Bao Cao Tong Hop Kc10.01-16-20.Pdf

KHO H V NG NGH VI N CÔNG NGH SINH H C Ọ Ấ 6 20 ứ ứ ụ ệ ụ ụ ả ệ ứ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ Ứ Ế Ứ Ấ Ợ Ế Ừ Ủ Ấ Ừ (Huperzia serrta) 6 20 Cơ quan chủ trì Viện Công nghệ sinh học ủ ệ TS L[.]

KHO H V NG NGH VI N CÔNG NGH SINH H C

T P TH CÁN B THAM GIA THỰC HIỆ TAI

Viện Công nghệ sinh học

Viện Công nghệ sinh học

Viện Công nghệ sinh học

Viện Công nghệ sinh học

Viện Công nghệ sinh học Đại họ ư H N i

Họ viện Qu n Y Công ty IMC

Viện Công nghệ sinh học

Viện Công nghệ sinh học

V th nh vi n th m gi kh

PDA Potato dextrose agar

PDB Potato dextrose broth

PVP K30 Polyvinylpyrrolidone

HPMC Hydroxypropyl Methyl cellulose

DTNB 5,5′-Dithiobis (2-nitrobenzoic acid)

T ĐVN Tiru hu n ư đi n Việt N m

2.3.1 Phân lập, tuyển chọn các chủng vi nấm nội sinh có khả năng sinh tổng

hợp up r in t h h t ng răng up r i s rr t i t N

18

) X định khả năng sinh tổng h p hoạt hất Hup rzin : 18

h) Định danh vi nấm n i sinh bằng phương ph p sinh học phân tử 22

2.3.2 Nghiên cứu nâng cao khả năng sinh tổng hợp Huperzine A của các

chủng nấ tu ển chọn

23

) Phương ph p bảo quản vi nấm cấy truyền trong ống thạch nghiêng 25 ) Phương ph p ảo quản vi nấm trong chất chống đ ng v điều kiện lạnh sâu 25

2.3.3 Nghiên cứu quy trình lên men các chủng nấm sản sinh ho t chất

Huperzine A qui mô pilot

26

) Khảo s t m i trường nh n giống v n m n 26

2.3.4 Nghiên ứu qu trình ông ngh tá h hiết, tinh s h, thu nhận ho t hất

Huperzine t sinh khối nấ

h)Tinh sạ h ằng sắ ký tr o đổi nion m r it IR 400

i)Tinh sạch bằng sắ ký tr o đổi anion DEAE-sepharose

29

29

)Phương ph p x định tồn dư m th no , th no , tạp hất kh , kim oại n ng 30

2.3.5 Nghiên cứu qu trình o hế v sản uất viên n ng ứng hứ ho t

2.3.6 Xây dựng tiêu chuẩn ơ sở của bán thành phẩm và thành phẩm 36

nhận thức của thần kinh trung ương tr n hu t nhắt trắng bị gây thiếu máu não

cục b làm giảm hoạt đ ng thần kinh, giảm trí nhớ

39

2.3.7.3 Đ nh gi t dụng cải thiện trí nhớ, tăng ường khả năng học tập và 41

nhận thức của thần kinh trung ương tr n hu t nhắt trắng già

2.3.7.4 Nghiên cứu ơ hế tác dụng củ Hup rzin n tế o n o hu t 43

3.1 Phân lập, tuyển chọn các chủng vi nấm nội sinh có khả năng sinh

t ng hợp up r in t câ hạch tùng răng cưa up r ia s rrata iệt

3.1.2 Xá ịnh khả năng sinh tổng hợp ho t chất Huperzine A của các chủng

nấm nội sinh phân lập ợ v tu ển họn ợ hủng khả năng sinh

3.3 Nghiên cứu qu trình lên m n các chủng nấm sản sinh hoạt chất

Huperzine A qui mô pilot

3 3 4 Nghiên ứu i u ki n ên n: Độ thông kh , p , nhi t ộ, ợng giống,

tuổi giống ho sinh tổng hợp Huperzine A

79

3 3 5 Nghiên ứu ộng thái quá trình ên n sinh tổng hợp up rzine A theo

ẻ trên thiết ị ên n 5-10 và 80-100 lít

82

3.3.6 X dựng qu trình nh n giống v qu trình ên n hủng nấ sản sinh

ho t hất up r in th o ẻ ở qu ô 5-10 lít và 80-100 lít

85

3.3.7 Nghiên ứu i u ki n ên n v dựng qu trình ên n hủng nấ

sản sinh ho t hất Huperzine A ở qu ô thiết ị ên n 500 t

92

4 Nghiên cứu qu trình công nghệ tách chiết, tinh sạch, thu nhận hoạt

chất up r in t sinh hối nấm

100

3 4 Nghiên ứu ự họn á i u ki n ông ngh tá h hiết, tinh s h v thu

nhận ho t hất up r in t sinh khối nấ th o qu ô ph ng th nghi

năng suất 2-3 g ẻ

100

3.4.1.1 Nghiên cứu lựa chọn điều kiện công nghệ t h hiết hoạt chất

Huperzine A từ sinh khối nấm quy m ph ng th nghiệm

100

3.4.1.2 Nghiên cứu lựa chọn điều kiện công nghệ tinh sạch và thu nhận

hoạt chất HupA từ sinh khối nấm quy mô phòng thí nghiệm

103

3.4.1.3 Xây dựng quy trình công nghệ tách chiết, tinh sạch và thu nhận hoạt

chất huperzine A từ sinh khối nấm quy mô 2-3 g/mẻ

114

3 4 2 Nghiên ứu ự họn á i u ki n ông ngh tá h hiết, tinh s h v thu

nhận ho t hất up r in th o qu ô pi ot năng suất ≥ 0g ẻ

118

3.4.2.1 Nghiên cứu lựa chọn công nghệ và thiết bị thích h p đ t h hiết hoạt

chất Hup rzin từ sinh khối nấm thu đư quy m pi ot

118

3.4.2.2 Nghiên cứu lựa chọn công nghệ và thiết bị thích h p đ tinh sạch và

thu nhận hoạt chất Huperzine A từ sinh khối nấm quy mô pilot

122

3.4.2.3 Xây dựng quy trình công nghệ tách chiết, tinh sạch và thu nhận hoạt

chất huperzine A từ sinh khối nấm quy m ≥ 10 g/mẻ

126

3 4 3 h o dõi ộ ổn ịnh củ ngu ên i u up ở i u ki n th ng và lão

hóa cấp tốc nguyên li u HupA

132

3.5 Nghiên cứu qu trình o chế v sản uất viên nang cứng chứa hoạt

chất up qui mô ph ng th nghiệm

135

3.5.1 Nghiên cứu lựa chọn công thức, công ngh bào chế viên nang, lựa chọn

và thiết kế o ì ng g i sản phẩm

135

3.5.1.1 Nghiên cứu lựa chọn t dư c và xây dựng công thức, qui trình bào chế

vi n n ng ứng ở quy mô phòng thí nghiệm (3000 viên nang/mẻ)

135

3.5.1.2 Nâng cấp và th m định quy trình sản xuất vi n n ng ứng quy m

10.000 viên nang/mẻ Sản xuất vi n n ng ứng trên quy mô 10.000 viên

3 6 2 X dựng tiêu huẩn ơ sở ủ viên n ng ứng hứ up

ánh giá t nh an to n ộc t nh v tác ng h trợ cải thiện tr nhớ trên

3 7 2 Đánh giá tá dụng hỗ trợ ải thi n tr nhớ trên thự nghi 183

3.7.2.1 Kết quả đ nh gi t dụng ải thiện tr nhớ, tăng ường khả năng họ tập v

nhận thứ ủ thần kinh trung ương tr n hu t nhắt trắng ị g y thiếu m u n o ụ

m giảm hoạt đ ng thần kinh, giảm tr nhớ

183

3.7.2.2.Đ nh gi t dụng cải thiện trí nhớ, tăng ường khả năng học tập và

nhận thức của thần kinh trung ương trên chu t nhắt trắng già

186

3 7 3 Nghiên ứu ơ hế tá dụng ủ up r in ên tế o n o huột 188

3.7.3.2 Kết quả đ nh gi khả năng ức chế enzym acetylcholinesterase (AChE)

Bảng 3.1: Kết quả phân lập nấm n i sinh từ các b phận của cây Thạch tùng

răng ư ph n ố tại S P v Đ Lạt – Việt Nam

Bảng 3.2b: Các chi, loài nấm và số ư ng nấm n i sinh phân lập từ cây

Thạ h t ng răng ư ph n ố tại Việt Nam

53

Bảng 3.3: Tỉ lệ sống sót của chủng M1.10 và T44C sau xử đ t biến 54 Bảng 3.4: Các khu n lạ đư c chọn ngẫu nhiên sau thời gian chiếu UV

Bảng 3.5: Các khu n lạ đư c chọn ngẫu nhiên sau thời gian xử lý NTG

Bảng 3.6: So s nh h m ư ng HupA giữa chủng đ t biến và chủng gốc

ảng 3.7: Lư ng sinh khối tươi thu đư v h m ư ng Hup trong dị h

hiết ủ hủng vi nấm nghi n ứu ở m i trường kh nh u

Bảng 3.8: Đ đi m sinh học của các chủng nấm sau bảo quản

Bảng 3.9: Khả năng sinh trưởng của 2 chủng nấm Tsp25 v LĐL 4.4 tr n

m t số m i trường nhân giống

Bảng 3.10: Lư ng sinh khối tươi thu đư v h m ư ng HupA trong dịch

chiết của các chủng vi nấm nghiên cứu ở m i trường lên men khác nhau

Bảng 3.11 Ảnh hưởng của nguồn on đến khả năng sinh tổng h p HupA

Bảng 3.14: Ảnh hưởng của tỉ lệ dung dịch MS tới sinh khối tươi v h m

ư ng Hup ủ hủng vi nấm nghi n ứu

Bảng 3.15: Ảnh hưởng của tiền chất tới sinh khối tươi v h m ư ng Hup

ư ng Hup ủ 2 hủng vi nấm nghi n ứu

ảng 3.17 Ảnh hưởng ủ thời gi n nh n giống đến khả năng sinh tổng h p

ảng 3.35 Thời gi n thự hiện ng đoạn trong 1 mẻ n m n

Bảng 3.36 H m ư ng HupA thu đư c từ các mẻ lên men

Bảng 3.37 Kết quả HPLC ki m tr h m ư ng ũng như đ sạch củ 3 mẫu

HupA tinh sạch qua c t than hoạt tính và cồn

Bảng 3.38 Kết quả HPLC ki m tr h m ư ng ũng như đ sạch củ 3 mẫu

HupA tinh sạch sau khi nghiên cứu điều kiện kết tinh

Bảng 3.39 Ảnh hưởng của nhiệt đ đến quá trình kết tinh

79

Bảng 3.40 Ảnh hưởng của nồng đ Hup đến quá trình kết tinh

Bảng 3.41 Ảnh hưởng của thời gi n đến quá trình kết tinh

Bảng 3.42 Ảnh hưởng củ pH đến quá trình kết tinh

Bảng 3.43 Kết quả HPLC ki m tr h m ư ng ũng như đ sạch củ 3 mẫu

HupA tinh sạch sau khi nghiên cứu điều kiện kết tinh

Bảng 3.44 Tóm tắt quá trình tách chiết, tinh sạch theo mẻ chế ph m

huperzine A

Bảng 3.45 Kết qủa các hỉ ti u hó – ý – sinh ủ th nh ph m t Hup

tinh khiết

Bảng 3.46 Đ bền cảm quan sản ph m HupA sau 6 tháng bảo quản

Bảng 3.47 H m ư ng Huperzin A ở các thời đi m nghiên cứu sau các thời

gian sau 6 tháng bảo quản

Bảng 3.48 Tính ổn định của sản ph m Huperzin A qua các thời gian bảo

quản

Bảng 3.49 Đ bền hoạt tính sinh học của Huperzin A sau 6 tháng bảo quản

Bảng 3.50 Hình thức và hàm m của hỗn h p nghiên cứu t nh tương h p

với HupA

Bảng 3.51 Đ trơn hảy của cốm HupA với tỷ lệ Aerosil khác nhau

Bảng 3.52 Thời gian rã (phút) của các mẫu viên nang có tỷ lệ t dư c rã

khác nhau

Bảng 3.53: Công thức sản xuất viên nang Huperzine A 100mcg

Bảng 3.54: Kết quả ki m tra ba mẫu cốm Hup A

Bảng 3.55: Kết quả ki m tra các mẫu cốm lactose

Bảng 3.56: Kết quả đ đồng đều hàm lư ng Huperzine A theo thời gian tr n

Bảng 3.57: Kết quả ki m tra cốm sau tr n ngoài trên 3 lô th m định

Bảng 3.58: Kết quả ki m tra khối ư ng cốm trong nang

Bảng 3.59: Kết quả ki m tr đ m v đ rã viên

Bảng 3.60: Kết quả ki m tra cảm qu n, đ m, đ kín lọ

Bảng 3.61: Kết quả ki m tra 3 lô thành ph m

Bảng 3.62: Kết quả ki m tra viên nang lô 010718, 020718

Bảng 3.63: Kết quả ki m tra mẫu chọn o đóng gói s u 1 th ng th o dõi

Bảng 3.64: Kết quả ki m tra mẫu chọn o đóng gói s u 3 th ng th o dõi

Bảng 3.65: Kết quả ki m tra thành ph m tại thời đi m To

Bảng 3.66: Kết quả ki m tra tại thời đi m T3 – LHCT

Bảng 3.67: Kết quả ki m tra tại thời đi m T6 – LHCT

Bảng 3.68: H m ư ng Huperzine A trong các mẫu LHCT

Bảng 1.69: Đồng đều hàm ư ng Huperzine A trong các mẫu LHCT

Bảng 3.70: Kết quả ki m tra tại thời đi m T3 - ĐK Q

Bảng 3.71: Kết quả ki m tra tại thời đi m T6 – ĐK Q

Bảng 3.72: Kết quả ki m tra tại T9 – ĐK Q

Bảng 3.73: Kết quả ki m tra tại thời đi m T12 – ĐK Q

Bảng 3.74: H m ư ng Hup rzin đ nh gi th o dõi ở ĐK Q

Bảng 32.75: Đồng đều h m ư ng Huperzine A trong mẫu theo dõi ở ĐK Q

Bảng 3.76: H m ư ng dung môi tồn dư

ảng 3.77 Đ t nh ấp đường uống ủ vi n n ng Hup rzin tr n hu t nhắt trắng

ảng 3.77b Ảnh hưởng ủ vi n n ng Hup rzin đối vớith trọng hu t (n = 10, ± SD)

