Báo Cáo Tóm Tắt Dự Án Azpa_Cấp Nhà Nước _Phần 2_15.3.2021.Docx

PHẦN V KẾT QUẢ THỰC HIỆN DỰ ÁN 5 1 Hoàn thiện quy trình công nghệ sản suất bộ kit chẩn đoán đột biến gen AZF gây vô sinh nam giới ở quy mô phòng thí nghiệm (Nội dung 1) 5 1 1 Hoàn thiện bộ hỗn hợp (Ma[.]

Bảng 5.1 Danh sách 8 trình tự mồi khuếch đại mất đoạn AZF cơ bản

TT Tên mồi Kích thước (bp) Ghi chú

Ghi chú:* F là trình tự mồi xuôi; R là trình tự mồi ngược; ** Các trình tự mồi được thiết kế mới.

Các mồi được đặt mua từ các hãng sản xuất (IDT, Sigma, Invitrogen,…) và đượccung cấp dưới dạng đông khô Các mồi được pha về nồng độ gốc 100 µM theo hướngdẫn chi tiết trong đơn giao hàng và được bảo quản ở - 20oC

- Kiểm tra tính đặc hiệu của mồi bằng các phản ứng PCR đơn mồi

Tính đặc hiệu của các mồi nhân STS tham khảo theo khuyến cáo củaEAA/EQMN và các mồi sau khi thiết kế mới được kiểm tra bằng các phản ứng PCRđơn với thành phần như sau:

- Kiểm tra sự có mặt của STS bằng phản ứng PCR đơn mồi

Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1,5% (Hình 5.1)

Hình 5.1 Điện di đồ sản phẩm PCR với các STS đơn

Bảng 5.6 Các chỉ thị STS và kích thước (bp) của chúng trong bộ

xét nghiệm AZF cơ bản

- Tối ưu các STS của bộ AZF cơ bản trong một phản ứng mPCR

Bộ xét nghiệm AZF cơ bản được chạy thử với 04 mẫu DNA đối chứng của namgiới, không bị mất đoạn, và 01 đối chứng nữ Kết quả được thể hiện trên hình 5.2 Đốichứng nữ chỉ cho kết quả dương tính với duy nhất chỉ thị ZFX, trong khi đó các chỉ thịSTS đặc hiệu cho NST Y đều âm tính Với các mẫu DNA của 04 nam giới bìnhthường đều cho các băng DNA đúng với kích thước dự tính của các STS Các băngnày được phân tách đều nhau và dễ dàng nhận biết trên bản điện di agarose 3%, ở 100

V trong vòng 75 - 90 phút (Hình 5.2)

Hình 5.2 Điện di đồ sản phẩm mPCR của bộ AZF cơ bản

M: marker 100 bp, (-) đối chứng âm, nữ: DNA nữ giới, bình thường, TL19087, TL19094,

TL9114, TL19117: DNA nam giới bình thường

Như vậy, nghiên cứu đã thành công trong việc thiết kế bộ xét nghiệm AZF cơbản Tuy nhiên, để có một đánh giá đầy đủ về bộ AZF cơ bản, cần thiết phải sản xuấtmột số lượng lớn bộ xét nghiệm AZF mới và áp dụng trên các mẫu bệnh nhân

5.1.1.2 Tách dòng toàn bộ 8 chỉ thị STS có mặt trong bộ xét nghiệm AZF cơ bản vào vector tách dòng

Để phục vụ cho việc giải trình tự các chỉ thị STS có mặt trong bộ xét nghiệmAZF cơ bản, sản phẩm PCR chứa các chỉ thị được tinh sạch, sau đó gắn vào vectorpBT bằng enzyme T4 ligase, tiếp đến sản phẩm ligate được biến nạp vào E.coli DH5α

Để chọn dòng tế bào E.coli DH5α tái tổ hợp, chúng tôi tiến hành phản ứng PCR sử dụng cặp mồi PUC18_F (5’-CAGGGTTTTCCCAGTCACGA-3’) và PUC18-

colony-R (5’-GCGGATAACAATTTCACACA-3’) Kết quả điện di sản phẩm colony-PCcolony-R sửdụng cặp mồi PUC18_F/R sàng lọc các dòng E coli DH5α mang các đoạn DNA đượcnhân dòng trong vector pBT được thể hiện ở hình 5.4

