PHẦN I MỞ ĐẦU Đột biến mất đoạn vùng AZF là nguyên nhân di truyền phổ biến đứng thứ hai, gây vô sinh ở nam giới AZF (Azoospermia factor) nằm ở vùng đặc hiệu giới tính nam trên nhiễm sắc thể giới tính[.]
Trang 1PHẦN I MỞ ĐẦU
Đột biến mất đoạn vùng AZF là nguyên nhân di truyền phổ biến đứng thứhai, gây vô sinh ở nam giới AZF (Azoospermia factor) nằm ở vùng đặc hiệu giớitính nam trên nhiễm sắc thể giới tính Y (NST Y), được gọi là yếu tố vô tinh hay yếu
tố không có tinh trùng Trên vùng AZF có chứa các gen quy định việc sản xuất, biệthóa và trưởng thành tế bào sinh dục nam là tinh trùng Đột biến mất đoạn AZF haycòn gọi là đột biến mất đoạn nhỏ trên nhiễm sắc thể (NST) Y là bất thường cấu trúchay gặp nhất trên NST Y dẫn đến người nam bị hạn chế hoặc không có khả năngsinh tinh tinh trùng Tỉ lệ nam giới vô sinh do mất đoạn AZF dao động từ 7 ÷ 17%,gặp ở nhóm nam giới không có tinh trùng nhiều hơn nhóm ít tinh trùng [1], [2]
Vùng AZF được chia thành các phân vùng nhỏ hơn là AZFa, AZFb vàAZFc Trên các vùng này có các trình tự nucleotid ngắn và duy nhất trong hệ gen,được gọi là các trình tự đánh dấu STS (Sequence-Tagged Sites) Có rất nhiều STS
và các STS đại diện cho từng vùng AZF Từ năm 1986, bản đồ vị trí mất đoạn nhỏtrên NST Y đã được thiết lập dựa vào công nghệ PCR khuếch đại các STS trên toàn
bộ NST Y [3], [4] Năm 1999, Viện Nam học Châu Âu (EAA - European Academy
of Andrology) và Mạng lưới chất lượng di truyền phân tử Châu Âu (EMQN European Molecular Genetics Quality Network) đã tham gia tích cực trong việc hỗtrợ cải thiện chất lượng của các xét nghiệm mất đoạn nhỏ trên NST bằng việc xuấtbản các cẩm nang hướng dẫn phòng thí nghiệm cũng như cung cấp các chương trìnhngoại kiểm để đảm bảo chất lượng kết quả xét nghiệm [5], [6] Theo EAA vàEMQN, quy trình chẩn đoán mất đoạn nhỏ trên NST Y được thực hiện bằng phảnứng multiplex PCR (mPCR, PCR đa mồi), khuếch đại các vùng đặc hiệu trên NST
-Y áp dụng cho các bệnh nhân nam có chỉ số mật độ tinh trùng thấp hơn 5x106/mLtinh dịch Có khoảng 300 STS đặc hiệu cho vùng AZF có thể sử dụng cho chẩnđoán mất đoạn nhỏ, tuy nhiên nếu sử dụng tất cả các STS này cho chẩn đoán sẽ rấtmất thời gian và tốn kém Về mặt nguyên tắc, chỉ cần phân tích 1 STS trong từngvùng AZF là đủ để xác định mất đoạn trong các vùng AZFa, AZFb, AZFc Tuynhiên phân tích hai STS trong mỗi vùng sẽ làm tăng độ chính xác của chẩn đoán
Do đó, EAA khuyến cáo chỉ cần sử dụng 2 STS cho phát hiện mất đoạn nhỏ ở mỗiphân vùng (độ chính xác của xét nghiệm lên tới 95%) Các STS được khuyến cáo để
sử dụng trong phát hiện mất đoạn vùng AZF gồm: vùng AZFa: sY84 và sY86; vùngAZFb: sY127 và sY134; vùng AZFc: sY245 và sY255 Năm 2013, EAA và EMQN
