon và cộng sự

(2002) cho thấy cả ba mẫu chitosan cĩ độ deacetyl

(DA) và khối lượng phân tử (Mw) khác nhau

(DA = 86,4%, Mw = 1,8 × 103 kDa; DA = 89,3%,

Mw = 9,6 × 102 kDa; DA = 91,3%, Mw = 6,6 × 102 kDa)

đều cĩ hiệu quả ngăn chặn quá trình oxy hĩa lipid

trên cá tuyết Đại Tây Dương (Gadus morhua) và cá

Kim và Thomas (2007) đã nghiên cứu kéo dài thời

hạn bảo quản của cá hồi bằng cách xử lý với

chi-tosan cĩ khối lượng phân tử 30, 90 và 120 kDa ở

các nồng độ thay đổi từ 0,2 - 1% Nhiều nghiên cứu

cho thấy khối lượng phân tử và độ deacetyl cĩ ảnh

hưởng đáng kể đến hoạt tính chống oxy hĩa của

chitosan, chitosan cĩ khối lượng phân tử thấp và độ

deacetyl càng cao thì hoạt tính chống oxy hĩa càng

tăng (Xia và cộng sự, 2011)

Việt Nam là nước xuất khẩu tơm nên cĩ tiềm

năng lớn về sản xuất và ứng dụng chitosan từ phế

liệu chế biến tơm Nhiều nghiên cứu sản xuất thành

cơng chitin, chitosan từ phế liệu chế biến tơm ở Việt

Nam và ứng dụng của chitosan sản xuất được vào

bảo quản hạt giống, xử lý nước thải, bảo quản quản

một số loại thực phẩm như thịt bị, mực, sữa, trứng

gà, cà chua, (Trung và cộng sự, 2011) Tuy nhiên,

những nghiên cứu về hoạt tính chống oxy hĩa của

chitosan cịn rất hạn chế Vì vậy, nghiên cứu này đã

đánh giá hoạt tính chống oxy hĩa của chitosan thủy

phân bằng acid sulfuric ở các nồng độ và trong các

khoảng thời gian khác nhau để làm cơ sở thiết lập

quy trình sản xuất chitosan cĩ hoạt tính chống oxy

hĩa nhằm nâng cao giá trị sử dụng của chitosan

II ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

1 Nguyên vật liệu và hĩa chất

Chitosan sử dụng trong nghiên cứu này được

chiết tách từ vỏ tơm thẻ chân trắng cĩ các chỉ tiêu

chất lượng như sau:

là 99%; 96,5% và 99,9%, tất cả đều được sản xuất bởi cơng ty Hĩa chất Guanghua, Trung Quốc

2 Thủy phân chitosan bằng H 2 SO 4

Hịa tan 2g chitosan trong 100 ml dung dịch acid acetic 1% tạo thành dung dịch keo chitosan 2% Mỗi mẫu thí nghiệm sử dụng 100 ml dung dịch keo

cĩ nồng độ lần lượt là 100mM, 300 mM và 500mM Các mẫu hỗn hợp sau khi phối trộn được khuấy

thời gian từ 12 - 72 giờ Hỗn hợp sau khi thủy phân được trung hịa bằng dung dịch NaOH cĩ nồng độ tương ứng là 100 mM, 300 mM và 500 mM Kết tủa chitosan tạo thành được tách ra khỏi hỗn hợp, rửa đến pH trung tính, sấy khơ rồi đưa đi phân tích hoạt tính chống oxy hĩa, độ deacetyl và hiệu suất thu hồi chitosan thủy phân

- Độ deacetyl của chitosan được xác định theo phương pháp của Alonso và cộng sự (1993)

- Khả năng khử gốc tự do DPPH của chitosan được xác định theo phương pháp của Fu và cộng

vẽ đồ thị Sự khác biệt cĩ ý nghĩa về mặt thống kê

(p < 0,05) của các giá trị trung bình được phân tích

trên phần mềm thống kê R phiên bản 2.13.1

1 Hiệu suất thu hồi chitosan thủy phân

Hiệu suất thu hồi chitosan thủy phân bằng acid sulfuric ở các nồng độ khác nhau theo thời gian được trình bày trên đồ thị hình 1

Trang 10

Hình 2 Ảnh hưởng của nồng độ acid sulfuric và thời gian thủy phân đến độ deacetyl của chitosan thủy phân

Zamani và Taherzadeh (2010) đã chứng minh rằng quá trình deacetyl xảy ra đồng thời với quá trình thủy phân cắt mạch polymer của chitosan khi

xử lý bằng acid sulfuric loãng Kết quả nghiên cứu

ở đồ thị hình 2 cho thấy độ deacetyl của chitosan tăng lên đáng kể sau 24 giờ thủy phân ở các nồng

độ acid sulfuric khác nhau Mức độ deacetyl của chitosan trong quá trình thủy phân phụ thuộc rất nhiều vào nồng độ acid sulfuric Độ deacetyl của chitosan sau 24 giờ thủy phân bằng 50µM, 150µM và 250µM acid sulfuric đạt lần lượt là 85,3 ± 0,6%; 87,4 ± 0,4% và 89,1 ± 0,3% Khi kéo dài thời gian thủy phân đến 48 giờ độ deacetyl của

chitosan ở các mẫu đều không tăng thêm (p > 0,05).

3 Hoạt tính chống oxy hóa của chitosan thủy phân

Hoạt tính chống oxy hóa của chitosan được đánh giá dựa vào khả năng khử gốc tự do DPPH và tổng năng lực khử Khả năng khử gốc tự do DPPH

và tổng năng lực khử của chitosan thủy phân bằng acid sulfuric ở các nồng độ khác nhau theo thời gian được trình bày trên đồ thị hình 3

Hình 1 Ảnh hưởng của nồng độ acid sulfuric và thời gian

thủy phân đến hiệu suất thu hồi chitosan thủy phân

Kết quả nghiên cứu ở đồ thị hình 1 cho thấy

hiệu suất thu hồi chitosan giảm dần theo thời gian

thủy phân Khi tăng nồng độ acid sulfuric dùng để

thủy phân đã làm giảm đáng kể hiệu suất thu hồi

chitosan Hiệu suất thu hồi chitosan sau 12 giờ thủy

phân bằng acid sulfuric 250 mM chỉ còn 69 ± 4%,

trong khi đó hiệu suất thu hồi ở các mẫu thủy phân

bằng 150 mM và 50 mM lần lượt là 81 ± 2% và

89 ± 2% Nguyên nhân là do trong môi trường acid

sulfuric loãng, chitosan bị thủy phân cắt mạch

polymer tạo ra các sản phẩm khác nhau bao gồm

chitosan có khối lượng phân tử thấp, oligochitosan

hoặc glucosamin (Zamani và Taherzadeh, 2010) Tỷ

lệ giữa các thành phần này phụ thuộc vào nồng độ

acid và thời gian thủy phân Khi tăng nồng độ acid

và kéo dài thời gian thủy phân, lượng oligochitosan

và glucosamin tạo ra càng nhiều nên bị thất thoát

trong quá trình kết tủa và rửa càng lớn, dẫn đến

hiệu suất thu hồi chitosan thủy phân giảm

2 Độ deacetyl của chitosan thủy phân

Độ deacetyl của chitosan thủy phân bằng acid

sulfuric ở các nồng độ khác nhau theo thời gian

được trình bày trên đồ thị hình 2

Hình 3 Ảnh hưởng của nồng độ acid sulfuric và thời gian thủy phân đến khả năng khử gốc tự do DPPH (a) và tổng năng lực khử (b) của chitosan thủy phân

Trang 11

Kết quả nghiên cứu cho thấy khả năng khử

gốc tự do DPPH (hình 3a) và tổng năng lực khử

(hình 3b) của chitosan thủy phân bằng acid sulfuric

tăng dần theo thời gian thủy phân và nồng độ acid

sulfuric Khả năng khử gốc tự do DPPH và tổng

năng lực khử của chitosan đạt cực đại sau 24 giờ

thủy phân ở các nồng độ acid sulfuric khác nhau

Xie và cộng sự (2001) chứng minh rằng khả năng

khử gốc tự do DPPH và tổng năng lực khử của

chitosan phụ thuộc vào nhĩm amino (-NH2) trong

phân tử chitosan, số lượng nhĩm amino trong phân

tử chitosan càng nhiều thì khả năng khử gốc tự do

DPPH và tổng năng lực khử của chitosan càng lớn

Kết quả nghiên cứu này cũng cho thấy khả năng

khử gốc tự do DPPH và tổng năng lực khử của

chitosan thủy phân phụ thuộc vào độ deacetyl Độ

deacetyl của chitosan càng cao thì khả năng khử

gốc tự do DPPH và tổng năng lực khử càng lớn

Từ kết quả nghiên cứu trên đề xuất quy trình

sản xuất chitosan thủy phân cĩ hoạt tính chống oxy

hĩa như sơ đồ hình 4

Hình 4 Sơ đồ quy trình sản xuất chitosan thủy phân cĩ hoạt

tính chống oxy hĩa

Thuyết minh quy trình:

Hịa tan chitosan trong dung dịch acid acetic 1% tạo thành dung dịch keo chitosan 2% Sau

500 mM/dung dịch chitosan 2% là 1/1 Hỗn hợp sau khi phối trộn được khuấy đều rồi đưa đi

Hỗn hợp sau khi thủy phân được điều chỉnh về

pH = 8 bằng dung dịch NaOH 500 mM Kết tủachitosan tạo thành được lọc tách ra khỏi hỗn hợp, rửa đến pH trung tính, sấy khơ thu được chitosan thủy phân cĩ hoạt tính chống chống oxy hĩa (hình 5)

Chitosan

Chuẩn bị dung dịch chitosan 2%

trong acid acetic 1%

trong 24 giờ ở 30 ± 2oC

Kết tủa bằng NaOH 500 mM

ở pH = 8Lọc tách kết tủaRửa kết tủa đến pH trung tính

- Thời gian thủy phân: 24 giờ;

- Nhiệt độ thủy phân: 30 ± 2oC

Trang 12

4 Darmadji, P., Izumimoto, M., 1994 Effect of chitosan in meat preservation Meat Science, 38(2), 243-254

5 Fu, H., Shieh, D., Ho, C., 2002 Antioxidant and free radical scavenging activities of edible mushrooms Journal of Food lipids, 9, 35-46

6 Jeon, Y I., Kamil, J Y V A., Shahidi, F., 2002 Chitosan as an edible invisible ﬁlm for quality preservation of herring and Atlantic cod Journal of Agricultural and Food Chemistry, 20, 5167-5178

7 Kamil, Y V V A., Jeon, Y J., Shahidi, F., 2002 Antioxidative activity of chitosans of diﬀerent viscosity in cooked

comminuted ﬂesh of herring (Clupea harengus) Food Chemistry, 79, 69-77.

8 Kim, K W., Thomas, R L., 2007 Antioxidative activity of chitosans with varying molecular weights Food Chemistry, 101, 308-313

9 Oyaizu, M., 1986 Studies on products of browning reactions: antioxidative activities of products of browning reaction prepared from glucosamine Japanese Journal of Nutrition, 44, 307-315

10 Xia, W., Liu, P., Zhang, J., Chen, J., 2011 Biological activities of chitosan and chitooligosaccharides Food Hydrocolloids,

Trang 13

SINH TRƯỞNG VÀ SẢN SINH BACTERIOCIN CỦA VI KHUẨN LACTIC T13 TRÊN MƠI TRƯỜNG NUƠI CẤY VÀ TRÊN CÁ GIỊ NGUYÊN LIỆU TƯƠI

THE GROWTH AND BACTERIOCIN PRODUCTION OF LACTIC ACID BACTERIA

STRAIN T13 ON CULTURE MEDIUM AND FRESH COBIA MEAT

Nguyễn Văn Duy1, Lưu Thị Thúy2

Ngày nhận bài: 22/02/2012; Ng ày phản biện thơng qua: 18/9/2012; Ngày duyệt đăng: 15/12/2012

TĨM TẮT

Bacteriocin với bản chất peptide hay protein cĩ hoạt tính ức chế mạnh sinh trưởng của nhiều nhĩm vi sinh vật đang được xem là chất bảo quản sinh học an tồn trong cơng nghệ thực phẩm Mục tiêu của nghiên cứu này là nhằm xác định khả năng sinh trưởng và sinh bacteriocin của chủng vi khuẩn lactic T13 trên mơi trường nuơi cấy và trên da cá giị nguyên liệu tươi Kết quả nghiên cứu cho thấy hoạt tính sinh bacteriocin của chủng này đạt cực đại ở cuối pha sinh trưởng logarit, sau 12 giờ nuơi cấy Cùng với việc tiết ra các acid hữu cơ thì khả năng sản sinh bacteriocin đã tăng cường hoạt tính kháng khuẩn của chủng này Hơn nữa, nghiên cứu này cũng xác định được các điều kiện nuơi cấy thích hợp cho sinh trưởng của chủng T13, trong đĩ nguồn cacbon là glucose, nguồn nitơ là pepton, pH 6,4, nhiệt độ 31 0 C Cuối cùng, chủng T13 đã thể hiện khả năng sinh trưởng và sinh bacteriocin tốt trên mơi trường da cá giị trong một tuần thí nghiệm Kết quả này mở ra tiềm năng bảo quản của chủng T13 đối với cá giị tươi nguyên liệu cũng như với các sản phẩm thủy sản và thực phẩm khác.

Từ khĩa: Bacteriocin, Bảo quản thực phẩm, Cá giị, Vi khuẩn lactic

ABSTRACT

Bacteriocins are the peptide and protein antibiotics with inhibitory activity on the growth of variety microbes, which are expected to become safe biological preservatives in food technology This research aims to deﬁ ne the growth and bacteriocin production of lactic acid bacteria strain T13 on culture medium and fresh cobia skin The results have showed that its optimal production of bacteriocin approached at the 12h-cultured late log phage Beside the secretion of organic acids, the bacteriocin production enhanced its anti-microbial mode of action The favourite culture condition for the growth

of strain T13 were also investigated, in which glucose shown as a carbon source, peptone as a nitrogen source, pH at 6.4 and the temperature at 31 0 C Finally, the growth and bacteriocin production of strain T13 were well expressed on culture medium and fresh cobia skin within one week Thus, the strain T13 is potentially used as a preservative for fresh cobia meat and other seafood products.

Keywords: Bacteriocin, Cobia, Food preservation, Lactic acid bacteria

1 TS Nguyễn Văn Duy: Viện Cơng nghệ Sinh học và Mơi trường - Trường Đại học Nha Trang

2 Lưu Thị Thúy: Lớp Cao học Cơng nghệ Sau thu hoạch 2009 - Trường Đại học Nha Trang

Từ hàng ngàn năm nay, người dân Việt Nam

đã biết sử dụng vi khuẩn lactic trong tự nhiên để

muối dưa, cà Vi khuẩn lactic được cơng nhận là

an tồn để sử dụng trong quá trình lên men thực

phẩm truyền thống Khi ứng dụng trong bảo quản

thực phẩm, chúng giúp giảm bổ sung các chất bảo

quản hĩa học cũng như cường độ xử lý nhiệt, do

đĩ làm cho thực phẩm sau bảo quản vẫn giữ được

trạng thái tự nhiên và đảm bảo tính chất cảm quan

và dinh dưỡng Khi sử dụng trong bảo quản nguyên liệu thủy sản tươi đánh bắt xa bờ, chúng giúp giảm chi phí và nhu cầu về đá lạnh cũng như duy trì độ tươi thơm đảm bảo giá nguyên liệu ổn định Ngồi

ra, chúng cịn cĩ thể thay thế các chất bảo quản thực phẩm hiện tại để đáp ứng nhu cầu tiêu dùng ngày càng tăng về tính an tồn, độ tươi ngon, thực phẩm ăn liền, thực phẩm chế biến tối thiểu và

Trang 14

gia tăng sản phẩm có tính cảm quan mới lạ như

giảm tính acid hoặc giảm nồng độ muối (De Vuyst,

Leroy, 2007)

Trong những năm gần đây, người ta đã nghiên

cứu sử dụng bacteriocin trong bảo quản thực phẩm

và nhận thấy sử dụng bacteriocin có thể kéo dài thời

gian bảo quản, tăng cường bảo vệ thực phẩm trong

các điều kiện nhiệt độ bất thường, làm giảm nguy

cơ truyền bệnh qua chuỗi thức ăn, giảm thiệt hại

kinh tế do hư hỏng thực phẩm, giảm tỷ lệ sử dụng

phụ gia trong bảo quản thực phẩm… (Gálvez et

al., 2007)