Hình 5.4 Kết quả colony-PCR sử dụng cặp mồi PUC18_F/R sàng lọc các dòng E.

coli DH5α mang các đoạn DNA được nhân dòng trong vector pBT

Kết quả điện di cho thấy, sản phẩm PCR thu được theo đúng kích thước tính toán lýthuyết (kích thước STS + 164 bp) Như vậy đã tách dòng thành công các chỉ thị STS có mặttrong bộ xét nghiệm AZF cơ bản Các plasmid pBT tái tổ hợp sau đó được tách chiết, tinhsạch và được sử dụng để giải trình tự các STS trong bộ AZF cơ bản

5.1.1.3 Đọc trình tự nucleotide toàn bộ 8 chỉ thị có mặt trong bộ xét nghiệm AZF cơ bản

Các vector pBT tái tổ hợp chứa các STS trong bộ xét nghiệm AZF cơ bản được sửdụng làm khuôn cho phản ứng giải trình tự với các M13-F (5´-GTAAAACGACGGCCAG-3´), sử dụng BigDye terminator cycler v3.1 và đọc kết quảtrên hệ thống ABI3500XL (Applied Biosystems, Mỹ) Trình tự nucleotide thu được sẽ được

phân tích bằng phần mềm Bioedit Trình tự ADN sau khi đọc được hiệu chỉnh với sự trợgiúp của phần mềm ChromasPro1.7.6 (Technelysium, 2013) để loại bỏ các tín hiệu nhiễu.

Các trình tự STS có mặt trong bộ xét nghiệm AZF cơ bản được trình bày ở bảng5.12

Các trình tự phân tích bằng phần mềm Bioedit phù hợp với ngân hàng gen AZF

Ví dụ kết quả đọc trình tự với mồi M13 của chỉ thị sY255 (Hình 5.5)

Hình 5.5 Trình tự với mồi M13 của chỉ thị sY255

5.1.1.4 Sản xuất thử 1 bộ kit AZF cơ bản, mỗi bộ kit tương ứng với 20 mẫu, 20 mẫu bệnh nhân, bao gồm cả mẫu chứng âm và mẫu chứng dương

Bộ kit AZF cơ bản được sử dụng để xác định các mất đoạn AZFa, AZFb, vàAZFc ở 20 bệnh nhân nam được cung cấp với Bệnh viện Đại học Y Hà Nội Kết quảphân tích bằng bộ kit AZF cơ bản được thể hiện ở hình 5.6 20/20 bệnh nhân nam chokết quả khuếch đại tất cả 8 chỉ thị có trong bộ xét nghiệm AZF cơ bản Các chỉ thị đốichứng SRY và ZFXY ở 20 mẫu bệnh nhân trên đều cho kết quả dương tính Trong khi

đó, mẫu đối chứng nam của nam giới không bị mất đoạn cho kết quả khuếch đại tất cả

8 chỉ thị có trong bộ xét nghiệm AZF cơ bản Đối chứng trắng cho kết quả âm tính, vàđối chứng nữ chỉ cho kết quả khuếch đại với chỉ thị ZFX/Y, đúng với yêu cầu của bộxét nghiệm (Hình 5.6)

Hình 5.6 Điện di đồ sản phẩm mPCR của bộ AZF cơ bản với 20 mẫu bệnh nhân

M: marker 100 pb plus, (-) đối chứng âm, nữ: ADN tách từ nữ giới

Như vậy, với bộ xét nghiệm AZF cơ bản được thiết kế cho 20 mẫu bệnh nhân

và 01 mẫu chứng dương và 01 mẫu chứng âm cho phép chẩn đoán sự hiện diện của tất

cả 08 STS có mặt trong bộ xét nghiệm Cần tiến hành các xét nghiệm AZF mở rộng E1

và mở rộng E2 để có kết luận chính xác nhất về đột biến AZF Các nghiên cứu tiếptheo sẽ tập trung vào việc xác định độ nhạy, độ đặc hiệu, tính lặp lại của bộ xét nghiệmAZF cơ bản với số lượng bệnh nhân lớn hơn (n=400) để đảm bảo bộ kit AZF cơ bản

có độ tin cậy cao trong chẩn đoán.

