Hiện nay do quá trình chuyển hóa sinh khối từ lương thực có nguy cơ cạn kiệt trong tương lai, vì thế người ta nghiên cứu đến những loại sinh khối trên cạn rơm rạ, bã mía… và sinh khối dư
QUAN
Tổng quan về rong Lục Chaetomorpha
1.1.1 Khái quát về rong lục Chaetomorpha
Ngành rong lục đặc trưng bởi màu xanh lục và khả năng quang hợp tự dưỡng, giúp tổng hợp các chất hữu cơ cho tế bào Rong lục chứa nhiều sắc tố diệp lục, cho phép sản xuất tinh bột và cellulose với hiệu suất cao Cấu trúc của rong lục đa dạng, bao gồm dạng phiến, dạng sợi và dạng ống, với vỏ được cấu tạo từ pectin hoặc cellulose Trong chất nguyên sinh, có các túi nhỏ chứa sản phẩm trao đổi chất Các sắc tố chính bao gồm chlorophyll và caroten, cùng với các hạt tạo bột nhỏ và tinh thể protein Sản phẩm trao đổi chất trong dịch bào chủ yếu là đường, tanin, sunfat canxi và các chất màu antoxyan.
Theo các tác giả Nguyễn Hữu Dinh, Phạm Hoàng Hộ và Tsutsui, ngành rong lục hiện nay đã được các nhà nghiên cứu xác định có trên dưới nhiều loài khác nhau.
360 chi và hơn 5700 loài, phần lớn là sống trong nước ngọt, còn nước mặn chủ yếu là những chi sau đây: Monostroma, Enteromorpha, Ulva, Ulothrix, Rhizoclonium,
Cladophora, Chaetomorpha, Cladophoropsỉs, Boergesenm, Valonia, Valoniopsis, Struvea, Boodlea, Microdyction, Caulerpa, Bryopsis, Codium, Acetabulariav.v
Nguyên sinh chất có thành mỏng, bên trong chứa một túi lớn đầy dịch bào Thành phần của nguyên sinh chất bao gồm thể sắc tố với nhiều hình dạng khác nhau như phiến, đai vành móng ngựa, sao nhiều cạnh, và hạt nhỏ Sắc tố chủ yếu là chlorophyll và caroten, cùng với các hạt tạo bột hình tròn nhỏ chứa tinh thể protit Hạt tạo bột dễ bắt màu khi gặp dung dịch KI, trở thành tiêu chuẩn phân loại Nhân thường nằm ở giữa khoang túi dịch bào hoặc sát bên thành lớp nguyên sinh, với thể nhiễm sắc hình que ngắn hoặc hạt nhỏ Trong dịch bào, sản phẩm của quá trình trao đổi chất chủ yếu là đường, tanin, canxi sunfat và các chất có màu antoxyan.
Rong lục sinh sản qua nhiều hình thức, bao gồm sinh sản dinh dưỡng, nơi một tế bào mẹ chia thành hai tế bào mới, và sinh sản vô tính, trong đó tế bào dinh dưỡng phân chia thành nhiều bào tử, phát triển thành cá thể mới khi gặp điều kiện thuận lợi Sinh sản hữu tính diễn ra qua sự thụ tinh giữa phối tử đực và cái, hình thành tinh tử và trứng Hiểu biết về sinh sản là cơ sở cho việc phát triển nhiên liệu bền vững Rong có hình dạng sợi, cứng, dài từ 5-10cm hoặc hơn, màu xanh lục với phần nổi trên mặt nước hơi vàng Khi già, rong có màu xanh đậm hơn, sợi dày hơn, chiều ngang từ 100-150 µm, chiều dài các đốt không đều, có thể dài gấp 1,5 lần chiều ngang Tế bào dinh dưỡng khi hình thành bào tử phình rộng ra 160-170 µm, có sắc tố dạng lưới và nhiều hạt tạo bột Rong sống tự do thường đan kết thành chùm và trộn lẫn với các loại rong khác như Enteromorpha và Caladophra.
Rhizoclonium) [52, 53, 54] b Thành phần hóa học của rong lục Được tác giả Kim nêu tóm gọn trong bảng [55]
Bảng 1.1: Thành phần hóa học của rong lục Thành phần hóa học (%) Rong lục
Carbohydrate (thành phần) 25 – 50 (cellulose, tinh bột)
Rong lục chứa bốn thành phần hóa học chính: tro, lipid, protein và carbohydrate, trong đó carbohydrate chiếm tỷ trọng cao từ 25-50% trọng lượng, phù hợp hơn cho sản xuất nhiên liệu sinh học so với lipid chỉ có 1-2% Rong lục cũng chứa polysaccharide như tinh bột và cellulose, với cellulose và tinh bột chiếm khoảng 40-50% Khi thủy phân rong lục, lượng lớn glucose được thu nhận, cùng với glucose từ thủy phân paramylon (β-1,3-glucan), tạo ra nguồn glucose dồi dào, làm cho rong lục trở thành nguyên liệu lý tưởng cho sản xuất ethanol.
Rong lục có thời gian sinh trưởng nhanh và năng suất cao hơn so với rong đỏ và rong nâu, làm cho nó trở thành nguồn sinh khối lý tưởng cho sản xuất ethanol.
1.1.2 Tổng quan về quá trình chuyển hóa sinh khối rong thành ethanol
Hiện nay, do nguy cơ cạn kiệt nguồn lương thực trong tương lai, nghiên cứu về sinh khối từ các nguồn tài nguyên khác như rơm rạ, bã mía và các loại rong biển như rong đỏ, rong nâu, rong lục đang trở nên quan trọng.
Quá trình chuyển hóa sinh khối thành ethanol theo những bước cơ bản của sơ đồ sau:
Hình 1.1: Quy trình chuyển hóa sinh khối thành ethanol
Quá trình tiền xử lý là bước cần thiết để chuyển hóa carbohydrate trong rong thành ethanol, vì các polymer phải được bẻ gãy thành những phân tử đường nhỏ hơn trước khi vi sinh vật có thể hoàn tất quá trình chuyển hóa Cellulose có tính bền vững cao trước sự tấn công của enzyme, do đó, tiền xử lý giúp cải thiện hiệu quả của quá trình đường hóa Mục tiêu của quá trình tiền xử lý bao gồm việc tăng cường khả năng tiếp xúc của enzyme với cellulose và nâng cao hiệu suất chuyển hóa.