Trang 2tiếp tục đưa ra hướng dẫn mới trong chẩn đoán các vị trí đột biến gen AZF, gọi làAZF mở rộng, ngoài những vị trí cần xác định mất đoạn nhỏ của AZFa,b,c (6 vị trísY84, sY86, sY127, sY134, sY254, sY255) cần mở rộng thêm các vị trí STS khác
bị mất đoạn của AZFa,b,c sẽ không bỏ sót các tình trạng mất đoạn nhỏ của gen trênNST Y gây vô sinh nam (thêm 6 vị trí của AZFa, 6 vị trí của AZFb, 3 vị trí củaAZFc)
Mất đoạn giữa các vùng AZF khác nhau xuất hiện với tỉ lệ khác nhau, mấtđoạn AZFc chiếm tỉ lệ cao nhất (∼80%), sau đó là AZFa (0,5% đến 4%), AZFb(1% đến 5%) và mất đoạn AZFbc (1% đến 3%) [1] Các nghiên cứu gần đây pháthiện thêm các vị trí đại diện cho các vùng AZF abc, ngoài 6 vị trí cơ bản đại diệncho 3 vùng AZFa, AZFb và AZFc, còn có thêm 11 đến 13 STS thuộc vùng AZF mởrộng, nhằm phát hiện các đột biến mất đoạn hoàn toàn cho AZFabc Năm 2018,Lương Thị Lan Anh và cộng sự trong nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật hoàn chỉnhmất đoạn AZF mở rộng với 19 trình tự STS bằng kỹ thuật QF-PCR đã phát hiện tỉ
lệ mất đoạn tăng lên khá cao khi rà soát được 6 STS thuộc vùng cơ bản của AZFabc
và 13 STS thuộc vùng AZF mở rộng, tỉ lệ mất đoạn ở nam giới vô sinh không cótinh trùng là 40%, trong đó vùng AZF cơ bản là 16,7%, vùng AZF mở rộng là83,3% (Lương Thị Lan Anh và cộng sự, 2018)
Khi mất các phân đoạn khác nhau hoặc các kiểu mất đoạn khác nhau sẽ chonhững biểu hiện lâm sàng khác nhau, việc này liên quan chặt chẽ đến quá trình tưvấn sinh sản và hỗ trợ sinh sản Vì vậy việc nghiên cứu những phân đoạn bị mất vàkiểu mất đoạn rất quan trọng đến vấn đề điều trị và tư vấn bệnh nhân Với tỉ lệ mấtđoạn AZF chiếm đa số trong nguyên nhân gây vô sinh nam giới, phân tích mất đoạnnhỏ trên NST Y tại vùng AZF là xét nghiệm đầu tay của các nhà nam khoa, sản phụkhoa và di truyền trong chẩn đoán vô sinh nam giới Lợi ích chẩn đoán mang lại:xác định được nguyên nhân vô sinh nam, định hướng cho điều trị và tiên lượng,
Hiện nay trong nước chưa có bộ kit chẩn đoán mất đoạn AZF, các phòng xétnghiệm chủ yếu thực hiện bằng phương pháp thủ công, tốn nhiều thời gian và chấtlượng luôn phải kiểm soát Các bộ kit chẩn đoán AZF có nguồn gốc ngoại nhập.Phương pháp Real-time PCR và QF-PCR trong các bộ kit ngoại nhập được tối ưutrong 1-2 phản ứng, nhưng kỹ thuật phức tạp và giá thành rất cao Các công ty kinhdoanh thương phẩm y tế chủ yếu chào bán bộ kit Devyser (v2 và Extension) cho 17STS - phát hiện mất đoạn AZF vùng cơ bản và mở rộng, tuy nhiên giá thành khácao Với giá thành trên 30 triệu/ bộ/ 25 test, như vậy chi phí cho 1 bệnh nhân bao
Trang 3gồm tiền công, tiêu hao và chiết tách DNA từ mẫu khoảng 2 triệu đến 3 triệu đồngcho 1 lần xét nghiệm Tính chung các phòng xét nghiệm trong cả nước (600 - 1.000bệnh nhân/1 phòng xét nghiệm cần làm xét nghiệm mỗi năm) để thực hiện các xétnghiệm này với bộ kit ngoại nhập, theo ước tính, Việt Nam cần phải bỏ ra vài chụcđến vài trăm tỷ đồng mỗi năm.
