Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học bệnh dại và dịch tễ học phân tử vi rút dại - đề xuất chủng vi rút dại để sản xuất vắc xin

Phạm vi nghiên cứu: Do thời gian nghiên cứu ngắn không đủ cho quá trình cố định, thích ứng chủng phânlập trong tự nhiên cùng với các yêu cầu khắt khe về mặt kỹ thuật trong việc lấy mẫu,

Biểu B1-2a-TMĐTCN

08/2017/TT-BKHCN

THUYẾT MINH

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG

VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ CẤP QUỐC GIA1

I THÔNG TIN CHUNG VỀ ĐỀ TÀI

1 Tên đề tài

Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học bệnh dại và

dịch tễ học phân tử vi rút dại - đề xuất chủng

vi rút dại để sản xuất vắc xin

1a Mã số (được cấp khi Hồ sơ trúng tuyển)

(Từ tháng 04/2019 đến tháng 12/2020) Quốc gia

4 Tổng kinh phí thực hiện: 8.547,38 triệu đồng, trong đó:

- Từ nguồn ngoài ngân sách nhà nước

0,0

5 Đề nghị phương thức khoán chi:

Khoán đến sản phẩm cuối cùng Khoán từng phần, trong đó:

- Kinh phí khoán: 5.185,49 triệu đồng

- Kinh phí không khoán: 3361.89 triệu đồng

Tự nhiên; Nông nghiệp;

Kỹ thuật và công nghệ; Y, dược

1 Bản Thuyết minh đề tài này dùng cho hoạt động nghiên cứu ứng dụng và phát triển công nghệ thuộc 4 lĩnh vực khoa học nêu tại mục 7 của Thuyết minh Thuyết minh được trình bày và in trên khổ A4

8 Chủ nhiệm đề tài

Họ và tên: Nguyễn Văn Khải

Ngày, tháng, năm sinh: 10/2/1967 Giới tính: Nam/ Nữ: Nam

Học hàm, học vị/ Trình độ chuyên môn: Phó Giáo sư, Tiến sĩ, Bác sĩ

Chức danh khoa học: Giảng viên chính

Chức vụ: Hiệu trưởng, Trường Đại học Y Dược Hải Phòng, Bộ Y Tế

Tên tổ chức đang công tác: Trường Đại Học Y Dược Hải Phòng

Địa chỉ tổ chức: 72A Nguyễn Bỉnh Khiêm, Ngô Quyền, Hải Phòng

Điện thoại: 0313 731 907

Fax: 031 3 733315 E-mail: nvkhai@hpmu.edu.vn Địa chỉ nhà riêng: số 9/102 Cát Bi, Hải An, Hải Phòng

Mobile: 0912607957

9 Thư ký khoa học của đề tài

Họ và tên: ThS Nguyễn Thị Minh Ngọc

Ngày, tháng, năm sinh: 21/02/1978 Nam/ Nữ: NữHọc hàm, học vị/ Trình độ chuyên môn:

Chức danh khoa học: Thạc sĩ Chức vụ: Giảng viên

Tên tổ chức đang công tác: Trường Đại Học Y Dược Hải Phòng

Địa chỉ tổ chức: 72A Nguyễn Bỉnh Khiêm, Ngô Quyền, Hải Phòng

Tên tổ chức chủ trì đề tài: Trường Đại học Y Dược Hải Phòng

Điện thoại: 031.3731907 Fax: +84-31-3731525

E-mail: contact@hpmu.edu.vn

Website: http://hpmu.edu.vn

Địa chỉ: 72A Nguyễn Bỉnh Khiêm, Ngô Quyền, Hải Phòng

Họ và tên thủ trưởng tổ chức: Nguyễn Văn Khải

Số tài khoản: 3713 cấp I, mã số sử dụng ngân sách: 1057278

Kho bạc Nhà nước: Hải Phòng

Tên cơ quan chủ quản đề tài: Bộ Y Tế

11 Các tổ chức phối hợp chính thực hiện đề tài (nếu có)

1 Tổ chức 1 : Học viện Quân y

Tên cơ quan chủ quản: Bộ Quốc phòng

Điện thoại : 069566100 Fax : 04.6884779

Địa chỉ: 160 Phùng Hưng – Hà Đông – Hà Nội

Họ và tên thủ trưởng tổ chức: Thiếu tướng, GS.TS Đỗ Quyết

Số tài khoản: 931.02.001

Ngân hàng: Kho bạc Nhà nước Hà Đông

2 Tổ chức 2 : Công ty Vắcxin và Sinh phẩm số 1 (VABIOTECH)

Tên cơ quan chủ quản : Bộ Y Tế

Điện thoại: 04) 9717710 - 9717712 / # 104 Fax: (04) 9717711

Địa chỉ: 1 Yersin, Hà Nội

Họ và tên thủ trưởng tổ chức: TS Đỗ Tuấn Đạt

Số tài khoản: 311.11.002381

Ngân hàng: TMCP Sài Gòn Thương Tín

Ngân hàng: Khoa Bạc Nhà nước Hai Bà Trưng, Hà Nội

12

Cán bộ thực hiện đề tài

(Ghi những người có đóng góp khoa học và thực hiện những nội dung chính thuộc tổ chức chủ trì và

tổ chức phối hợp tham gia thực hiện đề tài Kỹ thuật viên, nhân viên hỗ trợ lập danh sách theo mẫu này

có xác nhận của tổ chức chủ trì và gửi kèm theo hồ sơ khi đăng ký)

3 GS.TS Phạm Văn Thức Thành viên chính Trường ĐH Y Dược Hải Phòng

4 PGS.TS Phạm Minh Khuê Thành viên chính Trường ĐH Y Dược Hải Phòng

5 ThS Nguyễn Thị Thanh

Trường ĐH Y Dược Hải Phòng

6 TS Phạm Thị Thu Trang Thành viên chính Trường ĐH Y Dược Hải Phòng

7 TS Nguyễn Bảo Trân Thành viên chính Trường ĐH Y Dược Hải Phòng

8 TS Nguyễn Thị Thu Thảo Thành viên chính Trường ĐH Y Dược Hải Phòng

9 TS.BS Nguyễn Văn

10 PGS TS Hồ Anh Sơn Thành viên chính Học viện Quân y

11 ThS Nguyễn Thế Anh Thành viên chính Học viện Quân y

12 TS Phùng Thị Thủy Thành viên chính Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm,

Đại học Bách Khoa Hà Nội

2 Theo quy định tại bảng 1 Điểm b Khoản 1 Điều 7 thông tư liên tịch số 55/2015/TTLT-BTC-BKHCN ngày

22/4/2015 hướng dẫn định mức xây dựng, phân bổ dự toán và quyết toán kinh phí đối với nhiệm vụ KH&CN có

sử dụng ngân sách nhà nước.

13 TS Lê Quang Hòa Thành viên chính Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm,

Đại học Bách Khoa Hà Nội

14 ThS Mạc Văn Trọng Thành viên chính Công ty Vắcxin và Sinh phẩm số 1 (VABIOTECH)

15 CN Phạm Hà Thu Thành viên chính Công ty Vắcxin và Sinh phẩm số 1 (VABIOTECH)

II MỤC TIÊU, NỘI DUNG KH&CN VÀ PHƯƠNG ÁN TỔ

CHỨC THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

13 Mục tiêu của đề tài (Bám sát và cụ thể hoá định hướng mục tiêu theo đặt hàng)

1 Xác định đặc điểm dịch tễ học bệnh dại và dịch tễ học phân tử vi rút dại.

2 Đề xuất được chủng vi rút dại để sản xuất vắc xin

Phạm vi nghiên cứu:

Do thời gian nghiên cứu ngắn (không đủ cho quá trình cố định, thích ứng chủng phânlập trong tự nhiên) cùng với các yêu cầu khắt khe về mặt kỹ thuật trong việc lấy mẫu, bảoquản mẫu bệnh phẩm trên bệnh nhân dại, trong phạm vi nghiên cứu của đề tài này, nhómnghiên cứu sẽ tập trung nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học bệnh dại và một số đặc điểm sinhhọc phân tử của các chủng vi rút dại hiện đang lưu hành tại Việt Nam để từ đó đề xuất chọnchủng vi rút dại sản xuất vắc xin từ tập hợp các chủng vi rút được WHO khuyến cáo sửdụng