Giảm kích thước nguyên liệu, phân cắt một phần các sợi β-glucan để tạo ra nhiều đầu không khử cho hoạt động của enzyme
Tăng kích thước lỗ xốp trong cấu trúc sợi của nguyên liệu
Tăng vùng vô định hình của cellulose
Loại bỏ thành phần hemicellulose bao quanh và loại bỏ lignin khỏi các sợi cellulose
Quá trình tiền xử lý sinh khối bao gồm các phương pháp sinh học, cơ học, hóa học hoặc sự kết hợp của chúng Trong đó, phương pháp vật lý và cơ học đóng vai trò quan trọng trong việc cải thiện tính chất của sinh khối.
Tiền xử lý Sinh khối
Các phương pháp không sử dụng hóa chất trong xử lý bao gồm nghiền nhỏ, đồng hóa, sử dụng bức xạ năng lượng cao, và xử lý thủy nhiệt cùng hơi nước.
Nghiền nhỏ là quá trình làm giảm kích thước hạt, giúp vật liệu dễ dàng xử lý và tăng diện tích bề mặt Bước tiền xử lý này rất quan trọng để chuẩn bị cho quá trình thủy phân diễn ra thuận lợi hơn.
Sử dụng sóng siêu âm: thường sử dụng cho sinh khối lignocellulose nghiên cứu ở quy mô phòng thí nghiệm [22]
Thủy nhiệt (Liquid hot water LHW) là quá trình xử lý sinh khối bằng nước ở nhiệt độ và áp suất cao, trong đó sinh khối được xử lý trong 15 phút với nhiệt độ tối ưu.
Quá trình tiền xử lý ở nhiệt độ từ 200 o C đến 230 o C cho phép hòa tan 40% đến 60% tổng sinh khối, trong đó cellulose chiếm 4 - 22%, lignin từ 35 - 60%, và tất cả hemicellulose bị loại bỏ Hơn 90% hemicellulose được thu hồi và thủy phân bằng acid để tạo thành đường monomeric Acid acetic hình thành trong quá trình này hoạt động như một chất xúc tác cho thủy phân polysaccharide, dẫn đến việc các đường monomeric có thể bị phân hủy ở nhiệt độ cao, tạo ra các chất ức chế furfural, ảnh hưởng đến quá trình lên men.
Phương pháp xử lý acid bao gồm sử dụng acid loãng, bơm hơi nước có acid và nổ hơi có acid, trong đó acid sulfuric được nghiên cứu nhiều nhất Meinita, Park và cộng sự (2012) đã áp dụng acid sulfuric loãng nồng độ 0.3-0.9N ở nhiệt độ 100-140 o C để xử lý rong nguyên liệu Các yếu tố như nồng độ acid, thời gian phản ứng, nhiệt độ và nồng độ nguyên liệu ảnh hưởng đến lượng đường khử và hiệu suất lên men Tuy nhiên, thiết bị cần phải chịu được ăn mòn và lượng thạch cao (CaSO4) sinh ra từ quá trình trung hòa acid với Ca(OH)2 là một thách thức Ngoài ra, xử lý ở nhiệt độ cao có thể tạo ra các chất ức chế vi sinh vật như furfural, 5-hydroxymethylfurfural (HMF), acid levulinic và acid caffeic, xuất phát từ xylose và galactose trong rong, thường được loại bỏ bằng than hoạt tính hoặc vôi.
Alkaline xúc tác thủy phân xylan và xà phòng hóa các liên kết ester, đồng thời phá vỡ liên kết hydrogen trong phân tử cellulose Khi sử dụng calcium hay sodium hydroxide làm tác nhân tiền xử lý, các muối tạo thành trong dịch tiền xử lý có thể được loại bỏ và tái chế Điều kiện nhẹ nhàng của quá trình tiền xử lý giúp hạn chế sự phân hủy đường thành furfural, HMF và các acid hữu cơ.
Cố định tế bào
Kỹ thuật cố định tế bào là phương pháp bao bọc hoặc định vị các tế bào trong một không gian nhất định, nhằm bảo vệ các hoạt tính xúc tác mong muốn (Karel và cộng sự, 1985).
Cố định tế bào là quá trình mô phỏng hiện tượng mà các tế bào vi sinh vật có khả năng phát triển trên bề mặt hoặc trên các cấu trúc của một số nguyên liệu tự nhiên.
Kỹ thuật cố định tế bào đã được nghiên cứu một cách sâu rộng từ những năm 70 của thế kỷ trước, với nhiều chất mang và kỹ thuật mới được phát triển nhằm mở rộng ứng dụng của tế bào cố định.
1.2.2 Các kỹ thuật cố định tế bào: Để thu được hiệu quả cao nhất khi sử dụng tế bào cố định, ngoài việc lựa chọn giống vi sinh vật và chất mang, chúng ta còn phải lựa chọn kỹ thuật cố định phù hợp cho từng loại tế bào tùy theo mục đích sử dụng Mỗi kỹ thuật cố định đều có ưu nhược điểm riêng và chỉ phù hợp cho một số loài vi sinh vật cũng như một số mục đích sử dụng dựa vào tương tác giữa tế bào và chất mang, các kỹ thuật tế bào có thể chia làm
Cố định tế bào lên bề mặt chất mang rắn (carrier – binding)
Nhốt tế bào trong cấu trúc gel (entrapment)
Kết bông tế bào (aggregation)
Vi bao tế bào (microencapsulation)
Khi lựa chọn phương pháp cố định tế bào cần xem xét một số yêu cầu sau:
Không gây ảnh hưởng bất lợi đến hoạt tính tế bào
Đảm bảo được hiệu quả kinh tế
Kỹ thuậy cố định đơn giản dễ thực hiện và ứng dụng vào sản xuấy quy mô lớn
Hình 1.5: Các phương pháp cố định tế bào[28] a Kỹ thuật cố định tế bào trên chất mang rắn (carrier – binding)
Quá trình cố định tế bào trên chất mang rắn diễn ra thông qua sự hấp phụ vật lý, bao gồm các liên kết ion, tĩnh điện, liên kết đồng hóa trị và các liên kết đặc trưng giữa tế bào và chất mang Lớp tế bào hấp phụ thường có độ dày khoảng 1mm và sẽ giảm dần trong quá trình lên men.