ảng 3.78 Ảnh hưởng ủ vi n n ng Hup rzin đối vớiđiện tim hu t (n = 10, x±SD)

ảng 3.79 Ảnh hưởng ủ vi n n ng Hup rzin n số ư ng hồng ầu

v h m ư ng huyết sắ tố trong m u hu t (n = 10, x± SD)

ảng 3.80 Ảnh hưởng ủ vi n n ng Hup rzin n h m to rit v th

t h trung nh hồng ầu trong m u hu t (n = 10, x± SD)

ảng 3.81 Ảnh hưởng ủ vi n n ng Hup rzin n số ư ng ạ h ầu

Bảng 3.85 Kết qủ đ nh gi t dụng của các chế ph m nghiên cứu lên hoạt

đ ng của chu t nhắt trắng dùng mô hình bảng đục lỗ (x± SD, n = 10)

ảng 3.86 Kết quả đo thời gi n chu t tìm thấy h n đế (giây) ở bài tập có bến

đỗ (x± SD, n = 10)

ảng 3.87 Kết quả đo thời gi n ơi trong v ng ó ph o ở i tập kh ng ó ến

đỗ (x± SD, n = 10)

Bảng 3.88: Tố đ hình thành phản xạ ó điều kiện tìm thứ ăn trong m

của các lô chu t nghiên cứu (x± SD, n = 10)

Bảng 3.89: Tố đ dập tắt phản xạ ó điều kiện tìm thứ ăn trong m của

chu t nhắt trắng các lô nghiên cứu (x± SD, n = 10)

Bảng 3.90 Kết quả đ nh gi t dụng của Huperzine A trong thử nghiệm

tránh né chủ đ ng (active acvoidant) (x± SD, n = 10)

Bảng 3.91 Hoạt tính AChE trên các vùng não chu t (x± SD, n = 10)

Bảng 3.92 Nồng đ ức chế 50% (IC50) của Huperzine A và Tacrin

Bảng 3.93 H m ư ng MDA não chu t nghiên cứu(x± SD, n = 10)

Bảng 3.94 H m ư ng SOD não chu t nghiên cứu

Bảng 3.95 H m ư ng GSH-Pxnão chu t nghiên cứu

Bảng 3.96 H m ư ng CATnão chu t nghiên cứu

H nh 2.1: Sơ đồ thự hiện nghi n ứu sản xuất vi n n ng Hup rzin 33

H nh 2.5: M y đo phản xạ tự đ ng ó điều kiện Automatic Reflez

Conditioner Cat No 7530, Ugo Basile

43

Hình 3.1: Cây H serrata thu thập tại Vườn quốc gia Hoàng Liên, Sa Pa –

Lào Cai

46

Hình 3.2: Cây H serrata thu thập tại Langbiang – Đ Lạt (L m Đồng) 46

Hình 3.14: Kết quả điện di sản ph m PCR khuế h đại gen ITS1-5,8S-ITS4

của m t số chủng vi nấm nghiên cứu trên gel agarose 1%

phát hiện bằng thuốc nhu m KMnO4 0.3%

Hình 3.17: Khu n lạc các chủng đ t biến 25uv 15.3 (A), 25hc 30.2 (B),

20hc 10.1 (C), 4.4hc 15.2 (D) và 5.2uv20.3 (E), 41uv20.1 (F), 4.4hc 20.1

58

59

(G), 4.4uv30.3(H), Muv 15.1(I), Tuv10.3 (K) và Thc20.2 (L)

Hình 3.18: Sinh khối lên men của chủng 25uv15.3 (A), 25hc20.2 (B), 5.2uv

20.3(C) và 41uv20.1 (D)

Hình 3.19: Sắ k đồ HPLC của chủng 25hc30.2 và 25uv15.3

Hình 3.20: Ảnh hưởng của nhiệt đ đến sinh trưởng hệ s i nấm của 7 chủng

nấm

Hình 3.21: Ảnh hưởng củ pH đến sinh trưởng hệ s i nấm

Hình 3.22: Ảnh hưởng của tố đ lắ đến sinh trưởng hệ s i nấm

Hình 3.22a: Sinh khối lên men của chủng Tsp 41 tr n m i trường MT 9 (A),

chủng Tsp 20 tr n m i trường MT 5 (B) và chủng Rsp 5.2 tr n m i trường

MT 8 ( ), Tsp 25 tr n m i trường MT 5 ( ), LĐL 4.4 tr n m i trường MT

9 (E), M1.10 tr n m i trường MT 7 (G), T44 tr n m i trường MT 9 (H)

Hình 3.23: Sắ k đồ h m ư ng HupA của chủng Tsp 25 tr n m i trường

MT 1 (A) và MT 2 (B); chủng LĐL 4.4 tr n m i trường MT 1 (C)

Hình 3.24: Sắ k đồ x định h m ư ng HupA của chủng Tsp25 trên môi

trường MT 5 (A) và chủng LĐL 4.4 tr n m i trường MT 9 (B)

Hình 3.25: Các ống penicillin giữ chủng giống vi nấm và hình thái các

chủng nấm đư c hoạt hó tr n m i trường PDA sau bảo quản lạnh sâu

Hình 3.26: Sinh khối chủng Tsp 25 trong m i trường khoai tây (A), PDA

(B) và Czapek – Dox (C); chủng LĐL 4.4 trong m i trường khoai tây (D),

Czapek – Dox (E) và PDA (F)

Hình 3.27: Sinh khối lên men của chủng Tsp25 tr n m i trường MT 5 (A),

MT 9 (B), YM (C), Li (D) và Zhao (E); chủng LĐL 4.4 tr n m i trường

MT 5 (F), MT 9 (G), YM (H), LI (I) và Zhao (K)

Hình 3.28: Sinh khối và dịch chiết nấm chủng Tsp 25 v LĐL4.4 tr n m i

trường bổ sung cao nấm men

Hình 3.29: Dịch chiết và sinh khối chủng Tsp 25 v LĐL 4.4 thu đư c ở

m i trường pH 7, nhiệt đ nuôi cấy 28o

C Hình 3.30 Bình giống cấp I chủng LĐL 4.4 ( ) v Tsp 25 ( )

Hình 3.31 Quy trình lên men Huperzin A theo mẻ ở quy mô 5-10 lít

Hình 3.32 Quy trình lên men Huperzin A theo mẻ quy mô 80-100 lít

Hình 3.33 Nhân giống cấp 2 trên thiết bị lên men 10 lít và lên men chủng

LĐL 4.4 v Tsp 25 tr n thiết bị lên men 100 lít

Hình 3.34 Quy trình lên men Huperzin A theo mẻ ở quy mô bình 500 lít

H nh 3.35 H nh ảnh n m n sản xuất HupA trên thiết bị lên men 500 lít

v mẫu dị h hiết ủ hủng M1.10 từ phương ph p hiết bằng cồn ( ),

ằng tổng h p( ), dung m i hữu ơ ( ), ằng x t o ng (E)

Hình 3.39 Sắ ký đồ TL ph n đoạn tinh sạch HupA từ dịch lên men

chủng Penicillium sp LDL4.4 khi qua c t sephadex G100

Hình 3.40 (A) Sắ ký đồ TL ph n đoạn tinh sạch HupA khi qua c t

sắ ký tr o đổi anion amberlite IRA67: (B) c t anion amberlite IRA67

Hình 3.41 Sắ ký đồ TL ph n đoạn tinh sạch HupA khi qua c t sắc ký

tr o đổi anion DEAE-sepharose

H nh 3.42 Thu ph n đoạn qua c t than hoạt t nh; ( ) đ c dịch mẫu chiết

qua c t than hoạt tính (B; (C) Kết quả TLC ki m tr ph n đoạn tinh sạch

khi qua c t than hoạt tính

Hình 3.43 (A) TLC ki m tr ph n đoạn tinh sạch khi chiết bằng cồn ần

1, ( ) đ c dịch mẫu chiết v ( ) TL ki m tr ph n đoạn tinh sạch

khi chiết bằng cồn ần 2

H nh 3.44 Đ sạch củ Hup mẫu TST4.2 tinh sạch từ HupA thô

Hình 3.45 TLC dịch Huperzin A thô bằng các hệ dung môi khác nhau (1) Chloroform : methanol (9:1, v/v); (2) 1-Butanol : isopropanol : H2O (10 :

5 : 4, v ⁄ v ⁄ v); (3) h oro orm : ton : isoprop no (4:4:2, v/v/v); (4)

Chloroform : methanol : acetone : H2O (4:4:1,5:0,05) (C) HupA chuẩn; (M)

mẫu dịch chiết tr ớc khi tinh s ch

H nh 3.46 TL ph n đoạn tinh sạch HupA từ dị h Hup th qu t

silica gel bằng hệ dung môi chloroform : methanol với các tỉ lệ khác nhau;

(C) HupA chuẩn; (LC) mẫu lên cột, tr ớc khi tinh s ch

Hình 3.47 Sự phân tách các h p chất trên c t si i g 60F254 khi đ y

bằng dung môi chloroform

Hình 3.48 Sự phân tách các h p chất trên c t si i g 60F254 khi đ y

bằng dung môi chloroform : methanol (10:0,5, v/v)

Hình 3.49 Sự phân tách các h p chất trên c t si i g 60F254 khi đ y

bằng dung môi chloroform : methanol (9:1, v/v)

H nh 3.50 TL ph n đoạn tinh sạch HupA từ dịch HupA thô (C: HupA

chuẩn)

H nh 3.51 Đ sạch của HupA tinh sạch từ HupA th qu t si i g ần 2

Hình 3.52 Kết quả TLC ki m tr ph n đoạn tinh sạch khi chiết bằng

aceton, methanol, ethanol

H nh 3.55 t nấm kh hứ Hup thu đư

H nh 3.56 t Hup thu đư s u t h hiết, ản TLC mẫu dịch chiết và

HPLC củ sản ph m Hup th thu đư

H nh 3.57 ( ) ị h hiết Hup s u tinh sạ h, ( ) TL ph n đoạn từ

Hup tinh sạ h (1-3: mẫu dị h hiết ủ ph n đoạn, : mẫu hup

111

112

114

115

116

116

H nh 3.59 Quy trình tách chiết, tinh sạch v thu nhận Hup rzin tinh

khiết từ sinh khối nấm

H nh 3.60 L n m n sản xuất tr n quy m pi ot v dị h n m n trướ khi

Hình 3.63 (A) TLC các mẻ chiết thu HupA thô từ sinh khối nấm ( ần ư t:

PP1, PP2, PP3); (B) T h hiết Hup tr n hệ thống t h hiết v qu y

dung m i i n tụ , ( ) t Hup th thu đư ủ 3 phương ph p t h hiết

Hình 3.64 TLC Huperzine A tinh sạch bằng sắ ký ph thường quy mô pilot

Hình 3.65 Kết quả HPLC mẫu HupA tinh sạ h s u khi đ đư c kết tinh

H nh 3.66 Kết tinh thu nhận Hup tinh sạ h ằng ton ạnh v HPL

mẫu HupA tinh sạ h s u khi đ đư c kết tinh trong aceton 0-40C

H nh 3.67 Sinh khối nấm kh v t nấm kh thu đư qui m pilot

Hình 3.68 Sắc ký bản mỏng TLC mẫu HupA thô và b t Hup th thu đư

H nh 3.68 TL ph n đoạn tinh sạ h Hup rzin thu đư , sản ph m

Hup tinh sạ h v HPL ủ sản ph m Hup tinh sạ h thu đư

H nh 3.69 Hoạt t nh ứ hế hE I 50 ủ mẫu Hup hu n v mẫu Hup

tinh khiết nghi n ứu

H nh 3.70 Quy trình tách chiết, tinh sạch v thu nhận Hup rzin tinh

khiết từ sinh khối nấm qui m pi ot

Hình 3.71 Phổ HPLC của các mẫu HupA tại các thời đi m nghiên cứu: (A)

n đầu, (B) Sau 3 tháng bảo quản và sau 6 tháng bảo quản (C)