5.1.1.5 So sánh với kit chẩn đoán có IVD, bộ kit sử dụng là Devyser v2 (Thụy Điển) chẩn đoán 6 vị trí STS trên vùng AZF (sY84, sY86, sY127, sY134, sY254, sY255) và 2 trình tự chứng SRY, ZFX/Y

Khi so sánh với kit chẩn đoán có IVD, bộ kit sử dụng là Devyser v2 (ThụyĐiển) chẩn đoán 6 vị trí STS trên vùng AZF (sY84, sY86, sY127, sY134, sY254,sY255) và 2 trình tự chứng SRY, ZFX/Y, nhận thấy: Kết quả của 20 bệnh nhân, 1 đốichứng nam, 1 đối chứng nữ khi chạy bằng bộ AZF tự thiết kế hoàn toàn trùng khớpvới kết quả khi chạy bằng bộ kit Devyser v2

5.1.2 Hoàn thiện bộ hỗn hợp (Mastermix) chẩn đoán mất đoạn AZF mở rộng (Công việc 2)

5.1.2.1 Thiết kế các trình tự mồi (STS) chẩn đoán mất đoạn AZF mở rộng AZF mở rộng bao gồm 11 STS gồm có: sY88, sY121, sY1182, sY105, sY1191, sY1291, sY153, sY160, sY82, sY143, sY83, và hai đối chứng SRY, và ZFX/Y

Bảng 5.15 Trình tự mồi và kích thước bộ AZF mở rộng E1

Chú thích:* F là trình tự mồi xuôi; R là trình tự mồi ngược; ** Các trình tự mồi được thiết kế mới.

Bảng 5.16 Trình tự mồi và kích thước bộ AZF mở rộng E2

Thứ tự Tên mồi Kích thước sản phẩm PCR (bp) Ghi chú

R

R 7

ZFXY-1 hoặc ZFXY- 2

F

R F

R

Chú thích:* F là trình tự mồi xuôi; R là trình tự mồi ngược; ** Các trình tự mồi được thiết kế mới.

- Kiểm tra tính đặc hiệu của mồi nhân STS bằng các phản ứng PCR đơn

Sản phẩm PCR của STS đơn được điện di kiểm tra trên gel agarose 1,5% (Hình 5.9)

Hình 5.9 Điện di đồ sản phẩm PCR với các STS đơn (bộ AZF mở

rộng)

DNA nam giới bình thường được sử dụng làm khuôn cho sản phẩm PCR

Các cặp mồi được lựa chọn trong bộ AZF mở rộng E2 bao gồm: sY153 (139bp); sY160 (236bp); sY82 (264bp); sY143 (311bp); sY83-2 (400bp) và hai đối chứngSRY (472 bp), và ZFX/Y-2 (495 bp)

- Tối ưu các STS của bộ AZF mở rộng trong một phản ứng mPCR

Bộ xét nghiệm AZF mở rộng được chạy thử với các 04 mẫu ADN đối chứngcủa nam giới, không bị mất đoạn, và 01 đối chứng nữ Kết quả tối ưu các STS được tối

ưu khi hỗn hợp mồi được chuẩn bị với tỷ lệ bằng nhau các mồi nhân các chỉ thị STStrong bộ mở rộng E1 và mở rộng E2 và ở nồng độ mồi là 40 pm Nhiệt độ gắn mồi tối

ưu cho phản ứng PCR multiplex ở bộ xét nghiệp AZF mở rộng E1 là 57 oC, trong thờigian gắn mồi là 90 giây, trong khi đó nhiệt độ gắn mồi tối ưu cho phản ứng PCRmultiplex ở bộ xét nghiệm AZF mở rộng E2 là 59 oC Thời gian điện di tối thiếu đểcho hình ảnh rõ nét nhất trong điều kiện 100V, sử dụng agarose gel 3% với bộ mởrộng E1 là 90 phút, trong khi đó, thời gian điện di tối thiểu để cho hình ảnh rõ nét nhấtvới bộ mở rộng E2 là 75 phút.