Việc lựa chọn chủng vi rút dại để sản xuất vắc xin: trong phạm vi nghiên cứu của đề tài,nhóm nghiên cứu tập trung lựa chọn 1 trong 2 chủng được WHO khuyến cáo sử dụng để sảnxuất vắc xin là chủng vi rút PV và PM Cơ sở của việc lựa chọn chủng ngoài việc dựa trênphân tích kiểu gen bằng gen N (mã hóa Nucleoprotein của vi rút) còn dựa trên việc đánh giá

sự biến động của các vùng quyết định tính kháng nguyên trên glycoprotein G ở các chủng virút phát hiện được Căn cứ kết quả so sánh sự tương đồng axít amin của các chủng vi rút dại

ở Việt Nam (từ kết quả nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử của các chủng phân lập được)

so với các chủng sản xuất vắc xin (PM, PV) để chọn ra 1 chủng phù hợp phục vụ sản xuấtthử nghiệm vắc xin dại

Từ chủng đã được lựa chọn, nhóm nghiên cứu sẽ tiến hành sản xuất thử nghiệm vắc xinphòng bệnh dại bằng công nghệ nuôi cấy tế bào Vero Kết quả thử nghiệm vắc xin dại sẽcho phép khẳng định sự phù hợp của chủng vi rút đã lựa chọn cũng như là tiền đề để tiếnhành sản xuất vắc xin phòng bệnh dại ở quy mô lớn trong tương lai gần

14 Tình trạng đề tài

Mới Kế tiếp hướng nghiên cứu của chính nhóm tác giả

Kế tiếp nghiên cứu của người khác

15 Tổng quan tình hình nghiên cứu, luận giải về mục tiêu và những nội dung nghiên cứu của đề tài

15.1 Đánh giá tổng quan tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực của đề tài

1 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM VỀ VI RÚT DẠI VÀ BỆNH DẠI

1.1 Cấu trúc phân tử của virus dại

Vi rút dại có hình viên đạn một đầu tròn một đầu dẹt, có chiều dài trung bình 180 nm(dao động trong khoảng 130–250 nm), đường kính trung bình 75 nm (dao động từ 60–110nm) (Hình 1)

Hình 1 Cấu trúc hạt vi rút dại.

Thuộc chi Lyssavirus họ Rhabdoviridae, vi rút dại có hệ gen là một sợi RNA đơn âm có

độ dài khoảng 12 Kb vi rút dại không có khả năng tồn tại bên ngoài vật chủ, bị bất hoạt bởiánh nắng, nhiệt độ hoặc phơi khô (Leung et al., 2007)

Hình 2 Cấu trúc hệ gen của vi rút dại

Hệ gen của vi rút dại (Hình 2) chứa 5 đoạn ORF có tính bảo tồn khá cao và được phiên

mã riêng biệt để tạo các protein: nucleoprotein N, non-structural protein NS (phosphoproteinP), matrix protein M, glycoprotein G và polymerase protein L (Yousaf et al., 2012) Giữacác đoạn ORF nói trên là các trình tự vùng IR (intergenic region) có độ dài khác nhau Trình

tự IR dài nhất nằm giữa gen G và L, và được gọi là pseudogene (Tordo et al., 1986) Vùngtrình tự này có tốc độ tiến hóa cao và đã được sử dụng để đánh giá dịch tễ học phân tử của

vi rút dại (Sacramento et al., 1991)

Gen N (1350 bp) mã hóa cho nucleoprotein (450 axit amin (aa)), một thành phần thiếtyếu cho protein capsid của vi rút; đóng vai trò quan trọng trong bước đóng gói hệ gen vi rút.ORF NS (978 bp) và L (6381 bp) mã hóa cho các protein phi cấu trúc phosphoprotein vàtranscriptase Hai protein này tạo phức hợp với RNA, thực hiện quá trình phiên mã và nhânbản của vi rút Protein M (202 aa) giúp gập lõi nucleocapsid của vi rút thành cấu trúc xoắngọn Lõi vi rút được bao bọc bởi một lớp màng lipid kép có nguồn gốc từ màng tế bào vậtchủ Trên lớp màng này có glycoprotein G là một protein xuyên màng Vùng ngoại bào củaprotein G có chức năng tương tác và bám vào các tế bào cơ, thần kinh hoặc tế bào hạt củatuyến nước bọt của vật chủ (Cox et al., 1977) Bất cứ thay đổi axit amin nào ở vùng epitopecủa protein G cũng sẽ gây nên các thay đổi về khả năng gây bệnh, khả năng gây đáp ứngmiễn dịch và các đặc điểm miễn dịch khác của vi rút dại Hiện nay, các vắc xin tái tổ hợpphòng dại đều có bản chất là protein G tái tổ hợp (Ramya et al., 2018) do đây là khángnguyên chủ đạo có khả năng cảm ứng tạo đáp ứng miễn dịch phòng ngừa được vi rút dạingay cả khi vi rút được sử dụng với liều cao trên mô hình động vật (Cox et al., 1977).

Gen G dài 1572 nucleotide, mã hóa cho protein dài 524 axit amin (65 kDa) bao gồm cácvùng sau (Benjathummarak et al., 2016)

- từ axit amin (aa) 1 đến 19 là vùng peptit tín hiệu dẫn đường (sẽ được loại bỏ khỏiprotein trưởng thành ở màng tế bào);

- từ aa 20 đến 459 là vùng nằm trên bề mặt virion (vốn quyết định đặc tính khángnguyên của chủng vi rút dại);

- từ aa 460 đến 480 là vùng xuyên màng;

- từ aa 481 đến 524 là vùng nằm trong virion

Glycoprotein G tồn tại ở dạng trimer và là protein duy nhất hiện diện trên bề mặt hạtvirion (Hình 3) Chức năng chủ yếu của protein này là tương tác với thụ thể, thực hiện quátrình nhập bào Đây cũng là protein duy nhất tạo phản ứng miễn dịch sau khi xâm nhiễm.Trimer hóa là một quá trình cần thiết để glycoprotein G có thể thực hiện đầy đủ chức năng.Ngoài ra, trimer hóa cũng ảnh hưởng trực tiếp đến sự cảm ứng sinh kháng thể trung hòa tạođáp ứng miễn dịch bảo vệ khỏi sự lây nhiễm vi rút dại (Astray et al., 2017) Quá trìnhglycosyl hóa protein G (tại các vị trí asparagine 56, 223, 338) cũng ảnh hưởng rất lớn đếnkhả năng sinh đáp ứng miễn dịch đối với vi rút dại Các yếu tố quyết định kháng nguyên(epitope) của protein G đã được xác định bao gồm (Buthelezi et al., 2016; Evans et al.,2018)

- vùng từ aa 34–42 (IIb) (trình tự là GCTNLSGFS) và 198–200 (IIa) (trình tự là KRA),tồn tại ở dạng không gian

- vùng từ aa 226 – 231 (trình tự là KLCGVL) tồn tại cả ở dạng tuyến tính và dạngkhông gian

- axit amin ở vị trí 251 (T)

- vùng từ aa 261 – 264 (trình tự là HDFR)

- vùng từ aa 330 đến 338 (trình tự là KSVSFRRLS)

- vùng aa 342 và 343 (trình tự là KL)

Hình 3 Cấu trúc trimer của glycoprotein G vi rút dại (Astray et al., 2017)

Các thay đổi về trình tự axit amin trong các vùng quyết định kháng nguyên này sẽ có thể làm giảmhoặc vô hiệu hóa sự bắt cặp của các kháng thể trung hòa với protein G, do vậy, có thể ảnh hưởngxấu đến hiệu quả bảo vệ của các vắc xin(Koprowski et al., 1985) Do vậy, cần theo dõi sự biến đổi

về trình tự axit amin trong các vùng quyết định kháng nguyên của protein G ở các chủng vi rút dạitrong tự nhiên để lựa chọn được chủng vi rút sản xuất vắc xin phù hợp