H nh 3.72 H m ư ng Huperzin A theo các tháng bảo quản

H nh 3.73 Sản xuất vi n n ng v vi n n ng th nh ph m

Hình 3.73 Sơ đồ quy trình bào chế viên nang HupA quy mô 10.000 viên/lô

Hình 3.74: Bi u đồ đ m sau 6 tháng theo dõi ở điều kiện lão hóa cấp tốc

Hình 3.75 Bi u đồ d m sau 12 tháng theo dõi ở điều kiện bảo quản

H nh 3.76 Phổ 1H NMR ủ mẫu Hup nghi n ứu

H nh 3.77 Phổ UV-VIS, MS v HPL ủ hất Hup nghi n ứu

Hình 3.78: Sắ ký đồ mẫu thử HupA qua các lần thử nghiệm

Hình 3.79: Sắ ký đồ các dung môi qua 3 lần tiêm mẫu

Hình 3.80: Pic khối phổ các nguyên tố kim loại tồn dư

Hình 3.81: Hình ảnh sắ ký đồ phân tích Huperzine A trong mẫu trắng

Hình 3.82: Hình ảnh sắ ký đồ phân tích Huperzine A trong mẫu giả dư c

Hình 3.83: Hình ảnh sắ ký đồ phân tích HupA trong mẫu th m định đ đ c

Ly opodium k oid, đư c tách chiết lần đầu tiên từ m t cây thảo dư c truyền thống

của Trung Quốc - Huperzia serrata (Thun x Murr y) Tr v (Thạ h t ng răng ư )

trong những năm 1980 S u khi ng tr nh nghi n ứu của các nhà khoa học Trung Quố đư c công bố, thì các nhà khoa họ Phương T y đ kết luận rằng chất này có tác dụng trong việc chữa trị các bệnh về trí nhớ, đ c biệt đối với bệnh Alzeimer củ người già ệnh rối oạn tr nhớ ng y ng trẻ hó tr n to n ầu T dụng tích cực từ hoạt chất Hup rzin đ mở r hướng rẽ mới cho y học, nó không chỉ hỗ tr điều trị hiệu quả cho não b củ người bệnh zh im r, người già có bi u hiện sụt giảm trí nhớ mà

còn có hiệu quả trong việc cải thiện trí nhớ ở người lớn khỏe mạnh Đối với Việt Nam,

hiện nay tỷ lệ người lớn tuổi ng y ng gi tăng, v ệnh rối loạn về trí nhớ ũng phát tri n, dẫn đến nhu cầu về chữa bệnh ũng tăng n Tỷ lệ người già củ nước phát tri n ũng hiếm tỷ lệ đ ng k và vấn đề đư đ t ra là phải có những biện pháp

giúp đ họ có cu c sống hài hòa

Việt Nam là m t trong đất nước giàu tiềm năng nhất về cây thuố Đ c biệt

những o i y đư c sử dụng chữa các bệnh hi m nghèo Cây Thạ h t ng răng ư (H serrata) là m t o i dư c liệu quý hiếm của Việt N m trong s h đỏ , đ ng ần đư

ảo tồn ũng như kh i th v ph t tri n nhằm thu nhận đư hoạt hất Hup m nguồn nguy n iệu ho việ sản xuất thuố hỗ tr điều trị rối oạn tr nhớ, đ iệt

zh im r tại Việt N m Ở Việt Nam, cây Thạ h t ng răng ư hỉ mọc ở núi cao trên

1000 m, hiện nay phát hiện đư c ở S p (L o i) v Đ Lạt (L m Đồng) Chúng thường mọ dưới tán rừng qu nh năm m ướt, nhiều m n húng m t o i dư c liệu qúy, nhưng hư đư c quan tâm nghiên cứu và khai thác ứng dụng trong điều trị ệnh rối oạn tr nhớ tại Việt Nam Vì vậy, cần thiết phải đ t ra vấn đề bảo tồn nguồn gien qúy hiếm này, song song với việc tổ chức gây trồng và từng ước nghiên cứu, sản xuất

và biến nó thành hàng hóa cung cấp cho thị trường trong v ngo i nước Tuy nhiên, do

điều kiện nuôi trồng thực vật cây H serrata ũng như nu i ấy y in vitro rất khó khăn

(đ i hỏi phải mất nhiều thời gian, chi phí nhiều cho trồng trọt) đ có th chiết t h đư c

m t ư ng lớn HupA, nên việc tìm kiếm chủng vi nấm sản sinh ra HupA là rất quan trọng cần đư c quan tâm và là m t hướng đi mới nhằm hướng tới m t nguồn nguyên liệu lớn có hiệu quả kinh tế cho ngành công nghiệp dư trong nướ v trong điều trị bệnh rối loạn trí nhớ tại Việt N m, đ p ứng cho nhu cầu thị trường trong v ngo i nước

M t khác, trên thị trường dư c liệu trong nước hiện nay chủ yếu là các sản ph m thuốc

hỗ tr điều trị chữa bệnh rối loạn trí nhớ ó hứ hoạt hất Hup đư c nhập ngoại, các sản ph m trong nước từ nguồn nguyên liệu bản địa là hầu như hư ó h nh vậy, việc phát tri n các sản ph m trong nước cần đư qu n t m đ y mạnh nhằm giảm giá thành sản ph m giúp người dân tiếp cận đư v ó điều kiện hơn trong hữa trị bệnh góp phần đảm bảo và nâng cao sức khỏe c ng đồng v tăng hiệu quả kinh tế, xã h i

Xuất ph t từ kết quả ướ đầu ủ nhóm đề t i (nhóm đề t i đ ph n ập đư

02 hủng vi nấm ó khả năng tổng h p Hup từ y H serrata Việt N m), khi ó

chủng vi nấm sản sinh hoạt hất Hup , ằng công nghệ lên men, với các nghiên cứu tối

ưu về thành phần m i trường v điều kiện nuôi cấy như khi vi sinh vật tồn tại trong dịch

nhựa cây H serrata, húng t ó th lên men, thu hồi h p chất HupA m t cách nhanh

hơn, đơn giản hơn, hiệu quả o hơn m kh ng ần tới sự sinh trưởng và phát tri n của cây trồng, đó h nh yếu tố cần ó đ tiến hành nghiên cứu

Tr n ơ sở t nh năng ưu việt củ hủng vi nấm n i sinh trong cây H

serrata m húng t i ph n ập đư , húng t i đ thực hiện đề tài: ứu bào

ch viên nang chứa hoạt chấ z ược tách chi t từ m t số chủng nấm

phân lập từ cây Thạ ù ư (Huperzia serrata) với mục tiêu sản xuất

đư vi n n ng hứ hoạt hất Hup rzin từ nguồn nguy n iệu ản đị phụ vụ hỗ

tr điều trị các bệnh về trí nhớ, đ c biệt là bệnh Alzheimer, giúp những người bị bệnh khỏ mạnh, ó khả năng sinh hoạt như nh thường Từ đó góp phần giảm giá thành sản

ph m, nâng cao sức khỏe c ng đồng v tăng hiệu quả kinh tế, xã h i

ụ :

Nghi n ứu v sản xuất đư vi n n ng hứ hoạt hất Hup rzin t h hiết từ

m t số hủng nấm ph n ập từ y Thạ h t ng răng ư (Huperzia serrata) Việt N m

phụ vụ hỗ tr điều trị ệnh về tr nhớ, đ iệt ệnh zh im r

ụ ụ :

1 Tuy n họn đư hủng nấm ó khả năng sản sinh hoạt hất Hup rzin o

từ y Thạ h t ng răng ư (Huperzia serrata)

2 X y dựng đư qui tr nh n m n hủng nấm nói tr n

3 X y dựng đư qui tr nh t h hiết, tinh sạ h, thu nhận hoạt hất Hup rzin từ sinh khối nấm

4 Nghi n ứu qui tr nh o hế vi n n ng hứ hoạt hất Hup rzin qui m ph ng

N i dung 3 Nghi n ứu quy tr nh n m n hủng nấm sản sinh hoạt hất Hup rzin

A qui mô pilot

N i dung 4 Nghi n ứu quy tr nh ng nghệ t h hiết, tinh sạ h, thu nhận hoạt hất Hup rzin từ sinh khối nấm

N i dung 5: Nghi n ứu quy tr nh o hế v sản xuất vi n n ng ứng hứ hoạt hất Hup qui m ph ng th nghiệm

N i dung 6 X y dựng ti u hu n ơ sở ủ n th nh ph m v th nh ph m

N i dung 7 Đ nh gi t nh n to n (đ t nh) v t dụng hỗ tr ải thiện tr nhớ tr n thự nghiệm

Ổ Q

1.2 Giới thiệu cây thạ ù ư

1.1.1 Khái niệm và lịch sử nghiên cứu

Thạ h t ng răng ư (TTRC) hay còn gọi là cây chân sói (Huperzia serrata) là

m t loài thực vật có mạch (nhóm thực vật có các mô hóa gỗ đ dẫn truyền nước, khoáng chất và các sản ph m quang h p trong cây; ngoài thạch tùng còn có ngành dương xỉ, m c t c, thực vật có hoa, thực vật lá kim và thực vật hạt trần khác) trong họ Thạch tùng (còn gọi th ng đất, các loài họ này mang bào tử trong m t cấu trúc chuyên biệt hóa ở đỉnh củ th n y, húng tr ng như i h y nhỏ, không ra hoa và không có hạt)

Đư c biết nhiều đến ở Trung Quố dưới tên gọi Qian Ceng Ta Trong truyền thống Trung Quốc thì cây TTRC đư c sử dụng làm thuố điều trị sưng, sốt, bầm máu, tinh thần phân lập, ở Vân Nam (Trung Quốc) cây còn dùng trị viêm phổi, phế ung, lao thương thổ huyết, ng đ c ghi hép đ lại trong cuốn dư đi n ó t n n o Shi Yi từ thời cổ đại năm 739 Năm 1948 nh kho học Trung Quốc phân lập đư c hoạt chất chính của cây là m t alcaloide có tên là Huperzine A, các thí nghiệm lâm sàng ũng như ứng dụng điều trị đ đư c tiến hành ở quốc gia này Sau đó các nhà khoa

họ Phương T y đ kết luận rằng chất này có tác dụng trong việc chữa trị các bênh liên

qu n đến trí nhớ, đ c biệt là bệnh Alzheimer củ người già Alkaloid này có khả năng

xuyên qua hàng rào mạ h m u n o v t đ ng trực tiếp lên não b với liều ư ng rất thấp tính bằng microgram Trên thực tế, alkaloid này ức chế việc sinh ra

acetylcholinesterase, m t enzyme tạo ra sự suy thoái của acetylcholine Khi enzyme này

bị thiếu hụt, ho c chỉ có với h m ư ng rất thấp th h m ư ng acetylcholine trong não tăng n, giúp ho tr nhớ và các chứ năng nhận thứ đư c cải thiện (khi acetylcholine

đư sinh r đồng nghĩ với việc nó sẽ tác dụng với nướ đ tạo ra cholin và acetate,

m t trong các chất dẫn truyền trong dây thần kinh)

Do có giá trị sử dụng cao trong y học dẫn đến khai thác quá mức c ng thêm quá

tr nh sinh trưởng chậm nên hiện nay, trên Thế giới và Việt Nam, H serrata đ ng đư c

đư v o trong d nh s h nguy ơ tuyệt chủng, các loài thực vật quý hiếm cần đư c bảo tồn Đ ó nhiều nghiên cứu về việc nhân giống bảo tồn giống cây quý này

1.1.2 Mô tả

Thạ h t ng răng ư o khoảng 15-40 m, đơn h y ư ng phân 1-2 lần, đường kính khoảng 2mm, hình trụ Lá có hình bầu dụ mũi m , d i 15mm r ng 3mm, tương đối mỏng, gân giữ rõ, mép ó răng Túi o tử ở nách nhánh lá, túi bào tử hình thận,

m u v ng tươi Sinh sản bằng các bào tử trong m i trường ướt như mư m cao, có khả năng phục hồi, mọc chồi sau khi bị cắt ho c gãy (hình 1.1)

Hình 1.1: Hình ảnh cây Thạ h t ng răng ư (Huperzia serrata)

1.1.3 Phân bố

Thạ h t ng răng ư sống trên các vùng núi cao, mọc ở những nơi ó đ m và mùn cao; phân bố nhiều từ vùng cận nhiệt đới đến vùng nhiệt đới: khu vực ở ph đ ng,

ph n m v V ng Đ ng N m Á, h u Đại ương, Trung Mỹ và Trung Quốc

Ở Việt Nam cây TTRC sống ở đ cao trên 1000m so với mự nước bi n, phân bố

ở h i v ng núi h nh S P v Đ Lạt, và còn có ở Cao Bằng, Quảng trị, Khánh Hòa, Quảng N m Đ Nẵng, chúng mọ dưới tán rừng qu nh năm m ướt, nhiều mùn

B : Lycopodiales (Phân loại của nhóm này trong những năm gần đ y vẫn hư

đư c giải quyết và vẫn hư ó sự đồng thuận Các phân loại ũ ó định nghĩ v giới

hạn r ng hơn ho hi Lycopodium (thạch tùng), và thực tế bao gồm toàn b các loài của

b Lycopodiales Trong những năm gần đ y ó định nghĩ cho chi Lycopodium hẹp hơn

và xếp các loài khác trong vài chi, m t sự xếp đ t đư c cả các dữ liệu hình thái học lẫn

dữ liệu phân tử hỗ tr v đư c phê chu n trong m t loạt các sử đổi cho nhóm thực vật

n y hi n y rơi v o h i nhóm kh iệt nhưng vẫn hư ó đồng thuận về việc nên

công nhận chúng trong m t họ duy nhất là Lycopodiaceae hay nên tách chúng ra thành hai họ: là họ Lycopodiaceae với định nghĩ hẹp và họ Huperziaceae (thạch sam)

Họ: Lycopodiaceae (thạ h s m, th ng đất)

Chi: Huperzia

Loài: H serrata

1.3 Vi nấm n i sinh thực vật

1.2.1 ịnh nghĩa vi nấm nội sinh thực vật

Vi nấm n i sinh (VNNS) là các loài vi nấm tồn tại trong mô của thực vật, ở ơ

qu n kh nh u như , rễ, cành, thân trong ít nhất m t phần v ng đời của nó mà không gây triệu chứng bệnh rõ ràng cho cây Vi nấm n i sinh có m t khắp nơi v đ

đư c tìm thấy trong tất cả các loài thực vật đư c nghiên cứu ho đến nay; tuy nhiên, hầu hết các mối quan hệ thực vật và VNNS vẫn hư đư c hi u rõ, nó phụ thu c vào cách vi nấm hình thành khu n lạc trong mô tế bào thực vật ở gi i đoạn sinh trưởng phát tri n cây chủ M t số VNNS có th tăng ường sự phát tri n của vật chủ, thu nhận chất dinh dư ng và cải thiện khả năng hịu đựng áp lực phi sinh học củ y, như hạn hán và giảm ăng thẳng sinh học bằng h tăng ường sứ đề kháng củ y đối với

côn trùng, mầm bệnh v đ ng vật ăn ỏ (K iz v P t r, 2008)