Kết quả được thể hiện ở hình 5.10 Mẫu đối chứng nam của nam giới không bịmất đoạn cho kết quả khuếch đại tất cả 8 và 7 chỉ thị có trong bộ xét nghiệm AZF mởrộng E1 và E2 tương ứng Đối chứng âm cho kết quả âm tính, và đối chứng nữ chỉ chokết quả khuếch đại với chỉ thị ZFX/Y, đúng với yêu cầu của bộ xét nghiệm

Hình 5.10 Điện di đồ sản phẩm mPCR của bộ xét nghiệm

AZF mở rộng

A Điện di đồ của AZF mở rộng E1; B Điện di đồ của AZF mở rộng E2.

M: marker 1 kb plus; (-) đối chứng âm, nữ: ADN tách từ nữ giới, TL068 và PA071: ADN tách

từ nam giới không bị mất đoạn trong vùng AZF CF19, PA18087 là mã bệnh nhân bị mất

đoạn trong vùng AZF.

Kết quả cho thấy rằng các bệnh nhân với mã số CF19 và PA18087 bị mất chỉthị sY1291, trong khi đó bệnh nhân với mã số PA071 thì hoàn toàn bình thường ở cả 3xét nghiệm AZF cơ bản và AZF mở rộng

Như vậy, trong nội dung trình bày phía trên, chúng tôi đã thành công trong việc

thiết kế bộ xét nghiệm AZF mở rộng Tuy nhiên, để có một đánh giá đầy đủ về bộAZF mở rộng, cần thiết phải tách dòng, giải trình tự, sau đó sản xuất một số lượng lớn

bộ xét nghiệm AZF mới và áp dụng trên các mẫu bệnh nhân

5.1.2.2 Tách dòng toàn bộ 13 chỉ thị STS có mặt trong bộ xét nghiệm AZF mở rộng vào vector tách dòng

Hình 5.11 Kết quả colony-PCR sử dụng cặp mồi PUC18_F/R sàng lọc các dòng

E coli DH5α mang các STS trong bộ xét nghiệm AZF mở rộng được nhân dòng

GTAAAACGACGGCCAG-3´), sử dụng BigDye terminator cycler v3.1 và đọc kếtquả trên hệ thống ABI3500XL (Applied Biosystems, Mỹ) Trình tự nucleotide thuđược sẽ được phân tích bằng phần mềm Bioedit Trình tự ADN sau khi đọc được hiệuchỉnh với sự trợ giúp của phần mềm ChromasPro1.7.6 (Technelysium, 2013) để loại

bỏ các tín hiệu nhiễu

Các trình tự STS có mặt trong bộ xét nghiệm AZF mở rộng được trình bày ở bảng 5.22

Ví dụ kết quả đọc trình tự với mồi M13 của chỉ thị sY88 (hình 5.12)

Hình 5.12 Trình tự với mồi M13 của chỉ thị sY88

5.1.2.4 Sản xuất thử 1 bộ kit AZF mở rộng, mỗi bộ kit tương ứng với 20 mẫu, 20 mẫu bệnh nhân, bao gồm cả mẫu chứng âm và mẫu chứng dương

Bộ kit AZF mở rộng được sử dụng để xác định các mất đoạn mở rộng AZFa,AZFb, và AZFc ở 20 bệnh nhân nam được cung cấp với Bệnh viện Đại học Y Hà Nội.Kết quả phân tích bằng bộ kit AZF mở rộng E1 và mở rộng E2 được thể hiện ở hình5.13 và hình 5.14

Hình 5.13 Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR multiplex của bộ AZF mở rộng E1

với 20 mẫu bệnh nhân

Chú thích: M: marker 100 pb plus, (-) đối chứng âm, nữ: DNA tách từ nữ giới

(1): ĐC (-), (2): Chứng nữ TL110, (3): mẫu PA071, (4): mẫu CF19, (5): mẫu PA18087, (6): chứng nam TL068, (7): ĐC (-), (8): Chứng nữ , (9): mẫu PA071, (10): mẫu CF19, (11): mẫu PA18087, (12): chứng nam TL035, (13): ĐC (-), (14): Chứng nữ TL086, (15): mẫu Y10