Ở Việt Nam hiện nay đã có một vài nghiên cứu

về khả năng sinh bacteriocin của vi khuẩn lactic

Nghiên cứu của Lê Thị Hồng Tuyết và Hoàng Quốc

Khánh (2004) đã cho thấy vi khuẩn Lactobacillus

acidophilus sản sinh bacteriocin có khả năng kháng

một số vi khuẩn gây bệnh trong thực phẩm như

E.coli, Samonella và một số vi khuẩn lactic khác

Ngoài ra, bacteriocin từ Lactococcus lactic đã

được thu nhận, cố định trên chất mang cellulose vi

khuẩn và bước đầu ứng dụng trong bảo quản thịt

tươi sơ chế (Nguyễn Thúy Hương, Trần Thị Tưởng

An, 2008) Mới đây, nhóm nghiên cứu chúng tôi đã

tuyển chọn được hai chủng vi khuẩn lactic T8 và

T13 có khả năng sinh bacteriocin mạnh nhất trong

số 69 chủng vi khuẩn lactic phân lập được từ nguồn

nước dưa lên men truyền thống (Nguyễn Văn

Duy, Lưu Thị Thúy, 2012) Hai chủng vi khuẩn này

có phổ kháng khuẩn bổ sung nhau, trong đó dịch

bacteriocin từ chủng T8 đã được thử nghiệm thành

công nhằm kéo dài thời gian bảo quản cá giò

nguyên liệu tươi (Nguyễn Văn Duy, Phạm Ngọc

Minh Quỳnh, 2011) Mục tiêu của nghiên cứu này

là nhằm xác định đặc điểm sinh trưởng và sinh

bacteriocin của chủng T13 trên môi trường nuôi cấy

và trên da cá giò nhằm định hướng sử dụng chúng

bổ sung với chủng T8 trong bảo quản thực phẩm và

nguyên liệu thủy sản

II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1 Đối tượng nghiên cứu

Chủng vi khuẩn lactic T13 sinh bacteriocin và

chủng vi khuẩn Bacillus B1.1 đã được lấy từ bộ sưu

tập chủng vi sinh vật của Viện Công nghệ sinh học

và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang (Nguyễn

Văn Duy, Lưu Thị Thúy, 2012) Trong đó, chủng T13

được sử dụng làm vi khuẩn thử nghiệm còn chủng

B1.1 dùng làm vi khuẩn đích để xác định khả năng

sinh bacteriocin của chủng T13

Cá giò (Rachycenton canadum) nguyên liệu tươi

được thu mua tại lồng nuôi cá giò ở Lương Sơn Nha Trang - Khánh Hòa vào tháng 3 - 5 năm 2010

-Da cá giò được nhúng vào dịch tế bào vi khuẩn lactic trong 120 giây, giữ ở nhiệt độ 300C (Zhang et

al., 2010) Mẫu được lấy theo thời gian bảo quản từ

1 - 7 ngày

2 Xác định khả năng sinh trưởng

Khả năng sinh trưởng của vi khuẩn lactic được xác định bằng phép đo mật độ quang của dịch nuôi

phổ Cary 100 Bio (Varian, Mỹ) Tổng số vi khuẩn lactic được đếm theo phương pháp đổ đĩa trên môi trường MRS (Trần Linh Thước, 2008)

3 Xác định hoạt tính sinh bacteriocin

Hoạt tính sinh bacteriocin của vi khuẩn lacticđược xác định bằng phương pháp khuếch tán trên thạch đĩa (well diffusion assay) Sau 16 - 24h nuôi trên môi trường MRS ở 370C, dịch tế bào vi khuẩn lactic được ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 30 phút ở 40C để thu dịch nổi Sau đó dịch

nổi được điều chỉnh pH đến 7,0 bằng NaOH 1N Chủng vi khuẩn đích Bacillus B1.1 được nuôi trong

đĩa thạch mềm (0,75%) có bổ sung dịch nhuộm màu methylene blue 0,4% ở 370C trong 24 giờ Thạch

được đục lỗ với đường kính 5 mm, rồi nhỏ vào

200 µl dịch vi khuẩn lactic sau ly tâm ở trên và ủ ở nhiệt độ 370C trong 12-24h Hoạt tính bacteriocin của mẫu thí nghiệm được xác định theo đường kính vòng kháng khuẩn (D-d, mm) trong đó D và d lần lượt là các đường kính của vòng ức chế và lỗ thạch

(Deraz et al., 2005) Nếu tính theo đơn vị hoạt độ

AU/ml, hoạt tính của bacteriocin (AU/ml) là nghịch đảo của nồng độ pha loãng cao nhất (D), tại đó bacteriocin vẫn thể hiện vòng kháng rõ ràng với chủng chỉ thị (d ≥ 6 mm) Công thức tính như sau: AU/ml = (1000/V)*D trong đó V (ml) là thể tích dịch

nhỏ vào giếng trên đĩa thạch (Gao et al., 2010).

4 Xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp

Để xác định nguồn dinh dưỡng nitơ thích hợp, chủng vi khuẩn lactic T13 đã được nuôi trong môi trường MRS và thay thế các nguồn nitơ

Để xác định nguồn cacbon thích hợp, chủng T13 được nuôi ở các nguồn đường khác nhau: glucose, fructose, maltose, saccarose, và dextrin Để xác định

pH thích hợp, chủng T13 được nuôi ở pH acid từ 5,6 - 7,0 Cuối cùng, chủng này được nuôi ở

27 - 410C nhằm xác định nhiệt độ thích hợp

Trang 15

1 Đường cong sinh trưởng và sinh bacteriocin

của vi khuẩn lactic T13 trên mơi trường MRS

sản sinh các acid hữu cơ, cĩ thể là acid acetic và acid lactic Hơn nữa, ở hoạt độ bacteriocin là 800 và

1600 AU.ml-1, dịch chiết tế bào đã trung hịa pH của chủng T13 cũng ức chế lần lượt tới 47% và 63% sinh trưởng của B1.1 sau 6 giờ nuơi Thậm chí khi nhuộm tế bào và quan sát dưới kính hiển vi chúng tơi đã khơng phát hiện thấy tế bào nào của B1.1 cịn sống sau 8 giờ nuơi cĩ bổ sung dịch bacteriocin với

chế hoạt động của dịch bacteriocin từ chủng T13 là

cĩ hoạt tính kháng khuẩn

Những nghiên cứu trước đây cho thấy khả năng ức chế sinh trưởng của các vi khuẩn lactic đối với các vi khuẩn khác cĩ thể do nhiều nguyên nhân: tiết các acid hữu cơ như lactic acid, aceticacid; sinh ra hydrogen peroxide; hay tiết các chất kháng sinh cĩ bản chất khác nhau bao gồmbacteriocin cĩ bản chất peptide/protein Trongnghiên cứu này, để tuyển chọn các chủng sinh bacteriocin, trước hết chúng tơi đã trung hịa dịch chiết tế bào bằng NaOH để loại trừ ảnh hưởng của các acid hữu cơ được tiết ra Sau đĩ dịch nuơi cấy được xử lý bổ sung bằng enzym catalase để loại

bỏ hiệu quả của hydrogen peroxide Cuối cùng, để xác định bản chất protein của chất ức chế vi khuẩn thì các mẫu được xử lý với trypsin Một nghiên cứu tương tự được Todorov và Dicks (2009) tiến hành

đã cho thấy việc bổ sung dịch bacteriocin ST44AM

từ vi khuẩn lactic Pediococcus pentosaceus

chế mạnh theo hiệu ứng nồng độ đối với các chủng

vi khuẩn Listeria ivanovii subsp ivanovii ATCC

19119, L innocua 2030C và Enterococcus faecium

HKLHS khi nuơi trong mơi trường MRS Do đĩ,bacteriocin ST44AM được cho là cĩ tiềm năng lớn

để ứng dụng trong bảo quản thực phẩm chống lại

sự nhiễm khuẩn Listeria và hệ vi khuẩn đường ruột.

Hình 1 Đường cong sinh trưởng tính theo mật độ quang

(OD 600 ) và khả năng sinh bacteriocin tính theo đường kính

vịng kháng khuẩn (D-d, mm) của chủng T13

Kết quả từ hình 1 cho thấy đường cong sinh

trưởng của vi khuẩn lactic T13 bao gồm 4 pha điển

hình là pha lag, pha log, pha cân bằng và pha suy

vong (Lương Đức Phẩm, 2002) Pha sinh trưởng

log kéo dài từ 3-12 giờ sau nuơi cấy Trong giai

đoạn này, giá trị mật độ tế bào OD600 tăng cao nhanh

chĩng và khả năng sinh bacteriocin cao nhất ở cuối

pha log với các giá trị mật độ tế bào và hoạt độ sinh

bacteriocin lần lượt là OD600 = 2,77 và D - d = 11mm

Nếu tính theo đơn vị hoạt độ AU/ml, hoạt tính sinh

bacteriocin cực đại của chủng T13 đạt 8000 AU/ml

Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Tomé và

cộng sự (2007) đối với các chủng vi khuẩn lactic

khác nhau: Lactobacillus curvatus ET06, L curvatus

ET30, L delbrueckii E32 Như vậy, với mục đích thu

nhận các tế bào sinh trưởng tốt và sinh bacteriocin

mạnh thì quá trình nuơi cấy nên kết thúc cuối pha

log, sau 12 giờ nuơi cấy là tốt nhất

2 Khả năng kháng khuẩn của chủng vi khuẩn

lactic T13

Nhằm tìm hiểu cơ chế kháng khuẩn của dịch

bacteriocin, chúng tơi đã tiến hành khảo sát ảnh

hưởng của dịch bacteriocin thơ của chủng T13 đến

sinh trưởng của vi khuẩn Bacillus B1.1 Dịch chiết

tế bào nuơi 12h tuổi của chủng T13 với các hoạt

độ bacteriocin khác nhau đã được bổ sung vào

pha sinh trưởng log (sau 2 giờ nuơi cấy) của chủng

B1.1 Kết quả từ hình 2 cho thấy, nếu khơng trung

hịa pH thì ở nồng độ 400 AU.ml-1, dịch chiết tế bào

của chủng T13 ức chế hồn tồn sinh trưởng của

B1.1, trong khi đĩ nếu dịch này được trung hịa pH

về 7,0 thì chỉ ức chế 20% sinh trưởng của B1.1 ở

cuối pha log sau 6 giờ nuơi Điều này cho thấy khả

năng kháng khuẩn rất mạnh của chủng T13 là do Hình 2 Ảnh hưởng của dịch bacteriocin của chủng vi khuẩn lactic T13 đến sinh trưởng của Bacillus B1.1

Trang 16

Hình 5 Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng của vi khuẩn lactic T13 sau 12h nuôi cấy

Kết quả hình 5 chỉ ra rằng pH môi trường nuôi cấy cũng ảnh hưởng lớn đến khả năng sinh trưởng của vi khuẩn lactic, trong đó chủng T13 sinh trưởng tốt trong điều kiện axit Chủng này sinh trưởng mạnh khi giá trị pH môi trường từ 6,2 - 6,6 và cực đại ở pH 6,4

3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của vi khuẩn lactic T13

3 Điều kiện nuôi cấy thích hợp cho chủng T13

3.1 Ảnh hưởng cuả nguồn cacbon đến sinh trưởng

của chủng T13

nuôi cấy, nhưng vẫn thấp hơn so với nguồn nitơ từ pepton Vì vậy, chúng tôi tiếp tục chọn pepton làm nguồn nitơ khi nuôi cấy chủng vi khuẩn này

3.3 Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng của vi khuẩn lactic T13

Hình 3 Ảnh hưởng của đường đến sinh trưởng

của vi khuẩn lactic T13 sau 12h nuôi cấy

Kết quả từ hình 3 cho thấy khả năng sinh trưởng

của vi khuẩn lactic T13 rất thấp khi nuôi cấy trên

môi trường có chứa đường dextrin Giá trị OD600

chỉ khoảng 0,35 sau 12h nuôi cấy Còn với đường

fructose, saccarose, lactose thì khả năng sinh

trưởng của chủng T13 mạnh hơn rất nhiều

(OD600 1,75 - 1,89) Đối với đường glucose thì khả

năng sinh trưởng của vi khuẩn lactic là cao nhất

với OD600 lên tới 2,02 Vì vậy chúng tôi chọn đường

glucose làm nguồn cacbon trong môi trường nuôi

cấy ở các thí nghiệm tiếp theo

3.2 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến sinh trưởng của

chủng T13

Hình 4 Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sinh trưởng

của vi khuẩn lactic T13 sau 12h nuôi cấy

Từ hình 4 cho thấy nguồn nitơ khác nhau sẽ

ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh trưởng của

vi khuẩn lactic T13 Đối với nguồn nitơ từ ure hoặc

NH4Cl thì vi khuẩn lactic sau 12h nuôi cấy mật độ tế

bào phát triển rất thấp OD600 chỉ đạt 0,88 - 1,08 Đối

với nguồn nito từ bột đậu nành thì sinh trưởng của

Hình 6 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của vi khuẩn lactic T13 sau 12h nuôi cấy

Khi chúng tôi tiến hành khảo sát nhiệt độ nuôi

triển cao nhất là ở 310C và giảm mạnh ở nhiệt độ từ

410C trở lên (hình 6) Vì vậy chúng tôi chọn nhiệt độ

310C cho quá trình nuôi cấy tiếp theo

Trang 17

4 Khả năng sinh trưởng và sinh bacteriocin của

vi khuẩn lactic trên da cá giị

Hình 7 Khả năng sinh trưởng và sinh bacteriocin

của tổng vi khuẩn lactic trên da cá giị theo thời gian

Kết quả từ hình 7 cho thấy trên da cá giị tồn

tại sẵn một lượng vi khuẩn lactic và tăng trong thời

gian bảo quản Tuy nhiên, khi nhúng mẫu 1 và mẫu

2 vào dịch nuơi tế bào vi khuẩn lactic T13 thì tổng vi

khuẩn lactic tăng 10 lần so với lượng vi khuẩn lactic

ban đầu và tăng nhanh theo thời gian bảo quản

Trong khi đĩ mẫu đối chứng khơng nhúng dịch, mật

độ tế bào vi khuẩn lactic tổng số cũng tăng nhưng

tăng chậm hơn rõ rệt Kết quả này cho thấy vi khuẩn

lactic T13 phát triển được trên da cá giị và phát

triển tốt hơn khi khơng cho vào túi PE Hơn nữa, chủng vi khuẩn lactic T13 phát triển trên mơi trường

da cá giị vẫn cĩ khả năng sinh bacteriocin, thể hiện

ở đường kính vịng kháng khuẩn tăng dần tương đối đều trong vịng một tuần thí nghiệm Kết quả này

mở ra tiềm năng lớn trong việc ứng dụng vi khuẩn lactic T13 trong bảo quản cá giị Vì thế, việc đánh giá chất lượng cá giị sau 1 tuần bảo quản bằng dịch nuơi tế bào vi khuẩn T13 cần được tiến hành

để biến tiềm năng này thành những ứng dụng thực tiễn trong cơng nghệ thực phẩm

IV KẾT LUẬN

Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng vi khuẩnlactic T13 phát triển tốt nhất trên mơi trường cĩ nguồn cacbon là glucose, nguồn nitơ là pepton, ở

pH 6,4, nhiệt độ 310C Khả năng sinh bacteriocin đạt cực đại ở cuối pha sinh trưởng logarit, sau 12 giờ nuơi cấy trong điều kiện trên Cùng với việc tiết

ra các acid hữu cơ thì khả năng sản sinh bacteriocincũng là một cơ chế kháng khuẩn của chủng vi khuẩn này Hơn nữa, chủng T13 cịn thể hiện khả năng sinh trưởng và sinh bacteriocin tốt trên mơi trường

da cá giị trong vịng một tuần thí nghiệm

Chúng tơi khuyến nghị cần tiến hành thử nghiệm

sử dụng dịch nuơi vi khuẩn lactic T13 để bảo quản

cá giị tươi nguyên liệu

4 Lương Đức Phẩm (2002), Vi sinh vật và bảo quản thực phẩm, NXB Nơng nghiệp, Hà Nội

5 Trần Linh Thước (2008), Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm, NXB Giáo dục, Tp Hồ Chí Minh, 232 tr

6 Lê Thị Hồng Tuyết, Hồng Quốc Khánh (2004), Một số đặc tính của bacteriocin sản xuất bởi vi khuẩn Lactobacillus

acidophilus.Báo cáo Hội nghị khoa học Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, TP Hồ Chí Minh, tháng 10/2004.

9 Gao Y, Jia S, Gao Q and Tan Zh (2010), A novel bacteriocin with a broad inhibitory spectrum produced by Lactobacillus sake

C2 isolated from traditional Chinese fermented cabbage Food Control, 1(21): 76 - 81

10 Todorov SD, Dicks LM (2009), Bacteriocin production by Pediococcus pentosaceus isolated from marula (Scerocarya

birrea) Int J Food Microbiol, 132(2-3):117-26.