1.2 Con đường lây nhiễm

Từ hệ thần kinh trung ương, virus dại sẽ di chuyển đến tuyến nước bọt thông qua cácdây thần kinh hộp sọ và sẽ được tiết ra trong nước bọt của động vật mắc bệnh Từ đây, virusdại sẽ tiếp tục lây nhiễm sang vật chủ mới qua vết cắn và vết cào xuyên da của động vật mắcbệnh Động vật trung gian thường gây bệnh dại ở người là chó và mèo do chúng là thú nuôithân thiết của người (Chhabra and Ichhpujani 2003; Blanton et al 2009) Tại hầu hết cácquốc gia trên thế giới, đặc biệt tại châu Á và châu Phi, chó cắn là nguyên nhân gây ra từ 85đến 95  các ca bệnh dại ở người (Tang et al., 2005; Fitzpatrick et al., 2012) Lây truyềncũng có thể xảy ra khi virus dại trong nước bọt xâm nhập trực tiếp vào niêm mạc hoặc tổnthương da mới của nạn nhân tuy nhiên tỷ lệ lây nhiễm theo con đường này rất thấp So vớicác chủng virus dại từ chó, virus dại từ dơi có độc tính cao hơn nhiều lần khi lây nhiễm theocon đường tiếp xúc biểu mô Điều này là do các chủng virus dại từ dơi có khả năng nhânbản nhanh hơn trong các tế bào phi thần kinh và ở nhiệt độ thấp hơn (Singh et al., 2017) Tại

một số quốc gia đã thanh toán được bệnh dại ở người do trung gian là chó, dơi trở thành tácnhân truyền bệnh dại chủ yếu (Singh et al., 2017) Ngoài ra, một số ca bệnh dại đơn lẻ cũng

đã được ghi nhận do hít phải các chất tiết có chứa virus hoặc do ghép tạng Tại Mỹ vào năm

2004, đã ghi nhận 4 trường hợp mắc bệnh dại do ghép tạng của người chết vì bệnh dại(Krebs et al., 2005) Tại một số nước châu Á (Trung Quốc, Campuchia, Hàn Quốc, ViệtNam và Ấn Độ), các lò giết mổ chó mèo cũng là một trong những con đường lây nhiễm cónguy cơ cao do điều kiện vệ sinh và thú y không được đảm bảo (Rupert, 2002; Clifton,2003; Tang et al., 2005)

1.3 Đặc điểm bệnh học

Virus dại gây bệnh với tiến triển khá chậm và không có triệu chứng lâm sàng ban đầu.Tuy nhiên, khi các triệu chứng lâm sàng đã xuất hiện, gần như chắc chắn sẽ dẫn đến tửvong Sau khi bị phơi nhiễm với virus, virus dại sẽ ở trạng thái ủ bệnh tại vị trí vết thương.Thời gian này có thể kéo dài từ 2 tuần tới 6 năm (trung bình là 2 – 3 tháng)tùy thuộc vàolượng virus ban đầu, vị trí vết thương và mật độ dây thần kinh tại vị trí vết thương (Greeneand Rupprecht, 2006) Thời gian ủ bệnh sẽ ngắn hơn khi người bệnh bị cắn tại tay, cổ, mặthoặc vùng đầu Tại vị trí phơi nhiễm, vi rút dại sẽ bám vào các tế bào đích (tế bào cơ, tế bàothần kinh cảm quan cảm giác, tế bào thần kinh vận động) thông qua tương tác của protein Gvới các thụ thể đặc hiệu Sau đó, virus dại sẽ dịch chuyển đến hệ thống thần kinh trungươngbằng cơ chế vận chuyển sợi trục ngược (retrograde axonal transport) (Hình 3) Tại đây,quá trình nhân bản virus sẽ diễn ra mạnh mẽ, gây ra các tác động bệnh lý lên sinh lý tế bàothần kinh Sau đó, virus sẽ di chuyển từ hệ thần kinh trung ương qua các dây thần kinhngoại biên, đến các cơ quan khác như tuyến nước bọt Tại thời điểm khởi phát lâm sàng,virus dại đã được phát tán rộng rãi khắp cơ thể Lúc này, hệ thần kinh ngoại biên, tủy sống

và não người bệnh sẽ xuất hiện dấu hiệu thoái hóa, dẫn đến rối loạn chức năng của các tếbào thần kinh (Jackson, 2007) Ngoài ra ở tủy và não giữa, có thể quan sát thấy nhiều phảnứng viêm Ở thời kì cuối của bệnh, virus theo các dây thần kinh tới tuyến nước bọt để đượcgiải phóng ra ngoài (Hình 4)

Hình 4 Vòng đời của virus dại trong vật chủ.

Biểu hiện đầu tiên của bệnh dại thường là sốt nhẹ, đau và dị cảm tại vết thương Khivirus lan truyền vào hệ thần kinh trung ương, viêm não tiến triển sẽ xuất hiện các triệuchứng sợ nước hoặc sợ gió, tăng động và mất ngủ, co giật toàn thân, sau đó một vài ngàybệnh nhân sẽ tử vong Bệnh dại gây liệt có thể xảy ra ở 30% ca bệnh ở người, tiến triểnchậm hơn tuy nhiên kết cục cuối cùng cũng là tử vong Dạng bệnh dại này thường bị chẩnđoán nhầm là bệnh lý khác (Singh et al., 2017)

1.4 Chẩn đoán bệnh dại

Hiện chưa có thử nghiệm nào được sử dụng để chẩn đoán bệnh dại ở người trước khibệnh khởi phát trên lâm sàng Do vậy, chẩn đoán bệnh sẽ chỉ dựa trên tiền sử bệnh, các biểuhiện và triệu chứng có liên quan đến tình hình dịch tễ của bệnh trên động vật Biểu hiện đầutiên của bệnh dại thường là sốt nhẹ, đau và dị cảm tại vết thương sau đó sẽ xuất hiện có cáctriệu chứng đặc trưng là sợ nước, sợ gió, tăng động và mất ngủ, co giật toàn thân Đối vớinhững trường hợp có thời kỳ ủ bệnh dài, không rõ thời gian ủ bệnh và tiền sử phơi nhiễm,người bị bệnh dại ở thể liệt thì rất khó chẩn đoán trên lâm sàng, dễ bị bỏ sót hoặc chẩn đoánnhầm sang một bệnh viêm não khác Các phương pháp xét nghiệm thường quy (tỷ lệ bạchcầu đa nhân trong máu, bạch cầu niệu, chụp cắt lớp vi tính (CT Scan) hoặc cộng hưởng từ

(MRI)) không có giá trị chẩn đoán đặc hiệu bệnh dại do nhiều bệnh viêm não khác cũng chobiểu hiện tương tự.