1.2.2 Quan hệ giữa nấm nội sinh và vật chủ

 Quan h hỗ sinh

Các VNNS và thực vật thường tham gia vào sự tương hỗ, với các VNNS chủ yếu

hỗ tr sức khỏe và sự sống của cây chủ với các vấn đề như mầm bệnh và bệnh, stress nước, stress nhiệt, chất dinh dư ng và chất ư ng đất kém, đ m n v đ ng vật ăn ỏ Đổi lại, VNNS nhận r on ho năng ư ng từ cây chủ Tương t giữa thực vật và VNNS không gây nghiêm trọng lẫn nhau, nhưng VNNS có khả năng trở thành mầm

bệnh ho c hoại sinh ho c có th sinh sản trong điều kiện m i trường tự do khi cây chủ của chúng bị bất l i ho c bắt đầu suy như c và hạn chế ư ng carbon cung cấp cho VNNS (Jia và cs, 2016) VNNS ũng có th xâm chiếm r ng rãi các mô thực vật và loại trừ cạnh tranh các mầm bệnh tiềm năng kh x m hiếm tế bào cây chủ bằng h ngăn

ch n các sinh vật gây bệnh ho c ký sinh trùng khác (Zabalgogeazcoa 2008)

Các nghiên cứu đ hỉ ra rằng VNNS phát tri n trong m t tương t rất mật thiết với các tế bào thực vật chủ của chúng S i nấm đ đư c nhìn thấy phát tri n ho c làm phẳng ho c nêm vào các tế bào thực vật M h nh tăng trưởng này chỉ ra rằng s i nấm

đư c gắn ch t vào thành tế bào của cây chủ, nhưng kh ng x m ấn tế bào thực vật (Christensen và cs, 2008) S i nấm n i sinh dường như ph t tri n với tố đ tương tự như y hủ của chúng, trong các khoảng gian bào của mô thực vật (hình 1.2)

Hình 1.2: Nấm n i sinh phát tri n trong rễ cây Cối x y v y Phong đường

Sự hiện diện của m t số VNNS trong mô phân sinh, lá và cấu trúc sinh sản đ

đư c chứng minh m tăng đ ng k sự sống sót của vật chủ Khả năng sống sót đư c tăng ường này phần lớn là do sản xuất n i tiết của các chất chuy n hóa thứ cấp bảo vệ chống lại đ ng vật ăn ỏ ũng như tăng hấp thu chất dinh dư ng (Christensen và cs, 2008) VNNS đóng góp đ ng k vào sự phát tri n và sức khỏe củ y trong điều kiện hạn chế ánh sáng, và thực vật dường như đ tăng sự phụ thu c vào VNNS trong những điều kiện này (Davitt và cs, 2010)

Có bằng chứng cho thấy thực vật và VNNS tham gia giao tiếp với nhau bằng sự

hỗ tr c ng sinh M t ví dụ về tương t ndosym iont thực vật này xảy ra giữa các loài

thực vật hai lá trong cây Convolvulaceae và nấm clavicipitaceous Khi nấm ở trong cây,

nó tổng h p các alcaloid ergoline với tố đ o hơn so với khi nó đư c trồng cách xa

y Điều này ủng h giả thuyết rằng tín hiệu thực vật là cần thiết đ tạo ra sự bi u hiện của các chất chuy n hóa thứ cấp n i sinh (Kusari và cs,2012)

 Tác nhân gây b nh

Không phải hầu hết các loài nấm n i sinh đều có quan hệ hỗ sinh với cây, m t số loài có th là tác nhân gây bệnh không rõ ràng cho cây Ví dụ, trong số 109 vi nấm n i sinh kh nh u đư c phân lập từ các cây thân thảo, ó 5 o i đư c biết đến là các tác nhân gây bệnh cho cỏ M t số loài VNNS th hiện như o i hoại sinh tiềm n, chúng có

th không gây triệu chứng và phát tri n cùng với gi i đoạn của cây chủ, nhưng

vi nấm này có th phát tri n không hạn chế và tái sản sinh khi mà cây chủ già ho c chết

đi (S n h z M rqu z v s, 2007)

 Sự truy n tải nấm nội sinh trong thực vật

Vi nấm n i sinh có th lây nhiễm từ phần này sang phần khác trong cây chủ (truyền ngang), ho c các cây di truyền cho các thế hệ sau (truyền dọc) Ví dụ ho ơ chế truyền ngang: m t số nghiên cứu chỉ ra rằng, trong hạt giống và cây hầu như kh ng

chứa nấm n i sinh, tuy nhiên tỷ lệ nấm n i sinh tăng n khi h y hạt lớn lên Còn số

nấm n i sinh loài Neotyphodium và Epichloe lại đư c truyền theo chiều dọ ưu trữ trên

thế hệ con cháu (G ry v s, 2007; rno d v s, 2004)

1.2.3 Phân loại vi nấm nội sinh thực vật

Có hai phương pháp khác nhau đ phân oại VNNS

 Phương pháp đầu tiên phân chia VNNS thành hai oại: N i sinh toàn phần (systemic) và

m t phần/tạm thời (nonsystemic) Các oại này dự trên di truyền, sinh họ và ơ hế truyền từ vật hủ sang vật hủ Các VNNS toàn phần sống trong các mô thự vật trong toàn vòng đời ủ nó và tham gia vào mối quan hệ ng sinh mà không gây ệnh

ho gây hại cho cây tại ất kỳ thời đi m nào, mật đ và sự đ dạng ủ nó không thay đổi trong vật hủ khi điều kiện môi trường thay đổi Các VNNS tạm thời khác nhau về

số ư ng và tính đ dạng trong cây hủ ủ chúng khi điều kiện môi trường thay đổi, nó ũng đ đư hứng minh là gây ệnh cho cây hủ trong điều kiện cây hủ phát tri n yếu (Wanivà cs, 2015)

 Phương pháp thứ hai phân chia VNNS thành 4 nhóm dự trên 6 tiêu chí khác nhau: phạm vi vật hủ, mô hủ, thự vật, đ dạng sinh họ , phương thứ truyền ệnh và i ích (Rodriguez và cs, 2009) ốn nhóm này đư chia thành các VNNS Class 1 và endophytes không clavIDIAitaceous (Class 2, 3 và 4)

Các VNNS Class 1 hủ yếu đư truyền từ vật hủ sang vật hủ ằng cách truyền dọ , trong đó cây mẹ truyền nấm cho con cái ủ chúng thông qua hạt giống Loại này có th

đư chia thành oại I, II và III Các endophytes oại III phát tri n trong cây hủ ủ chúng mà không i u hiện các triệu hứng ệnh ho gây hại cho vật hủ ủ chúng Loại I thường mang ại i ích cho vật hủ ủ chúng như ải thiện sinh khối thự vật, tăng khả năng hịu hạn và tăng sản xuất các hóa hất đ hại và không thích ứng với đ ng vật, do đó làm giảm việ ăn ỏ Những i ích này có th thay đổi tùy thu vào điều kiện cây hủ và môi trường sống

Các VNNS Class 2, 3 và 4 đại diện cho m t nhóm các VNNS đ hình, đi n hình là nấm Ascomycota Vai trò sinh thái ủ các oại nấm này rất đ dạng và vẫn hư đư

hi u rõ và hư đư nghiên ứu r ng rãi cho đến nay Những tương tác thự vật và VNNS này rất phổ iến và đ đư tìm thấy trong hầu hết các loài thự vật trên đất iền

và hệ sinh thái Nhiều VNNS có khả năng huy n đổi giữ hành vi n i sinh và ối sống

tự do Class 2 có th phát tri n trong các mô thự vật ả trên và dưới m t đất, loại tế bào

n i sinh này đ đư nghiên ứu r ng rãi nhất và đ đư hứng minh là tăng ường i ích ủ cây hủ ủ chúng do các điều kiện ất i đ thù ủ môi trường sống như pH, nhiệt đ và đ m n Class 3 ị hạn hế phát tri n ở các mô thự vật dưới m t đất và hình thành trong các khu vự ủ mô thự vật Class 4 ũng ị hạn hế ở các mô thự vật dưới m t đất nhưng có th xâm hiếm nhiều hơn các mô thự vật

1.2.4 Những ứng d ng của vi nấm nội sinh

 Trong y học

Các chất có hoạt tính sinh họ đư c sản sinh bởi các vi nấm n i sinh đư đ nh giá là có tiềm năng ph t tri n trong ĩnh vự y dư c Theo các nghiên cứu đ nh gi , vi nấm n i sinh cung cấp hàng loạt các chất chuy n hóa thứ cấp hoạt tính sinh học có cấu trú đ đ o, o gồm: alkaloid, benzopyranones, chinones, flavonoid, acid phenolic, quinon, st roid, t rp noid, t tr on,… hất chuy n hóa hoạt tính sinh họ đư c ứng

dụng r ng r i như hó hất nông nghiệp, thuốc kháng sinh, ức chế miễn dịch, chất chống oxy hóa và chất chống ung thư (M ri n v s, 2010)

Ergoflavin (C30H26O14) thu c nhóm h p chất Ergo hrom s đư c mô tả như m t tác nhân chống ung thư mới đư c phân lập từ m t loại nấm n i sinh phát tri n trên lá của cây thuốc Sến xanh (m t loài thu c họ Hồng xiêm) ở Ấn Đ Chủng nấm n i sinh

Penicillium brasilianum đư c tìm thấy trong vỏ rễ y Xo n, thú đ y sự sinh tổng h p

các amit phenylpropanoid - nhóm chất Ph ny prop noid n y đư c chú ý vào việc sử dụng như thuốc chống ung thư, hống oxy hóa, kháng khu n, chống viêm Chủng nấm

F0010 thu c chi Xylaria sp n i sinh trong cây thân gỗ đư c mô tả là sản xuất ra

Griseofulvin – m t chất kháng sinh chống nấm đư d ng điều trị ho người v đ ng vật (Korkina L.G., 2007; Fi v s, 2010)

Chất chống oxy hóa tự nhi n thường đư c tìm thấy trong cây thuốc, rau và trái cây Tuy nhiên, chất chuy n hóa từ nấm n i sinh có th là m t nguồn tiềm năng ủa chất chống oxy hóa tự nhiên mới Pestacin (C15H14O4) đ thu đư c từ các loại nấm n i

sinh Pestalotiopsis sp phân lập từ cây Terminalia morobensis P st in đư c cho là có

hoạt tính chống oxy hóa gấp 11 lần lớn hơn tro ox - m t dẫn xuất vitamin E Ngoài ra, các nhà khoa họ đ t h hiết đư c rất nhiều các chất có hoạt tính sinh học có ứng

dụng o trong y dư c từ các nấm n i sinh thu c các chi: Aspergillus, Fusarium, Alternaria, Penicillium, Pestalotiopsis,… (M ri n v s, 2010)

 Trong nông nghi p

Các chất có hoạt tính sinh họ đư c sản xuất trực tiếp từ vi nấm n i sinh, hay là sản ph m kết h p giữa mối quan hệ tương t giữa nấm và thực vật, giúp cho vi nấm

n i sinh thích ứng tốt hơn v thực hiện m t số chứ năng ảo vệ, cung cấp các chất có

l i cho cây chủ Bên cạnh đó, vi nấm n i sinh ũng ó th là nguyên nhân gây biến đổi sinh lý cây chủ giúp cây chủ chống đư c với điều kiện sống bất l i (Posy v s, 2015)

Acremonium là m t dạng nấm n i sinh đư c biết đến khả năng ó th ki m soát

côn trùng gây hại L i dụng tính chất này, Koga và c ng sự đ thực hiện cấy nhiễm nấm

chi Acremonium v o y đ chúng có th truyền cho cây chủ khả năng kh ng ại sự

cạnh tranh với các loài gây hại cho cây Kết quả nghiên cứu công bố đ ấy nhiễm

thành công vào cây cỏ đu i tr u (Festuca arundinacea) và cỏ hắc mạch (Lolium perenne), y n y đ kh ng ại đư c sâu kéo màng cỏ Poa P teterrella

Năm 1999, ằng h tương tự Pereira và c ng sự đ p dụng trên cây chuối Việc cấy nhiễm nấm n i sinh vào cây chuối không chỉ giúp cây có khả năng kh ng ại thuốc

diệt nấm m nó n đ t biến đ duy trì sự đối kháng Beauveria bassiana là loại nấm

diệt côn trùng bằng cách gây bệnh lên côn trùng ở giai đoạn ấu trùng và thành trùng Nấm n y đư c cấy nhiễm vào m t số hạt ngũ ố đ chống lại các côn trùng tấn công cây chủ trong m t số gi i đoạn sinh trưởng và phát tri n Tuy nhiên, trong số m t số

y đ t m thấy sự có m t của loài này, chứng tỏ nấm này có dạng n i sinh tự nhiên không liên quan tới quá trình nấm xâm nhập vào cây Ngoài ra, m t số nấm gây bệnh

tr n n tr ng ũng đ đư c phân lập trên m t số cây trồng khác

1.2.5 Nghiên cứu a ạng vi nấm nội sinh trong thực vật

Vi nấm n i sinh thực vật đề tài nghiên cứu đ ng đư c chú ý, khai thác tiềm năng Nhiều bài thuốc cổ truyền có tác dụng rất tốt ho người bệnh đư c sử dụng từ các cây có nguồn gốc tự nhiên Qua nghiên cứu thì có nhiều loại cây chất có tác dụng làm

thuốc lại không phải bản chất của cây sinh ra mà do các VNNS sinh r Qu đó ó rất nhiều các nhà nghiên cứu đ điều tra khảo s t t nh đ dạng của VNNS thực vật, đ có

th phát hiện ra nhiều loài VNNS mới, có tác dụng cho việc sản xuất hàng loạt thuốc cứu chữ ho người bệnh Trung bình có khoảng 50 loài nấm n i sinh trong mỗi loài thực vật đư c tìm thấy trong các cu điều tra khảo s t đư c thực hiện trướ năm 2000 Khi có sự góp m t củ phương ph p sinh học phân tử đ phân loại nấm đư c sử dụng thì số ư ng các VNNS trong cây chủ tăng n đáng k Các chủng nấm đư c phân lập, nuôi cấy trong phòng thí nghiệm và áp dụng phương ph p x định ki u gen cho phép x định chính xác loài ho c ít nhất có th phân biệt đư c các loài với nh u đ góp phần thuận l i cho việc nghiên cứu đ dạng loài vi nấm n i sinh (Ston v s, 2014; Zabalgogeazcoa, 2008)