190191, (16): mẫu Y10 190195, (17): mẫu Y10 190196, (18): mẫu MGY139, (19): chứng nam TL035, (20): ĐC (-), (21): Chứng nữ TL123, (22): mẫu PA087, (23): mẫu MGY134, (24): mẫu MGY135, (25): mẫu MGY138, (26): chứng nam TL035, (27): ĐC (-), (28): Chứng nữ TL113, (29): mẫu PA086, (30): mẫu MGY139, (31): mẫu MGY141, (32): mẫu CF16, (33): chứng nam TL049, (34): ĐC (-), (35): Chứng nữ TL088, (36): mẫu PA083, (37): mẫu PA084, (38): mẫu PA085, (39): Chứng nam TL061: có đột biến ở chứng nam.

Kết quả cho thấy, các mẫu PA071, CF19, PA18087, mẫu MGY139, TL061 mấtchỉ thị sY1291 trong bộ AZF mở rộng E1, trong khi các mẫu còn lại có sự xuất hiện củatất cả các chỉ thị STS trong bộ AZF mở rộng E1 Trong khi đó, mẫu đối chứng nam củanam giới không bị mất đoạn cho kết quả khuếch đại tất cả các chỉ thị STS có trong bộ

xét nghiệm AZF mở rộng E1 Đối chứng trắng cho kết quả âm tính, và đối chứng nữ chỉcho kết quả khuếch đại với chỉ thị ZFX/Y, đúng với yêu cầu của bộ xét nghiệm.

Hình 5.14 Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR multiplex của bộ AZF mở rộng E2

với 20 mẫu bệnh nhân

Chú thích: M: marker 100 pb plus, (-) đối chứng âm, nữ: DN A tách từ nữ giới

(1): ĐC (-), (2): Chứng nữ TL110, (3): mẫu PA071, (4): mẫu CF19, (5): mẫu PA18087, (6): chứng nam TL068, (7): ĐC (-), (8): Chứng nữ , (9): mẫu PA071, (10): mẫu CF19, (11): mẫu PA18087, (12): chứng nam TL035, (13): ĐC (-), (14): Chứng nữ TL086, (15): mẫu Y10

190191, (16): mẫu Y10 190195, (17): mẫu Y10 190196, (18): mẫu MGY139, (19): chứng nam TL035, (20): ĐC (-), (21): Chứng nữ TL123, (22): mẫu PA087, (23): mẫu MGY134, (24): mẫu MGY135, (25): mẫu MGY138, (26): chứng nam TL035, (27): ĐC (-), (28): Chứng nữ TL113, (29): mẫu PA086, (30): mẫu MGY139, (31): mẫu MGY141, (32): mẫu CF16, (33): chứng nam TL049, (34): ĐC (-), (35): Chứng nữ TL088, (36): mẫu PA083, (37): mẫu PA084, (38): mẫu PA085, (39): Chứng nam TL061.

Kết quả cho thấy, ở các mẫu bệnh nhân đều có sự hiện diện của tất cả các chỉthị trong bộ xét nghiệm AZF mở rộng E2 Trong khi đó, mẫu đối chứng nam của namgiới không bị mất đoạn cho kết quả khuếch đại tất cả các chỉ thị STS có trong bộ xétnghiệm AZF mở rộng E2 Đối chứng trắng cho kết quả âm tính, và đối chứng nữ chỉcho kết quả khuếch đại với chỉ thị ZFX/Y, đúng với yêu cầu của bộ xét nghiệm.

Như vậy, với bộ xét nghiệm AZF mở rộng được thiết kế cho 20 mẫu bệnh nhân

và 01 mẫu chứng dương và 01 mẫu chứng âm cho phép chẩn đoán đột biến của cácSTS trong bộ xét nghiệm Các nghiên cứu tiếp theo sẽ tập trung vào việc xác định độnhạy, độ đặc hiệu, tính lặp lại của bộ xét nghiệm AZF mở rộng E1 và bộ xét nghiệmAZF mở rộng E2 với số lượng bệnh nhân lớn hơn (n=100) để đảm bảo bộ kit AZF mởrộng có độ tin cậy cao trong chẩn đoán