11 Tomé E, Pereia VL, Lopes CI, Gibbs PA, Teixeira PC (2008), In vitro tets suitability of bacteriocin - producing lactic acid

bacteria, as potential biopreservation cultures in vacuum - packaged cold - smoked salmon Food Control, 19(5): 535 - 543

12 Zhang J, Liu G, Li P, Qu Y (2010), Pentocin 31-1, a novel meat-borne bacteriocin and its application as biopreservative in chill-stored tray-packaged pork meat Food Control 21: 198-202

Trang 18

TÁC ĐỘNG CỦA β -GLUCAN LÊN MỘT SỐ THƠNG SỐ VỀ ĐÁP ỨNG

MIỄN DỊCH KHƠNG ĐẶC HIỆU CỦA CÁ CHẼM

(Lates calcarifer bloch) EFFECT OF Β-GLUCAN ON SOME NON-SPECIFIC IMMUNE RESPONSE

PARAMETERS OF BARRAMUNDI (Lates calcarifer bloch)

Từ khĩa:Lates calcarifer, β-glucan, Lysozyme, Thực bào

ABSTRACT

The effects of dietary β-glucan on some non speciﬁ c immune response were investigated in barramundi (Lates calcarifer Bloch) Β-glucan was supplemented into the commercial diet (Seabass feed, UP, Vietnam) at 5‰ level and fed

to barramundi for a period of three weeks while ﬁ sh in control group were fed the commercial diet Control and treated

fi sh were exposed to Streptococcus iniae on the day 14 of the experimental period The blood and head kidney from experimental fi sh were separated and analysed for immunity parameters on the 12h, 24h, 36h, 48h, 60h, 72h, 84h and 96h after exposed S iniae The result showed that dietary supplementation of β-glucan signifi cantly increased the sera lysozyme level and phagocytic activity Lysozyme level was also increased 96 h post-injection S iniae Whilst no differences in phagocytic index were observed among treated and untreated fish.

Keywords: Lates calcarifer, β-glucan, Lysozyme, Phagocytic

1 ThS Trần Vĩ Hích: Khoa Nuơi trồng Thủy sản - Trường Đại học Nha Trang

2 TS Nguyễn Hữu Dũng: Viện Nghiên cứu Giống và Dịch bệnh Thủy sản - Trường Đại học Nha Trang

β -glucan là một trong những chất kích thích

miễn dịch quan trọng thường được sử dụng trong

nuơi trồng thủy sản nhằm tăng cường khả năng

kháng lại tác nhân gây bệnh cho các đối tượng

nuơi thủy sản (Gatesoupe 2007; Robertsen et al

1990; Chen & Ainsworth, 1994; Cook et al 2003…)

β -glucan cĩ khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch

khơng đặc hiệu của cá cũng như ở động vật cĩ

vú (Di Luzio 1985; Robertsen et al.1994) Kết quả nghiên cứu của nhiều nhà khoa học cho thấy việc

bổ sung β-glucan vào thức ăn cho cá cĩ khả năng làm tăng hoạt tính bùng nổ oxy hĩa khử của tế bào (Secombes and Fletcher, 1992; Yoshida et al 1995; Volpatti et al 1998; Cook et al 2003 and Li and Gatlin 2004), hoạt tính thực bào (Misra et al 2006;

Trang 19

Ai et al 2007; Kumari and Sahoo 2006; Li and

Gatlin 2004), nồng độ lysozyme (Misra et al 2006;

Ai et al 2007; Bagni et al 2005 and Ogier et al 1996)

và chống lại tác nhân vi khuẩn gây bệnh ở một số

lồi cá nuơi (Ai et al 2007; Selvaraj et al 2006)

Ngồi ra, β -glucan cịn được sử dụng như là chất

bổ trợ để làm tăng đáp ứng miễn dịch đặc hiệu của

cá khi tiêm vaccine (Selvaraj et al 2006) Tuy nhiên

một số nghiên cứu khác lại cho kết quả trái ngược

Việc bổ sung β-glucan vào thức ăn khơng làm tăng

hoạt tính bùng nổ oxy hĩa khử của tế bào (Verlhat

et al, 1998; Sealay et al 2008) hoặc tăng nồng độ

lyzozyme (Verlhat et al, 1998; Sealay et al 2008;

Whittington et al 2005)

Cá chẽm (Lates calcarifer Bloch) là một trong

những đối tượng nuơi quan trọng nhất ở Việt Nam

Tuy nhiên, những năm gần đây, nghề nuơi cá chẽm

đã và đang đối mặt với những rủi ro do dịch bệnh

Hiện tượng kháng kháng sinh của vi khuẩn cũng đã

được báo cáo ở nhiều nơi trong khi cĩ quá ít những

thơng tin về việc sử dụng chất kích thích miễn dịch

khơng đặc hiệu nhằm tăng cường khả năng kháng

bệnh của cá chẽm Nghiên cứu này nhằm đánh giá

tác động của β-glucan lên đáp ứng miễn dịch khơng

đặc hiệu của cá chẽm

II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1 Chuẩn bị cá

Cá chẽm thương phẩm (135-155g/con) bắt từ

Cơng ty TNHH Mai Hương Cam Ranh Khánh Hịa

chuyển về Trung tâm Nghiên cứu giống và dịch

bệnh thủy sản Trường Đại học Nha Trang nuơi

thuần trong 2 tuần trước khi bắt đầu thí nghiệm 80

con cá chẽm được nuơi trong 2 bể composite trịn

cĩ thể tích 1000L Ở nghiệm thức đối chứng, cá

được cho ăn thức ăn viên dành cho cá chẽm của

cơng ty UP theo nhu cầu của cá; ở nghiệm thức kia

cá được cho ăn thức ăn tương tự nhưng cĩ bổ sung

5‰ β-glucan (Beta β-glucan, Korea) liên tục trong 2

tuần Trong suốt quá trình thí nghiệm, nhiệt độ được

duy trì từ 28-300C, độ mặn thay đổi từ 26 - 31ppt, pH

biến động từ 7.7 - 8.3

2 Chuẩn bị vi khuẩn bất hoạt

Vi khuẩn Streptococcus iniae được nuơi trong

bình tam giác 1L chứa 300mL trypticase soy broth

(TSB), (Merk, Germany) bổ sung 2% NaCl đặt trong

tủ ấm lắc (180 vịng/phút) ở nhiệt độ 28oC trong 24h

Tồn bộ vi khuẩn được thu bằng cách ly tâm dung

dịch nuơi cấy ở 1000g trong 15 phút và rửa 2 lần

bằng PBS trước khi tạo dịch huyền phù của vi khuẩn

được tính dựa vào chỉ số mật độ quang của máy

đo quang phổ Cho thêm 0,5% formalin vào dung dịch này và để qua đêm nhằm bất hoạt vi khuẩn

Streptococcus iniae Tồn bộ cá thí nghiệm được

tiêm dịch huyền phù vi khuẩn này với lượng 0.3mL/cá sau lần thu mẫu đầu tiên Mẫu huyết thanh

và tiền thận của cá được thu sau mỗi 12h sau khi tiêm và liên tục trong 96h

3 Phương pháp đo hoạt tính lysozyme trong huyết thanh

Máu cá được lấy từ đuơi và giữ trong eppendoft

tâm để thu huyết thanh Huyết thanh cá được bảo

lysozyme của huyết thanh được phân tích dưới máy quang phổ dựa theo phương pháp của Shugar (1952) cĩ sửa đổi Theo đĩ, hoạt tính của lysozyme được xác định dựa theo đường chuẩn về phân giải

Micrococcus lysodeikticus (Sigma) của hen egg

white lysozyme (sigma) Lấy 25µL mẫu huyết thanh cần kiểm tra đặt vào 1 giếng, lập lại 3 lần Để đối chứng, 6 giếng chứa 25µL hen egg white losozyme với các nồng độ giảm dần 20, 10, 5… 0,3125µg/mL

Cho 175µL dịch huyền phù vi khuẩn Micrococcus

lysodeiltikus 0,075% vào các giếng, trộn nhanh và

đặt đĩa lên máy đọc quang phổ Sự thay đổi về độ đục được đo sau mỗi 30 giây trong 5 phút ở 450nm

4 Phương pháp đánh giá chỉ số thực bào và hoạt tính thực bào

Phương pháp thu leucocyte ở cá

Leucocytes của cá chẽm được thu bằng cách nghiền tiền thận trong mơi trường Leibovitch (L-15, Sigma) cĩ bổ sung 1ppt huyết thanh cá chẽm và

ép qua màng lọc 100um (fancol) Leucocytes được phân lập bằng cách ly tâm dung dịch thu được ở trên với Percoll 1,04g/mL và Percoll 1,075g/mL ở 400g trong 35 phút tại nhiệt độ phịng

Rửa leucocytes bằng cách trộn 2 thể tích PBS với 1 thể tích dịch thu được và ly tâm ở 40C ở 200g trong 10 phút Định lượng mật độ leucocytes bằng cách nhuộm trypan blue và điều chỉnh mật độ bằng cách cho thêm L15 bổ sung 0,1% Fetal calf serum (FCS) và 100µg/mL penicyclin hoặc streptomycine

dịch này vào mỗi giếng của đĩa 96 giếng đáy bằng

những tế bào khơng bám sau đĩ cho 100µL L15 cĩ

được giữ trong 24 giờ trước khi sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo

Chỉ số thực bào được xác định dựa theo

Trang 20

Crosbie và Nowak, 2004 Theo đó, 100µL dung

dịch đại thực bào ủ với 100µL dung dịch nấm men

đã nhuộm bằng thuốc nhuộm Congo red (mật độ

108CFU/mL) Sau khi ủ 2h ở 22oC, hỗn hợp trên

được quan sát dưới kính hiển vi với độ phóng đại

400 và 1000 lần để xác định khả năng thực bào

Hoạt tính thực bào được tính bằng số lượng tế

bào thực bào trong 100 tế bào được đếm và chỉ số

thực bào được tính bằng số lượng trung bình của tế

bào nấm men bị bắt giữ bởi mỗi đại thực bào

Hình 1 Hoạt tính thực bào của đại thực bào cá chẽm trước và sau khi tiêm vi khuẩn S iniae bất hoạt

Hình 2 Chỉ số thực bào của đại thực bào cá chẽm trước và sau khi tiêm vi khuẩn S iniae

1 Tác động của β -glucan lên hoạt tính thực bào

và chỉ số thực bào của đại thực bào.

Việc bổ sung 5‰ β-glucan vào thức ăn của

cá chẽm có tác dụng làm tăng hoạt tính thực bào của đại thực bào của cá chẽm Trong điều kiện bình thường, có khoảng 45,6% số lượng đại thực bào của cá chẽm sau khi nuôi cấy ở môi trường L15 trong 24h có khả năng thực bào Tuy nhiên sau khi

bổ sung 5‰ β-glucan vào khẩu phần thức ăn của

cá chẽm liên tục trong 2 tuần, hoạt tính thực bào của đại thực bào tăng đến 79,8% (hình 1)

Tuy nhiên kết quả của thí nghiệm này chưa cho

thấy được sự gia tăng về chỉ số thực bào của đại

thực bào cá chẽm sau khi cho cá ăn bổ sung 5‰

β-glucan trong vòng 14 ngày Trung bình mỗi đại thực

bào của cá chẽm có khả năng thực bào được khoảng

2 tế bào nấm men (hình 2) Sau khi cho cá tiếp xúc

với vi khuẩn Streptococcus iniae 12h, hoạt tính thực

bào và chỉ số thực bào của cá chẽm đồng loạt tăng

Ở cá đối chứng, hoạt tính thực bào của đại thực bào

tăng khoảng gấp đôi trong khi chỉ số thực bào tăng khoảng gấp 1,5 lần Đến 36h sau khi cho tiếp xúc với

vi khuẩn S iniae, hoạt tính thực bào và chỉ số thực

bào của đại thực bào cá chẽm trở lại như lúc ban đầu Kết quả thí nghiệm cũng cho thấy rằng sau khi

cho cá tiếp xúc với vi khuẩn Streptococcus iniae 12

giờ đồng hồ, không có sự khác nhau về chỉ số thực bào cũng như hoạt tính thực bào ở 2 nhóm cá đối chứng và cá cho ăn thức ăn có bổ sung 5‰ β-glucan

Trang 21

2 Tác động của β-glucan lên nồng độ lysozyme

trong huyết thanh của cá chẽm

Việc bổ sung β-glucan vào thức ăn của cá cũng

cĩ tác động làm gia tăng hàm lượng lysozyme trong

huyết thanh cá chẽm Ở cá cho ăn thức ăn cĩ bổ

sung β-glucan, hàm lượng lysozyme đạt khoảng

11,8µg/mL trong khi ở cá đối chứng, con số này chỉ

là 6,4µg/mL (hình 3) Trong khoảng thời gian 96 giờ

sau khi tiếp xúc với vi khuẩn Streptococcus iniae,

nồng độ lysozyme trong huyết thanh cá chẽm cĩ xu hướng tăng dần (r>0,95) Sau 96h, chỉ số lysozyme của huyết thanh cá đạt đến khoảng 21µg/mL Trong suốt quá trình thí nghiệm nồng độ lysozyme trong huyết thanh của cá chẽm ở nhĩm cho ăn thức ăn cĩ

bổ sung 5‰ β-glucan luơn duy trì ở mức cao hơn

so với nhĩm cá đối chứng

Hình 3 Nồng độ lyzozyme của huyết thanh cá chẽm trước và sau khi tiêm vi khuẩn S iniae

3 Thảo luận

Đã cĩ nhiều thí nghiệm nghiên cứu về việc bổ

sung β-glucan vào thức ăn của cá nhằm cải thiện

đáp ứng miễn dịch và làm tăng sức kháng bệnh

của cá Đến nay, hầu hết các nghiên cứu đều ghi

nhận tác động làm tăng khả năng chống lại các tác

nhân gây bệnh như vi khuẩn hay kí sinh trùng ở cá

của β-glucan thơng qua việc nâng cao các đáp ứng

miễn dịch khơng đặc hiệu như làm gia tăng hoạt tính

lysozyme, tăng chỉ số thực bào và hoạt tính thực

bào hay làm tăng phản ứng bùng nổ oxy hĩa của đại

thực bào (Dalmo and Bogwald 2008; Misra et al

2006; Ai et al 2007) Duncan và Klesius (1996) đã

chứng minh rằng việc bổ sung β- glucan vào thức

ăn cho cá da trơn cĩ tác dụng làm gia tăng khả năng

thực bào của đại thực bào β-glucan cũng cĩ tác

dụng làm tăng hoạt tính lysozyme ở cá hồi, cá rohu

Labeo rohita (Misra et al 2006; Ai et al 2007) mặc

dù sự khác nhau về lồi nghiên cứu, kích cỡ cá,

phương pháp bố trí thí nghiệm… đã làm cho mức độ

gia tăng nồng độ lysozyme trong huyết thanh cũng

như hoạt tính thực bào của đại thực bào do việc bổ

sung β-glucan vào thức ăn mang lại khơng cĩ sự

thống nhất giữa các tác giả Kết quả thí nghiệm của

chúng tơi một lần nữa xác nhận lại tác động làm gia

tăng nồng độ lysozyme trong huyết thanh của cá

chẽm cũng như hoạt tính thực bào của đại thực bào

cá chẽm của việc bổ sung β- glucan vào thức ăn cho

cá chẽm tương tự kết quả nghiên cứu của nhiều tác

giả như đã đề cập phía trên

Mặc dù kết quả thu được từ thí nghiệm chưa

cho thấy được tác động làm tăng chỉ số thực bào khi bổ sung β-glucan vào thức ăn của cá, nhưng

đã cĩ nhiều kết quả tương tự từng xảy ra ở một số

lồi cá khác như cá hồi Oncorhynchus mykiss hay

cá rơ phi Oreochromis niloticus (Verlhat et al, 1998;

Sealay et al 2008; Whittington et al 2005) Kết quả thí nghiệm của Verlhat và các cộng sự năm 1998 đã khơng tìm thấy tác động cải thiện đáp ứng miễn dịch khơng đặc hiệu bao gồm hoạt tính lysozyme huyết thanh và phản ứng bùng nổ oxy hĩa đại thực bào của việc bổ sung β-glucan vào thức ăn của cá hồi,

Oncorhynchus mykiss.

Kết quả thí nghiệm của Figueras và các cộng

sự năm 1998 đã khơng tìm thấy sự khác biệt về hoạt tính thực bào và chỉ số thực bào của đại thực bào

cá bơn (Scophthalmus maximus L.) giữa hai nhĩm

cá đã cĩ tiếp xúc và khơng tiếp xúc với β-glucan sau

khi tiêm vi khuẩn Vibrio damsela bất hoạt vào xoang

bụng Những số liệu thu được từ thí nghiệm cũng cho thấy khơng cĩ sự khác biệt về chỉ số thực bào cũng như hoạt tính thực bào ở 2 nhĩm cá đối chứng

và cá cho ăn thức ăn cĩ bổ sung 5‰ β-glucan sau

khi cá chẽm tiếp xúc với vi khuẩn Streptococcus

iniae 12h

Tĩm lại, mặc dù phần lớn các nhà khoa học đều cơng nhận tác động cải thiện đáp ứng miễn dịch khơng đặc hiệu của β-glucan đối với các lồi cá nuơi, nhưng mức độ và hướng tác động vào các phản ứng nào của cá khơng chỉ thay đổi theo hàm lượng, con đường đưa β-glucan vào cơ thể cá, thời gian tiếp xúc với β-glucan mà cịn theo đặc điểm

Trang 22

của loài cá, kích cỡ, môi trường nuôi…Việc bổ sung

chất kích thích miễn dịch không đặc hiệu nói chung

hay β-glucan nói riêng sau khi chủng vaccine cho cá

thường gây suy giảm đáp ứng miễn dịch trong khi

nghiên cứu của Figueras và các cộng sự năm 1998

trên cá bơn (Scophthalmus maximus L.) đã chứng

minh điều ngược lại Do đó, các nghiên cứu đánh

giá tác động của β-glucan lên đáp ứng miễn dịch

của các loài cá khác nhau cần được tiếp tục thực

hiện trong tương lai

IV KẾT LUẬN

Việc bổ sung β-glucan vào thức ăn của cá chẽm

có tác động kích thích đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu của cá chẽm thông qua khả năng làm tăng nồng độ lysozyme của huyết thanh cá và hoạt tính thực bào của đại thực bào của cá chẽm

Sau khi đưa vi khuẩn Streptococcus iniae bất

hoạt vào cơ thể cá chẽm 12h, β-glucan không có tác dụng làm gia tăng hoạt tính thực bào và chỉ số thực bào của đại thực bào cá

1 Ai Q, Mai K, Zhang L, Tan B, Zhang W, Xu W, et al 2007 Effects of dietary ß-1,3 β-glucan on innate immune response of

large yellow croaker, Pseudosciaena crocea Fish Shellﬁsh Immunol 22:394-402.