Các chất mang có thể được sử dụng bao gồm polysaccharide tự nhiên như DEAE-cellulose, gỗ, mùn cưa, dextran, cũng như polysaccharide tổng hợp và các hợp chất vô cơ như ceramic, thủy tinh xốp và silicate Những chất mang này có thể được sử dụng trực tiếp hoặc được xử lý bằng hóa chất để tăng cường khả năng hấp phụ của chúng.
Tế bào có ưu điểm là dễ dàng tiếp xúc với cơ chất nhờ nằm trên bề mặt của chất mang, điều này giúp quá trình trao đổi chất của tế bào ít bị ảnh hưởng Hơn nữa, liên kết giữa tế bào và chất mang rất bền vững, đặc biệt là đối với liên kết đồng hóa trị.
Tế bào hấp phụ trên bề mặt Tế bào liên kết tĩnh điện Tế bào liên kết đồng hóa trị
Nhốt tế bào bên trong cấu trúc gel
Tế bào kết bông tự nhiên
Tế bào kết bông nhân tạo (liên kết ngang)
Vi bao tế bào bằng polymer bán thấm
Vi bao tế bào bằng màng lỏng
Chặn tế bào giữa hai màng membrane
Pha lỏng Chất mang xốp
Tác nhân liên kết ngang
A CỐ ĐỊNH TẾ BÀO TRÊN BỀ MẶT CHẤT MANG RẮN
B NHỐT TẾ BÀO TRONG CẤU TRÚC GEL
Nhược điểm của liên kết ion và lực hấp phụ vật lý là sự không bền vững giữa tế bào và chất mang, dẫn đến việc tế bào dễ bị rửa trôi và hiệu suất cố định tế bào chỉ đạt khoảng 40 – 60% Hơn nữa, khả năng bảo vệ tế bào trước các điều kiện bất lợi của môi trường xung quanh cũng thấp do tế bào được cố định trên bề mặt chất mang Kỹ thuật nhốt tế bào trong cấu trúc gel (entrapment) là một giải pháp tiềm năng để cải thiện tình trạng này.
Kỹ thuật nhốt tế bào trong cấu trúc gel bao gồm việc bao bọc tế bào trong gel để ngăn cản sự khuếch tán ra môi trường xung quanh, đồng thời vẫn cho phép tế bào thực hiện trao đổi chất Chất mang thường có hình dạng là các hạt gel hình cầu với đường kính từ 0,3 đến 5 mm.
Các chất mang thường được sử dụng trong kỹ thuật này chủ yếu là các hợp chất hữu cơ như polysaccharide (alginate, κ-carrageenan, agar, pectin), protein (gelatin, collagen) và polymer tổng hợp (polyvinyl alcohol, polyacrylamide) Trong số đó, alginate là chất mang phổ biến nhất trong ngành công nghệ lên men thực phẩm.
Quá trình trao đổi chất giữa môi trường bên trong và bên ngoài hạt gel diễn ra nhờ sự chênh lệch nồng độ cơ chất Quá trình này phụ thuộc vào kích thước, độ chặt của hạt gel, cũng như mật độ tế bào bên trong và mật độ hạt gel trong môi trường lên men.
Phương pháp cố định này có nhiều ưu điểm, bao gồm tính đơn giản và khả năng tối ưu hóa quy trình dễ dàng, cùng với chi phí thấp Hạt gel có độ bền cao và khả năng chứa mật độ tế bào lớn, đồng thời bảo vệ tế bào khỏi các điều kiện môi trường bất lợi như thay đổi nhiệt độ và pH Việc tối ưu hóa điều kiện lên men và quá trình cũng được thực hiện một cách thuận lợi.
Tế bào có thể phát triển trên bề mặt hạt gel và giải phóng khỏi thể hạt, dẫn đến môi trường lên men chứa hỗn hợp tế bào tự do và tế bào cố định Nồng độ cơ chất và sản phẩm tại bề mặt và tâm hạt gel có sự khác biệt, ảnh hưởng đến hoạt tính và đặc điểm sinh lý của tế bào ở các vị trí khác nhau trong hạt gel Hơn nữa, khí CO2 sinh ra trong quá trình lên men có thể gây nứt vỡ hạt gel.
28] c Kỹ thuật kết bông tế bào (aggregation) [48]:
Một số loài vi sinh vật như nấm men có khả năng tự kết lại thành khối, cho phép sử dụng hiện tượng này như một phương pháp cố định đơn giản và tiết kiệm Tuy nhiên, việc thay đổi điều kiện môi trường hoặc sử dụng các tác nhân hóa học như glutaraldehyde và diisocyanate để kết nối tế bào thành khối hạt gặp nhiều nhược điểm Phương pháp này phức tạp và tốn kém, đồng thời các tác nhân hóa học có thể gây hại cho sức khỏe người tiêu dùng, dẫn đến việc ít được áp dụng trong ngành công nghệ thực phẩm Hơn nữa, các hóa chất này còn cản trở quá trình trao đổi chất của tế bào ở trung tâm khối hạt.
Kỹ thuật vi bao gồm có:
Sử dụng bao vi thể (micorencapsulte type): tế bào được nhốt trong các bao vi thể bằng các polymer bán thấm
Kiểu lipoxome: tế bào được nhốt trong màng lỏng từ các chất mang có tính lưỡng cực (amphiphatic)
Sử dụng membrane: tế bào được nhốt bằng màng vi lọc hay siêu lọc
Phương pháp này thường được áp dụng để liên tục tách sản phẩm khỏi tế bào, nhưng nhược điểm chính là sự tắc nghẽn khi vận chuyển các chất có phân tử lượng lớn qua màng Do đó, việc lựa chọn chất mang là rất quan trọng.