Nhóm nghiên cứu tại Trường Đại học Y Hà Nội phối hợp với Công ty Cổphần Công nghệ Việt Á thực hiện dự án cấp Nhà nước: “Hoàn thiện quy trình côngnghệ sản xuất bộ kit chẩn đoán đột biến gen AZF gây vô sinh nam giới” với mụcđích tạo ra 1 bộ kit chẩn đoán mất đoạn AZF đạt được tiêu chí chất lượng đảm bảo
và giá thành hợp lý, số lượng STS đặc trưng cho các đột biến liên quan đến bệnh vôsinh ở nam giới, đại diện cho quần thể người Châu Á nói chung và người Việt Namnói riêng, đồng thời các STS này cần phải phù hợp với công bố và khuyến cáo củaEAA/EMQN và kỹ thuật thực hiện tiện dụng cho người làm xét nghiệm
Công nghệ mà dự án thực hiện là ứng dụng kỹ thuật mPCR để xác định 17STS, bao gồm 6 STS thuộc vùng AZF cơ bản và 11 STS thuộc vùng AZF mở rộng.Các trình tự đại diện cho vùng AZFa là: sY82, sY83, sY84, sY86, sY88, sY1182,trong đó 2 trình tự sY84, sY86 được xác định là đại diện chính, gọi là vùng AZFa
cơ bản, các trình tự còn lại gọi là AZFa mở rộng Các trình tự đại diện cho vùngAZFb: sY105, sY121, sY127, sY134, sY143, trong đó 2 trình tự sY127 và sY134được xác định là đại diện chính, gọi là vùng AZFb cơ bản, các trình tự còn lại gọi làAZFb mở rộng Các trình tự đại diện cho vùng AZFc: sY254, sY255, sY1191,sY1192, sY160, sY153, trong đó 2 trình tự sY254 và sY255 được xác định là đạidiện chính, gọi là vùng AZFc cơ bản, các trình tự còn lại gọi là AZFc mở rộng Dựkiến mỗi mẫu xét nghiệm được thực hiện trong 3 phản ứng mPCR Kỹ thuật mPCR
là 1 trong các kỹ thuật di truyền phân tử được ứng dụng trongphát hiệnđột biến gen
có có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, thực hiện đơn giản, chi phí xét nghiệm hợp lý vàkhông đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền Do có nhiều vị trí STS trên vùng AZF cần pháthiện, hiện nay các kit chẩn đoán mất đoạn AZF hay các nghiên cứu tối ưu ứng dụng
kỹ thuật mPCR thường chỉ giới hạn trong 1 phản ứng mPCR phát hiện đồng thời 3
-4 STS Do đó, nếu phải phát hiện đồng thời 17 STS cần tới 6 đến 7 phản ứng trong
1 lần thực hiện, tốn nhiều thời gian Vì vậy, dự án sẽ hoàn thiện công nghệ để xâydựng quy trình kỹ thuật mPCR cho phát hiện 17 STS chỉ với 3 phản ứng trong 1 lầnthực hiện, đồng thời phát triển thành bộ kit chẩn đoán đột biến AZF Nếu dự án
Trang 4thành công, sản phẩm của dự án sẽ có khả năng cạnh tranh cao với các sản phẩmcùng loại trên thị trường, vì các lý do như sau:
1. Chúng ta chủ động sản xuất trong nước, phục vụ nhu cầu tại chỗ nên khôngphải mất nhiều thời gian bảo quản sản phẩm
2. Không phải chi trả phí vận chuyển hàng hóa từ nước ngoài về Việt Nam
3. Không phải chi trả thuế nhập khẩu Đây cũng là các yếu tố cấu thành nênviệc kết quả của dự án có thể ứng dụng được vào sản xuất kinh doanh haykhông? Vì không phải chi trả nhiều loại phí nên giá thành có thể sẽ giảm hơncác sản phẩm nhập ngoại Và thời gian bảo quản và vận chuyển ngắn nênthời gian hiệu lực thực tế của sản phẩm sẽ dài hơn các sản phẩm nhập ngoại.Hiện nay, nhu cầu của thị trường về kit chẩn đoán mất đoạn AZF cho bệnhnhân nam giới bị vô sinh (nam giới vô sinh không có tinh trùng, nam giới vô sinh íttinh trùng, rối loạn giới tính, ) có nhu cầu lớn và tiềm năng, đặc biệt chẩn đoán mấtđoạn vùng AZF mở rộng, do đó nhu cầu ứng dụng của sản phẩm dự án là rất lớn