Khi bệnh đã khởi phát trên lâm sàng, có thể sử dụng các phương pháp chẩn đoán sau đểkhẳng định ca bệnh :

- Nuôi cấy phân lập virus: virus dại từ các mẫu bệnh phẩm (thần kinh trung ương,tuyến nước bọt…) có thể được nuôi cấy phân lập trên chuột hoặc các dòng tế bàoNeuro2a/CCL 131, BHK) 21/C13, Vero trong đó dòng tế bào CCL 131 là được sử dụng phổbiến nhất do đa số các chủng virus dại có thể nhân bản trên dòng tế bào này mà không cầnqua giai đoạn thích ứng Quá trình nhân bản virus trong chuột hay dòng tế bào sẽ được pháthiện bằng kỹ thuật nhuộm miễn dịch huỳnh quang trực tiếp dFAT (direct fluorescentantibody test) Đây là các phương pháp chính xác nhất để chẩn đoán virus dại do cho phépkhẳng định được khả năng lây nhiễm Tuy nhiên, chúng thường chỉ được ứng dụng trongcác phòng thí nghiệm trung tâm chuyên nghiên cứu về virus dại do yêu cầu về trang thiết bị(phòng an toàn sinh học cấp III) và nguy cơ lây nhiễm cao đối với các kỹ thuật viên

- Phát hiện kháng nguyên virus: sự có mặt của virus dại trong mô não có thể đượckhẳng định bằng các phương pháp miễn dịch như dFAT, DRIT (Direct rapidimmunohistochemistry test hay kỹ thuật miễn dịch hóa mô trực tiếp), sắc ký miễn dịch.Trong các phương pháp này, dFAT hiện được công nhận là phương pháp tiêu chuẩn để chẩnđoán bệnh dại ở động vật bởi cả WHO và OIE (World Organisation for Animal Health hay

Tổ chức Thú y thế giới) Quy trình dFAT yêu cầu các mẫu mô não còn tươi và bao gồm cácbước chính sau (Hình 4): cố định mô não trên phiến kính, nhỏ hai cộng hợp kháng thể đơndòng gắn FITC lên mô cố định (sử dụng hai kháng thể giúp giảm hiện tượng âm tính giả do

sự biến đổi kháng nguyên), rửa để loại bỏ kháng thể dư, quan sát kết quả nhuộm dưới kínhhiển vi huỳnh quang Ưu điểm của phương pháp này là chính xác (độ nhạy và độ đặc hiệuđều là 100%) và thời gian thu nhận kết quả nhanh (khoảng 2 giờ không kể thời gian lấymẫu) Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là có nguy cơ lây nhiễm bệnh dại caocho kỹ thuật viên vì phải thao tác nhiều bước trực tiếp với mô bệnh phẩm Gần đây, kỹ thuậtsắc ký miễn dịch sử dụng kháng thể đơn dòng đã được sử dụng để phát hiện trực tiếp khángnguyên virus dại của các kiểu gen 1, 5, 6 và 7 trong mẫu não Khi so sánh với dFAT, quethử sắc ký miễn dịch có độ đặc hiệu là 100 % và độ nhạy là 88,5 % (Servat et al., 2012) Ưuđiểm chủ yếu của phương pháp này là quy trình phân tích đơn giản, không cần sử dụng cácthiết bị phức tạp như kính hiển vi huỳnh quang

Hình 5 Quy trình phát hiện kháng nguyên virus dại bằng dFAT

- Do các phòng thí nghiệm có khả năng ứng dụng phương pháp dFAT để phát hiệnkháng nguyên virus dại thường chỉ tập trung tại các thành phố lớn và yêu cầu tiên quyết củaphương pháp này là mẫu bệnh phẩm cần phải tươi Đây chính là điểm hạn chế chủ yếu khảnăng chẩn đoán bệnh dại trên động vật nghi mắc dại Nhiều nghiên cứu đã sử dụng kỹ thuậtRT-PCR để phát hiện RNA của virus dại trong mẫu bệnh phẩm não Thông thường, các cặpmồi trong phản ứng RT-PCR sẽ được thiết kế dựa vào vùng trìnhtự gen N do đây là vùnggen có tính bảo tồn nhất của virus dại (Fooks et al., 2009; Wacharapluesadee andHemachudha, 2010) Do có độ nhạy phân tích cao (về lý thuyết cho phép phát hiện 1 phiênbản/phản ứng), các phương pháp này cho phép phát hiện virus dại trong cả các mẫu trước(mẫu nước bọt, dịchnão tủy) và sau tử vong (mô não).Khi ứng dụng RT-PCR trên các mẫubệnh phẩm trước và sau tử vong, Biswal và đồng tác giả (2012) nhận thấy độ nhạy và độ đặchiệu của phương pháp này đều đạt 100% trong khi đó độ nhạy của các phương pháp chẩnđoán dFAT chỉ đạt 83% Mộtnghiên cứu khác cũng cho thấy sử dụng RT- hemi nested PCRtrên vùngtrình tự gen L cũng cho hiệu quả cao trong chẩn đoán dại trước tử vong(Dacheux L

et al., 2008) Khi ứng dụng phương pháp này trên các mẫu da cổ, phương pháp này có độchính xác rất cao (độ đặc hiệu 100%; độ nhạy 98,3%) Tuy nhiên, một hạn chế của kỹ thuậtRT-PCR là khả năng nhiễm chéo do phải điện di sản phẩm khuếch đại Do vậy, để khẳngđịnh tính chính xác, thông thường sản phẩm RT-PCR dương tính cần được giải trình tự(Fooks et al., 2009; Wacharapluesadee and Hemachudha, 2010) Để giải quyết hạn chế này,

kỹ thuật Real-Time RT-PCR một bước đã được đề xuất để phát hiện các virus có vật liệu ditruyền là RNA Gần đây, Wadhwa và đồng tác giả (2017) đã ứng dụng kỹ thuật TaqmanReal-Time RT-PCR một bước để phát hiện toàn bộ các kiểu gen của Lyssavirus Trong

nghiên cứu này, các tác giả đã thiết kế các trình tự mồi và mẫu dò suy biến nhắm đến vùnggen đích giữa trình tự dẫn đường không mã hóa (vốn có tính bảo thủ cao) và một phần củatrình tự mã hóa protein N để đảm bảo độ bao phủ của toàn bộ các chủng Lyssavirus Thửnghiệm trên tập hợp mẫu chuẩn cho thấy phương pháp Real-Time RT-PCR phát hiện chínhxác toàn bộ các biến thể virus thuộc chi Lyssavirus Khi tiến hành kiểm định liên phòngphương pháp này tại 14 phòng thí nghiệm khác nhau trên một tập hợp 2,978 mẫu bệnh phẩm

từ các châu Phi, châu Mỹ, châu Á, Trung Đông và châu Âu, Gigante và đồng tác giả (2018)

đã nhận thấy phương pháp này hoàn toàn có thể thay thế cho phương pháp dFAT tiêu chuẩn(ngưỡng phát hiện: 8 phiên bản RNA/phản ứng; độ nhạy: 99,90%, độ đặc hiệu: 99,68%) Ưuđiểm chủ yếu của phương pháp Real-Time RT-PCR này là cho phép phát hiện RNA củaLyssavirus ngay cả trong các mẫu bệnh phẩm được bảo quản ở nhiệt độ thường hoặc cácmẫu đã được cố định bởi formalin, điều không thể thực hiện được bởi dFAT (luôn yêu cầumẫu tươi) Điều này sẽ cho phép nâng cao khả năng phân tích chẩn đoán đặc biệt tại nhữngvùng không có các phòng thí nghiệm tiêu chuẩn về virus dại

2 DỊCH TỄ HỌC BỆNH DẠI

2.1 Thực trạng bệnh dại ở người

2.1.1 Thực trạng bệnh dại ở người trên thế giới

Bệnh dại hiện nay lưu hành ở tất cả các quốc gia trên thế giới trừ một số đảo quốc TheoWHO, mỗi năm có khoảng 59000 người mắc dại ở hơn 150 quốc gia trong đó 95% là xảy ratại các quốc gia tại châu Á và châu Phi (WHO, 2018) Tuy nhiên, các nhà dịch tễ học chorằng thống kê này chưa đầy đủ và gánh nặng thực tế của bệnh dại cao hơn nhiều (WHO,2018) Hiện nay, 99% các ca mắc dại là do truyền từ chó nhiễm bệnh (chủ yếu từ các vùngnúi và nông thôn) (WHO, 2018) Ngoài ra, xấp xỉ một nửa các ca dại hàng năm là ở trẻ emdưới 15 tuổi (WHO, 2018)

Hiện nay, bệnh dại do trung gian là chó đã được loại trừ hoàn toàn khỏi các nước Tây

Âu, Canada, Mỹ, Nhật Bản, một số nước Mỹ Latinh và Australia Ngoài các khu vực trên,tình hình dịch tễ bệnh dại được trình bày ngắn gọn như sau:

- Mỹ latinh và Caribe:

Nhờ vào các nỗ lực của tổ chức Pan America, tình hình bệnh dại ở khu vực này đượckiểm soát liên tục, dẫn đến giảm đáng kể các ca mắc dại ở người và chó Số ca nhiễm bệnhgiảm từ 250 (1990) xuống còn khoảng 10 ca (2010) Giai đoạn 2013 – 2018, bệnh dại ởngười chủ yếu là do trung gian là các loài dơi và các ca bệnh do trung gian là chó chỉ đượcghi nhận ở 8 quốc gia (WHO, 2018)

- Châu Á:

Bệnh dại hiện vẫn là một gánh nặng ở châu Á với ước tính hơn 35000 người chết mỗinăm (chiếm 35% toàn cầu) (WHO, 2018) Ấn Độ là nước có gánh nặng bệnh dại cao nhấttrên toàn cầu (WHO, 2018) Một nghiên cứu đa trung tâm trong năm 2003 cho thấy có

20565 ca tử vong vì bệnh dại xảy ra hàng năm tại quốc gia này (WHO, 2018) Một nghiêncứu khác năm 2005 đưa ra con số thực tế vào khoảng 12700 ca tử vong chưa tính các trườnghợp không điển hình Châu Á hiện nay cũng là khu vực sử dụng nhiều kinh phí nhất chotiêm chủng sau phơi nhiễm (Post Exposure Prophylaxis hay PEP), ở mức 1,5 tỉ USD mỗinăm (WHO, 2018) Để cải thiện tình hình này, các nước Đông Nam Á (ASEAN) đã áp dụngchiến lược loại trừ bệnh theo khu vực, với mục tiêu loại bỏ hoàn toàn bệnh dại ở người vàonăm 2020

- Châu Phi:

Mỗi năm ở châu Phi có hơn 21000 ca tử vong do dại, chủ yếu là truyền từ chó Tuynhiên, con số tử vong do bệnh dại ở châu Phi không chắc chắn vì thiếu những báo cáo và dữliệu đáng tin cậy Một số nghiên cứu cho thấy tỷ lệ mắc bệnh dại ở người được báo cáo thấphơn nhiều lần trên thực tế vì hầu hết các trường hợp tử vong xảy ra trong cộng đồng khôngđược thống kê, và những người tử vong tại các bệnh viện cũng thường xuyên được chẩnđoán nhầm là viêm não (WHO, 2018) Ngoài ra, rất ít chương trình tiêm chủng vắc xin chochó quy mô lớn được triển khai trong khu vực này Các thống kê cho thấy, so với thế giới,châu Phi là khu vực chi tiêu ít nhất cho PEP và cũng là khu vực có tỉ lệ tử vong do dại caonhất (WHO, 2018) Do đó, cần có các chính sách cải thiện khả năng tiếp cận PEP của ngườibệnh, từ đó giảm tỉ lệ tử vong do dại ở khu vực này

- Trung Á và Trung Đông:

Các thống kê về bệnh dại ở khu vực này còn khá hạn chế Số ca tử vong mỗi năm đượcước tính vào khoảng hơn 2000, gây hậu quả kinh tế xấp xỉ 8,6 tỉ USD (WHO, 2018) Thiệthại do bệnh dại bao gồm tổn thất khả năng sản xuất cho các ca tử vong ở người trong độ tuổilao động, chi phí PEP và các chi phí y tế khác

Nhìn chung hiện nay, các nước trên thế giới đều triển khai các chương trình kiểm soátbệnh dại, với nhiều thành tựu trong việc mở rộng phạm vi tiêm phòng cho chó, nâng cao khảnăng tiếp cận PEP của người bệnh và giảm số ca tử vong do dại Cộng đồng y tế hiện nayđặt mục tiêu loại bỏ hoàn toàn các ca tử vong vì bệnh dại do trung gian là chó vào năm

2030 Các quốc gia và vùng lãnh thổ có thể tuyên bố đã loại bỏ bệnh khi không có ca nhiễmmới ở người và động vật trong 2 năm liên tiếp

2.1.2.Thực trạng bệnh dại ở người tại Việt Nam

Cũng giống như các nước trong khu vực Đông Nam Á và châu Á thì động vật truyền

bệnh dại ở nước ta chủ yếu là chó, chưa phát hiện các loài động vật hoang dã có bệnh dạilưu hành hoặc có mang vi rút dại ở Việt Nam [12], [45].

Bảng 1 Số người tiêm vắc-xin Dại và số ca tử vong do bệnh Dại tại Việt Nam 1991-2016 Năm Số người tiêm vắc-xin Số ca tử vong Ghi chú

1991 87.625 282 - Chết vì bệnh Dại: Tổng 5 năm có:

2001 người chết; Trung bình 400 ca/năm

- Tiêm vắc-xin Dại: 1.167.238 người;

758 người chết; trung bình 152 ca/năm

- Tiêm vắc-xin Dại: 2.649.757 người; trung bình: 529.951 người/ năm

450 người chết; trung bình 90 ca/năm

- Tiêm vắc-xin Dại: 1.981.249 người; trung bình: 396.250 người/ năm

* Tình hình tử vong do bệnh dại ở người

Bệnh dại truyền từ chó sang người lưu hành ở hầu hết các tỉnh, thành phố của ViệtNam Trong 5 năm (1984-1988) ở Việt Nam có 1.234 người tử vong do bệnh dại, tập trungtại các tỉnh Hà Bắc, Hà Tuyên, Bắc Thái, Vĩnh Phú, Hà Nội…

Từ 1988-1991 tổng số ca tử vong ở người trên toàn quốc là 1.748 (tỷ lệ tử vong trungbình là 1,0/100.000 dân) Trong 6 năm (1989-1994) tại 23 tỉnh/thành phố ghi nhận 1.218 ca

tử vong Nghiên cứu trong giai đoạn 1992-1999 cho thấy tỷ lệ tử vong chung là 0,3/100.000dân, nhưng không đồng đều giữa các vùng (ở miền Bắc là 0,6/100.000 dân,miền Nam là0,11/100.000 dân, miền Trung là 0,15/100.000 dân, khu vực Tây Nguyên là 0,18/100.000dân) Trong 6 năm (1996-2000) miền Bắc cũng dẫn đầu về tử vong với tỷ lệ trung bình0,12/100.000 dân, miền Nam là 0,053/100.000 dân, miền Trung là 0,093/100.000 dân [35],[71].

- Trong các năm từ 1991-1995, tính trung bình mỗi năm có 400 người chết do bệnh Dại(cao gấp 8 lần số người chết do bệnh Viêm não vi rút và gấp 4 lần so với số người chết dobệnh Sốt xuất huyết) Tỉnh có số ca tử vong do Dại cao nhất là 131 ca/ năm và trên 10 tỉnh,thành phố có từ 45-131 ca tử vong do Dại /năm

- Năm 1996, Thủ tướng Chính phủ ban hành Chỉ thị 92/TTg về tăng cường phòngchống bệnh Dại, từ đó công tác phòng chống bệnh Dại được các cấp chính quyền quan tâmhơn và chương trình tiêm phòng vắc-xin Dại cho người bị chó cắn được tổ chức với quy môrộng tới nhiều quận, huyện Đến đầu năm 2007 cả nước đã có 936 điểm tiêm phòng Dại chongười và tại các điểm tiêm đã có sổ sách theo dõi, quản lý và báo cáo thường xuyên theo hệthống các Trung tâm Y tế dự phòng Nhờ đó số ca tử vong do bệnh Dại đã giảm đi rõ rệt,đến năm 2003 cả nước chỉ còn có 34 người bị chết do bệnh Dại và tỉnh có số chết cao nhất

là 5 người Như vậy là trong 12 năm từ 1996 - 2007, trung bình hàng năm có 107 ca tử vong

do Dại, giảm mỗi năm 293 ca so với thời kỳ 1991 - 1995 Tuy nhiên số người chết do bệnhDại vẫn còn cao hơn rất nhiều so với số chết của các bệnh truyền nhiễm gây dịch nguy hiểmkhác ở Việt Nam