1.2.6 Yếu tố ảnh hưởng ến sự a ạng của vi nấm nội sinh thực vật

Yếu tố ảnh hưởng đầu tiên góp phần vào sự đ dạng loài vi nấm n i sinh trong thực vật là sự khác biệt về vị tr địa lý Ở vùng nhiệt đới tìm thấy sự phong phú về các loài nấm n i sinh hơn v ng n đới v h n đới do nơi đ y ó kh hậu ấm và m ướt, tạo điều kiện thuận l i cho sự phat tri n của vi nấm

Tuổi đời của cây chứa vi nấm ũng ảnh hưởng đến sự đ dạng của chúng Cây càng lớn tuổi càng t h ũy đư c m t số ư ng lớn các vi nấm n i sinh trong mô Bởi vì, các tế o trưởng thành có khả năng nu i dư ng các vi nấm n i sinh hơn tế bào mới ( rno d v s, 2004) Các nghiên cứu chỉ ra rằng chúng ta mới chỉ phân lập đư c m t

ư ng rất nhỏ vi nấm n i sinh thực vật (5%) Khi các hệ sinh thái mới, giống cây mới

đư c khám phá sẽ có càng nhiều loài nấm n i sinh đư c phát hiện và phân loại (Hawksworth, 2001)

1.2.7 Tình hình nghiên cứu vi nấm nội sinh trong thực vật tại Việt Nam

nghi n ứu về nấm n i sinh thự vật ở Việt N m ắt đầu từ ng tr nh

ủ Nguyễn Sỹ Gi o v s (1976) về ứng dụng m t số hủng nấm ng sinh ngoại nhập trong nu i trồng y non phụ vụ nghề trồng rừng tr n y th ng v y ạ h đ n Năm

1980, nhóm nghi n ứu n y ũng đ ph t hiện m t số o i nấm ng sinh tr n y th ng nhự ho đến năm 1998, nghi n ứu đi s u về nấm n i sinh trong y trồng Việt

N m, đ iệt trong y dư iệu qu mới ắt đầu đư qu n t m nghi n ứu ần đầu

ti n tại Việt N m trong đề n ấp Nh nướ gi i đoạn 1998-2000 ủ h nh nhóm đề

t i: Đi u tr hi n tr ng h nấ ộng sinh v nh vi sinh vật ối kháng ở d ợ

i u qu v ịnh h ớng ứng dụng do TS Nguyễn Hồng H m hủ tr tr n đối tư ng

y dư iệu ủ Việt N m: Sơn Thụ , Ngũ Gi , T m Thất Đề t i ần đầu ti n

ở Việt N m đ p dụng th nh ng kỹ thuật P R-RFLP đ nhận dạng th o ITS nấm n i sinh v kỹ thuật r y kết h p y t m th ng nồng đ đường đ t h v ph n iệt o tử nấm trong đất v ng rễ quy n y trồng; Đề t i ũng đ ph n ập đư 207 hủng nấm rễ

n i, ngoại sinh trong rễ y Sơn Thụ , Ngũ Gi v T m Thất thu 4 hi ủ ng nh

nấm túi ( s omy ot ): Fusarium, Acremonium, Arthrinium, Paecilomyces v nhóm nấm ất thụ sẫm m u ó v h; trong đó x định đư 4 hủng thu hi Acremonium, Arthrinium ó khả năng kh ng mạnh vi khu n Ralstonia solanacearum g y ệnh héo

x nh hu ũng như khả năng t h ũy nzym u o ngoại o ph n giải x u o o

Với hướng đi n y, nhóm đề t i đ thự hiện đề t i KH ấp : inh họ nấ nội sinh ở ơn hụ (2001-2002), Định ợng nấ ộng sinh v ng g ồi Đảo (2004-2005) v đ sưu tập đư Sưu tập nấm n i sinh y dư iệu Việt

N m S u đó m t oạt nghi n ứu về nấm n i sinh thự vật đư ng ố: Tại Viện Hó H p hất thi n nhi n (Viện H n m KH NVN) nhóm nghi n ứu ủ PGS.TS L M i Hương năm 2003-2004 đ ph n ập đư c trên 115 chủng nấm kí sinh

trên các cây thuố kh nh u trong đề t i Phân lập một số chủng nấm ký sinh thực vật

và tách chiết các hợp chất có ho t tính sinh học ; Năm 2009-2010, tr n ơ sở nhiệm vụ: Nghiên cứu khu h nấm nội ký sinh trong các cây Thông đ ph n ập đư 157 chủng nấm n i sinh trong y Th ng v x định đư hủng Daldinia fissa SHT46

sinh h p hất SHT46.1 có hoạt t nh g y đ c dòng tế o ung thư ơ v n ( I 50 4,19

μg/m ), hủng Eupenicillium ehrlichii SHT101 sinh h p hất SHT 101.1 kh ng mạnh vi khu n S aureus (MIC là 25 μg/m ) v h p chất SHT 101.2 có hoạt t nh g y đ c 2 dòng

tế o ung thư phổi v ung thư ơ v n (I 50 4,0 v 3,06 μg/m ) Trần Thị Như Hằng

v s (2007, 2008, 2009) đ ph n ập đư 55 hủng nấm n i sinh trong y Khổ s m

v m ụp, trong đó đ x định m t số hất trong hủng Trichoderma konilangbra KS14 ó hoạt t nh kh ng S aureus (MIC là 25μg /m ) v hoạt t nh đ c tế bào mạnh với

dòng tế o ung thư g n, ung thư ơ v n v ung thư tử ung; nhóm t giả ũng ần đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu mối liên quan giữa chủng VNNS với cây chủ và khảo sát

sự biến đổi về h m ư ng chất có hoạt tính sinh học cao trên cây chủ sau khi sử dụng

chế ph m dạng lỏng v dạng t ủa nấm T konilangbra KS14, hế ph m dạng ỏng

m tăng h m ư ng chất ent-kauran của cành chiết cây khổ sâm lên 50,43 % so với đối chứng, chế ph m dạng lỏng và dạng b t đều m tăng hiều dài trung bình của hệ rễ cành chiết cây khổ s m n 25 Phạm Qu ng Thu v s (2012), đ ph n ập đư 13 chủng VNNS từ 35 d ng K o t i tư ng tại Thừ thi n Huế, các h p chất hóa họ đư c

t h ủ hủng n y đều ó khả năng ức chế sự phát tri n của nấm gây bệnh loét

thân, thối vỏ và dẫn đến khô ngọn (Ceratocystis, Corticium salmonicolor) từ đó m

sáng tỏ ơ hế kháng bệnh củ d ng K o t i tư ng Võ Thị Ngọ Mỹ v s (2015)

đ tiến h nh khảo s t điều kiện nuôi cấy của chủng VNNS (Pseuderotium - chủng BC2

và Epicoccum - chủng BT2) phân lập từ y ưởi ó khả năng kh ng khu n (E coli, S aureus, S faecalis và MRSA) mạnh, m i trường và thời gian nuôi cấy thích h p đ 2

chủng BC2 và BT2 sản sinh chất biến dư ng kháng khu n tốt nhất dịch khoai tây (kho i t y/ nước cất: 20 g/l); glucose 4%; agar 1,5%; ướ đầu khảo sát quy trình chiết tách h p chất kháng khu n từ m i trường rắn nuôi cấy 2 chủng vi nấm n i sinh BC2 và

T2, x định đư c dung môi thích h p đ chiết thô h p chất kháng khu n

1.2.8 Tình hình nghiên cứu vi nấm nội sinh trong cây Thạch tùng răng cưa

1.2.8.1 Ở nước ngoài

Hoạt chất chính của Thạ h t ng răng ư Hup rzin Hầu hết các Huperzine A (Hup ) đ ng đư c sử dụng trong các loại thuốc thảo dư c hiện n y đư c chiết xuất

từ cây H serrata và m t số loài khác trong Họ Th ch sam

Tuy nhiên, H serrata và các cây khác trong họ Thạch Sam yêu cầu điều kiện canh

tác ng t nghèo v sinh trưởng phát tri n rất chậm, phải mất rất nhiều năm ph t tri n trong tự nhiên mới có th đ sử dụng làm thuốc Bởi vậy các nhà nghiên cứu đ ng nỗ lực rất nhiều đ có th thực hiện sản xuất HupA bằng nuôi cấy TTRC trong phòng thí nghiệm và tổng h p hóa họ đ có sản ư ng lớn hơn (M v G ng, 2008), nhưng vẫn

hư th đ p ứng đư c hết nhu cầu của ngành công nghiệp dư c

Gần đ y, nghi n ứu phân lập VNNS thực vật cung cấp nguồn nguyên liệu lớn

cho ngành công nghiệp dư c; rất nhiều chất mới, hoạt tính mới, đ dạng đư c chiết xuất

từ các VNNS thực vật V ũng v ý do tr n n n nh kho họ đ qu n t m đến việc nghiên cứu các chủng nấm n i sinh trong cây Thạ h t ng răng ư ó khả năng sản sinh hoạt chất HupA nhằm thay thế ho phương ph p hiết xuất hoạt chất từ cây trồng

tự nhi n, giúp tăng ường ư ng HupA phục vụ ngành công nghiệp dư c

Đ ó nhiều kết quả nghiên cứu khả qu n đư c công bố, đ c biệt là ở Trung Quốc

– nơi ó y H serrata phân bố nhiều Các loài nấm n i sinh trong cây H serrata bao gồm các chi chủ yếu như Aspergillus, Trichoderma, Coniochaeta, Rhizoctonia, Alternaria, Plectosphaerella,Podospora, Penicillium, Cyphellophora, Colletotrichum, Acremonium, Blastomyces, Botrytis… Với phương ph p ph n oại bằng đ đi m hình thái và bằng phân tích trình tự ITS – rDNA, Shi và cs (2005) đ ph n ập đư c 4 chủng: Cephalosporium sp., Plasmoparad sp., Saccharomyces sp., Penicillium sp n i sinh trong cây H serrata trồng tại tỉnh An Huy; Hu ng v s (2009) đ ph n ập đư c 4 chủng trong cây H serrata trồng tại tỉnh Hồ Nam (Cladosporium sp., Penicillium sp., Fusarium sp., Coniothyrium sp.); h n v s (2011 , ) đ ph n ập đư c 52

chủng nấm n i sinh trong cây trồng ở tỉnh Hải Nam và 53 chủng trong cây trồng ở tỉnh

Quảng Tây, các chủng này thu c 26 chi (Colletotrichum, Trichoderma, Fusarium, Coniochaeta, Rhizoctonia, Alternaria, Aspergillus, Plectosphaerella, Podospora, Cyphellophora ); Wang và cs (2011) phân lập đư c 127 chủng nấm, trong đó ằng

nhận dạng hình thái và trình tự ITS đ định dạng đư c 69 chủng thu c 19 chi nấm

Aspergillus, Podospora, Penicillium, Colletotrichum, Acremonium, Botrytis

1.2.8.2 Ở Việt Nam

Ở Việt Nam, Thạ h t ng răng ư m t loại thảo dư quý, nhưng hư đư c quan tâm nghiên cứu và khai thác ứng dụng trong điều trị Các nghiên cứu về nấm n i sinh trong cây Thạ h t ng răng ư ở Việt Nam là hư ó

Ngày càng có nhiều ca mắc bệnh Alzheimer hơn nữa, vì vậy việc nghiên cứu phân

lập các chủng nấm n i sung có khả sản sinh hoạt chất HupA sẽ là m t hướng đi mới có tri n vọng trong việc sản xuất thuố điều trị bệnh, giúp giảm tỉ lệ người mắc bệnh

1.3 Tổ q ạt chất Huperzine A

1.3.1 Giới thiệu v up r in

Hup rzin , đ i khi đư c gọi là Selagin, là m t k oid đư c tách chiết từ thảo

m c Lycopodium serratum; có cấu trúc hóa học C15H18N2O (hình 1.3); ó trọng ư ng

ph n tử 242,32; nhiệt đ nóng hảy 230o

C; có hoạt tính quang học, ổn định; dạng kết tinh trắng; tan trong dung dịch axit, chloroform, m th no , th no , t h t n trong nước Cấu trúc hóa học của HupA không bị thay đổi và việc mở vòng pyridone không xảy ra khi bảo quản lâu dài với enzym AChE ho c BchE (butyrylcholinesterase) ở 240C

ho c sau 96h ủ với HCl 0,1N ho c NaOH Dựa trên công nghệ mô phỏng bằng máy tính, các nghiên cứu về sự đồng nhất giữa HupA và ACh cho thấy HupA có cấu trú ơ bản giống ACh HupA đư x định lần đầu tiên vào những năm 1980, nhưng các chiết xuất củ y đ đư c sử dụng ở Trung Quốc hàng thế kỷ như m t loại thảo dư c

đ điều trị chấn thương, ăng thẳng, sưng tấy, tâm thần phân liệt Herbs là m t chất ức chế mạnh mẽ, có th đảo ngư c và chọn lọc acetylcholinesterase, hoạt đ ng này thậm chí mạnh hơn g nt min , m t loại thuố đư c FDA chấp thuận đ điều trị bệnh AD

và các rối loạn về trí nhớ khác từ nhẹ đến trung bình Khi sự suy giảm chức năng

cholinergic trong não là m t yếu tố chính ảnh hưởng đến sự thiếu hụt trí nhớ trong AD, HupA đ nổi n như m t ứng cử vi n đầy hứa hẹn cho việ điều trị bệnh nhân AD

Hup rzin thường đư c sử dụng đ điều trị bệnh AD và các bệnh thoái hóa thần kinh kh như P rkinson v khả năng ủ nó đ cải thiện trí nhớ và khả năng nhận thức trong khi hoạt đ ng như m t chất bảo vệ thần kinh Hup rzin thường đư c coi như m t chất bổ sung tự nhiên trong các cá nhân khỏe mạnh vì các hiệu ứng nootropic của nó