Khi lựa chọn chất mang cố định tế bào, cần xem xét các yêu cầu sau:
Khả năng và hiệu quả cố định tế bào cao, giá thành hợp lý, dễ sử dụng và tái sinh
Cố định nấm men trong gel alginate
Alginate là một polysaccharide tự nhiên, chủ yếu được chiết xuất từ tảo nâu (Phaeophyceae), nơi nó chiếm tới 40% khối lượng chất khô Ngoài ra, alginate cũng có mặt trong màng bao nhầy của một số loại vi khuẩn Hiện nay, các loại alginate thương mại chủ yếu được sản xuất từ tảo nâu và thường được sử dụng dưới dạng muối sodium, potassium, amonium hoặc calcium của acid alginic.
Acid alginic là một copolymer không phân nhánh, được cấu thành từ các monomer β-D-mannuronic acid (M) và α-L-guluronic acid (G) liên kết với nhau qua liên kết 1,4-glucoside Các monomer này phân bố trong mạch alginic theo các block.
Block M: gồm các gốc acid mannuronic nối tiếp nhau
Block G: gồm các gốc acid guluronic nối tiếp nhau
Block MG: gồm các gốc acid mannuronic và acid guluronic luân phiên nối với nhau
Acid alginic từ các loại tảo khác nhau có tính chất khác nhau, chủ yếu do tỉ lệ M/G và trật tự sắp xếp các block trong phân tử Sự khác biệt về tỉ lệ M/G của acid alginic từ các loại tảo được thể hiện trong bảng 1.7.
Hình 1.6 : Các monomer của acid alginic [29]
Hình 1.7 : Cấu trúc các block của phân tử alginic A: Block G, B:Block M,
Bảng 1.2: Tỉ lệ M/G của một số chế phẩm acid aginic [29] b: mẫu acid aginic thương mại c: khoảng thay đổi của tỉ số M/G trong một năm
Alginate thường được sản xuất dưới dạng muối tan như sodium alginate và potassium alginate Khi tiếp xúc với các ion kim loại đa hóa trị như Ca²⁺, Zn²⁺, Pb²⁺, các ion này sẽ thay thế các ion ban đầu trong phân tử alginate, tạo ra liên kết ngang giữa các lớp trong cấu trúc mạng phân tử và hình thành gel Khả năng tạo gel của alginate với các ion kim loại đa hóa trị giảm dần theo thứ tự: Pb²⁺, Cu²⁺, Cd²⁺, Ba²⁺.
Acid alginic từ Tỉ lệ
Sr 2+ , Ca 2+ , Co 2+ Trong phân tử alginate, acid gulurunic được ưu tiên liên kết với các ion đa hóa trị bằng liên kết ion
Trong ngành công nghệ thực phẩm, ion Ca²⁺ được sử dụng làm tác nhân tạo gel alginate, vì các ion khác có thể ảnh hưởng xấu đến sức khỏe và gây độc cho nấm men.
Có hai phương pháp tạo gel alginate là phương pháp tạo gel khuếch tán
(difussion gelasion) và phương pháp tạo gel nội ( internal gelation) a Phương pháp tạo gel khuếch tán (diffusion gelation)
Nguyên tắc của quá trình này là khuếch tán các ion Ca 2+ từ bên ngoài vào dung dịch alginate, nơi các ion này sẽ thay thế các ion kim loại ban đầu trong muối alginate Sự thay thế này dẫn đến việc hình thành các liên kết ngang, tạo ra các cấu trúc không gian cho mạch gel.
Phương pháp thực hiện này được áp dụng phổ biến trong kỹ thuật cố định tế bào, trong đó hỗn hợp dung dịch alginate và huyền phù nấm men được nhỏ giọt vào dung dịch chứa ion Ca 2+, thường là CaCl2, nhằm tạo ra các hạt gel Ca-alginate chứa nấm men bên trong.
Quá trình tạo gel bắt đầu từ giọt ngoài của giọt alginate Khi tiếp xúc với ion
Khi Ca 2+ được thêm vào dung dịch, bề mặt gel alginate ngay lập tức bắt đầu quá trình gel hóa Cấu trúc xốp của gel alginate cho phép các ion Ca 2+ tiếp tục khuếch tán vào bên trong giọt, dẫn đến việc các phân tử alginate bên trong cũng được gel hóa Sự khuếch tán này tạo ra mật độ alginate cao hơn ở bề mặt so với trung tâm của hạt gel, làm giảm tính đồng thể của hạt gel.
Ưu điểm: phương pháp đơn giản, dễ thực hiện, không tốn thời gian, chi phí thấp
Nhược điểm: tính đồng nhất của hạt gel thấp, hình dạng của hạt gel chỉ có thể là hình cầu b Phương pháp tạo gel nội (internal gelation)
Nguyên tắc của quá trình này là khuếch tán đồng đều ion Ca 2+ ở dạng vô hoạt trong dung dịch alginate và huyền phù nấm men, sau đó kích hoạt để giải phóng các ion Ca 2+ Quá trình gel hóa sẽ diễn ra bên trong hạt alginate.
Phương pháp thực hiện thường sử dụng các muối vô cơ không tan của canxi như CaCO3, CaSO4, và một số muối hữu cơ không tan như Ca-EDTA, calcium citrate Các muối này được trộn đều trong dung dịch alginate và huyền phù nấm men, sau đó hỗn hợp có thể được cho vào khuôn để tạo ra hạt gel với hình dạng mong muốn.
Sử dụng D-glucono--lactone (GDL) để giảm pH của dung dịch giúp giải phóng ion Ca 2+, từ đó tham gia vào quá trình tạo gel với alginate.
Ưu điểm: hạt gel có tính đồng nhất cao, độ bền của hạt gel tốt hơn khi tạo gel bằng phương pháp khuếch tán
Nhược điểm: khó thực hiện, chi phí cao, tốn nhiều thời gian
Hình 1.8: Sự liên kết giữa ion Ca 2+ và gốc G [1]
Hình 1.10: Phương pháp tạo gel nội [1] Hình 1.9: Phương pháp tạo gel khuếch tán [1]
1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến độ bền của gel alginate a Ảnh hưởng của khối lượng phân tử
Nghiên cứu của Johansen và Flink (1986) chỉ ra rằng khối lượng phân tử alginate có ảnh hưởng đáng kể đến độ bền gel và khả năng lên men của nấm men cố định Kết quả cho thấy độ bền gel, được đo bằng khả năng chống chịu với lực nén, tăng rõ rệt khi độ nhớt dung dịch alginate ban đầu từ 5 – 70 cP Tuy nhiên, khi độ nhớt vượt quá 250 – 600 cP, sự gia tăng độ bền gel trở nên không đáng kể.