- Giai đoạn 2011 - 2015 là giai đoạn triển khai thực hiện chương trình quốc gia khốngchế và loại trừ bệnh Dại Trong giai đoạn này số ca tử vong có giảm xuống với trung bìnhkhoảng 95 ca tử vong/ năm với khoảng 380.000 người bị chó cắn phải đi điều trị dự phòngmỗi năm [34], [45]

- Trong năm 2015, cả nước có 78 trường hợp người bị tử vong do bệnh Dại Báo cáotình hình bệnh Dại những năm gần đây cho thấy bệnh Dại gây tử vong trên người nhiều nhất

ở các tỉnh miền núi phía Bắc và Bắc Trung bộ (Sơn La, Yên Bái, Lai Châu, Sơn La, LạngSơn, Phú Thọ, Nghệ An, Cao Bằng, Hà Giang, Điện Biên, Tuyên Quang, Hoà Bình, TháiNguyên, Quảng Nam, Vĩnh Phúc và Bình Phước)

Hình 2 Số trường hợp tử vong do Dại ở người theo khu vực ở Việt Nam, giai đoạn 1995 –

2015

Hình 3 Tỉnh có số người tử vong vì bệnh Dại cao nhất (2011– 2015)

Kết quả theo dõi và giám sát bệnh Dại trên người trong các năm gần đây cho thấy: trong

số người đến tiêm vắc-xin Dại có 89,2% là do chó nhà cắn người; 8,7% do mèo cắn, 1,6%

do tiếp xúc với chó và 0,5% là do các con vật khác như chuột, khỉ cắn

* Thực trạng tiêm vắc xin phòng dại ở người

Kết quả nghiên cứu về tình hình tiêm VXPD ở người trong 5 năm (1984- 1988) ở ViệtNam có 2.402.052 người được tiêm VXPD Trong giai đoạn tiếp theo từ 1988-1991, Việt

Nam có 2.095.393 người bị chó mèo cắn phải đi tiêm phòng dại, tỷ lệ trung bình là690/100.000 dân.

Hình 4 Số người đi tiêm vắc-xin phòng Dại theo khu vực ở Việt Nam giai đoạn 1996-2015

Nghiên cứu về tình hình bệnh dại ở Việt Nam giai đoạn 1992-1999 cho thấy tỷ lệ người

bị súc vật cắn phải đi tiêm phòng dại tăng nhanh từ 300/100.000 dân năm 1992 đã tăng lênđến 700/100.000 dân năm 1999 Trong 10 năm (1996-2005) cả nước ghi nhận có 5.776.370người bị súc vật cắn đã được tiêm phòng dại tại các điểm tiêm phòng trên toàn quốc Tỷ lệtiêm VXPD tính trên 100.000 dân thấp nhất là năm 1996 (652,5), cao nhất là năm 2002(796,1), trung bình trong 6 năm là 672/100.000 dân Tỷ lệ người tiêm phòng cũng phân bốtương đối đều qua các tháng, tuy nhiên từ tháng 3 đến tháng 8 có tỷ lệ cao hơn các thángkhác

Tỷ lệ tiêm VXPD trên cả nước trung bình giai đoạn 1996 – 2013 ở nam giới chiếm 54%cao hơn ở nữ và phân bố ở các vùng thì tỷ lệ nam giới tiêm phòng VXPD cũng đều cao hơn

ở nữ Tỷ lệ trẻ em <15 tuổi bị súc vật cắn phải đi tiêm phòng VXPD chiếm tỷ lệ tới 40%trong cơ cấu các nhóm tuổi [34], [45]

Theo nguồn số liệu từ dự án phòng, chống bệnh dại (Bộ Y tế) cho thấy 90% số người bịphơi nhiễm đến tiêm VXPD sớm trong 3 ngày đầu, vẫn còn 10% đến sau 3 ngày tính từ khi

bị cắn Những người đi tiêm phòng chủ yếu là do bị chó cắn

(93%) ngoài ra còn có một số các loại động vật gần người khác như mèo, chuột, khỉ…Khoảng 60% số người đến tiêm VXPD khi con vật cắn trông như bình thường vàchỉ có 6%con vật cắn trong lúc đang lên cơn dại [34]

Hình 5 Phân bố loại động vật mà người đến tiêm vắc-xin phòng Dại đã phơi nhiễm.

Kết quả giám sát bệnh Dại trên người cho thấy: bệnh Dại có thể xảy ra quanh năm, tuynhiên bệnh thường tăng cao vào mùa nắng nóng từ tháng 5 đến tháng 8 hàng năm Bệnh gặp

ở mọi lứa tuổi, nhưng nhiều nhất là ở trẻ em dưới 15 tuổi (chiếm trên 40%) và hầu hết cáctrường hợp chết do bệnh Dại đều không tiêm vắc-xin và 98% số ca mắc bệnh này là do bịchó nhà cắn hoặc do tiếp xúc như chăm sóc chó ốm, mổ chó Số còn lại là do mèo dại cắn vàcho đến nay chưa phát hiện được trường hợp tử vong nào do động vật hoang dã gây nên

2.2 Tình hình bệnh Dại ở động vật

Theo số liệu thống kê chưa đầy đủ, kết quả giám sát bệnh Dại ở động vật từ năm

1991-1995 có 2.600 ổ dịch Dại ở động vật nuôi (chó, mèo), riêng năm 1996 có 587 ổ dịch Dạilàm chết 16.800 động vật, trong đó 97% là chó, 3% là mèo và các gia súc khác

Bảng 2 Bệnh Dại trên động vật giai đoạn 2008-2016

30 xã, 20 huyện, 10 tỉnh Do công tác giám sát bệnh Dại còn yếu, nhiều địa phươngkhông phát hiện được bệnh Dại trên động vật, chỉ phát hiện sau khi có ca bệnh xảy ra trênngười Số địa phương báo cáo có bệnh Dại trên động vật còn thấp hơn nhiều so với số địaphương có bệnh Dại xảy ra trên người.

Trong nhiều năm qua, tỷ lệ tiêm vắc-xin Dại trên tổng đàn chó thực tế vẫn còn thấp(dưới 50%) Theo số liệu báo cáo của các tỉnh, thành phố, trong năm 2015, cả nước cótrên 9 triệu con chó nuôi, tuy nhiên số chó được tiêm phòng Dại là 3,89 triệu con (chiếm tỷ

lệ 42,9%) Cả nước có 17/63 tỉnh, thành phố tỷ lệ tiêm phòng đạt trên 70% tổng đàn chónuôi, 10/63 tỉnh tỷ lệ tiêm phòng đạt từ 50 - 69%

tổng đàn chó nuôi, 36/63 tỉnh có tỷ lệ tiêm phòng đạt dưới 50% tổng đàn chó, đặc biệt

có 8/63 tỉnh tiêm phòng chỉ đạt dưới 10% tổng đàn chó

Hình 6 Bản đồ phân bố các tỉnh có bệnh Dại trên chó giai đoạn 2011-2014 Bảng 3 Tình hình tiêm phòng Dại trên chó

Hình 7 Bản đồ phân bố chó nuôi và tỷ lệ tiêm phòng Dại cho chó, năm 2015

Năm 2016, Bộ Nông nghiệp và PTNT chỉ đạo địa phương thống kê thực tế đàn chónuôi Theo báo cáo của các địa phương, cả nước có khoảng 7,7 triệu con chó nuôi tronggần 3,9 triệu hộ nuôi chó Tuy nhiên số chó được tiêm phòng vắc-xin Dại chỉ đạt hơn 2,9triệu con (đến tháng 6/2016), chiếm tỷ lệ 38,50%

tổng đàn Phân tích thống kê cho thấy, cả nước chỉ có 22% số tỉnh, thành phố tiêmphòng Dại đạt yêu cầu trên 70% đàn chó nuôi và gần 56% số tỉnh, thành phố tiêm phòngDại thấp dưới 50% tổng đàn chó

3 DỊCH TỄ HỌC PHÂN TỬ VI RÚT DẠI

3.1 Dịch tễ học phân tử vi rút dại

Cùng với các tiến bộ của các kỹ thuật sinh học phân tử, dịch tễ học phân tử cung cấpnhững thông tin chính xác về phân bố của bệnh dại trong quần thể người và động vật Bêncạnh các phương pháp truyền thống xác định kiểu huyết thanh, các phương pháp xác địnhkiểu gen tiên tiến hiện nay mở ra nhiều cơ hội hơn về khả năng phân tích cấu trúc quần thểcủa virus dại cũng như chiều hướng tiến hóa của virus theo thời gian và không gian Từcác

thông tin này, sẽ đề xuất được các biện pháp phòng và điều trị bệnh hiệu quả hơn Ngoài ra,khi xảy ra dịch, dịch tễ học phân tử cho phép xác định nguồn bệnh và dự đoán tình hình tiếntriển của bệnh (Singh et al., 2017).