Công ty Cổ phần Công nghệ Việt Á là công ty chuyên về sản xuất kit sinhhọc phân tử với bề dày hoạt động hơn 5 năm, nên việc sản xuất sinh phẩm chẩnđoán của Việt Á đã ở quy mô công nghiệp Mặt khác, hiện nay Việt Á chiếm thịphần lớn về kit sinh học phân tử Đa số các bệnh viện và trung tâm y tế trên cả nướcđều là khách hàng của Việt Á, do đó rất thuận tiện trong việc phát triển thị trườngsản phẩm của dự án Bên cạnh đó, với hệ thống văn phòng đại diện và chi nhánhtrên toàn quốc, việc phân phối cũng như hỗ trợ kỹ thuật cho các sản phẩm của dự ánđến các cơ sở y tế sẽ rất dễ dàng Hơn nữa, việc sản xuất kit sinh học phân tử củaViệt Á đã ở mức độ chuyên nghiệp, việc sản xuất số lượng test lớn trên một mẻ làđiều không khó Mặt khác, gần 50 cơ sở y tế trên cả nước có trang bị hệ thống xétnghiệm PCR và real-time PCR là khách hàng của Việt Á, trong đó hơn 10 cơ sở có
số lượng tiêu thụ hàng tháng rất lớn Nếu chỉ tính riêng 10 cơ sở này, với số lượngkit đề xuất như trên (trong 24 tháng) thì tính trung bình mỗi sơ sở chỉ tiêu thụ trêndưới 200 test/tháng, đây là con số hoàn toàn khả thi
Mô hình kết hợp trong dự án là Trường - Doanh nghiệp có đủ năng lựcnghiên cứu - sản xuất - kinh doanh và sau dự án có sản phẩm hoàn chỉnh với đầy đủcác chứng nhận chất lượng và một dây chuyền sản xuất sản phẩm chuyên nghiệp,
hy vọng dự án đạt được mục tiêu đề ra
Trang 5PHẦN II MỤC TIÊU CỦA DỰ ÁN
1 Có được quy trình công nghệ sản xuất bộ kit chẩn đoán đột biến gen AZF* gây vôsinh nam giới
2 Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của bộ kit chẩn đoán đột biến gen AZF* gây vô sinhnam giới
3 Sản xuất được 300 bộ kit đạt tiêu chuẩn cơ sở (mỗi bộ kit bao gồm 20 test thựchiện cho 20 mẫu)
Chú thích thuật ngữ:
* Gen AZF: Vùng AZF trên nhiễm sắc thể giới tính Y chứa các gen quy định việc sinh tinh trùng, trưởng thành và biệt hóa tinh trùng.
Trang 6PHẦN III TỔNG QUAN TÀI LIỆU
3.1 AZF và vô sinh nam giới
3.1.1 AZF
3.1.1.1 Khái niệm
Trên nhiễm sắc thể giới tính Y có vùng đặc hiệu nam giới, không tương đồngvới nhiễm sắc thể giới tính X (MSY: male specific region of the chromosome Y).Tại vùng này có chứa nhiều gen kiểm soát sự hình thành giới và sinh tinh trùng,vùng có chứa các nhóm gen sinh tinh trùng được gọi là tiểu vùng AZF thuộc MSY,các đột biến mất đoạn gen tại vùng AZF dẫn đến vô sinh nam Hầu hết các gen đặctrưng của nhiễm sắc thể Y nằm ở vùng AZF này
AZF (Azoospermia factor) được gọi là yếu tố vô tinh hoặc yếu tố không cótinh trùng, đây là vùng gồm tập hợp các gen nằm trên nhánh dài NST Y, tại vị tríq11.23 (Yq11.23) có chức năng tạo tinh trùng AZF là vùng chủ yếu trong sàng lọcmất đoạn nhỏ trên NST Y do mức độ thường gặp của nó Vùng này chia làm 3 đoạn
là AZFa, AZFb, AZFc
3.1.1.2 Cấu trúc vùng AZF trên nhiễm sắc thể giới tính Y
Đoạn AZFa nằm gần tâm NST Y, ở vùng Yq11.21 (D3-D6), ở đoạn mất 5,phân đoạn 5C Đoạn AZFa kéo dài 1,1Mb [7], mã hóa các gen một bản sao quan
trọng trong chức năng sinh tinh trùng, đó là các gen USP9Y (Ubiquitin specific peptidase 9, Y-linked), DBY (Dead box on Y) và UTY (Ubiquitously transcribed
tetratricopeptide repeat gene, Y-linked) Các gen liên quan đến sinh tinh trùng.Đoạn AZFb nằm giữa phân đoạn 5M đến 6B, giữa AZFa và AZFc, kích thước lớn6,2Mb đến 7,7Mb, có đoạn trùng lặp với vùng AZFc 1,5Mb Các gen bao gồm