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của Huperzine A

1.3.2 Cơ chế hoạt ộng của up r in

Về m t bệnh ý, đ trưng ởi sự tích tụ quá nhiều các -amyloid peptide

ở ngoại bào, ở dạng mảng xơ vữ v đ m rối thần kinh n i bào Ngoài ra, nó còn ảnh hưởng đến quá trình dẫn truyền thần kinh trong não Ở những người mắc bệnh AD diễn

ra sự suy giảm chứ năng nghi m trọng của các tế bào dẫn truyền thần kinh cholinergic,

i n qu n đến việc mất trí nhớ ho c suy giảm nhận thức ở bệnh AD, điều này là do sự suy giảm nồng đ ACh trong não (Knusel và cs, 1996)

ơ hế của Hup trong điều trị bệnh : Trong ơ th người, não sản xuất ra m t chất truyền thần kinh là acetylcholine có chứ năng qu n trọng trong chuy n đ ng ơ bắp, suy nghĩ v tr nhớ; aceteycholine bị ức chế, gây thoái hóa bởi enzym

acetylcholinesterase Hoạt chất HupA có tác dụng ức chế việc sản sinh ra

acetylcholinesterase, giúp cho việc làm giảm ư ng nzym n y v khi đó ư ng

ty ho in trong n o tăng n, giúp ho tr nhớ và các chứ năng nhận thứ đư c cải thiện Vì vậy, Hup đư đ nh gi sự lựa chọn tiềm năng đ điều trị bệnh AD

Những nghiên cứu về cấu trúc sinh học cho thấy HupA trực tiếp liên kết với các

vị trí hoạt đ ng trong hE, ngăn h n sự tiếp cận cử ơ hất n i tại (Ferreira và cs 2016) tương t h nh giữa HupA và AChE là: (1) Các liên kết hydro mạnh và trực tiếp giữa các nhóm cacbonyl của phân tử HupA và nhóm oxy hydroxyl của tyrosine 130 nằm ở vị trí ngoại vi củ nzym ũng như giữa nhóm ethylidene methyl với chuỗi oxy của phân tử histidine 440, m t phương thức b ba xúc tác; (2) Các liên kết hydro gián tiếp qua 1 ho c 2 phân tử nước bên trong khu vực rãnh hoạt đ ng, nơi i n kết hydro với các phân tử nước khác ho c chuỗi bên và các nguyên tử sườn của phân tử protein; (3) tương t giữa cation -  của nhóm amino chính trong HupA với v ng thơm của trytophan 84 và phenylalanine 330 ở vị tr ho in , ũng như tương t ion với các nhóm cacboxyl của axit glutamic 199 và axit aspartic 72; (4) M t số kỵ nước quan trọng, đ c biệt là với các lõi bên và các nguyên tử trong lõi của phân tử trytophan 84, phenylalanine 331 và histidine 440

Hup rzin ũng ó m t số hoạt đ ng như m t chất đối kháng thụ th NMDA Nó là bảo vệ thần kinh, cho thấy đ bảo vệ nơ-ron từ thiệt hại do glutamate, peroxides, và beta-amyloids Trong các nghiên cứu trên chu t hỉ r rằng nó đ đư c

hi n thị đ thú đ y neurogenesis

Bốn trong số năm oại thuố đư c FDA chấp thuận đ điều trị bệnh Alzheimer là chất ức chế cholinesterase Acety ho in đ đư c chứng minh đóng m t vai trò quan trọng trong việc hình thành những kỷ niệm mới Mứ ty ho in o m tăng ường

đ truyền dẫn thần kinh đến vỏ não Nó ũng ức chế sự phóng th h g ut m t , do đó ngăn h n kích thích phản hồi của vỏ não Hiệu quả ròng là làm cho mạch vỏ não có th phản ứng nhanh với đầu vào cảm gi ó i n qu n, đồng thời giảm phản hồi kích thích

có th cản trở việc thu hồi b nhớ

Các chất ức chế cholinesterase hiện đ ng ó m t trên thị trường đ điều trị bệnh Alzheimer khá hiệu quả trong việc cải thiện trí nhớ ở những bệnh nhân này Những loại thuố n y ũng ó th làm chậm sự tiến tri n của bệnh thông qua các hiệu ứng bảo vệ thần kinh của chúng Tuy nhiên, việc sử dụng bốn loại thuố đư c FDA chấp thuận hạn chế bởi những tác dụng phụ nghiêm trọng củ húng đối với đường tiêu hóa, phổi và

ơ ty ho in đư c sử dụng trong nhiều b phận củ ơ th khác với n o v tăng

ty ho in trong ơ th gây ra nhiều rối loạn Huperzine A không có giới hạn này bởi

vì nó có vẻ có ái lực rất mạnh đối với cholinesterase trong não

thử nghiệm m s ng trướ đ y đ hỉ r phương ph p ải thiện chứ năng

b nhớ sử dụng ki m tra MMSE, MQ, ADAS-COG và ADL Ki m tr S- OG v MMSE, với những hứng ệnh rối oạn tr nhớ nhẹ iều d ng từ 0,1- 0,2 mg/ng y v đối với ệnh z im r việ ải thiện n ng o nhận thức với liều 0,2- 0,4mg Huperzine , hup rzin đư c dung nạp tốt ở liều ư ng 0.4mg trong vòng 24 tuần Vì vậy, Huperzine A là sự lựa chọn tiềm năng đ điều trị bệnh z im r ( Gi ng v s, 2011)

Trong m t nghiên cứu kh đ phát hiện 58% bệnh nhân AD cải thiện đ ng k

cả hai chứ năng nhận thức và trí nhớ khi dùng 200 mcg HupA mỗi ngày Ngoài ra, tác dụng tích cực ghi nhận ở những bệnh nhân này về chất ư ng cu c sống ũng như khả năng t m ại những kỷ niệm đ qu trong qu khứ, nó không chỉ hỗ tr điều trị hiệu quả cho não b củ người bệnh AD, người già có bi u hiện suy giảm trí nhớ mà còn có hiệu quả trong việc cải thiện trí nhớ ở người lớn khỏe mạnh

Tr n thế giới, đ iệt ở Mỹ nghi n ứu o hế v sản xuất vi n n ng

ứng hứ Hup hiết xuất tự nhi n từ nguồn y H serrata ủ Trung Quố đ rất

th nh ng với h m ư ng Hup từ 50-300 mcg/vi n Hiện n y, tại Mỹ, nướ

h u u v nhiều nướ tr n thế giới đ ng ưu h nh m t số sản ph m vi n n ng ứng

hứ Hup tự nhi n ủ m t số nh sản xuất h nh h ng ủ Mỹ như: Sour N tur s; LifeExtension, Absorb Health với th nh phần t dư kh nh u ( i ium phosphate, cellulose, microcrystalline cellulose, stearic acid, vegetable cellulose (capsule), maltodextrin, silica, gelatin, rice flour, magnesium stearate ) Tại thị trường

Việt N m hiện n y giao bán ó nhiều oại sản ph m Hup tự nhi n t h hiết từ y H serrata với 2 dạng hủ yếu: vi n n ng ứng (50 – 300 m g/vi n) v t (1- 99 ) Tuy

nhi n về nguồn gố v gi ả rất khó ki m so t, rất nhiều sản ph m ủ nh sản xuất h nh h ng ủ Mỹ ị giả mạo v n với gi rẻ hơn, như: Sour N tur s ( hỉ ó

2 oại v gi tại Mỹ Hup 100m g – 60 vi n/ ọ 12.5 US ọ, 200 m g 23.98

US / ọ); Li Ext nsion ( hỉ ó 1 oại Hup 200m g gi tại Mỹ = 40 US / ọ 60 vi n,

gi tại Việt N m = 1.550.000đ/ ọ), sor H th ( ó1 oại 200m g gi tại Mỹ = 69.99US / ọ 100 vi n, gi o n tr n mạng 17.97 US / ọ) Về oại t HupA

hiết xuất từ H serrata ũng rất kh nh u, m t s ng ty ở Trung Quố gi o n 1g

th y đổi hoạt đ ng của alkaloid này xảy ra trong quần th giống nhau sau mỗi năm

đư c phân tích bằng phần mềm SPSS 13.0 (Coefficient of variation, One-way ANOVA analysis, Paired-samples T tests) Kết quả cho thấy ư ng Hup kh nh u đ ng k bởi các vị tr đị ý, đ c biệt th y đổi th o kinh đ Ví dụ: Thứ tự ư ng HupA ở các quần

th CQ > Quần th GX > Quần th ZJ Hệ số biến đổi V như s u: 0,36 ( Q), 0,44(GX) v 0,4 (ZJ) Điều này chỉ ra rằng có sự đ dạng phong phú về ư ng HupA giữa các cá th trong quần th Phân tích ANOVA cho thấy có sự khác biệt đ ng k

ư ng HupA giữa các quần th Kết quả trình bày trong nghiên cứu này có th cung cấp

bằng chứng cho thấy ư ng Hurperzine biến đổi trong H serrata là kết quả của sự

tương t giữ g n v m i trường, bằng cách so sánh, chủ yếu đư c ki m soát bởi yếu

tố di truyền (Huang J and He CZ, 2010)

Phương ph p phổ biến đ x định số ư ng HupA là UPLC-MS Trong 11 loài

Hup rzi , h m ư ng cao nhất củ Hup đư c tìm thấy ở H pinifolia Sự tích tụ các

Lycopodium alkaloid kh nh u đư c theo dõi bằng sử dụng phân tích Q-IMS- TOFMS Nuôi cấy mô các loài Hup rzi kh nh u đ đư c thực hiện đ sản xuất

Hup , đ c biệt trong các mô sẹo của H pinifolia Các alkaloid chủ yếu sản xuất bởi cây phát tri n tự nhiên, mô sẹo của H pinifolia th y đổi đ ng k từ Hup đến nankakurine (K n’i hiro t ., 2013) Hàm ư ng Hup đư c tìm thấy ở Phlegmariurus caritus

o hơn o i H serata Cây trồng trong điều kiện đ m cao (ở các khu rừng m ướt)

ũng ho h m ư ng Hup o hơn đ ng k so với cây trồng trong m i trường ó đ

m thấp Lư ng Hup ũng th y đổi đ ng k theo mùa, cao nhất ở giữa mùa thu và thấp nhất v o đầu mùa xuân ( Ma et al., 2007)

H m ư ng Huperzine A cao nhất ở loài H pinifolia (1765.9 µg g-1 dw), trong H elmeri từ Philippines (608 µg g-1 ) và H carinata (1030 µg g-1) từ Queensland, Australia (Goodger và cs, 2008) H serrata từ Trung Quố đạt từ 80,2- 182,6 µg g-1 (Ma vác, 2007) Trong điều kiện Việt Nam chỉ có th nuôi trồng đư c H serrata như ủa Trung Quốc

ằng kỹ thuật ph n t h sắ ký ớp mỏng (TL ) v sắ ký ỏng hiệu năng o (HPL ) – nh kho họ đ ph n ập v x định đư nhiều hủng VNNS trong cây

H serrata ó khả năng sinh tổng h p Hup o Li v s (2007) đ ph n ập đư hủng Acremonium sp 2F09P03 sản sinh Hup với h m ư ng 8,32 g/ ; W ng v s (2011), đ x định đư 39/127 hủng ó khả năng sản sinh Hup v hủng Shiraia

sp S 14 ho sản ư ng Hup o nhất 327,8 g/l; Y ng v s (2011) ũng đ ph n

ập v x định đư hủng Colletotrichum gloeosporoides ES026 sản sinh 30 g HupA/g CDW; Zh ng v s (2011) ph n ập hủng Cladosporium cladosporioides LF70 sản sinh 56,8 / ; ong v s (2014) ph n ập đư hủng Trichoderma harzianum L44 (37.63 mcg/g); Su v Y ng ph n ập chủng Paecilomyces tenuis YS-13

sinh 21 µg HupA/l (2015) hủng n y đều đ đư đăng ký ản quyền tại Trung Quố , m t số t m đư điều kiện n m n th h h p v hủng giống gố m nguy n iệu ho sản xuất Hup quy m ng nghiệp

4 ứ ổ ợ ấ

hủng giống vi nấm ó khả năng sinh tổng h p Hup nguồn ung ấp Hup dễ ki m so t v th o t , ó th thu với ư ng ớn với thời gi n nh nh nhất Tuy nhiên, chủng sản ph n ập từ tự nhi n thường ó khả năng tổng h p hoạt hất sinh họ thấp Th ng thường, đ hủng ó khả năng tổng h p hoạt hất sinh họ o, ó gi trị trong ng nghiệp ần phải p dụng phương ph p n ng o hoạt t nh như ự họn điều kiện, m i trường nu i ấy th h h p, tối ưu th nh phần m i trường n m n theo mô hình đ p ứng ề m t ho g y đ t iến hủng (đ t iến ảm ứng, kỹ thuật di truyền v ng nghệ g n, điều khi n hoạt đ ng ủ g n, g y đ t iến định hướng) Trong công nghệ sản xuất các chất có hoạt tính sinh họ đ tạo giống ó năng suất o th phương ph p họn lọ g y đ t biến dưới t đ ng mạnh của các tác

nh n như ti UV, ti X, ti G mm ho c các chất g y đ t biến như ty nimin (EI), xit

nitric, nitrosoguanidin, natri nitrit (Hopwood và cs,1985) đ đư p dụng th nh

công Nhân tố g y đ t biến có th tạo ra những th y đổi về di truyền ó i n qu n đến nhiều đ t nh ũ ủa sinh vật Đ thu đư c những đ t biến ó ý nghĩ kinh tế, người ta