2 Bagni M, Romano N, Finola MG, Abelli L, Scapigliati G, Tiscar PG, et al 2005 Short- and long-term effects of a dietary

yeast beta-β-glucan (Macrogard) and alginic acid (Ergosan) preparation on immune response in sea bass (Dicentrarchus

labrax) Fish Shellﬁsh Immunol.18:311-25.

3 Biomarkers and Immunostimulators (ed by J.S Stolen & T.C Fletcher), pp 83-99 SOS Publications, Fair Haven, NJ, USA

4 Chen D & Ainsworth A.J 1992 Β-glucan administration potentiates immune defense mechanisms of channel catﬁ sh, Ictalurus punctatus Raﬁ neque Journal of Fish Diseases 15, 295-304

5 Cook M.T., Hayball P.I., HutchinsonW., Nowak B.F & Hayball J.D 2003 Administration of a commercial immunostimulant preparation, EcoActiva as supplement enhances macrophage respiratory burst and the growth rate of snapper (Pagrus auratus, Sparidae) (Bloch and Schneider) in winter Fish and Shellﬁ sh Immunology14, 333-345

6 Crosble P.B.B and Nowak B.F 2004 Immune responses of barramundi, Lates calcarifer (Bloch), after administration of an

experimental Vibrio harveyi bacterin by intraperitoneal injection, anal intubation and immersion, Journal of Fish diseases

9 Figueras, A., Santarém, M M 1998 Inﬂ uence of the sequence of administration of β-glucan and a Vibrio damsela vaccine

on the immune response of turbot (Scophthalmus maximus L.) Veterinary immunology and immunopathology 64: 59-68

10 Gatesoupe F.J 2007 Live yeasts in the gut: natural occurrence, dietary introduction, and their effects on ﬁ sh health and development Aquaculture 267, 20-30

11 Kumari J, Sahoo PK 2006 Dietary immunostimulants influence specific immune response and resistance of healthy and immunocompromised Asian catfish Clarias batrachus to Aeromonas hydrophila infection Diseases of Aquatic Organisms 70:63-70

12 Li P & Gatlin D.M III 2004 Dietary brewers yeast and the prebiotic probiotic kAE inﬂ uence growth performance, immune

responses and resistance of hybrid striped bass (Morone chrysops x M saxatilis) to Streptococcus iniae infection

Aquaculture 231, 445-456

13 Misra CK, Das BK, Mukherjee SC, Pattnaik P 2006 Effect of long term administration of dietary ß-β-glucan on immunity, growth and survival of Labeo rohita ﬁngerlings Aquaculture 255:82-94

Trang 23

14 Ogier de Baulny M., Quentel C., FournierV., Lamour F & Le Gouvello R 1996 Effect of long termoral administration of Beta-β-glucan as an immunostimulant or an adjuvant on some non-speciﬁ c parameters of the immune response of Turbot Scophthalmus maximus Diseases of Aquatic Organisms 26,139-147

15 Robertsen B., Engstad R.E & Jorenson J.B 1994 Beta β-glucans as immunostimulants in ﬁ sh In: Modulators of Fish Immune Responses: Models for Environmental Toxicology, Biomarkers and Immunostimulators (ed by J.S Stolen & T.C Fletcher), pp 83-99 SOS Publications, Fair Haven, NJ, USA

16 Robertsen, B., Rorstad, G., Engstad, R., Raa, J., 1990 Enhancement of non-speciﬁ c disease resistance in Atlantic salmon, Salmo salar L., by a β-glucan from Saccharomyces cerevisiae cell walls Journal of Fish diseases.13, 391–400

17 Sealey WM, Barrows FT, Hang A, Johansen KA, Overturf K, LaPatra SE, et al 2008 Evaluation of the ability of barley genotypes containing different amounts of ß-β-glucan to alter growth and disease resistance of rainbow trout Oncorhynchus mykiss Animal Feed Science and Technology 141:115-28

18 Secombes, C J & Fletcher, T C 1992 The role of phagocytes in the protective mechanisms of ﬁsh In Annual Review of Fish Diseases, pp 53–71 U.S.A.: Pergamon Press

19 Selvaraj V, Sampath K, Sekar V 2006 Adjuvant and immunostimulatory effects of ß-glucan administration in combination with lipopolysaccharide enhances survival and some immune parameters in carp challenged with Aeromonas hydrophila.Vet Immunol Immunopathol 114:15- 24

20 Shugar D 1952 Measurement of lysozyme activity and the ultraviolet inactivation of lysozyme Biochem Biophys Acta 8: 302-308

21 Verlhac V, Obach A,Gabaudan J, Schu ¨epW, Hole R 1998 Immunomodulation by dietary vitamin C and β-glucan in rainbowtrout (Oncorhynchus mykiss) Fish Shellﬁsh Immunol 8:409- 24

22 Volpatti D., D’Angelo L., Jeney G., Jeney Z., Anderson D P and Galeotti M 1998 Nonspeciﬁ c immune response in ﬁ sh fed β-glucan diets prior to induced transportation stress J Appl Ichthyol 14 201-206 Blackwell Wissenschafts-Verlag, Berlin

23 Yoshida T., Kruger R & Inglis V 1995 Augmentationof nonspeciﬁ c protection in African catﬁ sh, Clarias gariepinus Burchell,

by the long-term oral administration of immunostimulants Journal of Fish Diseases 18, 195-198

Trang 24

XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG NỘI TẠNG

Ở CÁ CHIM VÂY VÀNG (Trachinotus blochii) NUƠI Ở NHA TRANG

CAUSED AGENT DETECTION OF INTERNAL ORGAN WHITE SPOT DISEASE

IN CUTURED SNUB-NOSE POMPANO (Trachinotus Blochii) IN NHA TRANG

Đỗ Thị Hịa1, Dương Văn Quý Bình2, Nguyễn Thị Thùy Giang3

Ngày nhận bài: 20/3/2012; Ngày phản b iện thơng qua: 29/11/2012; Ngày duyệt đăng: 15/12/2012

TĨM TẮT

Gần đây, bệnh đốm trắng nội tạng đã xuất hiện và gây chết nhiều cá chim vây vàng (Trachinotus blochii) cĩ kích thước từ 8 - 14cm, nuơi trong các lồng trên biển ở Vũng Ngán, vịnh Nha Trang Trong năm 2011, 47 con cá bị bệnh này được đưa vào nghiên cứu và đã phát hiện được một số lớn vi khuẩn dạng que, dài từ 2 - 10 µm, phân nhánh, đơi khi gẫy

ra thành các đoạn ngắn, gram dương và kháng acid tồn tại ở trong mơ của các nội tạng như: gan, lách, thận, não và cơ gần các khối u cột sống Lồi vi khuẩn Nocardia sp đã được phân lập thành cơng từ mơ thận, lách của cá bệnh trên mơi trường Ogawa sau 7 - 10 ngày ở nhiệt độ 26 - 28 0 C, khuẩn lạc màu trắng như phấn, khơ và nhăn nheo trên bề mặt Một số phản ứng sinh hĩa của chủng vi khuẩn này đã được thực hiện, hình dạng, kích thước của các tế bào vi khuẩn này đã được quan sát dưới kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) Bằng thí nghiệm thử thách ở cá khỏe, lồi vi khuẩn Nocardia sp đã được xác định là tác nhân gây ra bệnh đốm trắng nội tạng ở cá chim vây vàng và sau 8 ngày cảm nhiễm LD50 của lồi vi khuẩn này được xác định là: 1,8 x 10 4 Đây là lần đầu tiên phân lập được vi khuẩn Nocardia từ cá nuơi bị bệnh ở Việt Nam.

Từ khĩa: Cá chim vây vàng, Bệnh đốm trắng nội tạng, Vi khuẩn Nocardia

ABSTRACT

Recently, internal organ white spot disease has occurred and caused high mortalites in cage- cultured snub-nose pompano (Trachinotus blochii), sized 8 - 14cm, in Vung Ngan, Nha Trang bay In 2011, large amount of rod-bacterium detected in tissues of internal organs of infected fi sh such as spleen, liver, kidney, brain and musle above spinal tumors of all the 47 diseased fi sh The bacteria were observed about 2 - 10 µm, branched, sometimes fragmented to short segments, Gram positive and acid fast Nocardia spp has been successfully isolated from internal organ tissues of the diseased snub-nose pompanos on Ogawa medium after 7 - 10 days in 26 - 28 0 C The bacterial colonies are white, dry and creasy Some chemical biological characteristics of the bacteria were identifi ed as well as cell shape and size were observed under transmission electronic microscope (TEM) From challenge experiments in vivo conditions, the Nocardia sp was detected was a primary agent causing internal organ white spot disease in snub-nose pompano and LD50% of the bacteria also detected

as 1,7x10 4 This is the ﬁ rst report that Nocardia sp is the causative agents of cultured ﬁ sh in Viet Nam.

Keywords: Snub-nose pompano, Interal organ white spot disease, Nocardia bacterium

1 PGS.TS Đỗ Thị Hịa, 3ThS Nguyễn Thị Thùy Giang: Khoa Nuơi trồng Thủy sản - Trường Đại học Nha Trang

2 Dương Văn Quý Bình: Lớp Cao học Norad 2010 - Trường Đại học Nha Trang

Cá chim vây vàng (Trachinotus blochii) là lồi

cá biển đã và đang được cho đẻ nhân tạo và ương

nuơi ở Vũng Ngán, Nha Trang, Khánh Hịa Bệnh

đốm trắng nội tạng đã xuất hiện và gây chết nhiều

cá cĩ kích thước từ 8 -14cm, đang nuơi trong các

lồng trên biển Cá bị bệnh đã thể hiện các dấu hiệu

như: cĩ các nốt phồng rộp nhỏ ở da, khi vỡ tạo nên các vết loét nhỏ màu xám, cĩ các khối u làm dọc cột sống làm cơ thể cá cong vẹo, dị dạng, bụng cá hơi phình và cứng Các u hạt màu trắng xám đã được quan sát thấy ở trên và trong một số cơ quan của cá như: mang, gan, thận và lách Do vậy, bên cạnh các nghiên cứu về các biến đổi bệnh lý trong tổ chức cơ

Trang 25

quan của cá bệnh (Đỗ Thị Hịa và CS., 2012), thì

nghiên cứu để phát hiện tác nhân chính gây ra bệnh

này là rất cần thiết, làm cơ sở cho phịng và trị bệnh

trong thực tế

II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1 Thu mẫu và số mẫu cá đã được thu

47 cá chim vây vàng bị bệnh đốm trắng nội tạng

và 10 con chưa bộc lộ các dấu hiệu của bệnh này,

kích thước từ 7-14cm đã được thu và chuyển về

phịng thí nghiệm trong các túi riêng biệt, cĩ sục khí

để đảm bảo các mẫu cá cịn sống khi đưa về phịng

thí nghiệm Ngồi ra, tình hình bệnh, hiện tượng cá

chết và một số yếu tố mơi trường (nhiệt độ, độ mặn)

và thời tiết đã được ghi chép tại hiện trường thu

mẫu

2 Các phương pháp nghiên cứu đã được

sử dụng

Từ các nghiên cứu ban đầu về sự biến đổi bệnh

lý bên trong mơ và tế bào của các nội quan ở cá

bệnh, Đỗ Thị Hịa (2012) đã cĩ nhận định rằng,

nghiên cứu vi khuẩn nên là nội dung cần thiết phải

làm khi muốn xác định tác nhân gây ra bệnh đốm

trắng nội tạng ở cá chim vây vàng Do vậy, các

phương pháp dùng để nghiên cứu vi khuẩn ở cá

được giới thiệu bởi Whitman et al (2004) đã được

lựa chọn thực hiện trong nghiên cứu này

2.1 Làm và nhuộm các tiêu bản phết mơ từ nội tạng

của cá bệnh và cá khỏe

Sát trùng bề mặt cơ thể cá nghiên cứu bằng

miếng bơng thấm cồn etylic 70%, kéo vơ trùng đã

được dùng để giải phẫu cá để quan sát các nội tạng

như mang, não, gan, lách, và thận của cá bệnh và

cá khỏe Dùng kéo và panh vơ trùng để cắt và kẹp

một miếng nhỏ mơ từ các tổ chức cĩ bộc lộ các u

hạt màu trắng, phết mơ cắt này trên mặt của tấm

làm sạch, trong một giọt nước muối sinh lý vơ trùng

(0,85%) để tạo một vết bơi và để tiêu bản khơ trong

khơng khí Các tiêu bản này đã được cố định trên

đèn cồn trước khi đưa vào nhuộm

Phương pháp nhuộm Gram: Các tiêu bản chứa

vùng mơ phết đã được làm khơ trong khơng khí

hoặc dưới ngọc lửa đèn cồn, được đưa vào nhuộm

Gram với thuốc nhuộm tím crystal (bao gồm: 2g tím

crystal hịa tan trong 20ml cồn etylic, sau đĩ trộn lẫn

với 80 ml dung dịch ammonium oxalate 1% trong

nước cất) và fuchsin, được cố định bằng dung dịch lugol, làm mất màu tím crystal bằng cồn-aceton Cuối cùng, các tiêu bản này được rửa dưới nước chảy nhẹ, để khơ tự nhiên và quan sát dưới kính hiển vi quang học ở độ phĩng đại 1000 lần trong dầu để phát hiện sự tồn tại của vi khuẩn trong mơ, quan sát hình dạng và màu sắc của vi khuẩn: vi khuẩn Gram (+) cĩ màu tím và vi khuẩn Gram (-)

cĩ màu hồng

Phương pháp nhuộm Ziehl - Neelsen: Nhuộm

Ziehl-Neelsen đã được sử dụng để nhận biết vi khuẩn kháng acid (acid fast) cĩ mặt trong tổ chức

mơ của cá bệnh Các bước tiến hành như sau: Dung dịch carbol fuchsin (0,03g fuchsin pha trong 10ml cịn etylic 95%, rồi bổ sung thêm 5g phenol và 95ml nước cất) đã được nhỏ tràn trên bề mặt của vết bơi trên tiêu bản phết mơ và hơ nĩng tiêu bản này trên ngọn lửa đèn cồn để nước bốc hơi trong

8 - 10 phút Tiếp theo, các tiêu bản này được rửa nhẹ nhàng với nước sạch trước khi làm mất màu bằng acid acetic 0,5% trong 20-30 giây Sau đĩ, tiêu bản phết được nhuộm bằng Methylene blue trong

60 giây, rồi rửa nhẹ bằng nước sạch, để cho khơ trong khơng khí Tiêu bản đã nhuộm Ziehl-Neelsen được quan sát dưới kính hiển vi quang học ở ở độ phĩng đại 1000x trong dầu, cơ chất của tổ chức vật chủ bắt màu xanh lam của methylene blue, các khuẩn lạc hay các đám tế bào của vi khuẩn kháng acid (acid fast) bắt màu hồng của Fuchsine

2.2 Phân lập vi khuẩn từ mơ của cá bệnh

Phương pháp phân lập vi khuẩn ở cá xương được trình bày bởi Whitman et al.(2004) đã được dùng để phân lập vi khuẩn từ cá cá chim vây vàng

bị bệnh đốm trắng nội ở Nha Trang

2.2.1 Chuẩn bị mơi trường dùng cho phân lập

vi khuẩn

Để phân lập vi khuẩn từ cá bệnh, một số mơi trường giàu dinh dưỡng khơng chọn lọc như: TSA (Tryp Soy Agar), NA (Nutrient Agar) và mơi trường chọn lọc Ogawa đã được dùng để phân lập các vi khuẩn kháng acid và mơi trường TCBS(Thiosulphate Citrate Bilesalt sucrose) dùng để phân lập vi khuẩn Vibrio Các mơi trường dinh dưỡng tổng hợp đã cĩ bán sẵn trên thị trường được pha chế như hướng dẫn của nhà sản xuất ghi trên nhãn mác chai đựng mơi trường Riêng mơi trường

Trang 26

Ogawa đã được pha chế bằng phường pháp thủ

công:

- Môi trường Ogawa: Có 3 thành phần phối trộn

nên môi trường Ogawa:

+ Dung dịch muối khoáng bao gồm có: 3g Kali -

6g NaCl hòa tan trong 300ml nước cất Dung dịch

này được hấp tiệt trùng bằng autoclave, ở nhiệt độ

121oC, trong thời gian 30 phút

+ Dung dịch malachite green, 2%: Hòa tan 2g

bột Malachite green với 100ml nước cất đã tiệt

trùng, đựng trong dụng cụ thủy tinh đã vô trùng

+ Trứng: Trứng gà mới đẻ (không quá 7 ngày

từ khi đẻ) được làm sạch bên ngoài bằng xà phòng,

rồi ngâm tiếp trong dung dịch xà phòng 30 phút, tiếp

theo rửa nước sạch và ngâm trong cồn etanol 70%

15 phút Trứng đã làm sạch, được làm vỡ bằng một

con dao vô trùng, rồi cho dịch trứng vào dụng cụ vô

trùng, trộn đều trứng bằng một dụng cụ khuấy đã

vô trùng

Trộn đều 300 ml dung dịch muối khoáng, 18ml

dung dịch malachite green 2%, 600 ml trứng gà và

18ml glycerol Điều chỉnh pH của hỗn hợp này là

6,8, sau đó phân phối môi trường này vào mỗi ống

nghiệm đã tiệt trùng (6 - 8ml/ống) Để ống nghiệm

môi trường trong các ống nghiệm này bằng cách

đặt vào tủ sấy ở nhiệt độ 800C - 850C trong thời gian

45 phút Khi môi trường đã rắn lại sẽ có màu xanh

lá chuối non

2.2.2 Phân lập vi khuẩn từ cá bệnh

Bệnh phẩm thu từ gan, thận, lách và mang của

cá bệnh được cấy trên các đĩa lồng chứa môi trường

phân lập như TSA (hoặc NA) và TCBS, ngoài ra còn

cấy lên phần mặt nghiêng của môi trường trứng

Ogawa trong các ống nghiệm Các đĩa lồng sau khi

hiện của các khuẩn lạc trên đĩa và ống nuôi cấy

2 lần/ngày

Các chủng thuần được tách ra từ các khuẩn lạc

rời trên môi trường TSA, NA và TCBS, đã được ủ

vi khuẩn tách ra từ môi trường Ogawwa đã được

ủ ở nhiệt độ 280C trong 7 - 10 ngày Khi các khuẩn

lạc xuất hiện trong các ống nghiệm chứa chủng

thuần, các tiêu bản ép tươi và nhuộm Gram, nhuộm

Ziehl-Neelsen đã được thực hiện để kiểm tra hình dạng, cách sắp xếp và cách bắt màu của vi khuẩn.Các phản ứng sinh hóa truyền thống đã được

sử dụng để xác định khả năng oxy hóa và lên men (OF), khả năng lên men đường lactose, glucose, sinh hơi và sinh H2S (KIA), khả năng di động, phản ứng catalase, oxidase, nitrat và khả năng lên men các loại đường như: Arabinose, sucrose, galactose, manose, maltose , làm cơ sở cho việc định danh

vi khuẩn theo hệ thống phân loại của Bergey được trình bày bởi Holt et al (1994)

2.3 Quan sát vi khuẩn là tác nhân gây bệnh dưới kính hiển vi điện tử

Để hỗ trợ cho việc định danh vi khuẩn là tác nhân gây bệnh, các mẫu mô thận, lách cá bệnh đã được cố định trong dung dịch Glutaraldehyde với tỷ

lệ về thể tích là 1/10 (mẫu/ dung dịch cố định), được giữ trong đá khô và gửi đi phân tích bằng kính hiển

vi điện tử truyền qua (TEM) ở Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, Hà Nội

2.4 Thí nghiệm cảm nhiễm trong điều kiện in vivo

để xác định tác nhân gây bệnh

Từ 2 chủng vi khuẩn đã phân lập được ở cá bệnh với tần xuất gặp cao (VKCVV01 và VKCVV02), các thí nghiệm cảm nhiễm vào cá khỏe đã được thực hiện ở trại thực nghiệm ở phường Vĩnh Hòa, Nha Trang vào các tháng cuối năm 2010

2.4.1 Các vật liệu dùng cho thí nghiệm

- Chủng vi khuẩn nghi ngờ VKCVV01: là trực

khuẩn ngắn (1-2 µm), tròn 2 đầu, Gram (-), phát triển nhầy rất mạnh xung quanh khuẩn lạc hình tròn trên môi trường dinh dưỡng tổng hợp TSA hoặc NA Loại vi khuẩn này cũng phân lập được trên TCBS

và đã gặp với tần số cao ở những con cá bị bệnh (30/47 con), đặc biệt khi bệnh phẩm lấy từ mang của cá bệnh

- Chủng vi khuẩn nghi ngờ VKCVV02: là trực

khuẩn dài (2 - 10µm), phân nhánh, có đốt, Gram (+), là vi khuẩn kháng acid (acid fast - có màu hồng khi nhuộm Ziehl-Neelsen), đã phân lập được trên

chọn lọc cho vi khuẩn kháng acid) Loại vi khuẩn này cũng đã gặp ở hầu hết (100% với n=47) các tiêu bản phết từ mô nội tạng (lách, gan, thận, mang,

cơ gần khối u cột sống) ở cá chim vây vàng bị bệnh đốm trắng nội tạng, nhưng đã không tìm thấy hoặc

Trang 27

phân lập được vi khuẩn này ở các con cá khỏe đã

đưa vào nghiên cứu (n=10 con)

Cá chim vây vàng (cĩ chiều dài: 8 - 10cm) dùng

cho thí nghiệm đã được mua từ trại thực nghiệm

của Khoa Nuơi trồng Thủy sản, Trường Đại học Nha

Trang Cá dùng cho thí nghiệm này hồn tồn khỏe

mạnh, khơng bộc lộ các dấu hiệu bệnh lý ở ngồi

và trong cơ thể cá 05 con cá đã được giải phẫu để

kiểm tra bệnh lý và tìm vị trí an tồn nhất để tiêm

huyền dịch vi khuẩn vào ổ bụng của cá thí nghiệm

Cá được đưa về cơ sở thực nghiệm 1 tuần trước khi

thí nghiệm bắt đầu

- Tạo huyền dịch vi khuẩn dùng để tiêm cho cá

Dùng một số khuẩn lạc mọc trên mặt nghiêng

của ống nghiệm chứa chủng thuần, đưa vào nước

muối sinh lý (0,85% NaCl) đã vơ trùng để tạo ra các

huyền dịch cĩ độ đục khác nhau So độ đục này với

các ống đục chuẩn của MacFaland để tạo ra các

ống chứa huyền dịch với các mật độ vi khuẩn khác

nhau theo mục đích của từng thí nghiệm Giữ các

ống chứa huyền dịch này ở nhiệt độ 40C cho đến khi

tiêm cho cá khỏe Ngồi ra, mật độ của các huyền

dịch này cũng đã được kiểm tra lại bằng phương

pháp gián tiếp

2.4.2 Thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn nghi ngờ vào

cá khỏe

Thí nghiệm 1: Cảm nhiễm 2 chủng VKCVV01

cá khỏe bằng cách tiêm vào xoang bụng của cá với

liều 0,1 ml/con, cá ở nghiệm thức đối chứng được

tiêm nước mối sinh lý vơ trùng (0,1ml/con) Thí

nghiệm được thực hiện trong các thùng nhựa 120 lít

(10 con/ thùng), lặp lại đồng thời 02 lần, sục khí liên

tục, thay nước đồng loạt 30% khi thấy đục Sức

khỏe của cá, các dấu hiệu bệnh lý, tỷ lệ cá chết và

một số yếu tố mơi trường như nhiệt độ, pH và độ

mặn đã được theo dõi hàng ngày Những con cá bị

bệnh khi hấp hối đã được thu để kiểm tra bệnh lý,

làm các tiêu bản phết nội tạng và phân lập vi khuẩn

như đã trình bày ở mục 2.1 và 2.2

Thí nghiệm 2: kết quả của thí nghiệm 1 đã xác

định chủng vi khuẩn VKCVV02, với liều 0,1ml huyền

pd (hiệu số hiệu chỉnh) = [L (tỷ lệ % cá chết thấp

nhất > 50%) – 50] / [L (tỷ lệ % cá chết thấp nhất > 50%) – H (tỷ lệ % cá chết cao nhất < 50%)].

1 Phát hiện vi khuẩn trên các tiêu bản phết mơ của cá bị bệnh

Các tiêu bản phết đã được làm từ mơ của mang, cơ dưới vùng da bị phồng rộp, gan, thận, lách

và não của cá chim vây vàng bị bệnh đốm trắng nội tạng, được nhuộm bằng 2 phương pháp: Gram và Ziehl-Neelsen Dưới kính hiển vi quang học với vật kính dầu ở độ phĩng đại 1000 lần, một loại vi khuẩn dạng que, phân nhánh, một số nhánh gẫy thành các đoạn ngắn, dài từ 2 - 10µm, Gram (+) đã được phát hiện rất phổ biến ở hầu hết các tiêu bản phết làm từ

cá bị bệnh, tuy nhiên đã khơng gặp loại vi khuẩn này trong các tiêu bản phết mơ làm từ cá khỏe Kết quả quan sát này thể hiện rằng, cá CVV bị bệnh đốm trắng nội tạng đã bị nhiễm vi khuẩn hệ thống (nhiễm tồn thân) Ngồi loại vi khuẩn như đã mơ tả ở trên,

ở một số tiêu bản phết cũng phát hiện một số ít trực khuẩn gram âm, cĩ màu hồng ở tiêu bản nhuộm Gram, ngắn 1 - 2µm nhiễm ở mơ mang và nội tạng của một số cá bệnh

Trang 28

Hình 1 Trực khuẩn mảnh, phân nhánh, có gẫy thành đốt,

Gram (+) và kháng acid (có mầu hồng của Fuchsin khi nhuộm

bằng phương pháp Ziehl-Neelsen) đã được phát hiện trên các

tiêu bản phết mô từ cá bị bệnh

- a,b,c và d: các tiêu bản phết mô của não, cơ ở bề mặt khối u, lách và thận

của cá bệnh nhuộm Gram:Vi khuẩn có màu tím, mô của cá có màu hồng

- e, f, g và h: các tiêu bản phết mô như đã trình bày ở trên nhưng được

nhuộm Ziehl-Neelsen: Mô cá có màu xanh của methylen blue, các tế bào

vi khuẩn có màu hồng của fuchin

2 Kết quả phân lập vi khuẩn từ cá bệnh

Bệnh phẩm lấy từ mang, gan, thận và lách

của cá bệnh đã được nuôi cấy phân lập trên các

môi trường dinh dưỡng: TSA, NA (có bổ sung

2% NaCL), môi trường Ogawa (có 2% NaCl) và

TCBS Sau 24h ủ mẫu ở nhiệt độ 280C, đã xuất hiện nhiều khuẩn lạc tròn, trắng và sinh nhày mọc trên môi trường TSA và NA, các khuẩn lạc tròn, lồi,

có màu vàng trên TCBS Kiểm tra trên các tiêu bản

ép, nhuộm Gram đã phát hiện các trực khuẩn ngắn, kích thước từ 1 - 2µm, Gram (-), các vi khuẩn này không bắt màu hồng khi nhuộm Ziehl-Neelsen và đã được ký hiệu là VKCVV01 (hình 2, d và e) Kết quả này đã chứng tỏ rằng, loại vi khuẩn dạng que dài từ

2 - 10µm, gram dương, kháng acid, phân nhánh và

bị gẫy thành đốt được quan sát thấy rất phổ biến trong mô nội tạng của cá bệnh như đã giới thiệu ở mục (III).1 đã không phát triển trên các môi trường

dinh dưỡng thông thường như NA, TSA hoặc TCBS.Tuy nhiên, trên mặt nghiêng các ống nghiệm chứa môi trường Ogawa, các khuẩn lạc màu trắng như phấn, khô và nhăn nheo trên bề mặt đã mọc khá dày sau 7 -10 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 26 - 280C.Quan sát cấu trúc tế bào của vi khuẩn này cho thấy

có dạng que mảnh, mọc hiếu khí trên bề mặt của môi trường nuôi cấy Từ các khuẩn lạc này, các tiêu bản nhuộm Gram và nhuộm Ziehl-Neelsen đã được thực hiện Dưới kính hiển vi quang học (phóng đại

400 - 1000 lần) đã xác định được rằng, đây là loại trực khuẩn, phân nhánh, một số nhánh bị gẫy để tạo nên các đoạn ngắn, Gram (+) và kháng acid,

là loại vi khuẩn đã gặp nhiều trong mô của cá bệnh

và chúng đã được phân lập thành công trên môi trường Ogawa Chủng vi khuẩn này được ký hiệu

là VKCVV02 và hoàn toàn không phân lập được từ các mẫu cá khỏe (hình 2, a,b và c)

Hình 2 Kết quả phân lập vi khuẩn từ cá CVV

bị bệnh

- VKCVV02: Khuẩn lạc (a), tế bào nhuộm

Ziehl-Neelsen(b) và nhuộm Gram (c) của chủng vi khuẩn

đã phân lập được trên môi trường Ogawa.

-VKCVV01: Khuẩn lạc (d) và tế bào nhuộm Gram (e) của

chủng vi khuẩn sinh nhầy phân lập được trên TSA, NA và

TCBS từ cá bệnh.

Trang 29

Bằng phương pháp vi sinh vật học truyền

thống, dựa vào các đặc điểm hình dạng, cấu tạo

và sinh hĩa, chủng vi khuẩn VKCVV01 đã được xác

định là lồi Vibrio alginolyticus, lồi này đã được

thơng báo là tác nhân gây bệnh ở tơm và cá biển

(Liu, C.H & CS, 2004) Chủng vi khuẩn VKCVV02

đã bộc lộ một số đặc điểm của giống vi khuẩn

Nocardia, thuộc nhĩm 22: nocadioform

Actinomycetes trong hệ thống phân loại của

Bergey như: là một trực khuẩn dài, mảnh, phân

nhánh, một số nhánh tồn tại tự do trong khơng khí

bị gẫy thành nhiều đoạn, Gram dương và kháng

acid, khuẩn lạc màu trắng như phấn, khơ, nhăn

nheo trên bề mặt, mọc khá chậm trên mơi trường

đặc thù Ogawa (cĩ 2% NaCl), phải cần từ 6 - 7 ngày

sau nuơi cấy ở nhiệt độ 26 - 280C mới phát hiện

được rõ các khuẩn lạc (hình 2,a là khuẩn lạc quan

sát ở ngày thứ 10 sau nuơi cấy) Một số đặc điểm

sinh hĩa của chủng VKCVV02 đã được xác định

như: Catalase (+), Cytochrom oxydase (-), O/F (-/-),

sinh hơi (-) Sinh H2S (-), khơng di động, Nitrate (+)

và ngồi glucose (+) cịn hàng loạt các loại đường

khác như: Lactose, Mannitol, Maltose, Mannose,

Galactose đều cho kết quả âm tính Các đặc điểm

sinh hĩa đã làm được cho thấy chủng VKCVV02

khá giống với lồi Nocardia seriolae đã được thơng

báo bởi Labrie et al (2008) Tuy nhiên, để phân loại

đến lồi của vi khuẩn này cần phải làm thêm một số

đặc điểm sinh hĩa khác như hàm xác định lượng

của acid mycolic, phản ứng hypoxanthine, phản

ứng testosterone, kháng Lysozyme… Song do điều

kiện phịng thí nghiệm cịn hạn chế, nên đã khơng

thực hiện được các phản ứng này Do vậy, chủng

VKCVV02 đã được định danh là lồi Nocardia sp

Mặc dù, đây là lần đầu tiên phân lập được giống

nhưng đã cĩ một số thơng báo về khả năng gây

bệnh nguy hiểm của giống vi khuẩn này ở các lồi

cá nuơi thuộc châu Á như: ở cá đuơi vàng - Seriola

quinqueradiala (Kudo et al.,1988; Itanoet al., 2002;

Shimahara et al., 2005), cá Larimichthys crocea

(Wang et al., 2005); cá lĩc- Ophiocephalus argus

(Wang et al., 2007), cá chim vây vàng - Trachinotus

blochii, cá hồng Lutjanus spp, cá rơ phi

-Oreochromis sp, cá mú- Epinephelus spp và các

loại cá khác (Labrie et al., 2008)

3 Cảm nhiễm chủng vi khuẩn đã phân lập được vào cá khỏe để xác định tác nhân gây bệnh

3.1 Cảm nhiễm 2 chủng VKCVV01 và VKCVV02 vào cá khỏe

mỗi chủng vi khuẩn nĩi trên đã được tiêm vào ổ bụng, ở vị trí trước vây bụng của cá khỏe (cỡ

8 - 10cm), cá ở nghiệm thức đối chứng được tiêm 0,1 ml nước muối sinh lý (0,85%) Thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện nhiệt độ 28 - 290C,

pH 7,8 - 8,0, độ mặn 30‰ Bố trí thí nghiệm đã

được trình bày ở mục 2.4.2 Thí nghiệm 1 và kết

quả thí nghiệm thể hiện ở hình 3

Hình 3 Tỷ lệ chết tích lũy (%) của cá trong thí nghiệm cảm nhiễm 1

-Kết quả thí nghiệm 1 đã xác định được chủng Nocardia sp là tác nhân gây ra bệnh này ở cá chim vây vàng

3.2 Cảm nhiễm VKCVV02 vào cá khỏe với các mật

độ khác nhau để xác định LD50

Để xác định liều vi khuẩn Nocardia sp gây

chết 50% (LD50) ở cá chim vây vàng, 0,1ml huyền

dịch của vi khuẩn Nocardia sp ở mật độ khác nhau

(NT1: 104; NT2: 105; NT3: 106 ; NT4: 107 và NT5: 108

tế bào/ ml) đã được tiêm vào ổ bụng của mỗi con cá khỏe, 0,1ml nước muối sinh lý vơ trùng được tiêm cho mỗi con cá ở nghiệm thức đối chứng (ĐC) theo

phương pháp đã được trình bày ở mục 2.4.2 Thí

nghiệm 2 Thí nghiệm đã được thực hiện trong điều

kiện: 24 - 260C, pH: 7,4 - 7.8 và độ mặn: 28 0‰, kết quả thể hiện ở hình 4 & 5

Trang 30

Hình 4 Tỷ lệ chết tích lũy (%) của cá khi bị cảm nhiễm chủng Nocardia sp ở các mật độ vi khuẩn khác nhau

- Mật độ vi khuẩn càng cao thì cá chết càng sớm và nhanh hơn: Cá ở các nghiệm thức NT2, NT3, NT4 và NT5 bắt đầu chết vào ngày thứ 5 sau cảm nhiễm

và chết 100% theo thứ tự vào các ngày thứ 12, 11, 10 và 8 Cá ở NT1, chỉ bắt đầu chết vào ngày thứ 7 và chết 100% vào ngày thứ 13.