KDM5D (lysine K-specific demethylase 5D), EIF1AY (eukaryotic translation initiation factor 1A, Y-linked), RPS4Y2 (Ribosomal protein S4 Y isoform 2), CYORF15 (chromosome Y open reading frame 15A and 15B), XKRY (XK, Kell blood group complex subunit-related, Y-linked), HSFY (heat shock transcription factor, Y-linked) Gen KDM5D có vai trò sinh tinh trùng và tái cấu trúc tế bào sinh
Trang 7tinh (trong kì đầu I của giảm phân) Gen EIF1AY có vai trò khởi đầu quá trình dịch
mã Gen RPS4Y2 điều hòa sau phiên mã quá trình tạo tinh trùng Gen CYORF15
liên quan đến điều hòa phiên mã tổng hợp các nguyên bào xương, vai trò trong sinhtinh chưa được biết rõ
Hình 3.4 Các gen trên vùng AZF
A Sơ đồ cấu trúc nhiễm sắc thể Y: PAR1, PAR2 (pseudo autosomal regions): vùng giả nhiễm sắc thể thường; Yp: nhánh ngắn nhiễm sắc thể Y; Yq: nhánh dài nhiễm sắc thể Y; MSY (male specific region): vùng đặc hiệu nam giới B Sơ đồ vị trí vùng AZF C Các gen thuộc vùng AZFa, AZFb, AZFc D Các trình tự DNA đặc hiệu cho các gen tại vùng AZF (các STS)
Đoạn AZFc thuộc đầu xa của nhánh dài nhiễm sắc thể Y, hay phân đoạn 6Cđến 6E, kích thước 3,5Mb Đoạn AZFc gồm có nhiều trình tự mã hóa lặp lại gầngiống nhau sắp xếp thành các trình tự lặp trực tiếp, gián tiếp và các cụm trình tự[16], [17] Đoạn AZFc là một đoạn gồm nhiều họ gen, mã hóa 21 họ gen Các genliên quan đến yếu tố được biểu hiện ở nhân tinh nguyên bào, tinh tử và tiền tinhtrùng hoặc có vai trò quan trọng điều hòa quá trình chết theo chương trình, một quátrình cần thiết để loại bỏ tinh trùng bất thường
Trang 83.1.2 Cơ chế mất đoạn nhỏ AZF trên nhiễm sắc thể giới tính Y gây vô sinh nam giới
Mất đoạn nhỏ AZF xuất hiện do lỗi tái tổ hợp không tương đồng của NST Y.Các mất đoạn nhỏ vùng AZF trên NST Y xảy ra tại vị trí q11.23 và thườngphân chia theo vị trí AZFa, AZFb, AZFc hoặc AZFd Có các kiểu mất đoạn nhỏ nhưsau: mất đoạn hoàn toàn AZFa thường tương ứng với 0,8Mb (792kb) chứa ít nhất 2gen; mất đoạn hoàn toàn AZFb tương ứng với 6,23Mb chứa 32 gen và các họ genđặc trưng cho tinh hoàn; mất đoạn hoàn toàn AZFc tương ứng 3,5Mb chứa 7 họgen; mất đoạn nhỏ phối hợp: AZFab, AZFac, AZFabc, AZFbc
3.1.3 Vô sinh nam giới và mất đoạn nhỏ AZF
3.1.3.1 Vô sinh nam giới
Theo tổ chức y tế thế giới (WHO), vô sinh được định nghĩa là khi một cặp vợchồng sau một năm (nếu người vợ dưới 35 tuổi) hoặc 6 tháng (người vợ trên 35tuổi) chung sống và quan hệ tình dục đều đặn 2 ÷ 3 lần / tuần và không sử dụng bất
kỳ biện pháp tránh thai nào mà người vợ vẫn không có thai Bất kỳ trường hợp nàorơi vào định nghĩa trên đều nên được khám sức khỏe sinh sản cho cả hai vợ chồng
3.1.3.2 Lịch sử nghiên cứu mất đoạn nhỏ AZF liên quan đến vô sinh nam giới 3.1.3.3 Chẩn đoán mất đoạn nhỏ AZF gây vô sinh nam giới
* Chẩn đoán mất đoạn AZF cơ bản
Theo hướng dẫn của EAA/EMQN, xét nghiệm chẩn đoán mất đoạn nhỏ trênNST Y được thực hiện bằng cách khuếch đại các vùng được chọn của NST Y bằng
kỹ thuật PCR, các vùng được chọn là các trình tự đặc hiệu có kích thước ngắn, từ200bp đến 500bp, là những trình tự duy nhất, còn được gọi là các STS (Sequence-tagged site/ STS) [14]
Về nguyên tắc, việc phân tích chỉ một locus STS không đa hình trong mỗiđoạn AZF là đủ để xác định xem có bất kỳ STS nào bị mất có trong AZFa, AZFbhoặc AZFc hay không Tuy nhiên, việc phân tích hai STS ở mỗi đoạn sẽ củng cố độchính xác chẩn đoán, vì mất đoạn ở các đoạn đã được xác định rõ bao gồm nhiều
Trang 9locus STS Những mồi này bao gồm: với AZFa là: sY84, sY86, với AZFb là:
sY127, sY134, với AZFc là: sY254, sY255 (cả hai đều nằm trong gen DAZ).