đ nghi n ứu tích cực về phương ph p v điều kiện sử dụng các nhân tố đó như: iều, pha, pH và cách phối h p các nhân tố khác nhau Ví dụ, người t đ hứng minh đư c rằng xử lý với EI liều nhỏ (kh ng g y đ t biến) có tác dụng hiệp đồng với tia tử ngoại, nhưng nếu theo trình tự ngư c lại thì chỉ n t đ ng của tia tử ngoại Xử ý trước với tia tử ngoại sẽ loại trừ tác dụng củ ti Rơn-gh n, nhưng m ngư c lại có tác dụng

c ng hưởng Việc lựa chọn phương ph p xử ý đ t biến sẽ dựa trên tiêu chu n sau: i) Quá trình thí nghiệm kh ng đư c quá nguy hi m, vì nhiều chất g y đ t biến là những chất g y ung thư Ii) kỹ thuật phải đơn giản và các thiết bị hóa chất phải có sẵn Axit nitric có tác dụng biến đổi về m t hóa họ zơ nitơ ủ N ưới tác dụng của axit nitric, nhóm min trong zơ ủa axit nucleic bị thay thế bằng nhóm hydroxyl h y oxy, nghĩ xảy ra phản ứng oxy hóa khử min o đó d nin huy n thành hydroxatin, guanin chuy n thành xantin và xytozin chuy n thành uraxin Tác dụng chủ yếu của axit nitric g y n n đ t biến ki u khử min đối với zơ ủa ADN Ngoài ra, axit nitric có th tác dụng m đứt mối liên kết hydro trong các s i

N đ ng ph n hi , tạo ra m t loại biến đổi kh như ki u cấu trúc lại nhiễm sắc th Tia cự t m t nh n đ t biến vật ý đư c sử dụng r ng rãi trong di truyền vi sinh vật học Tia UV tác dụng chủ yếu lên axit nucleic, mạnh nhất ở ước sóng 260 nm, dẫn đến hiện tư ng dime hoá timin Ở đ y h i timin gần nh u đư c liên kết c ng hoá trị với nhau ở nguyên tử cacbon thứ 5 và thứ 6, hậu quả là sao chép bị lầm vì ADN-polymeraza dễ lắp m t nucleotit không chính xác vào vị tr tr n ưới tác dụng của tia

UV, trên s i N ũng xuất hiện m t dime pirimidin-pirimidin khác gọi là quang sản

ph m 6-4 Ở đ y, nguy n tử cacbon thứ 6 của pirimidin ở đầu 5’ (T ho X) đư c liên kết với nguyên tử cacbon thứ 4 của pirimidin ở đầu 3’ (thường là X) Sản ph m này là nguyên nhân chủ yếu củ đ t biến gây nên bởi tia UV

Th o P t nt số N101914452 (2010), đ n ng o khả năng sản sinh Hup ủ

hủng Penicillium chrysogenum Thom, hủng n y đ đư g y đ t iến s ng ọ ằng

sóng si u m (mật đ tế o khoảng 106/ mL đư đ t trong m t cốc thủy tinh có chứa nướ đ - thời gian xử lý bức xạ là: 0, 20, 50, 80, 110, 130 giây), nuôi cấy ở 28 tr n

m i trường P , n m n v định ư ng Hup ằng HPL ho thấy ở 80 gi y sản sinh Hup o nhất (1.566μg/m ) hủng đ t iến n y s u khi ph n oại ằng ITS th vẫn

thu về o i Penicillium chrysogenum, tuy nhi n ó 2 tr nh tự nu otit kh iệt g y

n đ t iến ở vị tr 1-38 hủng n y đư đ t t n Endophyt sp T M-01 v đư

ưu giữ tại Sưu tập Vi sinh vật, Đại họ Vũ H n, Trung Quố hủng T M-01 đư

tiếp tụ nghi n ứu điều kiện n m n v với điều kiện n m n th h h p m i

trường P , nhiệt đ 28 , pH 6.4, tỷ ệ giống tiếp 12 , tuổi giống 48h, tố đ ắ 160

v ng/phút, thời gi n n m n 8 ng y - hủng T M-01 ho năng suất Hup o hơn

hủng gố n đầu từ 1.566μg/m n đến 4.761μg/m hủng n y đư n m n ư ng

ớn, t h hiết thu nhận hup tinh sạ h v o hế dạng vi n n ng ứng v vi n nén

sản ph m n y đ đư thử nghiệm m s ng tr n ệnh nh n mắ zh im r từ

nhẹ đến n ng, kết quả ho thấy: hiệu quả ủ vi n n ng ứng v vi n nén hứ Hup từ

hủng T M-01 ó hiệu quả đối với 63 ệnh nh n (s u 8 tuần điều trị) tương đương

nh u (65,08 với vi n n ng ứng v 62,3 với vi n nén) Thử nghiệm so s nh với

thuố pir t m tr n 61 ệnh nh n (s u 9 th ng điều trị) ho thấy, Hup từ T M-01

ho hiệu quả điều trị ệnh nhẹ đến AD tốt hơn v hiệu quả hơn so với pir t m

Theo tài liệu đ ng ố hoạt tính HupA của các chủng nấm n i sinh khác

nh u d o đ ng từ 8,32 đến 327,8 mcg/L dịch lên men Tuy nhiên nhiều chủng nấm dại

phân lập ó hoạt tính thấp, cần có sự nghiên cứu về th nh phần m i trường nu i ấy,

điều kiện nuôi cấy, điều kiện n m n đ tăng khả năng sản sinh HupA Các chủng nấm

n i sinh tổng h p HupA cần nhiều chất dinh dư ng đ c biệt trong m i trường sống,

chúng phát tri n tốt trong cây thạch tùng và ở đ cao và nhiệt đ đ c biệt cho nên trong

m i trường tổng h p HupA có lẽ ũng ần m t số chất đ c biệt Tuy nhiên, hai yếu tố

nguồn cacbon và nguồn nito trong môi trường vẫn đóng v i tr qu n trọng trong tổng

h p HupA Các chủng vi nấm khác nhau có khả năng sử dụng các nguồn cacbon, nito

kh nh u đ sinh tổng h p HupA

Theo Zhao X-M và c ng sự (2013), khi nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn on đến

tổng h p Hup A của chủng C gloeosporioides ES026 cho thấy nguồn cacbon, glucose

và sucrose, tổng h p Hup ũng như hệ s i mạnh hơn trong khi nguồn cacbon maltose

ũng ở chủng n y th ngư c lại (Zh o X-M v s, 2013) Nghiên cứu tối ưu điều

kiện n m n kh nh u đ sản xuất HupA từ C gloeosporioides ES026 đ m tăng

25,58% sản ư ng Hup M i trường khoai tây bổ sung glucose ho su ros nhưng

kh ng ó m tos đ m tăng khả năng sản xuất HupA từ nấm Eth no đư c bổ sung

v o m i trường đạt nồng đ cuối cùng 0,5-2% đ k h th h sự phát tri n của nấm trong

khi methanol với ư ng tương tự đ ức chế sự tăng trưởng Tuy nhiên, cả methanol và

th no đ m tăng khả năng sản xuất HupA lên nhiều (năng suất cao nhất của HupA

tăng 51,89 khi ổ sung ethanol) Phân tích sâu hơn ho thấy cả ethanol và methanol là

chất cảm ứng mạnh mẽ cho sản xuất HupA, trong khi ethanol m t phần đư c sử dụng

như m t nguồn carbon trong quá trình lên men Màu sắc của s i nấm dần dần trở nên

đ n khi ho th no trong khi ho m th no th s i nấm có màu xám trong suốt quá

trình lên men Các nghiên cứu n y đ ho thấy tầm quan trọng của việc tối ưu hó qu

tr nh n m n, trong đó, kết h p với các chất gây cảm ứng đ m ại hiệu quả sản xuất

h p chất HupA từ nấm n i sinh

Theo Zhu và c ng sự (2010), chủng nấm Shiraia sp Slf14 sau khi lên men 14 ngày ở

28o ho ư ng Hup đạt 327,8 mcg/L dịch lên men Nhằm tăng khả năng sinh tổng

h p HupA của chủng Shiraia sp Slf14, Yan và c ng sự (2014) đ ổ sung vào môi

trường lên men m t số chất cảm ứng HSE (H serrata extracts - tách chiết từ cây, lá

thạ h t ng răng ư ), L-Lysine và acid acetic với các nồng đ khác nhau, lên men ở ở

28oC trong 14 ngày Việc bổ sung L-Lysin v HSE đ k h th h khả năng sinh Hup

và hệ s i nấm, với a id ti th ngư c lại Bổ sung 1 ư ng rất nhỏ HSE đ m tăng

khả năng sinh Hup , đạt 40 mcg/g sinh khối khô Đ c biệt, chủng Shiraia sp Slf14 bổ

sung 0,2 g L-1 l- ysin trong m i trường nuôi cấy năng suất Hup tăng đến 296,7 mg/l,

o hơn đối chứng không bổ sung L-Lysine khoảng 40% (Riming Yan et al, 2014)

Chủng C gloeosporioidesisolate YLJ-13 (Patent CN 102168017 B) có khả năng sản

xuất Hup đư n m n trong m i trường khoai tây cải tiến Hup rzin đư c tiết ra khỏi tế o, m i trường khoai tây cải tiến đư c sử dụng như nguồn chất cảm ứng, và sản ư ng n đến 199,6 mg HupA / L dịch lên men

Theo Zhou v ng sự (2009), đ tăng sản ư ng Hup ủ nấm n i sinh Penicillium chrysogenum SH từ y họ Thạ h s m (Lycopodium serratum), điều kiện n men

ỏng đ đư nghi n ứu Kết quả ho thấy điều kiện n m n ỏng th h h p nhất ủ

SH đ sản xuất HupA là 280

C, pH n đầu 6,4, tỉ ệ giống 12 , tuổi giống 48 giờ, khuấy 160 v ng/phút v n m n trong 8 ng y ưới những điều kiện n y năng suất Hup ó th đạt 7,21 m g /m

1.5 ứ ạ ậ ạ ấ

nghi n ứu về t h hiết, tinh sạ h, thu nhận hoạt hất Hup từ hủng nấm n i sinh ũng đư hú trọng nghi n ứu nhằm thu nhận đư h m ư ng Hup hiệu quả nhất nghi n ứu về phương ph p, qui tr nh t h hiết Hup từ hủng

vi nấm đư tiến h nh tương tự như t h hiết từ y H serrata Ở quy m ph ng th

nghiệm phương ph p t h hủ yếu đư thự hiện th o ướ : (1) ịch lên men

→ sinh khối → y t m, ọc thu c n nấm → Lọ →-Làm khô sinh khối nấm bằng cách sấy khô ở 60º → Nghiền s i nấm bằng máy nghiền i, ni tơ ỏng → Tr h y với dung môi hữu ơ ( hiết thu hồi HupA với sự xúc tác của methanol, ethanol, propanol,

ut no , h oro orm ) → đ c pha dung môi chứ Hup → Thu Hup th ở dạng

dị h→ Tinh sạch bằng sắc ký lọc gel, siêu lọc ho c th m thấu ngư → Kết tinh lại bằng dung môi hữu ơ → đ c – Kết tinh, lọ , → HupA tinh sạch; (2) Dịch lên men

→ sinh khối → x t hó đến pH=4,0 → Tr h y với dung môi hữu ơ→ đ c pha dung môi chứ Hup → Thu Hup th ở dạng dịch chiết → Tinh sạch bằng sắc ký c t silica gel, sắc ký lỏng o p HPL → đ c, kết tinh, lọ → HuP tinh Th o đó, h m

ư ng tinh sạ h ủ Hup thu đư thường rất o: 95-99 Tuy nhi n, phương ph p n y kh ng p dụng đư c ở quy mô công nghiệp do nhiều ng đoạn, chi phí tinh sạch bằng phương ph p sắc ký lọc gel, c t sắ ký tr o đổi ion, siêu lọc/th m thấu ngư c cao và hiệu suất thu hồi thấp M t số các tác giả đ đư r phương ph p tách chiết và tinh sạ h Hup đơn giản, hiệu quả v hướng tới t nh n to n o đ có th

áp dụng trong sản xuất công nghiệp như s u: ị h n m n → sinh khối → hiết bằng cồn nhiệt đ 50-60o → n chiết cồn đư c chiết trong dung m i h oro orm →

đ c, kết tinh, lọc thu nhận Hup th → Tinh sạch bằng phương ph p sử dụng các dung môi nhóm chlorinate ho c hỗn h p dung môi /ho c kết tinh lại nhiều lần với methanol,

th no → đ c, kết tinh, lọc, sấy và thu nhận HupA tinh sạ h; T y phương ph p m thu đư Hup tinh sạ h 80-98 (M nd G ng., 2008; Qi n nd Ji., 1989; Xi nd Kozikowski, 1989; Szypu v s 2005; p t nt số: N 103333109 , 2014; CN

103705548 A, 2014; CN 102702101 A, 2012; CN 102432535 A, 2012 )

TTRC thu thập tại v ng núi L ng i ng – Đ ạt – L m Đồng

2.2 Hóa chất và các trang thi t bị thí nghiệm

Hóa chất

- Chất chu n (−)-Huperzine A: Hãng Sigma – Mỹ, công thức phân tử C15H18N2O, đ tinh khiết ≥ 99

- Hóa chất xử lý mẫu y: nướ ất, ồn tuyệt đối, dH20, KMnO4, HgCl2

- Hóa chất sử dụng m m i trường nuôi cấy PDA, Czapek: glucose, peptone, tryptone, cao nấm men, ampicillin, streptomycin, agar, NaNO3, MgSO4, KCl,

N , N OH, KH2PO4, K2HPO4, N 2HPO4.2H2O, dH20, nước cất, ồn

- Hóa chất giữ chủng: glycerol

- hó hất sử dụng trong t h hiết, tinh sạ h Hup : m th no , th no , x ton, chloroform, Acetonitrile, amoni axetat, axit axetic, ethylenglycol

- Các hóa chất, t dư c sử dụng trong bào chế viên nang: Microcrystalline cellulose PH102 (Avicel PH102), lactose, Dicalcium phosphate, Polyvinylpyrrolidone (PVP K30), Hydroxypropyl Methyl cellulose (HPMC), Titan dioxyd, Talc, Magnesi stearat, Aerosil, HCl, ethanol,vỏ nang số 1 và 0