5.1.2.5 So sánh với kit chẩn đoán có IVD, bộ kit sử dụng là Devyser Extension (Thụy Điển) chẩn đoán 11 vị trí STS trên vùng AZF mở rộng (sY160, gr/gr (sY1191, sY1192), sY1291, sY88, sY1065, sY82, sY83, sY153, sY121, sY105) và 2 trình tự chứng SRY, ZFX/Y

So sánh bộ kit AZF mở rộng thử nghiệm với kit chẩn đoán có IVD, bộ kit sửdụng là Devyser Extension (Thụy Điển)

Hình ảnh minh họa bệnh nhân được thực hiện bằng 2 phương pháp xét nghiệmphát hiện mất đoạn AZF mở rộng bằng bộ kit mới và bộ kit thương mại Devyser (Hình5.15 và hình 5.16)

A B Hình 5.15 Kết quả điện di đồ sản phẩm mPCR chạy bằng kit tự thiết kế

Chú thích: A: Kết quả bộ mở rộng E1; Mẫu 190010 bị mất đoạn sY1291 B: Kết quả bộ mở

rộng E2; M: marker; 1: Đối chứng âm; 2: Chứng nữ; 3,6: Mẫu 190011; 4,5: Mẫu 190010.

Hình 5.16a Kết quả phân tích mất đoạn AZF mở rộng bằng

bộ kit Devyser Extension

Mẫu 190011 không bị mất đoạn

1 2 3 4 5 6 7

88

M 1 2 3 4 5 6

M 1 2 3 4 5 6

Hình 5.16b Kết quả phân tích mất đoạn AZF mở rộng bằng

bộ kit Devyser Extension

Mẫu 190010 bị mất đoạn sY1291

Khi so sánh với kit chẩn đoán có IVD, bộ kit sử dụng là Devyser Extension(Thụy Điển) chẩn đoán 11 vị trí STS trên vùng AZF mở rộng (sY160, gr/gr (sY1191,sY1192), sY1291, sY88, sY1065, sY82, sY83, sY153, sY121, sY105) và 2 trình tựchứng SRY, ZFX/Y nhận thấy: Kết quả của 20 bệnh nhân, 1 đối chứng nam, 1 đốichứng nữ khi chạy bằng bộ AZF tự thiết kế hoàn toàn trùng khớp với kết quả khi chạybằng bộ kit Devyser Extension

5.2 Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của bộ kit (Nội dung 2)

5.2.1 Xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của bộ kit chẩn đoán AZF cơ bản (Công việc 1)

5.2.1.1 Lựa chọn, đánh giá, thu thập, lập hồ sơ các mẫu DNA chuẩn để dùng đánh giá AZF cơ bản

Đã chọn được 422 Hồ sơ đạt tiêu chuẩn (phụ lục)

5.2.1.2 Đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của bộ kit xét nghiệm AZF cơ bản (AZPA_D)

Có 422 mẫu DNA được xét nghiệm để phát hiện mất đoạn AZFa, AZFb, AZFc.Kết quả được thể hiện ở bảng 5.25 389 trường hợp không phát hiện mất đoạn, 34

trường hợp phát hiện mất đoạn 422 trường hợp đều được phân tích đồng thời bằng bộkit thương mại Devyser v2 của Thụy Điển Kết quả tương đương giữa 2 phương pháp

về khả năng phát hiện mất đoạn và phân loại chính xác kiểu mất đoạn AZF cơ bản

Bảng 5.25 Độ nhạy và độ đặc hiệu của bộ kit AZPA_D so với kit thương mại

Phân loại

Xác nhận đơn mồi

Kit Devyser v2 Kit của dự án

Có 387 mẫu không phát hiện mất đoạn AZFabc cơ bản bằng bộ kit thương mại

và 386 mẫu không phát hiện mất đoạn AZFabc cơ bản bằng bộ kit của dự án sản xuất

Có 36 trường hợp bị mất đoạn khi xét nghiệm bằng bộ kit thương mại và 35 trườnghợp bị mất đoạn khi xét nghiệm bằng bộ kit của dự án, trong đó:

- Mất đoạn AZFa, AZFb, AZFc riêng lẻ và mất đoạn AZFabc đồng thời cho kếtquả tương đương giữa 2 bộ kit