- Chỉ số LD50% của chủng vi khuẩn này đã được xác định sau 8 ngày cảm nhiễm là: 1,78 x 104

Hình 5 Cá chim vây vàng bị bệnh thu từ thí nghiệm 1 & 2 đã bộc lộ các dấu hiệu đặc thù của bệnh đốm trắng nội tạng khi bị

cảm nhiễm vi khuẩn Nocardia sp.

a Cá khỏe trước khi cảm nhiễm và cá ở NT đối chứng; b Cá bệnh sau cảm nhiễm: bụng chướng to, có các nốt phồng nhỏ dưới da;

c Gan cá bệnh với các đốm trắng; d Vi khuẩn Nocardia sp đã phân lập được từ nội tạng cá bênh, có mầu hồng trên các tiêu bản nhuộm Ziehl-Neelsen

4 Quan sát vi khuẩn Nocardia sp ở nội tạng của cá chim vây vàng bị bệnh dưới kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM)

Dưới TEM, chủng VKCVV02 (Nocardia sp.) có dạng que mảnh, kích thước khoảng 2-10µ (a), phân nhánh

(c) và bị gẫy thành các đoạn ngắn (b) đã được phát hiện thấy rất phổ biến trong mô gan, lách, não, cơ gần khối

u cột sống và thận của cá chim vây vàng bị bệnh đốm trắng nội tạng (hình 6)

Hình 6 Hình dạng của vi khuẩn Nocardia sp dưới kính hiển vi điện tử truyền qua-TEM)

a Phóng đại ở 1500 lần; b Phóng đại ở 8000 lần; c Phóng đại ở 6000 lần.

gây ra bệnh đốm trắng nội tạng ở cá chim vây vàng

(Trachinotus blochii) nuôi trong lồng đặt tại Vũng

Ngán trên vịnh Nha Trang, Khánh Hòa Đây là lần đầu tiên phân lập được giống vi khuẩn này từ cá bệnh ở Việt Nam

IV KẾT LUẬN

Vi khuẩn Nocardia sp với các đặc điểm như:

là trực khuẩn mảnh, dài 2 - 10µm, phân nhánh,

một số nhánh gẫy thành các đoạn ngắn, Gram

dương, kháng acid đã được xác định là tác nhân

Trang 31

1 Đỗ Thị Hịa, Nguyễn Thị Thùy Giang và Nguyễn Xuân Nguyên (2012) Dấu hiệu bệnh lý và biến đổi mơ bệnh học của bệnh

đốm trắng nội tạng ở cá chim vây vàng (Trachinotus blochii) nuơi ở Nha Trang Tạp chí Khoa học - Cơng nghệ Thủy sản, số

4 Kudo, T., Hatai, K and A Seino (1988) A Nocardia seriolae sp nov causing nocardiosis of cultured ﬁ sh International

Journal of Systematic Bacteriology 38, p.173–178

5 Labrie, L., Ng, J., Tan, Z., Komar, C., Ho, E and L Grisez (2008) Nocardial infections in ﬁ sh: an emerging problem in both freshwater and marine aquaculture systems in Asia, p 297-312

6 Liu, C.H., Cheng, W., Hsu, J.P and J.C Chen (2004) Vibrio algynolyticus infection in the white shrimp- Litopenaeus

vannamei conﬁ rmed by polymerase chain reaction-PCR and 16s rDNA sequancy Dis Aquat Org, vol 61, p.169-174

7 Shimahara, Y., Yasuda, H., Nakamura, A and T Itami (2005) Detection of antibody responses against Nocardia seriolae by enzyme-linked immunosorbent assay and a preliminary vaccine trial in yellowtail Seriolae quinqueradiata Bulletin of The

European Association of Fish Pathologists, 25, p.270-275

8 Wang , G.L., Xu, Y.J., Jin S J.L and S P Zhu (2007) Nocardiosis in snakehead, Ophiocephalus argus Cantor Aquaculture,

Trang 32

NGHIÊN CỨU BẢO QUẢN TINH TRÙNG CÁ CHÉP

(Cyprinus carpio Linnaeus, 1758) TRONG NITƠ LỎNG

STUDY ON SPERM CRYOPRESERVATION OF COMMON CARP

(Cyprinus carpio Linnaeus, 1758) IN LIQUID NITROGEN

Lê Minh Hồng1, Võ Thị Thu Hiền2

Ngày nhận bài: 13/8 /2012; Ngày phản biện thơng qua: 31/8/2012; Ngày duyệt đăng: 15/12/2012

TĨM TẮT

Mục đích của nghiên cứu này là tìm ra chất bảo quản, chất chống đơng và quy trình làm lạnh thích hợp nhất cho việc bảo quản tinh trùng cá chép Cyprinus carpio trong nitơ lỏng Tinh trùng đã được pha lỗng bởi một trong các chất bảo quản CCSE-1, CCSE-2, CCSE-3 hoặc CCSE-4 (CCSE = common carp sperm extender) và được bổ sung một trong các chất chống đơng: 10% DMSO (dimethyl sulfoxide), Glycerol hoặc Methanol ở tỉ lệ 1:3 (tinh dịch:dung dịch pha lỗng), sau đĩ được bảo quản theo một trong ba quy trình: (1) các cọng rạ được đưa xuống nhiệt độ -20 0 C trong 3 phút rồi chuyển xuống -76 0 C trong 3 phút rồi được bảo quản trong nitơ lỏng -196 0 C; (2) các cọng rạ được đưa xuống nhiệt độ -76 0 C trong

6 phút rồi được bảo quản trong nitơ lỏng -196 0 C; (3) các cọng rạ được bảo quản ngay trong nitơ lỏng -196 0 C Sau 3 ngày,

7 ngày, 21 ngày thí nghiệm, tinh trùng được rã đơng ở nước ấm (37 0 C) khoảng 60 giây rồi được kiểm tra hoạt lực Kết quả thí nghiệm cho thấy, tinh trùng ở nghiệm thức sử dụng chất bảo quản CCSE-2, chất chống đơng là DMSO ở nồng độ 10%

và quy trình làm lạnh (2) cho hoạt lực và thời gian hoạt lực tinh trùng tốt nhất, và khơng cĩ sự ảnh hưởng của thời gian lên kết quả bảo quản tinh Kết quả thí nghiệm này gĩp phần cung cấp thơng tin về bảo quản lạnh tinh trùng cá chép trong nitơ lỏng

Từ khĩa: Cá chép, Cyprinus carpio, Chất bảo quản, Chất chống đơng

ABSTRACT

The aim of this study was to ﬁ nd the optimal extender, cryoprotectant and cryoprocedure for cryopreservation of common carp Cyprinus carpio Sperm was diluted with extenders (common carp sperm extender) CCSE-1, CCSE-2, CCSE-3 or CCSE-4 and 10% DMSO (dimethyl sulfoxide), Glycerol or Methanol as cryoprotectant at ratio of 1:3 (sperm:diluent), and then cryopreserved following three procedures (1) put straws at temperature of -20 0 C at 3 minutes, put straws into vapor liquid nitrogen (-76 0 C) at 6 minutes and put straws into liquid nitrogen (-196 0 C); (2) put straws into vapor liquid nitrogen (-76 0 C) at 6 minutes and put straws into liquid nitrogen (-196 0 C) or (3) directly put straws into liquid nitrogen (-196 0 C) Cryopreserved spermatozoa were thawed in water bath (37 0 C) for 60 seconds and checked their motility after cryopreserving in liquid nitrogen 3, 7 or 21 days The results showed that the best sperm motility when sperm was diluted with CCSE-2 as extender and added 10%DMSO as cryoprotectant and cryopreserved at the second proce- dure There is no effect of storage time on cryopreserved sperm in this study These results supply more information about cryopreservation of carp sperm.

Keywords: Carp, Cyprinus carpio, Extender, Cryoprotectant

1 TS Lê Minh Hồng: Khoa Nuơi trồng Thủy sản - Trường Đại học Nha Trang

2 Võ Thị Thu Hiền: Trung tâm Khuyến nơng - Khuyến ngư Sơng Cầu - Phú Yên

Trang 33

Bảo quản tinh trùng cá trong nitơ lỏng là phương

pháp đã và đang được nghiên cứu rộng rãi trên thế

giới bởi lợi ích của chúng trong cơng tác chọn giống

và bảo tồn nguồn gen như: bảo vệ đàn giống bị mất

đi do thảm họa tự nhiên, bùng nổ dịch bệnh xảy ra

đột ngột, hoặc tai nạn như tràn dầu; cung cấp ổn

định tinh trùng tốt nhất cho các trại sản xuất giống

và các thí nghiệm ở phịng thí nghiệm, dễ dàng vận

chuyển tinh trùng bảo quản giữa các trại sản xuất

giống với nhau…[1]

Cá Chép (Cyprinus carpio) là một trong những

lồi cĩ giá trị kinh tế quan trọng được nuơi ở khắp

Châu Á và Châu Âu Sản lượng cá được nuơi tồn

cầu chiếm khoảng 6,14% (3.172.488 tấn) tổng sản

lượng nuơi trồng thủy sản trên tồn thế giới [10]

Ở Việt Nam, cá Chép là đối tượng nuơi cĩ giá trị

thương phẩm, thịt thơm ngon và được nuơi khá phổ

biến [2] Cho đến nay, trên thế giới đã cĩ nhiều cơng

trình nghiên cứu bảo quản tinh cá chép Cyprinus

carpio được cơng bố rộng rãi với nhiều phương

pháp bảo quản khác nhau Tuy nhiên, hiện nay do

quá trình di nhập cá chép giữa các vùng trên cả

nước và di nhập cá chép từ nước ngồi dẫn tới quá

trình lai tạp xảy ra nhiều làm cho biến đổi nguồn

gen, nên việc lưu trữ và bảo tồn giống thuần phục

vụ cơng tác lai tạo, chọn giống là yêu cầu đặt ra của

ngành thủy sản Bên cạnh đĩ, do đặc điểm sinh lý,

hĩa và điều kiện nuơi cá chép ở mỗi vùng khác nhau

là khác nhau nên việc tìm ra quy trình bảo quản tinh

thích hợp cho lồi cá trong điều kiện cụ thể là rất

cần thiết [18]

Nghiên cứu này được thực hiện nhằm tìm ra

dung dịch bảo quản và chất chống đơng phù hợp

với việc bảo quản tinh trùng cá chép (Cyprinus

carpio) trong nitơ lỏng tại Việt Nam; gĩp phần bổ

sung dữ liệu về quy trình kỹ thuật bảo quản tinh

trùng cá chép Cyprinus carpio trong nitơ lỏng tại

Việt Nam; lưu trữ nguồn gen và bảo tồn giống thuần

phục vụ cho cơng tác lai tạo

II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1 Chọn cá đực, vuốt tinh và đánh giá hoạt lực

ban đầu

Thí nghiệm được tiến hành từ tháng 3 đến tháng

5 năm 2012 tại Phịng thí nghiệm Sinh học nghề cá

- Trường Đại học Nha Trang trên đối tượng cá chép

Cyprinus carpio Cá chép đực (chiều dài: 26,6 ± 1,4cm;

khối lượng: 685,5 ± 17,1g) đã được đưa vào nghiên

cứu thành thục tốt, màu sắc tươi sáng, hoạt động tốt và khơng bị bệnh hoặc xây xát và dị tật Tinh dịch

đã được vuốt bằng cách dùng tay ấn nhẹ bụng cá

từ từ cho tinh dịch chảy vào eppendof tube 1,5ml

đã được vơ trùng Trong khi vuốt tinh, phân, nước, máu và nước tiểu của cá đã được tránh để khơng

bị lẫn vào tinh trùng Tinh dịch thu xong đã được giữ lạnh trên đá để dùng cho việc tiến hành các thí nghiệm Trước khi tiến hành thí nghiệm, tinh trùng

đã được đánh giá hoạt lực ban đầu Hoạt lực tinh trùng (HLTT) ban đầu được đánh giá bằng cách pha lỗng tinh dịch với nước cất ở tỷ lệ 1:100 Sau đĩ tinh trùng pha lỗng ngay lập tức được quan sát trên kính hiển vi với độ phĩng đại 400 lần HLTT được tính bằng cách quan sát tổng số tinh trùng hoạt động so với tổng số tinh trùng quan sát Thời gian hoạt lực tinh trùng được tính từ lúc pha lỗng cho đến khi 100% tinh trùng khơng hoạt động Tinh trùng cĩ HLTT ban đầu lớn hơn 90% thì được sử dụng cho các thí nghiệm

2 Quy trình bảo quản tinh trùng cá chép trong nitơ lỏng

Tinh trùng được bảo quản trong chất bảo quản

cĩ bổ sung thêm chất chống đơng ở tỉ lệ 1:3 (tinh dịch: dung dịch pha lỗng) Tinh trùng pha lỗng được hút vào các cọng rạ cĩ thể tích 0,25ml Đầu cịn lại của cọng rạ được hàn kín và tiến hành bảo quản theo qui trình hai bước: (1) hạ nhiệt từ nhiệt

(trên đá khơ) xuống nhiệt độ -760C (cách bề mặt hơi nitơ lỏng 5cm) trong 6 phút, (2) từ -760C đưa xuống bảo quản trong nitơ lỏng (-1960C) Sau khi bảo quản trong nitơ lỏng trong một khoảng thời gian thì các

khoảng 60 giây Sau đĩ lấy tinh bảo quản ra để tiến hành kiểm tra hoạt lực HLTT bảo quản được đánh giá theo phương pháp nêu ở trên Việc xác định HLTT ở tất cả các thí nghiệm đều được lặp lại 3 lần

3 Thí nghiệm về ảnh hưởng của chất bảo quản

Các chất bảo quản được sử dụng là: Common

carp sperm extender (CCSE): CCSE-1, CCSE-2, CCSE-3 và CCSE-4 Thành phần của các chất bảo quản được trình bày ở Bảng 1 Để thực hiện thí nghiệm tìm ra chất bảo quản tốt nhất cho bảo quản tinh trùng cá chép trong nitơ lỏng, tinh trùng được pha lỗng trong các chất bảo quản nêu ở trên và

bổ sung 10% DMSO như là chất chống đơng Cách bảo quản được thực hiện theo qui trình bảo quản được nêu ở mục 2, phần II

Trang 34

4 Thí nghiệm về ảnh hưởng của chất chống đông

Tinh trùng được pha loãng trong CCSE-2 và

bổ sung 3 chất chống đông là DMSO, Glycerol và

Methanol, nồng độ các chất chống đông là 10%

Cách bảo quản được thực hiện theo qui trình bảo

quản được nêu ở mục 2, phần II

5 Thí nghiệm về ảnh hưởng của quy trình

làm lạnh

Tinh trùng được pha loãng trong CCSE-2 và bổ

sung chất chống đông là 10% DMSO và thí nghiệm

được tiến hành với 3 quy trình làm lạnh sau đây:

Quy trình 1: Đưa các cọng rạ vào tủ lạnh ở ngăn

thùng xốp có chứa nitơ, cách bề mặt nitơ 5cm

(-760C) 3 phút, rồi đưa vào bình nitơ lỏng (-1960C)

có thể tích 3 lít để bảo quản Quy trình 2: Đưa các

cọng rạ vào thùng xốp có chứa nitơ, cách bề mặt

nitơ 5cm (-760C) trong 6 phút rồi đưa vào bình nitơ

lỏng (-196°C) có thể tích 3 lít để bảo quản Quy trình

để bảo quản Cách bảo quản được thực hiện theo

qui trình bảo quản được nêu ở mục 2, phần II

6 Ảnh hưởng của thời gian bảo quản lên kết quả

bảo quản tinh

Thí nghiệm được tiến hành bằng cách sử dụng

chất bảo quản tốt nhất CCSE-2, chất chống đông

thích hợp nhất DMSO với nồng độ 10% và quy

trình làm lạnh tốt nhất (quy trình làm lạnh 2 bước)