Tỉ lệ G/M trong phân tử alginate, là tỉ lệ giữa số gốc L-guluronic acid và D-mannuronic acid, ảnh hưởng đến độ bền gel Khi tỉ lệ G/M tăng, độ bền gel cũng tăng do ion Ca²⁺ ưu tiên liên kết với block G, giúp gel có hàm lượng G cao không bị phồng nở hay co rút, giữ hình dạng tốt hơn và nâng cao khả năng tái sử dụng nấm men mà không ảnh hưởng đến khả năng khuếch tán glucose trong hạt gel Tuy nhiên, gel có hàm lượng G cao có thể cản trở sự phát triển của nấm men.
Nghiên cứu của Yamagiwa và cộng sự (1995) chỉ ra rằng nồng độ alginate có ảnh hưởng đáng kể đến độ bền gel và khả năng lên men của nấm men cố định Cụ thể, độ bền gel tăng khi nồng độ dung dịch alginate tăng, và nồng độ alginate tối ưu để cố định nấm men là khoảng 2%.
Theo nghiên cứu của Theo Yamagiwa và cộng sự (1995), pH lý tưởng cho dung dịch alginate trong quá trình tạo gel nằm trong khoảng 6 – 8 Khi pH nằm ngoài khoảng này, hình dạng của các phân tử alginate sẽ bị thay đổi, dẫn đến giảm độ bền của gel Ngoài ra, nhiệt độ tối ưu cho quá trình tạo gel không nên vượt quá 25 °C.
1.3.4 So sánh tế bào cố định với tế bào tự do a Ưu điểm:
Nhu cầu ethanol trên thế giới và Việt Nam
Sự gia tăng dân số và công nghiệp hóa đang thúc đẩy nhu cầu ethanol toàn cầu Tuy nhiên, nhiên liệu sinh học thế hệ thứ nhất và thứ hai, bao gồm lignocellulose từ gỗ, phụ phẩm nông nghiệp, đường mía và tinh bột, không thể đáp ứng đủ nhu cầu sản xuất bioethanol do các vấn đề về an ninh lương thực, kỹ thuật và môi trường Do đó, rong biển nổi lên như một nguồn năng lượng sinh học bền vững tiềm năng, nhờ vào hàm lượng tinh bột cao và cellulose, cùng với sự phân bố rộng rãi trong tự nhiên.
1.4.1 Tình hình nghiên cứu và sản xuất ethanol trên thế giới
Các nguồn nguyên liệu sản xuất ethanol bao gồm lignocellulose từ gỗ, phụ phẩm nông nghiệp, tinh bột từ hạt và đường mía Tuy nhiên, phụ phẩm nông nghiệp từ đường mía và tinh bột có giá thành cao, ảnh hưởng đến an ninh lương thực, kỹ thuật sản xuất và môi trường.
Rong tảo biển, đặc biệt là rong Lục, là nguồn sinh khối lý tưởng cho sản xuất bioethanol Nghiên cứu tại Đan Mạch cho thấy tinh bột từ rong Lục chiếm 40-50%, trong khi fibrin dưới 5%, giúp quá trình lên men dễ dàng hơn so với carbohydrate từ rong Nâu khi sử dụng các dòng vi khuẩn thông thường như nấm men.
Nhiều quốc gia đang đẩy mạnh nghiên cứu và sản xuất ethanol, trong đó có Israel với dự án "Green Technology" sản xuất thành công ethanol từ rong biển, cho thấy rằng 5 kg rong khô có thể tạo ra 1 lít nhiên liệu sinh học Đồng thời, một dự án hợp tác giữa Indonesia và Hàn Quốc cũng đang phát triển nhiên liệu sinh học từ rong biển của Indonesia, kết hợp với công nghệ sản xuất của Hàn Quốc.
Dự án Sea Gardens của trường Đại học Costa Rica, được tài trợ bởi Ngân hàng Thế giới, nhằm nuôi trồng rong biển để sản xuất bioethanol Dự án Blomara, hợp tác giữa Hiệp hội Khoa học Biển Scotland và Liên minh châu Âu, với sự hỗ trợ của chính phủ Ailen và Scotland, đã đầu tư 8 triệu USD vào năm 2009 để đánh giá tiềm năng rong biển và chọn dòng vi tảo cho sản xuất quy mô công nghiệp Tại Nhật Bản, dự án Sunrise tập trung vào việc sản xuất bioethanol từ rong biển Sargassum, bắt đầu từ năm 2012, phát triển công nghệ nuôi rong biển vào năm 2016 và thiết lập quy trình sản xuất vào khoảng năm 2020.
1.4.2 Tình hình nghiên cứu và sản xuất ethanol ở Việt Nam
Việt Nam, với vị trí trong vùng nhiệt đới gió mùa, sở hữu hệ thống sông suối phong phú và bờ biển dài hơn 3260 km cùng với 3000 đảo, đã tạo ra một sinh thái ngập mặn rộng lớn Hệ sinh thái rừng ngập mặn và hệ cửa sông là môi trường lý tưởng cho sự phát triển của rong Lục Do đó, nghiên cứu chuyển hóa sinh khối rong biển thành nhiên liệu sinh học ethanol đã được hình thành tại Việt Nam.
Phòng nghiên cứu tảo của Viện Công nghệ Sinh học đang tiến hành nghiên cứu về diesel sinh học từ sinh khối vi tảo Việt Nam Một nhóm nghiên cứu khác đang tập trung vào quá trình tiền xử lý và chuyển hóa sinh khối rong Lục (Enteromorpha intestinalis) thành đường lên men, ứng dụng trong sản xuất ethanol tại Viện Sinh học Nhiệt đới Đề tài của TS Lê Như Hậu - NITRA, mang tên “Nghiên cứu đánh giá tiềm năng rong biển Việt Nam làm nguyên liệu sản xuất ethanol nhiên liệu (Biofuel)", được thực hiện từ 2009 đến 2011, nằm trong khuôn khổ đề án phát triển nhiên liệu sinh học của Bộ Công Thương đến năm 2015 và tầm nhìn đến năm 2025.