- Mất đoạn AZFbc đồng thời (AZFb_sY127, sY134; AZFc_sY254, sY255) có1/9 trường hợp không tương ứng giữa 2 bộ kit Kit thương mại phát hiện mất đoạnAZFbc trên cả 9 trường hợp, kit của dự án chỉ phát hiện mất đoạn trên 8 trường hợp

Để xác thực việc này, nhóm thực hiện dự án và các nhà nghiên cứu đã tiến hành phântích ít nhất 3 lần với mẫu trên với cả 2 bộ kit và bao gồm cả phân tích đơn mồi chotrường hợp trên Kết quả, mẫu dương tính với kết quả đơn mồi, có sản phẩm PCR khiđiện di, tức là có mặt cả 4 STS: sY127, sY134 của AZFb và sY254, sY255 của AZFc(Hình 5.17).

Hình 5.17 Điện di đồ đơn mồi AZFbc (sY127, sY134, sY254, sY255)

Chú thích: M: thang chuẩn DNA 100bp; (-): chứng âm, không có DNA; S1 - S4 (kí hiệu của mẫu MGY20027): Mẫu DNA có mất đoạn đồng thời AZFbc khi xét nghiệm bằng bộ kit thương mại Devyser v2, không mất đoạn AZFbc khi xét nghiệm bằng bộ kit của dự án; N: chứng dương, nam giới bình thường, không bị mất đoạn AZFbc.

Hình ảnh điện di đồ sản phẩm PCR đơn mồi của 4 STS cho thấy, bên cạnhchứng dương là nam giới bình thường không bị mất đoạn (vạch điện di sản phẩm PCRtương ứng rất rõ), thì mẫu bệnh nhân (S1-S4) đều có sản phẩm điện di, mặc dù sảnphẩm PCR điện di không được rõ nét như chứng dương của người nam, nhưng trênhình ảnh điện di đồ thể hiện khá rõ vạch điện di tương ứng với các STS, giống vớichứng dương Thí nghiệm đơn mồi được lặp lại nhiều lần tại Đại học Y Hà Nội vàCông ty Cổ phần Công nghệ Việt Á, đảm bảo không nhiễm chéo và hạn chế sai sóttrong quá trình thao tác kỹ thuật (chứng dương rõ nét và chứng âm luôn đảm bảo,không có sản phẩm PCR), kết quả đều tương tự nhau, mẫu được xét nghiệm có mấtđoạn AZFbc bằng kit thương mại (âm tính) thì đều dương tính với kit của dự án Điềunày cũng đặt ra vấn đề đánh giá độ đặc hiệu của kit thương mại, bởi tiêu chuẩn “vàng”

để xác định có mất đoạn hay không là khi có mất đoạn được xác định bằng phức hợp

đa mồi, nếu nghi ngờ, đều được xác nhận (confirm) bằng xét nghiệm đơn mồi, cáctrình tự mồi này được khuyến cáo chung theo tiêu chuẩn của EAA/EMQN

Nếu coi bộ kit thương mại Devyser v2 là tiêu chuẩn để so sánh thì độ nhạy của

bộ kit dự án AZPA_D đạt 97,2% (35/36 mẫu) Thực tế, theo công bố của kit thươngmại, độ nhạy của kit Devyser v2 đạt > 97% và độ đặc hiệu > 99% (phụ lục dự án 3.3)

Như vậy, nếu tính tiêu chuẩn vàng là phân tích đơn mồi, thì độ nhạy và độ đặchiệu của bộ kit dự án AZPA_D (xét nghiệm AZF cơ bản) đạt 100%, độ nhạy và độ đặchiệu của bộ kit thương mại Devyser v2 là 100% và 99,7%

5.2.2 Xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của bộ kit chẩn đoán AZF mở rộng (Công việc 2)

5.2.2.1 Lựa chọn, đánh giá, thu thập, lập hồ sơ các mẫu DNA chuẩn để dùng đánh giá AZF mở rộng

Đã chọn được 214 hồ sơ đạt tiêu chuẩn (phụ lục)

5.2.2.2 Đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của bộ kit xét nghiệm AZF mở rộng (AZPA_E)