Trang thiết bị thí nghiệm

n thăng ằng, Cân phân tích (Mettelex, Toledo), Máy li tâm (Epp ndo , Đức),

Lò vi sóng (Electrolux, Nhật), Kính hi n vi (Nikon, Nhật), Tủ cấy vô trùng (Esco, Singapore), Tủ lạnh (Sanaky, Nhật), Pipetman (Đức), Máy lắc ổn nhiệt (G rh r t, Đức), Máy vortex (Rotolab, OSI, Pháp), Nồi khử trùng (Tommy, Nhật), Tủ ủ 280C (Friocell, Đức), Hệ thống n m n 5, 10, 80 v 500 t; M y qu y h n kh ng (Đức), Cân phân tích 3 số (Trung Quốc), Cân kỹ thuật 410g (Trung Quốc), Cân kỹ thuật 6000g (Trung Quốc), Thiết bị đo tỷ trọng hạt (Anh), M y đo đ m (Mỹ), M y đo đ rã (Anh), Máy

tr n, tạo hạt cao tốc (3-5kg, Việt Nam), Thiết bị tr n (5-10kg,Việt N m), M y đóng nang bán tự đ ng (Trung Quố ), M y đóng ọ (Việt Nam)

Môi trường nuôi cấy

M i trường PDA-I: 150g kho i t y, 10g đường glucos , 10g o nấm m n, 5g pepton, 5g tryton, 2g NaNO3, 0.5g MgSO4, 1g KH2PO4, 0.5g K2HPO4, 0.5

N 2HPO4.2H2O, 0.3g K , 0.3g N , nước cất 1L, agar 16g

Từ th nh phần m i trường P -I ải tiến đ ó m i trường th h h p sử dụng trong n i dung nghi n ứu về n ng o hoạt t nh ủ hủng

2 3 ươ ứu

1.3.1 Phân lập, tuyển chọn các chủng vi nấm nội sinh có khả năng sinh t ng hợp

up r in t câ hạch tùng răng cưa up r ia s rrata iệt Nam

a) Phương pháp thu mẫu cây

Thu thập mẫu thạ h t ng răng ư phải đầy đủ các b phận lá, thân và rễ th o phương ph p ngẫu nhi n Mẫu đư đựng trong các túi nilon có khóa kéo ghi rõ mã số, tên loài cây, thời gi n, đị đi m, người thu mẫu Mẫu đư c bảo quản trong điều kiện lạnh 4 - 80C, tr nh v đập m dập n t y

b) Phương pháp phân lập và bảo quản nấm nội sinh

Ph n ập nấm n i sinh th o phương ph p ủ o r ni et al (1995), Shen et al

(2000) ó ải tiến

ước tiến hành:

- Th o phương ph p ủa Dobranic và c ng sự (1995) có cải tiến: các mẫu cây

đư c rửa sạch, khử trùng bằng ethanol 70%, HgCl2 0.1%/KMnO4 1% trong khoảng thời gian thích ứng với từng mẫu Sau cùng, các mẫu đư c rửa lại bằng nước cất khử trùng 4÷5 lần Dùng dao khử tr ng dưới đèn n ắt mẫu thành từng phần nhỏ (0.2 – 1 cm) ở các b phận kh nh u từ lá, thân và rễ, với các mẫu từ các b phận kh nh u

đư đ t n đĩ p ptri hứ m i trường khác nhau với khoảng h đồng đều v đư c

đ nh k hiệu, số thứ tự ri ng tương ứng đĩ đư c nuôi ở nhiệt đ 280C, theo dõi

đĩ h ng ng y đ ki m tra sự phát tri n của các khu n ty nấm Cấy chuy n hệ

s i nấm từ hủng ph n ập đư từ đĩ thạ h n đầu s ng đĩ thạch mới và nuôi trong 280C, theo dõi và cấy chuy n đến khi thu đư c các chủng nấm thuần

- Nuôi cấy các chủng nấm thuần tr n m i trường thạ h nghi ng đến khi khu n ty nấm phát tri n phủ kín m t thạ h, s u đó ổ sung glycerol 15% vô trùng , giữ ở 4 ÷

100 đ ưu giữ và bảo quản chủng giống

c) Phương pháp nuôi cấ , lên m n chủng vi nấm

Chủng nghiên cứu đư nu i tr n MT nu i ấy P -I/Czapek-I 500 - 1000 ml

trên máy lắc tố đ 100 - 250 vòng/phút S u ≥120 giờ (t y hủng) nu i ấy ở nhiệt đ

28o , thu sinh khối

d) Phương pháp tách chiết HupA:

(1) Nuôi nấm trong ≥250 m m i trường PDA-I lỏng, lắ 150 rpm, 28o trong 5-14

ng y t y hủng; (2) Ly t m 8000 rpm thu sinh khối nấm; (3) Sấy kh sinh khối nấm ở 45-50oC; (4) Nghiền nấm ằng nitơ ỏng th nh t mịn; (5) ổ sung m t ư ng mmoni 10 với tỉ ệ 1 m /1 g b t nấm trong 1-2h ở nhiệt đ ph ng; (6) ổ sung 30m dung m i H 5 tỉ ệ 1:30 m , ắc ở nhiệt đ phòng trong 24h; (7) Ly tâm thu

dị h hiết ở 8000 rpm/10 phút; (8) hỉnh dung dị h thu đư về pH 9-10 bằng NaOH 10% / NH4OH 25%; chiết 3 lần với h oro orm v 2 ần với thy x t t v isopropanol (tỷ lệ 1:2), thu ph dưới; (9) Cô quay loại bỏ dung m i, thu đư ăn alkaloid toàn phần đư h t n trong 1 ư ng m th no đậm đ ≥1m

ký ớp mỏng (TL )

- Nguyên liệu, hóa chất:

+ Dịch chiết nấm n i sinh

+ Hóa chất: Chất chu n Huperzine A, chloroform, acetone, isopropanol, axit acetic, axit tartaric, phenol, isoamyl alcohol, iod, KMnO4

+ Bản mỏng silicagel Merck 0.25mm

- Tiến hành: (1) Hòa tan chất chu n HupA trong Methanol 1mg/ml Pha loãng đến các nồng đ hu n; (2) Hoạt hóa bản mỏng silicagel bằng cách sấy 1h ở 110o Mẫu đư hấm n ản mỏng ằng pip t ( hất chu n HupA 1µl nồng đ 10-6; mẫu dịch chiết nấm 5 ) Khoảng cách các giếng chấm h mép dưới 1 cm, hai bên mép 0.5 cm, giữa các giếng 0.7 m K h thước của vệt chấm càng nhỏ thì khả năng tách càng tốt Sấy nhẹ bản mỏng đ đuổi hết dung môi; (3) Dùng kẹp đư ản mỏng

đ hấm vào bình dung môi, đậy nắp bình.Theo dõi vạch dung môi di chuy n đến khi cách mép trên tấm bản mỏng 1 cm thì lấy bản mỏng ra khỏi bình, sấy nhẹ bản mỏng; (4) Sử dụng thuốc nhu m KMnO4 0.5% và Iod 0.5% xịt đều lên bản mỏng Sấy nhẹ bản mỏng, quan sát vết

f) ác ịnh h m lượng HupA: ằng phương ph p sắ ký ỏng hiệu năng o (HPL ) tr n

hệ thống Sắc ký lỏng hiệu năng o d t tor P (P rkinE m r) v sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS)

 h ơng pháp s k ng hi u năng o L á ịnh h ợng HupA trong mẫu nghiên cứu:

- Đi u ki n s c ký:

+ Máy Sắc ký lỏng hiệu năng o d t tor P (P rkinE m r)

+ Màng lọ 0,45 m ho kim ơm mẫu d ng đ lọc mẫu trướ khi ơm v o hệ thống

+ C t: C18 (150 x 4,6 mm, 5μm)

+ Tố đ dòng: 0,4 ml/min

+ Th tích tiêm: 20 µl

+ ước sóng: 310 nm

+ Ph đ ng: Dung môi A - Dung môi B (80 : 20)

Dung môi A: Acid formic 0,1 % Dung môi B: Methanol

- Chuẩn bị mẫu:

+ Dung dịch chu n: Cân h nh x c khoảng 10 mg Huperzine A chu n v o nh định mức 100 ml, h a tan v m vừa đủ ằng methanol, ắc đều Lọc qua m ng

ọc 0,45 µm

+ Dung dị h thử: ân h nh x c khoảng 10 mg hế ph m v o nh định mức 100

ml, h a tan v m vừa đủ ằng methanol, ắc đều Lọc qua m ng ọc 0,45 µm

- Tiến hành:

Ki m tra sự phù h p của hệ thống sắc ký: Tiêm l p lại 6 lần dung dịch chu n

Đ lệch chu n tương đối của diện tích pic Huperzine A giữa các lần tiêm l p lại

kh ng đư c lớn hơn 2,0

Lần ư t tiêm dung dịch chu n và dung dịch thử vào hệ thống sắc ký, ghi lại sắc

ký đồ

- Kết quả:

H m ư ng (%) của Huperzine A đư c tính theo công thức:

X (%)  100100

t C

T

m

C S S

Trong đó:

ST: Diện tích pic Huperzine A trên sắc ký đồ dung dịch thử

SC: Diện tích pic Huperzine A trên sắc ký đồ dung dịch chu n

C: Nồng đ Huperzine A trong mẫu chu n (mg/ml)

mT: Lư ng cân mẫu thử (mg)

 h ơng pháp s k ng khối phổ (LC-M á ịnh h ợng HupA trong viên nang thành phẩm:

Ion source Type HESI;

- Tiến hành:

+ Chu n bị dung dịch chu n gốc: Cân chính xác khoảng 25 mg chu n Huperzine A

v o nh định mức 20 ml, thêm khoảng 15m M th no (M OH), si u m đến

h t n ho n to n, đ ngu i, bổ sung vừ đủ th tích bằng MeOH, lắ đều đư c dung dịch chu n gốc có nồng đ 1250μg/m

+ Chu n bị dung dịch chu n nồng đ 250µg/ml: Hút chính xác 5,0ml dung dịch

chu n gố v o nh định mức 25ml, bổ sung vừ đủ th tích bằng MeOH, lắc đều

+ Chu n bị dung dịch chu n nồng đ 2,5 µg/ml: Hút chính xác 1,0ml dung dịch chu n gố v o nh định mức 100ml, bổ sung vừ đủ th tích bằng MeOH, lắc đều

+ Chu n bị dãy dung dịch chu n: Tiến hành pha loãng dung dịch chu n có nồng đ 2,5µg/ml bằng MeOH với hệ số pha loãng thích h p đ dãy dung dịch chu n có nồng đ 10, 25, 50, 75, 100, 125 ng/ml, lắ đều Lọc qua màng lọc 0,22µm

Mẫu viên nang cứng: Lấy b t chế ph m của 10 viên, nghiền mịn, tr n đều Cân

h nh x ư ng chế ph m tương ứng với khối ư ng 1 vi n v o nh định mức 100ml, thêm khoảng 70m M OH, si u m 15 phút, đ ngu i, bổ sung th tích

vừ đủ 100ml bằng MeOH, lắ đều Hút chính xác 2,0ml dung dịch trên vào bình định mức 20ml, bổ sung vừ đủ th tích bằng MeOH, lắ đều, lọc qua màng lọc 0,22µm

→ Tiến hành sắc ký các dung dịch chu n và dung dịch thử, ghi lại sắ ký đồ, thời gi n ưu v diện tích píc chu n và thử

H m ư ng Huperzine A trong chế ph m ( g/vi n) đư c tính theo công thức:

Trong đó: Mt khối ư ng cân của thử (g)

t đ pha loãng của thử (ml)

St là diện tích pic Huperzine A trong sắ ký đồ dung dịch thử

g) ịnh danh vi nấm sơ ộ bằng phương pháp tru n thống

Định danh với phương ph p truyền thống là nhận dạng chủng nấm qua màu sắc,

đ đi m hình thái khu n lạc: quan sát hệ s i, h nh th i, v h ngăn s i nấm, bào tử và cuống bào tử,… th o khó ph n oại của Nguyễn L n ũng v ng sự (1982), Bùi

Xu n Đồng (1984), Ainsworth et al (1973) đ sơ nhận dạng, phân loại các chủng nấm đến chi

ước tiến hành: (1) Nuôi cấy chủng nấm đ đư c phân lập tr n đĩ p ptri chứ m i trường PDA-I ở 28oC; (2) Theo dõi hàng ngày thời gian phát tri n, hình thái, màu sắ , k h thước khu n lạc; (3) Nu i ấy hủng tr n m m n v m k nh ở 280C trong khoảng thời gian 3÷10 ngày tùy từng chủng nấm ho đến khi s i nấm mọc lan đều bề m t lamen; (4) Quan sát và chụp ảnh hệ s i, bào tử, cuống bào tử, v h ngăn,… của các chủng nấm; (5) Nhận dạng sơ vi nấm n i sinh qua màu sắc – hình thái khu n lạc cùng bào tử theo các khóa phân loại

h) ịnh danh vi nấm nội sinh bằng phương pháp sinh học phân tử

Chuẩn bị sinh khối nấm

- Các s i nấm thuần đư c cấy chuy n sang các bình tam giác chứ m i trường PDB-I lỏng

- Sau khi cấy, các bình nhân sinh khối đư c nuôi lắc 150 vòng/phút, ở 280C trong thời gian từ 3-10 ng y Thu sinh khối ằng y t m ở 6000v/p trong 10 phút

- Bảo quản ở 4-80C

Tách chiết ADN: Nghiền khoảng 10÷50 mg mẫu nấm trong nitơ ỏng v t h hiết N

tổng số th o k t t h hiết N g nom G-spinTM Total DNA Extraction Kit (INtRON,

Đ g đ ng, ấy ư c ra, thả bản gel vào b điện di và tiến hành nạp mẫu