Đến nay, chưa có công bố nào từ các nhà khoa học trong nước về việc ứng dụng nấm men cố định trong gel alginate để lên men thu nhận ethanol từ rong Các nghiên cứu hiện có chủ yếu tập trung vào việc ứng dụng nấm men cố định trong sản xuất rượu vang và mật rỉ đường, như nghiên cứu xác lập điều kiện thích hợp để cố định nấm men Saccharomyces cerevisiae trong gel alginate và trên cellulose vi khuẩn nhằm ứng dụng trong lên men rượu vang nho, cũng như nghiên cứu cố định tế bào nấm men cho quá trình lên men cồn từ rỉ đường.
Mục tiêu nghiên cứu
Những tiến bộ trong kỹ thuật di truyền và tái tổ hợp gen đã giúp phát hiện các chủng nấm men mới với nhiều đặc tính ưu việt như khả năng chịu áp suất thẩm thấu và nhiệt độ lên men cao Tuy nhiên, việc sử dụng nấm men tự do trong quy trình lên men gặp nhiều nhược điểm Để khắc phục điều này, nghiên cứu “Thu nhận ethanol từ sinh khối rong Chaetomorpha sp bằng phương pháp cố định nấm men trong gel alginate” được thực hiện nhằm nâng cao hiệu quả thu nhận ethanol và giảm thiểu sự ức chế từ các hợp chất bất lợi lên nấm men.
Nội dung nghiên cứu
Sử dụng hệ enzyme Accellerase 1500 và Accellerase BG cố định để thu nhận ethanol từ sinh khối rong Chaetomorpha sp bằng phương pháp lên men SHF và SSF
1.6.1 Phương pháp lên men SHF:
Khảo sát nhiệt độ lên men
Khảo sát mật độ nấm men
Khảo sát thời gian lên men
1.6.2 Phương pháp lên men SSF:
Khảo sát nồng độ cơ chất
Khảo sát mật độ nấm men
Khảo sát thời gian lên men.
LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Nguyên liệu
Trong nghiên cứu này, rong Mền (Chaetomorpha) được thu thập từ các ao nuôi tôm tại tỉnh Bạc Liêu và Cà Mau Sau khi thu hoạch, rong được vận chuyển trong thùng xốp đến phòng thí nghiệm trong ngày Tại đây, rong được rửa sạch để loại bỏ tạp chất, sau đó xay nhỏ và sấy khô đến độ ẩm 5%, rồi bảo quản ở nhiệt độ phòng.
Hình 2.1: Rong sau khi thu nhận và xử lý
Hình 2.2: Rong sau xử lý và sấy tới độ ẩm 5%
Nấm men được sử dụng là chủng là Saccharomyces cerevisiae được sản xuất bởi hãng Brenntag Co (Đan Mạch) với tên gọi thương mại là Lalemarid
Hình 2.3: Saccharomyces cerevisiae nhìn dưới kính hiển vi
Nấm men được hoạt hóa và nuôi cấy trong môi trường YPD (Yeast extract Pepton Dextrose) với 2% glucose và thời gian 24h Bảo quản ở nhiệt độ 4 °C
2.1.3 Chất mang cố định tế bào:
Chất mang cố định trong nghiên cứu này là sodium alginate, được chiết xuất từ rong mơ (Sargassum meclurei) do công ty TNHH Hướng Đi cung cấp Một số chỉ tiêu hóa lý của chế phẩm này cũng được đề cập.
- Độ nhớt (dung dịch sodium aginate 2% ở 25 O C): 436cP
- Tỉ lệ M/G của chế phẩm 1,2
Enzyme Accellerase 1500 ( do hãngSIGMA-ALDRICH cung cấp) với nhiệt độ tối ưu là 50 - 60°C và pH tối ưu là 4.0 - 5.0 có hoạt tính 2200 – 2800 CMC U/g
Enzyme Accellerase BG ( do hãngSIGMA-ALDRICH cung cấp) với nhiệt độ tối ưu là 35 - 55°C và pH tối ưu là 4.0 - 6.0 có hoạt tính 3000 pNPG U/g
Sử dụng hệ enzyme này để tăng hiệu quả thủy phân cellulose tạo thành đường glucose cung cấp cho quá trình lên men
2.1.5 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị a Hóa chất:
Các hóa chất được sử dụng trong phòng thí nghiệm có nguồn gốc từ Trung Quốc, trong khi một số hóa chất chuẩn chỉ thị được cung cấp bởi MERCK, đảm bảo tiêu chuẩn chất lượng cao.
Bảng 2.1 Các hóa chất được sử dụng trong luận án
Hóa chất Trạng thái, tính chất
Một số chỉ tiêu chất lượng Độ tinh khiết (≥ %)
Chất lỏng sánh, không màu CTPT: H2SO4
Chất rắn khan, màu trắng CTPT: NaOH
Chất lỏng sánh, không màu CTPT: CH3COOH
Glycine là một chất rắn tinh thể không màu, có vị ngọt
CTPT: NH2-CH2-COOH hoặc C2H5NO2 pH = 5.5 – 7.0
Chất rắn kết tinh màu trắng hay không màu
Chất dạng tinh thể không màu hay bột màu trắng CTPT: Ca(OH)2
Là một hợp chất hữu cơ, dễ cháy, không màu
Chất rắn tinh thể với màu đỏ-cam
Chất rắn tinh thể không màu ngậm 5 nước
Là một polysacarit carbohydrate chứa hỗn hợp amyloza và amylopectin
Là hỗn hợp các polypeptide và các axit amin được tạo ra bởi quá trình thủy phân protein
Gồm 3 thành phần chính: các peptide, protein, axit amin tự do
Chiết xuất nấm men là hỗn hợp dinh dưỡng thu được khi phân giải tế bào nấm men bằng enzyme hoặc bằng quá trình tự phân
Chế phẩm giàu acid amin và các vitamin ở dạng bột pH: 5.5 – 6.5
Có 2 dạng là mạnh vòng và mạch hở Nhưng trong thực tế glucose chỉ tồn tại ở dạng mạch vòng, có hai loại là α- Glucose và β-Glucose
Eppendorf, micropipette, buret 25ml, đũa thủy tinh, ống ly tâm, curvet, đĩa petri, cốc 500ml, cốc 100ml, ống đong, bình tam giác, và bình định mức 1000ml là những dụng cụ thiết yếu trong phòng thí nghiệm, hỗ trợ hiệu quả cho quá trình thí nghiệm.