Có 214 mẫu bệnh nhân được lựa chọn để phân tích mất đoạn AZF mở rộngbằng song song 2 bộ kit thương mại (Devyser Extension) và bộ kit của dự án(AZPA_E) Kết quả được thể hiện ở bảng 5.26 Nhóm STS mở rộng thuộc gen AZFđược khảo sát bao gồm 11 STS:

- Bộ kit thương mại Devyser AZF Extension: sY160, sY1191, sY1291 sY88,sY1065, sY82, sY83, sY153, sY121, sY1192, sY105 2 STS chứng là SRY (sY14) vàZFX/Y Theo công bố của hãng, bộ kit Devyser Extension có độ nhạy > 94% (phụ lục3.3)

- Bộ kit của dự án sản xuất: sY160, sY1191, sY1291, sY88, sY1182 (thay chosY1065), sY82, sY83, sY153, sY121, sY143 (thay cho sY1192), sY105 2 STS chứng

là SRY (sY14) và ZFX/Y

Bảng 5.26 Độ nhạy và độ đặc hiệu của bộ kit AZPA_E so với kit thương mại

Phân loại

Kit Devys er Exten sion

Kit của

dự án (AZPA_

E)

Xác nhận đơn mồi

Devy ser AZPA_ E Devy ser AZPA_ E

Chú thích: 17*; 23*: số đoạn mất thật sự đã được xác định bằng đơn mồi; **: Nếu tính kit

dự án phát hiện mất đoạn sY1192 thì kit dự án có độ nhạy 20/23= 87%

Như vậy, các STS được khảo sát là tương đồng giữa 2 bộ kit Kết quả bảng 5.26cho thấy, với các STS: sY88, sY121, sY1182/sY1065, sY105, sY1191, sY1291,sY160, sY82, sY83, phát hiện mất đoạn là tương đồng giữa 2 bộ kit

Với trình tự sY1065 của bộ kit thương mại, có 2 trường hợp phát hiện mất đoạnsY1065 Bộ kit của dự án không sử dụng trình tự sY1065, nhưng đã sử dụng trình tựsY1182 Theo khuyến cáo của EAA/EMQN, hai trình tự này có thể thay thế cho nhautrong phát hiện mất đoạn vùng AZFa mở rộng Bộ kit của dự án cũng đã phát hiện cả 2trường hợp mất đoạn sY1065 cũng mất đoạn sY1182 Như vậy độ nhạy của kit khiphát hiện sY1065/sY1182 là 100%

Với trình tự sY153, có 3/20 trường hợp kit của dự án không phát hiện thấy mấtđoạn, trong khi với kit thương mại Devyser Extension phát hiện thấy mất đoạn sY153

ở cả 20 trường hợp Cũng giống như trường hợp phát hiện AZF cơ bản, nhóm nghiêncứu và thực hiện dự án đã tiến hành phân tích 3 mẫu này bằng đơn mồi sY153, cả 3mẫu đều dương tính với đơn mồi sY153, nghĩa là không mất đoạn sY153 Kết quảkhông mất đoạn sY153 của 3 mẫu được minh họa qua hình điện di đồ hình 5.18

Như vậy, với tiêu chuẩn đơn mồi, khả năng phát hiện của kit do dự án sản xuấtvới sY153 là chính xác Như vậy, khả năng phát hiện sY153 của kit dự án có độ nhạy

là 100%

Hình 5.18 Điện di đồ sản phẩm PCR đơn mồi sY153 với 3 mẫu bệnh

Chú thích: M: thang chuẩn DNA 100bp; (-): chứng âm, không có DNA; N: chứng dương, nam giới bình thường, không bị mất đoạn sY153; S1 - S3 (kí hiệu lần lượt của 3 mẫu MGY19035, MGY19046, MGY19063): 3 mẫu DNA có mất đoạn sY153 khi xét nghiệm bằng

bộ kit thương mại (Devyser Extension), không mất đoạn sY153 khi xét nghiệm bằng bộ kit của

dự án (AZPA_E)

Với trình tự sY1192, trong bộ kit thương mại Devyser Extension sử dụng đểphát hiện mất đoạn mở rộng của vùng AZFb Theo khuyến cáo của EAA/EMQN, 2trình tự sY1192 hoặc sY143 có thể thay thế trong phát hiện mất đoạn mở rộng vùng