Một điểm cần nhấn mạnh là virus dại cũng như cácvirus có hệ gen là RNA sợi âm khácđều sử dụng RNA polymerase có đặc tính sai sót cao cho quá trình nhân bản Vì thế, trongmột quần thể, hệ gen của virus dại thường là một tập hợp nhiều biến thể của một trình tựgốc Tuy nhiên, các biến thể này chịu ảnh hưởng của chọn lọc tự nhiên, dẫn đến loại trừ cácbiến thể không có lợi về mặt tiến hóa và hạn chế một phần đa dạng sinh học của virus dại.Virus dại có thể lây nhiễm bất kì động vật máu nóng nào, tuy nhiên, cũng có nhiều bằngchứng chỉ ra rằng chúng cần phải tiến hóa, thích nghi thích hợp để tấn công một loài vật chủmới(Hanlon et al., 2013)

Theo truyền thống, các chủng virus dại được phân loại theo kiểu huyết thanh dựa trênkhả năng phản ứng với một tổ hợp các kháng thể đơn dòng Những kháng thể đơn dòng nàythường kháng G hoặc protein N của virus dại Các chủng virus phản ứng với cùng một tổhợp kháng thể đơn dòng sẽ được xác là định là cùng kiểu huyết thanh Ngoài ra, chỉ số trunghòa (neutralization index) cũng được tính dựa trên sự giảm của hiệu giá virus sau khi được ủcùng với kháng thể (Teshome and Mebatsion, 1992) Hiện nay, đã xác định được 5 kiểuhuyết thanh của virus dại: kiểu 1RABV; kiểu 2 Lagos bat virus (LBV); kiểu 3 Mokola virus;kiểu 4 Duvenhage virus (DUVV); và kiểu 5 European bat lyssavirus (EBLV) (Badrane etal., 2001) Hạn chế của phương pháp này là giá thành cao do cần các tổ hợp kháng thể khácnhau cho các virus thuộc khu vực địa lý hoặc vật chủ khác nhau Ngoài ra, các nghiên cứucũng đã chỉ ra phương pháp phân loại này kém hiệu quả hơn so với các phương pháp xácđịnh kiểu gen dựa trên trình tự nucleotid (Albas et al., 2011)

Phương pháp xác định kiểu gen virus dại hiện nay được sử dụng phổ biến nhất là giảitrình tự gen Giải trình tự gen có thể được tiến hành tại một vùng gen đích (thường là vùnggen N) hoặc trên toàn bộ hệ gen của virus dại Kết quả thu nhận được sẽ cho phép so sánh

độ tương đồng về trình tự nucleotide và axít amin đối với các trình tự trong ngân hàng dữliệu Quy trình phân tích chung bao gồm các bước: thu thập mẫu bệnh phẩm (nước bọt, dịchnão tủy, dịch giác mạc… từ người hoặc động vật mắc bệnh); tách chiết RNA tổng số từ mẫubệnh phẩm; thực hiện phản ứng RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại vùng gen đích;xác định trình tự của sản phẩm RT-PCR; so sánh trình tự thu nhận được với ngân hàng dữliệu Ngoài vùng gen N, các vùng đích khác cũng đã được sử dụng trong các nghiên cứudịch tễ học phân tử bao gồm: G, L vàvùng pseudogene

Nghiên cứu dịch tễ học phân tử đầu tiên trên các chủng lyssavirus được công bố bởi

Bourhy và đồng tác giả (1993) Trong nghiên cứu này, các tác giả đã tiến hành giải trình tựmột vùng gen dài 5,6 kb bao gồm các trình tự mã hóa gen protein N, M, P và G Kết quảgiải trình tự cho thấy tính bảo thủ trình tự axit amin là giảm dần theo thứ tự từ N đến M, P.Dựa trên trình tự nucleotide của gen N, 6 kiểu gen lyssavirus đã được xác định trong đó 4kiểu gen 1 đến 4 tương ứng hoàn toàn với 4 kiểu huyết thanh đã được phân loại trước đó(RABV, LBV, Mokola và DUVV) Kiểu huyết thanh 5 EBLV nay được phân chia tiếpthành 2 kiểu gen 5 và 6 tương ứng với chủng EBLV1 và EBLV2 (Bourhy et al., 1993).Độtương đồng ở mức độ axít amin của protein N giữa các chủng virus trong cùng một kiểugene có thể đạt tới 98 - 99,5 Nếu độ tương đồng về trình tự axít amin của protein N giữacác chủng virus dại nằm trong khoảng 93,3% - 97,1% thì chúng có thể được kết luận thuộccác kiểu gene khác nhau (Bourhy et al., 1993).

Kiểu gen 7, có tên là ABLV (Australian Bat Lyssavirus) được phát hiện bởi Gould vàđồng tác giả (1998), được phân lập từ quần thể dơi tại Úc Kiểu gen này có phổ phản ứngvới kháng thể đơn dòng có độ tương đồng cao với kiểu huyết thanh 1 Tuy nhiên, trình tựaxit amin của protein N cho thấy ABLV là một kiểu gen hoàn toàn mới phân biệt với kiểugen 1 (Gould et al., 1998).Sau đó, 4 kiểu gen mới (Aravian virus, Khujand virus, Irkut virus

và West caucasian bat virus)lần lượt được phát hiện ở các loài dơi ăn côn trùng (Arai et al.,2003; Freuling et al 2011; Kuzmin et al., 2005) Sự phát hiện của 4 kiểu gen mới này cũnghoàn toàn dựa trên trình tự gen mã hóa protein N Các thông tin về các kiểu gen lyssavirusđược tóm tắt trong Bảng 1

Bảng1 Các kiểu gen thuộc nhóm Lyssavirus Kiểu gen Chủng đại diện Vùng địa lý lưu hành Động vật cảm thụ

1 chủng virus sử dụngVirus dại và các

làm vắc xin

Trên toàn thế giới trừ Úc,Vương Quốc Anh, Ireland,

New Zealand,Nhật Bản, Scandinavia và

Hawaii

Người; các loài độngvật hoang dại và vậtnuôi ăn thịt, ăn cỏ; dơihút máu và dơi

ăn quả

Negeria, cộng hoà Trung Phi,Nam Phi, Zimbabwe, Guinea,Seneral, Ethiopia,

Ai Cập Dơi ăn quả, mèo, chó

3 Mokola Phi, Zimbabwe, Ethiopia,Negeria, cộng hoà Trung

Cameroon

Người, chuột trù, mèo,chó, các loàiđộng vật gặm nhấm

4 Duvenhage Nam Phi, Zimbabwe Người, dơi ăn côntrùng

5 lập từ dơi ở châu ÂuLyssavirus 1 phân Châu Âu Người, chồn đá, cừu,dơi ăn côn trùng