- Tủ bảo quản mẫu: tủ lạnh
Thiết bị ly tâm Hettich EBA 21, với tốc độ 6000 vòng/phút, được sản xuất tại Đức, cùng với máy ly tâm lạnh đạt 10000 vòng/phút của hãng Hettich, mang đến hiệu suất cao và độ tin cậy trong các ứng dụng nghiên cứu và phòng thí nghiệm.
- Tủ sấy mẫu (Trung Quốc) d Các thiết bị phân tích:
- Máy đo quang phổ: sử dụng thiết bị đo quang phổ UV – Vis Spectrophotometer spectro UV - 2505
- Thiết bị phân tích đạm tổng: thiết bị phân tích đạm bán tự động Kjeldahl của Gerhardt (Đức)
- Cân phân tích (Trung Quốc)
- Nồi tiệt trùng của Gerhardt (Đức)
- Máy lắc ổn nhiệt (Trung Quốc)
Hình 2.4: Một số thiết bị dùng trong nghiên cứu
Các phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Mục đích và nội dung nghiên cứu
Thu nhận ethanol từ sinh khối rong bằng quá trình lên men sử dụng nấm men được cố định trong gel alginate
Hình 2.5: Quy trình chuyển hóa sinh khối thành ethanol
Trong đó ở quá trình thủy phân và lên men sẽ tiến hành theo 2 phương pháp là phương pháp SHF v à phương pháp SSF
Phương pháp SHF (Separate hydrolysis and fermentation)
Rong sau khi tiền xử lý, được tiến hành thủy phân ở nhiệt độ 50 °C bằng enzyme trong điều kiện vô trùng sau đó đưa vào thiết bị lên men
Phương pháp SSF (simultaneous saccharification and fermentation)
Sau khi hoàn tất quá trình tiền xử lý, enzyme cùng với các thành phần dinh dưỡng cần thiết được thêm vào môi trường để thực hiện quá trình thủy phân và lên men đồng thời.
Tinh sạch ethanol Lên men
Quá trình xử lý sơ bộ:
Sử dụng các biện pháp cơ học và lý học để làm sạch nguyên liệu giúp quá trình thủy phân diễn ra thuận lợi hơn Rong tươi sau khi thu hoạch cần được phơi khô dưới ánh nắng cho đến khi đạt độ giòn và độ ẩm còn 5 – 10% Sau đó, rong sẽ được xay nhỏ và sấy khô đến độ ẩm 5% trước khi bảo quản ở nơi khô ráo, chuẩn bị cho các bước tiếp theo.
Quá trình tiền xử lý:
Theo kết quả nghiên cứu tiền xử lý rong Chaetomorpha sp.của nhóm nghiên cứu thuộc viện Sinh học Nhiệt đới thành phố Hồ Chí Minh (2013)
Thông số phù hợp cho quá trình tiền xử lý sinh khối rong:
Quá trình chuyển đổi polysaccharide trong sinh khối rong thành đường đơn thông qua depolymer hóa hoặc thủy phân một phần trong giai đoạn tiền xử lý Để thực hiện quá trình này, thường sử dụng các enzyme thủy phân phù hợp, và việc lựa chọn enzyme sẽ phụ thuộc vào loại polysaccharide có trong rong.
Quá trình SHF là quá trình lên men được tách biệt với quá trình thủy phân, giúp dễ dàng kiểm soát các thông số và đạt hiệu quả cao nhất.
Quá trình SSF kết hợp thủy phân và lên men đồng thời, giúp giảm thiểu tạp nhiễm trong quá trình lên men Phương pháp này có chi phí thấp và yêu cầu ít thiết bị.
2.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình lên men SHF
Quy trình lên men SHF:
Hình 2.6: Quy trình lên men SHF
Sơ đồ thí nghiệm lên men SHF
Hình 2.7: Sơ đồ khảo sát thí nghiệm lên men SHF
Nhiệt độ lên men Thời gian lên men
Thủy phân Lên men SHF
Hiệu suất lên men Ethanol so với khối lượng glucose trong nguyên liệu
Xác định hàm lượng đường khử của cơ chất sau quá trình lên men
Thí nghiệm 1: Khảo sát nhiệt độ lên men phù hợp của quá trình lên men SHF Điều kiện thí nghiệm:
- Thực hiện quá trình lên men SHF bằng cách thay đổi nhiệt độ lên men lần lượt là 25 °C, 30°C, 35°C và 40 °C
- Thực hiện quá trình lên men SHF theo các thông số sau:
+ Mật độ nấm men: 15 x 10 6 (tế bào/ ml)
+ Nồng độ enzyme Accellerase 1500: 1600 CMC U/g
+ Nồng độ enzyme Accellerase BG: 968 pNPG U/g
Mục tiêu: Xác định nhiệt độ phù hợp cho quá trình lên men SHF
Kết quả đạt được bao gồm việc xác định nồng độ ethanol và hiệu suất của quá trình lên men SHF, cũng như hàm lượng đường khử còn lại trong cơ chất sau quá trình lên men.