* Chẩn đoán mất đoạn nhỏ AZF mở rộng
Mở rộng AZFa
Việc mở rộng xác định mất đoạn (hoàn toàn/ không hoàn toàn) nên đượcthực hiện bằng cách sử dụng các đoạn mồi khuếch đại STS sY82 (không mất đoạn),sY83 (mất đoạn hoặc có mặt tùy thuộc vào điểm ngắt) hoặc sY1064 (mất đoạn) chođường biên gần và sY1065 hoặc sY1182 (mất đoạn), sY88 (không mất đoạn) chođường biên xa Marker sY87 không được khuyến nghị nữa vì nó nằm giữa hai gencủa AZFa Nếu chỉ một trong hai locus STS AZFa (chỉ sY84 hoặc chỉ sY86) bị mấtđoạn và có thể loại trừ các lỗi kĩ thuật, đoạn AZFa cần được kiểm tra chi tiết hơn
việc không mất đoạn / mất đoạn của hai gen AZFa (DDX3Y và USP9Y) và các biên
giới theo bản đồ được cung cấp bởi Kamp và cộng sự (2001) [52] Tuy nhiên, việcnày cực kỳ hiếm xảy ra
Mở rộng AZFb (P5/đầu gần P1)
Thực hiện các phân tích bổ sung với các marker sau: sY105 (không mấtđoạn) và sY121 hoặc sY1224 (mất đoạn) cho đường biên gần và sY143 hoặcsY1192 (mất đoạn) và sY153 (không mất đoạn) cho đường biên xa Các markersY114 và sY52 không được khuyến nghị nữa vì chúng có ở nhiều vùng gen
Mở rộng AZFc (b2/b4)
Hai marker sY254 và sY255 đặc trưng cho gen DAZ Sự vắng mặt của cả haimarker cho thấy việc mất toàn bộ đoạn AZFc, loại bỏ tất cả các bản sao của DAZ.Theo hiểu biết hiện tại, việc mất chỉ một trong hai marker này là không thể xảy ra
và nên được coi là một lỗi kĩ thuật Các mồi được khuyến nghị bởi Kawaguchi và cộng sự (2001) và việc phân tích sY160 (marker dị nhiễm sắc) chophép phòng thí nghiệm xác định xem việc mất đoạn có tương ứng với dạng b2/b4không [24]
Kuroda-Mất đoạn gr/gr
Trang 10Đoạn gr/gr thuộc AZFc Việc sàng lọc mất đoạn gr/gr dựa trên phương phápPCR phát hiện sự có mặt của hai marker sY1291 và sY1191 [55] và chẩn đoán dựatrên sự vắng mặt của sY1291 và sự hiện diện của sY1191.
Trang 11Hình 3.5 Quy trình chẩn đoán mất đoạn nhỏ AZF trên NST Y
A: Bộ mồi cơ bản, B: Bộ mồi mở rộng
Nguồn: EAA/EMQN
B
Tỷ lệ thực hiện TESE thành công là 50%
Tỷ lệ thực hiện TESE thành công là 0%
Đưa ra lời khuyên
PCR đơn mồi Phân tích bộ mồi mở rộng
Không mất locus Có mất locus
Không có mất đoạn
Mất ≥2 locus Chỉ mất 1 locus
Không mất locus
Bộ mồi cơ bản:
AZFa: sY84, sY86 AZFb: sY127, sY134 AZFc: sY254, sY255
A
Chẩn đoán mất đoạn nhỏ AZF Mật độ tinh trùng <5 triệu/mL
Trang 12Mở rộng AZFbc (P5/đầu xa P1 hoặc P4/đầu xa P1)
Việc mất hoàn toàn cả hai đoạn AZFb và AZFc được biểu thị bằng việc vắngmặt của cả bốn marker sY127, sY134, sY254 và sY255 Ngoài ra, ở những bệnhnhân này, có thể kiểm tra sY160 (marker dị nhiễm sắc) để xác định xem đó có phải
là mất đầu tận hay không
Như vậy, theo khuyến cáo mới nhất năm 2014 của EAA/EMQN [14] về chẩnđoán phân tử mất đoạn nhỏ trên NST Y, các bệnh nhân nam giới thiểu tinh nặng và
vô tinh sẽ cần phải xét nghiệm tìm kiếm mất đoạn AZF bằng cách khảo sát các đoạnSTS cơ bản và mở rộng như sau: 6 đoạn STS cho AZF cơ bản bao gồm: sY84 vàsY86 cho vùng AZFa, sY127 và sY134 cho vùng AZFb, sY254 và sY255 cho vùngAZFc.11 đoạn STS cho AZF mở rộng bao gồm: sY82, sY83 (hoặc sY1064),sY1065 (hoặc sY1182) và sY88 cho vùng AZFa sY105, sY121 (hoặc sY1224),sY143 (hoặc sY1192) và sY153 cho vùng AZFb sY1191, sY1291 và sY160 chovùng AZFc