Các bước bảo quản cũng tiến hành tương tự như

nêu ở trên Sau khi bảo quản 3 ngày, 7 ngày và

21 ngày tiến hành rã đông và so sánh kết quả chấtlượng tinh

1 Ảnh hưởng của chất bảo quản

Ảnh hưởng của chất bảo quản lên bảo quản tinh trùng cá chép trong nitơ lỏng được thể hiện qua hình 1 Thông qua hình này, HLTT và thời gian hoạt lực (TGHL) bảo quản ở các chất bảo quản khác nhau là khác nhau (P<0,05) HLTT và TGHL bảo quản trong chất bảo quản CCSE-2 là tốt nhất, giá trị của chúng lần lượt là 83,0±1,7% và 41,0±1,7 giây Việc lựa chọn chất bảo quản thích hợp là chìa khóa trong sự thành công của bảo quản tinh trùng

cá dài hạn trong nitơ lỏng Thí nghiệm này đã sử dụng 4 chất CCSE-1, CCSE-2, CCSE-3 và CCSE-4 làm chất bảo quản cho tinh trùng cá chép trong nitơ lỏng CCSE-2 cho kết quả bảo quản tốt nhất Năm

2010, Irawan và ctv [13] đã sử dụng 6 chất bảo quản CCSE-1, CCSE-2, CCSE-3, CCSE-4, CCSE-5, CCSE-6 làm chất bảo quản tinh trùng cá chép, kết quả nghiên cứu trên cá chép với HLTT của CCSE-2-10% DMSO là 94,5±3,3% Kết quả thí nghiệm này cao hơn so với kết quả nghiên cứu hiện tại Bởi vì,

Bảng 1 Thành phần các chất bảo quản được sử dụng cho nghiên cứu

CCSE: common carp sperm extender

Trang 35

Hình 1 Ảnh hưởn g của chất bảo quản

lên kết quả bảo quản tinh

Tinh trùng được bảo quản ở chất bảo quản CCSE (common carp sperm

extender) khác nhau cĩ bổ sung 10% DMSO (Dymethy sunfoxide) như là

chất chống đơng Các chữ cái (in hoa cho HLTT, in thường cho TGHL)

khác nhau thể hiện sự sai khác cĩ ý nghĩa thống kê (P<0,05).

Hình 2 Ảnh hưởng của chất chống đơng lên kết quả bảo quản tinh

Tinh trùng được bảo quản trong ở bảo quản CCSE-2 cĩ bổ sung 10% chất chống đơng khác nhau như là DMSO, GLY (Glycerol) hoặc MET (Methanol) Các chữ cái (in hoa cho HLTT, in thường cho TGHL) khác nhau thể hiện sự sai khác cĩ ý nghĩa thống kê (P<0,05).

thành phần của các chất bảo quản trong nghiên cứu

này cĩ sự thay đổi chỉnh sửa khác đi Do thành phần

khác nhau nên kết quả bảo quản cũng khác nhau

Bên cạnh đĩ, một trong bốn chất bảo quản trong thí

nghiệm này là CCSE-1 trước đĩ được Hatipoglu và

Akcay [11] sử dụng trên cá Hồi, HLTT sau 24 và 48

giờ bảo quản lần lượt là 44,0 ± 4,9% và 34,0 ± 2,4%

So sánh kết quả thì kết quả bảo quản của tác giả

Hatipoglu và Akcay [11] thấp hơn kết quả bảo quản

trong nghiên cứu này (63,3 ± 4,9%) Qua đĩ cho

thấy, việc lựa chọn các chất bảo quản cho từng lồi cá trong từng điều kiện thí nghiệm là hết sứcquan trọng

2 Ảnh hưởng của chất chống đơng

Việc lựa chọn các chất đơng thích hợp cũng

cĩ nghĩa quan trọng trong kỹ thuật bảo quản tinh trùng cá trong nitơ lỏng Sự ảnh hưởng của các chất chống đơng lên kết quả bảo quản tinh trùng cá chép trong nitơ lỏng được thể hiện ở hình 2

HLTT và TGHL khi sử dụng các chất chống đơng

khác nhau là khác nhau (P<0,05) DMSO được sử

dụng như là chất chống đơng với nồng độ 10% cho

HLTT và TGHL (83,3 ± 1,5% và 45,3 ± 1,5 giây) tốt

hơn so với Glycerol (24,7 ± 0,6% và 4,7 ± 0,6 giây)

và Methanol (36,7 ± 7,7% và 20,0 ± 0,0 giây)

Tương tự như chất bảo quản, việc lựa chọn chất

chống đơng cĩ vai trị quan trọng trong bảo quản

tinh trùng cá dài hạn trong nitơ lỏng Các chất chống

đơng được cho là cần thiết để bảo vệ các tế bào

tinh trùng khơng bị sốc bởi chương trình làm lạnh

và rã đơng và ngăn ngừa sự mất nước của tế bào

[7] Tuy nhiên, chúng cĩ nhược điểm đĩ là sự tạo ra

độc tính bởi sự biến tính protein khi thay đổi nhiệt

độ Chen và Tian [8] đã cơng bố rằng độc tính của

Methanol thấp nhất trong các chất chống đơng Bên

cạnh đĩ, việc sử dụng Glycerol cho bảo quản tinh

cá chép là khơng thích hợp vì HLTT và TGHL của

tinh trùng khi sử dụng Glycerol làm chất chống đơng

cho nghiên cứu này thấp [4] Vì tinh trùng là những

tế bào rất nhạy cảm và dễ bị ảnh hưởng bởi dung

dịch pha lỗng như là chất bảo quản và chất chống

đơng nên các nghiên cứu về chất bảo quản và chất

chống đơng trong nghiên cứu bảo quản tinh trùng cá

trong thời gian dài được cho là quan trọng DMSO

là chất được sử dụng phổ biến trong bảo quản dài

hạn tinh trùng nhiều lồi cá như cá bơn, cá chẽm,

cá mú [15] Nồng độ DMSO thường được sử dụng

là 10% [15] Tuy nhiên, việc sử dụng Methanol 10% được cho là cĩ hiệu quả hơn so với DMSO 10% trên tinh trùng cá Hồi [15] Horváth và ctv [12], Aham-mad và ctv [5] đã cơng bố việc kết hợp giữa đường

- chất bảo quản và chất chống đơng là Methanol cho bảo quản tinh trùng cá chép cho kết quả bảo quản tốt hơn là sử dụng chất chống đơng DMSO, trong 3 loại đường glucose, fructose và sucrose thì glucose kết hợp với Methanol cho kết quả bảo quản tốt nhất với phần trăm hoạt lực là 74,0 ± 15% [12] Như vậy trong cùng một lồi cá, việc kết hợp chất bảo quản và chất chống đơng khác nhau cũng đưa

ra kết quả khác nhau Nhiều nghiên cứu thành cơng

về bảo quản tinh trùng cá chép đã được cơng bố bằng cách sử dụng kết hợp dung dịch nước muối hoặc đường với Methanol [12] hoặc DMSO [14], [16], [17] HLTT (94,5 ± 3,3%, 67,0 ± 4,0%) và TGHL (97,0 ± 20,8 giây, 98,0 ± 14,0 giây) của tinh trùng cá chép khi bảo quản trong dung dịch CCSE-2-DMSO,CCSE-4-DMSO đã được cơng bố bởi Irawan và ctv [13] So sánh kết quả thí nghiệm này với kết quả của Irawan và ctv [13] thì cĩ thấp hơn, tuy nhiên kết quả như vậy là khá tương đồng

Trang 36

3 Ảnh hưởng của quy trình làm lạnh

Kết quả phân tích thống kê cho thấy, các quy trình làm lạnh khác nhau thì cho kết quả bảo quản tinh khác nhau (P<0,05)

Từ hình 3 cho thấy quy trình làm lạnh 2 bước cho kết quả bảo quản tinh tốt nhất với HLTT và TGHL lần lượt là 83,3 ± 2,9% và 43,7 ± 1,2 giây

Quy trình làm lạnh bằng cách hạ nhiệt độ đột ngột (cho thẳng xuống nitơ lỏng) cho kết quả bảo quản tinh thấp nhất 7,7 ± 1,2% và 4,3 ± 0,6 giây

Năm 2003, Horvath và ctv [12] đã công bố kết quả bảo quản tinh cá chép trong nitơ lỏng bằng cách sử dụng đường làm chất bảo quản vàMethanol làm chất chống đông, sử dụng quy trình đặt các cọng rạ cách bề mặt hơi nitơ 3cm trong 3 phút sau đó đưa xuống bảo quản trong nitơ lỏng cho kết quả bảo quản tốt nhất

Trước đó Irawan và ctv [13] đã công bố có sự ảnh hưởng của các quy trình làm lạnh lên kết quả bảo quản tinh trong nitơ lỏng.Tác giả đã sử dụng 3 quy trình làm lạnh: đặt các cọng rạ cách bề mặt hơi nitơ lần lượt là 2cm, 4cm và 6cm Kết quả thu được quy trình đặt các cọng rạ cách bề mặt hơi nitơ ở 2cm trong 10 phút cho HLTT cao nhất 91,7 ± 7,8% Kết quả quy trình làm lạnh 2 bước cho kết quả tốt nhất - phù hợp với trích dẫn Cloud và Patton [9]

4 Ảnh hưởng của thời gian bảo quản lên kết quả bảo quản tinh

HLTT và TGHL tinh trùng sau 3 ngày, 7 ngày

và 21 ngày bảo quản trong nitơ lỏng lần lượt là:82,0 ± 2,0% và 45,3 ± 0,6 giây, 80,7 ± 1,2% và 45,0 ± 0,0giây, và 79,3 ± 0,6% và 44,7 ± 0,6 giây (Hình 4)

Hình 3 Ảnh hưởng của quy trình làm lạnh lên kết quả bảo quản tinh

Tinh trùng được bảo quản trong chất bảo quản CCSE-2 có bổ sung 10%

DMSO như là chất chống đông và bảo quản ở 3 qui trình khác nhau Các chữ cái (in hoa cho HLTT, in thường cho TGHL) khác nhau thể hiện sự sai khác có ý nghĩa thống kê (P<0,05).

Hình 4 Ảnh hưởng của thời gian bảo quản lên kết quả bảo quản tinh

Tinh trùng được bảo quản trong chất bảo quản CCSE-2 có bổ sung 10% DMSO và bảo quản ở thời gian khác nhau Các chữ cái (in hoa cho HLTT, in thường cho TGHL) giống nhau thể hiện sự sai khác không có ý nghĩa thống kê (P>0,05).

c

a b

C

A B

20 30 40 50 60

A A

20 30 40 50 60

Hoạt lực tinh trùng (HLTT) Thời gian hoạt lực (TGHL)

Qua hình 4 cho thấy chất lượng tinh suy giảm theo thời gian bảo quản, tuy nhiên theo phân tích

số liệu trong ANOVA với độ tin cậy 95% cho thấy không có sự ảnh hưởng của thời đến chất lượng tinh bảo quản Do vậy sự giảm chất lượng tinh theo thời gian ở thí nghiệm này là không có ý nghĩa thống

kê Kết quả này phù hợp với nhiều tác giả nghiên cứu trước đó của nhiều tác giả như Irawan và ctv [13]; Le và ctv [15], Nguyễn Minh Thành và ctv [3]

Nguyễn Minh Thành bảo quản tinh cá Tra trong nitơ lỏng và đi đến kết luận “thời gian bảo quản kéo dài có thể làm giảm sức sống của tinh bảo quản”, kết quả tỷ lệ thụ tinh sau 7 ngày và 3 tháng khi sử dụng dung dịch Hanks không canxi và dung dịch Hanks là 54,0-66,0% và 36,3 - 37,6% [3] Trước đó, Ashwood-Smith [6], Whittingham [20] và Stoss and Holtz [19] đã ước tính thời gian lưu trữ tinh trùng trong nitơ lỏng là từ 200 đến 32.000 năm Gần đây nhất, Le và ctv [15] đã công bố kết quả tỷ lệ thụ tinh của tinh trùng cá Đù vàng sau 1 tuần và 1 năm bảo

quản trong nitơ lỏng lần lượt là 45,7 ± 3,2% và 37,5

± 4,4% Như vậy trong nghiên cứu này thì thời gian bảo quản không ảnh hưởng đến kết quả bảo quản tinh trùng dài hạn trong nitơ lỏng

IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

1 Kết luận

HLTT (83,0 ± 1,7%) và TGHL (41,0 ± 1,5 giây) của tinh trùng bảo quản khi sử dụng chất bảo quản

là CCSE-2 và bổ sung 10% DMSO như là chất chống đông cho kết quả tốt nhất Bảo quản ở các chất bảo quản khác cho kết quả phần trăm hoạt lực

và thời gian hoạt lực thấp hơn

Sử dụng chất bảo quản là CCSE-2 với bổ sung 10% DMSO như là chất chống đông cho HLTT(83,3 ± 1,5%) và TGHL (45,3 ± 1,5 giây) tinh trùng bảo quản tốt nhất so với việc bổ sung 10% Glycerol hoặc 10% Methanol

HLTT (83,3±2,9%) và TGHL (43,7 ± 1,2 giây) của tinh trùng bảo quản ở quy trình làm lạnh hạ

Trang 37

nhiệt 2 bước ((1) hạ nhiệt từ nhiệt độ bảo quản

thơng thường của tinh cá chép là 40C (trên đá

lỏng 5cm) trong 6 phút, (2) từ -760C đưa xuống

bảo quản trong nitơ lỏng (-1960C)) cho kết quả bảo

quản tinh tốt nhất

HLTT và TGHL thơng qua thời gian bảo quản 3

ngày (82,0 ± 2,0% và 45,3 ± 0,6 giây), 7 ngày (80,7

Vì vậy, phịng thí nghiệm cần phải trang bị thêm thiết

bị để cĩ thể đánh giá hoạt lực chính xác hơn, chẳng hạn như CASA (computer aided for sperm analysis) Ngồi ra, những nghiên cứu về chất bảo quản tinh trùng cá chép cho kết quả tốt hơn cần phải được nghiêncứu Thí nghiệm tinh trùng sau khi bảo quản nên được tiến hành cho thụ tinh, ấp nở để đánh giá được chất lượng tinh tốt thay vì chỉ dùng đánh giá hoạt lực

Tiếng Việt

1 Lê Minh Hồng (2012) Chất bảo quản và chất chống đơng cho bảo quản lạnh tinh trùng cá Tạp chí Khoa học - Cơng nghệ

Thủy sản, Trường Đại học Nha Trang, số 2-2012

2 Võ Ngọc Thám (2011) Bài giảng sản xuất giống cá nước ngọt Trường Đại học Nha Trang.

3 Nguyễn Minh Thành (2003) Bảo quản tinh cá Tra Pangasianodon hypophthalmus dài hạn bằng ni tơ lỏng Viện Nghiên cứu

Nuơi trồng Thủy sản II (RIA2)

4 Nguyễn Văn Tính (2006) Báo cáo tốt nghiệp Nghiên cứu bảo quản tinh trùng cá Trê đen (Clarias fuscus, Lacepede 1803) trong tủ lạnh và ni tơ lỏng Trường Đại học Nha Trang.

Tiếng Anh

5 Ahammad, M.M., Bhattacharyya, D and Jana, B.B (2003) Hatching of common carp (Cyprinus carpio L.) embryos stored

at 4 and -2oC in different concentrations of methanol and sucrose Theriogenology, 60: p 1409 - 1422.

6 Ashwood-Smith, M.J (1980) Low temperature preservation of cells, tissues and Organs, in Low Temper ature Preservation

in Medicine and Biology, Ashwood-Smith, M.J.a.F., J., Eds, Editor Pitman Medical Ltd., Tunbridge Wells, Kent.

7 Chao, N.H and Liao, I.C (2001) Cryop reservation of finfish and shellfish gametes and embryos Aquaculture, 197: p 161-189.

8 Chen, S.L and Tian, Y.S (2005) Cryopreservation of ﬂounder Paralichthys olivaceus embryos by vitriﬁcation.

Therio-ge nology, 63: p 1207-1219

9 Cloud, J and Patton, S (2009) Basic principles of ﬁ sh spermatozoa cryopreservation, in Methods in Reproductive

Aquaculture Marine and Freshwater Species, Cabrita., E., Robles., V and Herrá ez., P., Editors CRC Press Taylor & Francis

Group p 237 - 249

10 FAO (2008) Yearbook,2008, in FisheryandAquacultureStatistics,2006.Food and Agriculture Organization of the United

Nations,Rome

11 Hatipoglu, T and Ackay, A (2010) Fertilizing ability of short - term preserved spermatozoa Abant trout (Salmon trutta

abanticus T, 1954) Ankara Univ Vet Fak Derg, 57: p 33 - 38.