Thí nghiệm 2: Khảo sát mật độ nấm men phù hợp của quá trình lên men SHF
- Thực hiện quá trình lên men SHF bằng cách thay đổi mật độ nấm men lần lượt là 5 x 10 6 , 10 x10 6 , 15 x10 6 và 20 x10 6 tế bào/ml dịch rong
- Thực hiện quá trình lên men SHF theo các thông số sau:
+ Nồng độ enzyme Accellerase 1500: 1600 CMC U/g
+ Nồng độ enzyme Accellerase BG: 968 pNPG U/g
+ Nhiệt độ: Kết quả được chọn ở thí nghiệm 1
Mục tiêu: Xác định mật độ nấm men phù hợp cho quá trình lên men SHF
Thí nghiệm 3: Khảo sát thời gian lên men phù quá trình lên men SHF
- Thực hiện quá trình lên men SHF bằng cách thay đổi thời gian lên men lần lượt là 12 giờ, 24 giờ, 30 giờ, 36 giờ, 42 giờ và 48 giờ
- Thực hiện quá trình lên men SHF theo các thông số sau:
+ Nồng độ enzyme Accellerase 1500: 1600 CMC U/g
+ Nồng độ enzyme Accellerase BG: 968 pNPG U/g
+ Nhiệt độ: Kết quả được chọn ở thí nghiệm 1
+ Mật độ nấm men: Kết quả được chọn ở thí nghiệm 2
Mục tiêu: Xác định thời gian phù hợp cho quá trình lên men SHF
Khảo sát thời gian (giờ)
Mật độ nấm men (triệu tb/ml)
2.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình lên men SSF a Quy trình lên men SSF
Hình 2.8: Sơ đồ quy trình lên men SSF
Rong sau khi được tiền xử lý sẽ được trung hòa pH về mức 5 bằng Ca(OH)2 Tiếp theo, bổ sung hai chế phẩm enzyme Accellerase 1500 và Accellerase BG cùng với nấm men để thực hiện quá trình thủy phân và lên men đồng thời trong phương pháp SSF.
Trung hòa giá trị pH
Thủy phân + Lên men đồng thời
121 o C, 30 phút b Sơ đồ thí nghiệm lên men SHF
Hình 2.9: Sơ đồ khảo sát thí nghiệm lên men SSF
Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ cơ chất phù hợp của quá trình lên men SSF
Thực hiện quá trình lên men SSF, lần lượt thay đổi nồng độ cơ chất Cố định các yếu tố khác
Thực hiện quá trình thủy phân và lên men SSF theo các thông số sau:
- Nồng độ enzyme Accellerase 1500: 1600 CMC U/g
- Nồng độ enzyme Accellerase BG: 968 pNPG U/g
- Mật độ nấm men: 15 x 10 6 (tế bào/ ml)
Khảo sát mật độ nấm men: 5, 10,
Hàm mục tiêu: Nồng độ Ethanol, động học quá trình lên men
Khảo sát ở nồng độ cơ chất: 5, 7.5,
Mục tiêu: Xác định nồng độ cơ chất phù hợp cho quá trình lên men
Kết quả cần đạt bao gồm việc xác định nồng độ ethanol và hiệu suất của quá trình lên men SSF, cũng như hàm lượng đường khử còn lại sau quá trình lên men.
Thí nghiệm 2: Khảo sát nhiệt độ ảnh hưởng đến lên men sinh khối rong bằng phương pháp SSF
Thực hiện quá trình lên men SSF bằng cách thay đổi nhiệt độ lên men lần lượt là, 30°C, 35°C, 37,5°C và 40 °C
Thực hiện quá trình lên men SSF theo các thông số sau:
Nồng độ cơ chất (%w/v): Chọn từ kết quả thí nghiệm 1
Nồng độ enzyme Accellerase 1500: 1600 CMC U/g
Nồng độ enzyme Accellerase BG: 968 pNPG U/g
Mật độ nấm men: 15 x 10 6 (tế bào/ ml)
Mục tiêu: Xác định nhiệt độ phù hợp cho quá trình lên men SSF
Thí nghiệm 3: Khảo sát mật độ nấm men phù hợp của quá trình lên men SSF
Thực hiện quá trình lên men SSF bằng cách thay đổi mật độ nấm men lần lượt là 5 x 10 6 , 10 x10 6 , 15 x10 6 và 20 x10 6 tế bào/ml dịch rong
Thực hiện quá trình lên men SSF theo các thông số sau:
Nồng độ cơ chất (%w/v): Chọn từ kết quả thí nghiệm 1
Nồng độ enzyme Accellerase 1500: 1600 CMC U/g
Nồng độ enzyme Accellerase BG: 968 pNPG U/g
Nhiệt độ: Chọn từ kết quả thí nghiệm 2
Mục tiêu: Xác định mật độ nấm men phù hợp cho quá trình lên men SSF
Kết quả đạt được bao gồm việc xác định nồng độ ethanol và hiệu suất của quá trình lên men SSF, cũng như hàm lượng đường khử còn lại trong cơ chất sau khi hoàn thành quá trình lên men.
Thí nghiệm 4: Khảo sát thời gian của quá trình lên men SSF
Thực hiện quá trình lên men SSF bằng cách thay thời gian lên men lần lượt là
Thực hiện quá trình lên men SHF theo các thông số sau:
Nồng độ cơ chất (%w/v): Chọn từ kết quả thí nghiệm 1
Nồng độ enzyme Accellerase 1500: 1600 CMC U/g
Nồng độ enzyme Accellerase BG: 968 pNPG U/g
Mật độ nấm men: chọn từ kết quả thí nghiệm 3
Nhiệt độ: chọn từ kết quả thí nghiệm 2
Mật độ nấm men (triệu tb/ml)
Mục tiêu: Xác định thời gian lên men phù hợp cho quá trình lên men SSF.
Các phương pháp phân tích
Xác định carbohydrate tổng và đường khử bằng phương pháp DNS [63]
Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Kjeldahl được phát triển bởi Johan Kjeldahl năm 1883
Xác định hàm lượng tro bằng phương pháp nung AOAC 930.30
Xác định hàm lượng nito amin – AOAC 945, 30 [4]
Xác định nồng độ Ethanol bằng phương pháp hóa học (Dien, 2010)
Phương pháp xử lý số liệu
Các thí nghiệm được thực hiện lặp lại 4 lần, với kết quả được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± SD Phần mềm Minitab 17 đã được sử dụng để phân tích thống kê dữ liệu thí nghiệm và đánh giá sự khác biệt giữa các mẫu.
Khảo sát thời gian (giờ)