3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước
3.2.1 Tỷ lệ mất đoạn nhỏ AZF và vô sinh nam giới
Nguyễn Minh Hà năm (2011) nghiên cứu trên 70 nam giới vô sinh có 9 bệnhnhân có phát hiện mất đoạn chiếm 12,8%, trong đó có 8 trường hợp mất đoạn tạivùng AZFc và 1 trường hợp mất đoạn tại vùng AZFb [59] Nguyễn Thị Việt Hà(2012) nghiên cứu trên 264 nam giới vô sinh có 19 trường hợp có mất đoạn nhỏ trênNST Y chiếm 8% số bệnh nhân tham gia nghiên cứu, trong đó mất đoạn nhỏ trênAZFc chiếm tỷ lệ cao nhất (57,89%), tiếp đến là mất đoạn trên AZFa (31,58%), mấtđoạn trên vùng AZFb và mất đoạn trên AZFa/b/c chiếm tỷ lệ thấp nhất (5,26%)[60] Trần Đức Phấn (năm 2015) nghiên cứu trên 469 nam giới vô sinh có 49 bệnhnhân có mất đoạn nhỏ ở vùng AZF trên NST Y chiếm 10,4%, trong đó không có ai
bị mất đoạn AZFa đơn thuần, 2 bệnh nhân có mất đoạn AZFb đơn thuần, 13 bệnhnhân có mất đoạn AZFc đơn thuần chiếm 26,33%, 7 bệnh nhân có mất đoạn AZFdđơn thuần chiếm 14,29%, 3 bệnh nhân có mất đoạn kết hợp AZFb+c chiếm 6,12%,
Trang 1313 bệnh nhân có mất đoạn kết hợp AZFc+d chiếm 26,33%, 8 bệnh nhân có mấtđoạn AZFa+b+c chiếm 16,33%, 3 bệnh nhân có mất đoạn AZFa+b+c+d chiếm6,12% [61] Nguyễn Bá Sơn (2017) nghiên cứu trên 327 nam giới mắc hội chứngOAT có 40 nam giới bị mất đoạn nhỏ trên NST Y, chiếm tỷ lệ 12,2%, trong đókhông có ai bị mất đoạn AZFa, AZFb; mất đoạn AZFc+d chiếm tỷ lệ cao nhất:19/40 (47,5%) tiếp theo là mất đoạn AZFc: 13/40 (32,5%) và mất đoạn AZFd: 8/40(20%) [62].
Điểm đáng chú ý là các nghiên cứu trên được thực hiện dựa trên quy trình vàcác trình tự STS của bộ xét nghiệm AZF cơ bản, vì vậy vẫn có những hạn chế trongviệc chẩn đoán chính xác và xác định phương hướng điều trị, và một nghiên cứu đểhoàn thiện quy trình phát hiện mất đoạn AZF mở rộng là rất cần thiết ở Việt Nam
3.2.2 Các kỹ thuật chẩn đoán mất đoạn nhỏ AZF
Từ năm 1999 đến nay, theo khuyến cáo của Viện Nam học Châu Âu (EAA European Academy of Andrology) và Mạng lưới chất lượng di truyền phân tử Châu
-Âu (EMQN - European Molecular Genetics Quality Network), chẩn đoán mất đoạnnhỏ AZFa, b và c cần sử dụng 6 trình tự sY84, sY86, sY127, sY134, sY254 vàsY255 cùng với 2 trình tự dùng làm chứng là SRY (sex-determining region Y), genbiệt hóa giới tính nam và ZFX/Y (Zinc Finger Protein X/Y-Linked), gen có trênNST của cả 2 giới nam và nữ (X và Y) 8 trình tự này được thiết kế trong 2 phảnứng PCR đa mồi (multiplex A và B), thời gian điện di sản phẩm mất khoảng 24 giờ,chưa kể chuẩn bị mẫu và PCR Do các trình tự có kích thước gần nhau, nên khi điện
di phải sử dụng điện thế thấp, thời gian dài nhằm phân tách được các sản phẩm PCR(Hình 3.6) Multiplex A gồm sY86, sY127, sY254, SRY và ZFX/Y; multiplex Bgồm sY84, sY134, sY255, SRY và ZFX/Y
Từ năm 2010, Trường Đại học Y Hà Nội, dựa trên phương pháp củaEAA/EMQN, cải tiến phương pháp PCR đa mồi phát hiện 8 trình tự trên bằng cáchchia thành 3 phản ứng PCR đa mồi (multiplex 1, 2 và 3), tách các trình tự có kíchthước gần nhau sang các phức hợp đa mồi khác nhau với mục đích rút ngắn thờigian điện di (chỉ tốn 30 ÷ 45 phút/ 1 lần điện di) (Hình 3.7)