12 Horváth, A., Miskolczi, E and Urbányi, B (2003) Cryopreservation of common carp sperm Aquatic Living Resources,

16: p 457 - 460

13 Irawan, H., Vuthiphandchai, V and Nimrat, S (2010) The effect of extenders, cryoprotectants and cryopreservation methods

on common carp (Cyprinus carpio) sperm Animal Reproduction Science, 122: p 236-243.

14 Kurokura, H., Hirano, R., Tomit a, M and Iwahashi, M (1984) Cryopreservation of carp sperm Aquaculture, 37:

p 267 - 273

15 Le, M.H., Lim, H.K., Min, B.H., Park , M.W and Chang, Y.J (2011) Semen cryopreservation of yellow croaker Larimichthys

polyactis Rev Fish Biol Fisheries, 21: p 789 - 797.

16 Linhart, O., Rodinaa, M and Cosson, J (2000 ) Cryopreservation of Sperm in Common Carp Cyprinus carpio: Sperm Motility and Hatching Success of Embryos Cryobiology, 41: p 241 - 250.

17 Magyary, I., Urbanyi, B and Horvath, L (1996) Cryopreservation of common carp (Cyprinuscarpio L.) sperm II.Optimal conditions for fertilization J.Appl.Ich-thyol, 12: p 117-119.

18 McAndrew, B.J (2000) E volution, phylogenetic relationships and biogeography, in Tilapias: Biology and Exploitation,

Beveridge, M.C.M and McAndrew, B.J , Eds., Editors Kluwer Academic, Dordrecht p 1 - 32

19 Stoss, J and Holtz, W (1981) Cryopreservation of rainbow trout (Salmo gairdneri) sperm and Effect of thawing soluti on, sperm density and interval between thawing and insemination Aquaculture, 22: p 97-104.

20 Whittingham, D.G (1980) Principles of embryo preservation, in Low Temperature Preservation in Medicine and Biology,

Ashwood-Smith, M.J and Farrant, J., Editors Pitman Medical Lts Tunbrdge Wells, Kent

Trang 38

PHÂN TÍCH HIỆU QUẢ KỸ THUẬT CHO CÁC TRẠI NUƠI CÁ TRA

THƯƠNG PHẨM TẠI ĐỒNG BẰNG SƠNG CỬU LONG

TECHNICAL EFFICIENCY ANALYSIS FOR TRA CATFISH AQUACULTURE

FARMS IN MEKONG RIVER DELTA

Đặng Hồng Xuân Huy1, Nguyễn Văn Ngọc2

Ngày nhận bài: 19/4/2012; Ngà y phản biện thơng qua: 03/10/2012; Ngày duyệt đăng: 15/12/2012

TĨM TẲT

Nghiên cứu phân tích hiệu quả kỹ thuật cho các trại nuơi cá Tra thương phẩm tại Đồng bằng sơng Cửu Long bằng phương pháp phân tích màng dữ liệu (DEA) theo mơ hình tối thiểu hĩa đầu vào và phương pháp đường biên ngẫu nhiên (SFA) Theo phương pháp DEA tối thiểu hĩa đầu vào trong trường hợp quy mơ khơng ảnh hưởng đến kết quả sản xuất (CRS), chỉ cĩ 9,47% số trại cá Tra đạt hiệu quả kỹ thuật, hệ số hiệu quả trung bình là 0,57; trong trường hợp qui mơ ảnh hưởng đến kết quả sản xuất (VRS), chỉ cĩ 19,47% số trại cá Tra đạt hiệu quả kỹ thuật, hệ số hiệu quả trung bình là 0,72 Trái lại, với phương pháp phân tích đường biên ngẫu nhiên (SFA), hệ số hiệu quả kỹ thuật trung bình là 0,89 và cĩ hai nhân

tố cĩ ý nghĩa thống kê ảnh hưởng đến hiệu quả kỹ thuật đĩ là chi phí hĩa chất và thức ăn.

Từ khĩa: Hiệu quả kỹ thuật, Phân tích đường biên ngẫu nhiên, Màng dữ liệu, Cá Tra

ABSTRACT

This study analyzes technical effi ciency for Tra catfi sh aquaculture farms in Mekong River Delta have used minimizing input-oriented Data Envelopment Analysis (DEA) and Stochastic Frontier Analysis (SFA) models According to DEA model, 9.47% of Tra catfi sh farms are effi cient and mean effi ciency is 0.57 with minimizing input-oriented Constant Return to Scale; 19.47 % of Tra catfi sh farms are effi cient and mean effi ciency is 0.72 with minimizing input-oriented Variable Return to Scale In other hand, in SFA model, mean effi ciency is 0.89 and factors effecting technical effi ciency are feed and chemicals cost.

Keywords: Technical efﬁ ciency, Stochastic frontier analysis, Data envelope analysis, Tra catﬁ sh

1 ThS Đặng Hồng Xuân Huy, 2 TS Nguyễn Văn Ngọc: Khoa Kinh tế - Trường Đại học Nha Trang

Trong những năm gần đây, cá Tra đã trở thành

một trong những đối tượng nuơi chủ yếu của vùng

Đồng bằng sơng Cửu Long, hàng năm đĩng gĩp

khoảng 2% GDP và 32% giá trị xuất khẩu của ngành

thuỷ sản Việt Nam [8] Giai đoạn 1998 - 2008, diện

tích nuơi cá Tra đã tăng 7 lần, sản lượng thu hoạch

tăng đến 36 lần và sản lượng xuất khẩu tăng hơn 40

lần [1] Năm 2010, giá trị cá Tra xuất khẩu đạt mức

kỷ lục là 1,5 tỷ USD, và đã xuất sang hơn 130 quốc

gia trên thế giới [9]

Tuy nhiên, cùng với sự phát triển nhanh chĩng

về sản lượng là giá cá bắt đầu cĩ xu hướng giảm

nhanh Giá xuất khẩu trung bình của cá Tra giảm từ

3,76 USD/kg vào năm 2000 [8] xuống 2,14 USD/kg trong năm 2010 [9] Giá cá giảm khơng chỉ ở các thị trường truyền thống, mà cịn ở các thị trường mới phát triển, chẳng hạn như Trung Đơng, Mêhicơ, Ả Rập Xê Út và Úc [9] Trái lại, chi phí sản xuất cá Tra lại tăng lên theo thời gian Năm 2006, chi phí sản xuất ước tính là 0,59 USD/kg [6], nhưng trong năm

2008 chi phí đã tăng lên 0,70 USD/kg [5] Các trại nuơi cá Tra liên tục thua lỗ trong những năm gần đây chủ yếu là do giá giảm và chi phí sản xuất gia tăng [4]

Trong năm 2009, giá trị xuất khẩu cá Tra đạt 1,3 tỷ USD và nhiều nhà nghiên cứu lập luận rằng ngành cơng nghiệp này vẫn phát triển tốt, nhưng

Trang 39

trên thực tế, nơng dân bị mất tương đương từ 10-20

cent USD cho mỗi kg mà họ sản xuất Trong năm

2008, khoảng 25% nơng dân nuơi cá tra bị phá sản,

30% mất vốn tự cĩ của hộ gia đình, và 40% hộ gia

đình khơng thể trả nợ ngân hàng do thua lỗ nặng [8]

Năm 2012, người nuơi cá gặp nhiều khĩ khăn trong

sản xuất do giá thức ăn tăng cao, nhiều khoản chi

phí tăng vọt và bị doanh nghiệp chế biến chậm trả

tiền mua cá Cĩ đến khoảng gần 40% diện tích nuơi

cá tra ở các tỉnh Đồng bằng sơng Cửu Long “treo

ao” do người nuơi bị thua lỗ [11] Chính vì vậy, việc

đo lường hiệu quả kỹ thuật và các nhân tố tác động

đến hiệu quả kỹ thuật của cá Tra nuơi thương phẩm

rất quan trọng, nhằm tìm kiếm giải pháp cắt giảm

các chi phí đầu vào cho người nuơi, gĩp phần nâng

cao hiệu quả phát triển nuơi bền vững

II CƠ SỞ LÝ THUYẾT VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

1 Khái niệm về hiệu quả (Efﬁ ciency)

Hiệu quả là sự liên quan giữa nguồn lực đầu

vào khan hiếm (như lao động, vốn, máy mĩc thiết

bị,…) với kết quả trung gian hay kết quả cuối cùng

Hiểu theo nghĩa rộng, hiệu quả thể hiện mối tương

quan giữa các biến số đầu ra thu được (outputs) so

với các biến số đầu vào (inputs) đã được sử dụng

để tạo ra những kết quả đầu ra đĩ

Hiệu quả = Đầu ra /Đầu vào [11]

2 Hiệu quả kỹ thuật (Technical efﬁ ciency)

Theo nhà kinh tế học người Anh M Farrell

(1957), hiệu quả hoạt động (operational efﬁ ciency)

được chia làm 2 phần: 1) Hiệu quả kỹ thuật hoặc

hiệu quả sản xuất (technical efﬁ ciency); và 2) Hiệu

quả phân phối nguồn lực (allocative efﬁ ciency)

Hiệu quả kỹ thuật là tối thiểu hĩa lượng các

yếu tố đầu vào với đầu ra cho trước hoặc tối đa

hĩa các yếu tố đầu ra với lượng yếu tố đầu vào cho

trước [7] Cĩ hai phương pháp đo lường hiệu quả

kỹ thuật phổ biến là: phân tích màng dữ liệu (Data

Envelopment Analysis - DEA) và phân tích đường

biên ngẫu nhiên (schochastic frontier analysis -

SFA), trong đĩ SFA sử dụng phương pháp tham số

(parametric methods), DEA dựa theo phương pháp

phi tham số (non - parametric methods) để ước

lượng giới hạn khả năng sản xuất dựa trên các quan

sát thực tế

2.1 Phương pháp DEA

DEA lần đầu tiên được phát triển bởi Charnes,

Cooper, và Rhodes vào năm 1978 Cĩ hai phương

pháp tiếp cận ước lượng giới hạn khả năng sản xuất

là: phân tích màng dữ liệu trong trường hợp qui mơ

khơng ảnh hưởng đến kết quả sản xuất (Constant Return to Scale - CRS) và phân tích màng dữ liệu trong trường hợp qui mơ ảnh hưởng đến kết quả sản xuất (Variable Return to Scale - VRS) Cả hai

giả thiết tối thiểu hĩa các yếu tố đầu vào mà khơng làm giảm sút đầu ra và tối đa hĩa đầu ra dựa trên đầu vào cĩ sẵn

ta xét điểm khơng đạt hiệu quả kỹ thuật P (hình 1)

Sự khơng hiệu quả kỹ thuật theo mơ hình phân tích màng dữ liệu tối thiểu hĩa đầu vào trong trường hợp qui mơ khơng ảnh hưởng đến kết quả sản xuất (CRS) của điểm P là một khoảng cách PPc Trong khi đĩ, sự khơng hiệu quả kỹ thuật theo mơ hình phân tích màng dữ liệu tối thiểu hĩa đầu vào trong trường hợp qui mơ ảnh hưởng đến kết quả sản xuất (VRS) chỉ là PPv Sự khác biệt của hai mơ hình đo lường này là do sự khơng hiệu quả về mặt qui mơ Các khái niệm này cĩ thể chỉ rõ trong đo lường hiệu quả tỉ lệ như sau:

TECRS = APc/ APTEVRS = APv/ AP

Hình 1 Mơ hình phân tích màng dữ liệu tối thiểu hĩa

đầu vào DEA CRS và DEA VRS

Hệ số hiệu quả TECRS, TEVRS trong mơ hình phân tích màng dữ liệu luơn nằm trong khoảng từ

0 đến 1 [2]

2.2 Phương pháp SFA

Phương pháp SFA cho phép đánh giá hiệu quả kỹ thuật và giải quyết một số vấn đề liên quan đến các mơ hình định lượng của hàm biên, cĩ tính đến các nhân tố đi kèm ảnh hưởng ngẫu nhiên đến quá trình sản xuất, do đĩ kết quả của SFA cũng mang tính ngẫu nhiên Phương pháp SFA lần đầu tiên được đề xuất vào năm 1977 bởi hai nhĩm tác giả độc lập là Aigner, Lovell và Schmidt, và nhĩmMeeusen, Van den Broeck Mơ hình phân tích SFA được tĩm gọn như sau:

(1)

Trang 40

Trong đó: Yi là mức sản lượng đầu ra của đơn

vị sản xuất (trại nuôi) thứ i (i = 1,2,…n); Xi là véc tơ

yếu tố đầu vào (1*K, với K là số lượng yếu tố đầu

vào) của đơn vị sản xuất thứ i; β là véc tơ (1*K) tham

số cần được ước lượng; Vi là sai số ngẫu nhiên,

được giả định là độc lập, đồng nhất và có phân phối

v

phần biến ngẫu nhiên không âm liên quan đến tính

phi hiệu quả trong sản xuất, và được giả định là có

phân phối độc lập, một phía và có dạng N+(Ziδ, σu2)

Nếu như Ui bằng không thì đơn vị sản xuất thứ i đạt

hiệu quả kỹ thuật 100% và nằm trên đường biên giới

sản xuất thứ i đang sử dụng lãng phí các yếu tố đầu

vào – còn gọi là phi hiệu quả Theo Battese và Coelli

(1995), Ui có thể được viết dưới dạng:

(2)Trong đó: Zi là véc tơ (1* p), các nhân tố có thể

ảnh hưởng đến hiệu quả kỹ thuật của đơn vị sản

xuất gồm có: các yếu tố vi mô như đặc điểm riêng

của đơn vị sản xuất (quy mô, kinh nghiệm, sự phối

hợp các đầu vào ); các yếu tố vĩ mô như thể chế,

chính sách, sự hỗ trợ của chính phủ (quy hoạch,

vốn vay, tập huấn kinh nghiệm ), δ là véc tơ (p*1)

nhiên giống như Vi

Hiệu quả kỹ thuật của đơn vị sản xuất kinh

doanh thứ i chính là:

(3)

Như vậy, nếu dạng hàm sản xuất f thích hợp

nhất được lựa chọn, Battese và Coelli (1995) đề

nghị các tham số ở mô hình (1) và (2) được ước

lượng đồng thời bằng phương pháp ML (Maximum

Likelihood) Lúc đó mô hình (1) sẽ cho biết mức sản

lượng lớn nhất có thể đạt tới với các đầu vào cho

trước Chỉ số hiệu quả kỹ thuật của mỗi đơn vị sản

xuất ở (3) chính bằng mức sản lượng quan sát (thực

tế) chia cho mức sản lượng lớn nhất có thể đạt tới

Các tham số được ước lượng ở mô hình (2) sẽ cho biết các nhân tố và mức độ ảnh hưởng tới hiệu quả

kỹ thuật [2]

3 Dữ liệu nghiên cứu

3.1 Địa bàn và qui mô nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là các trại nuôi cá Tra tại Đồng bằng sông Cửu Long năm 2010 với các biến

số lượng lao động, chi phí xăng dầu, chi phí tiền điện, chi phí hóa chất, số lượng thức ăn, số lượng con giống, sản lượng thu hoạch, số lượng mẫu nghiên cứu là 190 mẫu

3.2 Phương pháp chọn mẫu nghiên cứu

Phương pháp chọn mẫu ngẫu nhiên đơn giản bằng cách dựa vào danh sách các hộ nuôi, sau đó rút thăm ngẫu nhiên không lặp lại từ danh sách lập

để chọn ra các hộ cần điều tra Số liệu thu thập bằng phương pháp phỏng vấn trực tiếp chủ hộ

4 Phương pháp phân tích dữ liệu

4.1 Phương pháp DEA

Trong bài viết này đối với mô hình DEACRS

và DEAVRS, tác giả chỉ đo lường hiệu quả kỹ thuật theo hướng tối thiểu hóa các yếu tố đầu vào mà không làm giảm sút yếu tố đầu ra Phần mềm DEA Excel solver của Zhu [7] được sử dụng để ước lượng kết quả

4.2 Phương pháp SFA

Phương pháp SFA cho phép đánh giá hiệu quả

kỹ thuật và giải quyết một số vấn đề liên quan đến các mô hình định lượng của hàm biên, có tính đến các nhân tố đi kèm ảnh hưởng ngẫu nhiên đến quá trình sản xuất, do đó kết quả của SFA cũng mang tính ngẫu nhiên Phần mềm ước lượng được sử dụng là FRONTEIR 4.1 [3]

1 Một số giá trị thống kê của các biến dùng trong phân tích

Một số giá trị thống kê của các biến dùng trong phân tích được thể hiện trong bảng 1

Bảng 1 Một số giá trị thống kê của các biến dùng trong phân tích

Nguồn: Tính toán từ số liệu điều tra.

Tiêu đề	Hàm lượng độc tố Gây Liệt Cơ PSP Trong Các Lồi Hai Mảnh Vỏ Ở Nha Trang
Tác giả	Nguyễn Thuần Anh
Trường học	Trường Đại học Nha Trang
Chuyên ngành	Công nghệ Thực phẩm
Thể loại	Nghiên cứu
Năm xuất bản	2012
Thành phố	Nha Trang

Định dạng
Số trang	197
Dung lượng	21,85 MB