Trang 14Năm 2015, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia, Hồ ChíMinh, đã thiết kế lại các cặp mồi bắt cặp với 8 trình tự trên, vẫn thiết kế 2 phản ứng
đa mồi (multiplex A và multiplex B), tuy nhiên khi thiết kế lại, các trình tự có kíchthước không bị gần nhau nên được phân tách rõ trong cùng 1 phản ứng đa mồi(Hình 3.8)
Hiện nay trong nước chưa có kit chẩn đoán mất đoạn AZF, các phòng xétnghiệm chủ yếu thực hiện bằng phương pháp thủ công, tối thiểu cũng cần tới 2 phảnứng đa mồi cho 1 bệnh nhân trong 1 lần xét nghiệm chỉ để phát hiện mất đoạn AZF
cơ bản Quá trình xét nghiệm cho 1 bệnh nhân, cần có 1 đối chứng nam, 1 đốichứng nữ, 1 đối chứng âm (nước cất), các đối chứng cũng cần thực hiện 2 phản ứngPCR đa mồi, như vậy để chẩn đoán mất đoạn cho 1 mẫu bệnh, cần trộn 8 phản ứngcho 1 lần xét nghiệm, tốn thêm thời gian, hóa chất và chất lượng luôn phải kiểmsoát Mặt khác, các xét nghiệm vẫn chỉ tập trung phát hiện các vị trí mất đoạn AZF
cơ bản của AZFa, b và c (bao gồm 6 STS đã mô tả trên: sY84, sY86, sY127, sY134,sY254 và sY255), chưa xét nghiệm được AZF mở rộng
3.3 Tình hình nghiên cứu ngoài nước
3.3.1 Tỷ lệ mất đoạn nhỏ AZF và vô sinh nam giới
Manuela Simoni (2008) nghiên cứu trên 3.179 nam giới vô tinh hoặc thiểutinh nặng cho kết quả có 84 bệnh nhân có mất đoạn vùng AZF [23] Don KyungChoi (2013) nghiên cứu trên 289 bệnh nhân vô tinh và thiểu tinh nặng cho kết quả
110 bệnh nhân có mất đoạn nhỏ trên NST Y, trong đó có 29 bệnh nhân có mất đoạnAZFbc, 81 bệnh nhân có mất đoạn AZFc [64] Mariano Mascarenhas nghiên cứutrên 220 nam giới vô tinh hoặc thiểu tinh nặng cho kết quả có 13 bệnh nhân có mấtđoạn nhỏ trên NST Y chiếm 5,9% [65] Carolina Gonçalves nghiên cứu trên 128trường hợp mất đoạn vùng AZF cho kết quả 17 trường hợp có mất AZFa chiếm13,3%, 26 trường hợp có mất AZFb chiếm 20,3%, và 85 trường hợp có mất AZFcchiếm 66,4% tổng số mất đoạn [66] Shin Young Kim nghiên cứu trên 1.226 bệnhnhân nam giới vô sinh phát hiện được 134 trường hợp có mất đoạn vùng AZFchiếm 10,93% [67]
3.3.2 Các kỹ thuật chẩn đoán mất đoạn AZF
Trang 15Các kit chẩn đoán AZF có nguồn gốc ngoại nhập được thiết kế theo nhiềuphương pháp khác nhau, từ multiplex PCR, Real-time PCR đến QF-PCR thực hiệnđiện di mao quản trên máy giải trình tự gen Phương pháp multiplex PCR được tối
ưu từ các bộ kit ngoại nhập phù hợp với các phòng thí nghiệm và xét nghiệp phổthông nhưng chỉ giới hạn 3 - 4 STS trong 1 phản ứng, do đó, cần phải thực hiệnnhiều phản ứng, tiêu tốn nhiều thời gian (Bảng 3.1)
Bảng 3.1 Danh sách các kit thương mại chẩn đoán mất đoạn AZF
TT Tên bộ kit Phương
pháp
Số lượng STS
Đóng gói (test/bộ)
Giá thành (triệu đồng)
2
Elucigene Male Factor
Infertility Kit, IVD-CE
Ghi chú: *: đã có ở Việt Nam; **: đang xin phép nhập khẩu.
Với giá thành hơn 30 triệu/ bộ/ 25 test, như vậy chi phí cho 1 bệnh nhân baogồm tiền công, tiêu hao và chiết tách DNA từ mẫu có thể lên tới 1.500.000 -2.000.000 đồng/ bệnh nhân
Tính chung các phòng xét nghiệm trong cả nước (600 - 1.000 bệnh nhân/1phòng xét nghiệm cần làm xét nghiệm mỗi năm) để thực hiện các xét nghiệm này