6 lập từ dơi ở châu ÂuLyssavirus 2 phân Châu Âu Người, dơi ăn côntrùng

7 Lyssavirus phân lậptừ dơi ở Úc Úc Người, dơi ăn côntrùng, dơi ăn quả

8, 9, 10, 11 Khujand virus, IrkutAravian virus,

viru

và West caucasian bat virusCộng hoà Trung Á, Đức,

Tây Cáp-ca Dơi ăn côn trùng

Các phương pháp nghiên cứu dịch tễ học phân tử dựa trên trình tự gen N tuy đơn giản

và dễ thực hiện nhưng chúng không thể cung cấp một cái nhìn toàn cảnh về các biến đổitrên hệ gen của virus dại để từ đó đánh giá được tốc độ tiến hóa của các chủng virus dạitrong tự nhiên (Matsumoto et al., 2011) Do đó, các phương pháp giải trình tự toàn bộ hệgen của virus đã được đề xuất Ngoài ra, để xác định một loài lyssavirusmới ngày nay, cầnthiết phải có trình tự hệ gencủa chủng đó hoàn chỉnh (International Committee forTaxonomy of Viruses)

Có 2 cách tiếp cận để giải trình tự toàn bộ hệ gen virus dại Cách tiếp cận thứ nhất sửdụng các phản ứng RT-PCR để khuếch đại các vùng gen chồng lấp trên thể gen của virus.Sau đó, sản phẩm của các phản ứng khuếch đại này sẽ được giải trình tự bằng phương phápSanger Các kết quả giải trình tự này sẽ được lắp ghép để thu nhận trình tự hệ gen hoànchỉnh Nhược điểm của cách tiếp cận này là cần thiết kế mồi phù hợp cho mỗi kiểu gentrong quá trình giải trình tự Điều này sẽ kéo dài thời gian thu nhận kết quả.Cách tiếp cậnthứ hai sử dụng các công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới Do số lượng phiên bản RNAvirus thường thấp nên để thu nhận được trình tự toàn bộ hệ gen, cần thiết phải áp dụng các

kỹ thuật làm giàu như PCR, xử lý DNase để loại bỏ DNA vật chủ, lai loại bỏ rRNA… Sau

đó, RNA virus sẽ được chuyển hóa thành cDNA mạch kép, phân cắt thành các mảnh có kíchthước khoảng 500 đến 700bp nối với các adapter rồi khuếch đại bằng PCR.Sau khi tinhsạch các sản phẩm PCR và chuẩn hóa thư viện, các mẫu sẽ được giải trình tự trên hệ thốngIllumina Miseq Kết quả đầu ra là hỗn hợp trình tự của cả RNA virus lẫn RNA của vật chủ(chiếm phần lớn).Do vậy, việc ghép nối các trình tự thu được thành hệ gen hoàn chỉnhthường cần các phần mềm tin sinh học chuyên dụng Toàn bộ quy trình giải trình tự hệ gentheo cách tiếp cận mới này thường kéo dài trong khoảng 3 đến 4 ngày, rút ngắn đáng kể thờigian phân tích so với phương pháp giải trình tự gen thông thường Một ưu điểm khác là khảnăng giải trình tự multiplex giúp giảm đáng kể kinh phí Tuy nhiên, các phương pháp giảitrình tự gen thế hệ mới này cũng có hạn chế về mặt độ nhạy so với phương pháp giải trình

tự thông thường Để khắc phục hạn chế này, có thể sử dụng một lượng lớn mẫu bệnh phẩm

và tiến hành làm giàu virus dại ngay từ giai đoạn tách chiết

3.2 Ý nghĩa của các nghiên cứu dịch tễ học phân tử đối với việc phát triển vắc xin phòng dại

Các vắc xin phòng dại hiện nay thường chỉ có khả năng bảo vệ đối với các chủng virusthuộc kiểu gen 1 Do vậy, nhiều trường hợp tử vong do nhiễm kiểu gen 2 của lyssavirus (cónguồn gốc từ dơi) đã được ghi nhận trên khắp thế giới Một công bố của WHO năm 2016cho thấy đã có 1064 trường hợp mắc các chủng virus dại có nguồn gốc từ dơi ở 16 nướcchâu Âu Ở Mỹ, đã ghi nhận có 41 ca bệnh dại liên quan đến dơi (Dato et al., 2016).Ở TháiLan, đã ghi nhận một số ca bệnh dại có triệu chứng lâm sàng tương tự như các trường hợp

do dơi cắn Tuy được điều trị theo đúng quy trình tiêu chuẩn của WHO, các trường hợp nàyđều tử vong (Hemachudha et al., 1999; Khawplod et al., 2010) Đáng tiếc là nguồn gốc cácchủng virus dại ở các ca bệnh này đã không được xác định Từ đây có thể nhận thấy rằngcác kiểu gen lyssavirus từ dơi có nguy cơ trở thành tác nhân gây bệnh dại trong tương laigần Khi thử nghiệm công dụng bảo vệ trên mô hình chuột hamster của 2 loại vắc xinthương mại cho người và cho động vật đối với 4 kiểu gen virus dại mới phát hiện bao gồmARAV, KHUV, IRKV, và WCBV, Hanlon và đồng tác giả (2005) đã chỉ ra rằng khả năngbảo vệ của các loại vắc xin thương mại này là rất hạn chế trong nhiều trường hợp Ví dụ,việc tiêm phòng trước và sau phơi nhiễm là hoàn toàn không có tác dụng bảo vệ đối với kiểugen WCBV (Hanlon et al., 2005) Tương tự như vậy, Liu và đồng tác giả (2013) đã thửnghiệm tác dụng bảo vệ của các loại vắc xin đang lưu hành tại Trung Quốc đối với chủngIRKV được phân lập từ dơi ở Trung Quốc Kết quả thử nghiệm cho thấy rằng tiêm 1 liềuvắc xin trước phơi nhiễm không có tác dụng bảo vệ đối với chủng virus này Sử dụng chếphẩm vắc xin chứa glycoprotein G tái tổ hợp từ chủng IRKV cho hiệu quả bảo vệ cao hơn rõrệt so với vắc xin thông thường (Liu et al., 2013) Nhiều nghiên cứu cũng chỉ ra rằng cácvắc xin hiện nay chỉ có khả năng bảo vệ đối với các chủng lyssavirus thuộc phylogroup 1 vàkhông có khả năng bảo vệ đối với phylogroup 2 (Evans et al., 2012; Banyard et al., 2014).Một nghiên cứu khác ở Ethiopia chỉ ra rằng 1% các động vật mắc bệnh dại là do Mokolavirus thuộc phylogroup 2 (Mebatsion et al., 1992) Bên cạnh đó, cũng ghi nhận nhiều ca tửvong ở người dù tiêm vắc xin và kháng huyết thanh sau phơi nhiễm đúng theo quy trình(Tinsa et al., 2015) Các kết quả này cho thấy các loại vắc xin thương mại hiện nay không

có tác dụng bảo vệ hoàn toàn khỏi các chủng lyssavirus đang lưu hành tại nhiều khu vựctrên thế giới Do vậy, việc xác định các kiểu gen lyssavirus trong quần thể người và vật chủtrung gian là hết sức cần thiết để lựa chọn được chủng virus sản xuất vắc xin phù hợp

4 THỰC TRẠNG SẢN XUẤT VÀ CUNG ỨNG VẮC XIN DẠI

4.1 Thực trạng sản xuất và cung ứng vắc xin dại trên thế giới

* Các chủng virus được sử dụng cho sản xuất vắcxin

Nguồn gốc của các chủng virút dại cố định chính được sử dụng để sản xuất vắcxinđược trình bày trong sơ đồ dưới đây

Hai chủng Pitman-Moore (PM) và PV (Pasteur virus) được WHO khuyến cáo dùngtrong sản xuất vắcxin phòng dại cho người (Sarice et al., 2015; WHO) Ngoài ra, WHOcũng khuyến cáo chỉ sử dụng một chủng virus duy nhất trong sản xuất vắcxin dại, tuy nhiên,việc sử dụng kết hợp ba chủng virus được áp dụng bởi một số nhà sản xuất ở khu vực Mỹlatinh (Andral và Blancou, 1982) Chủng PV được phân lập từ bò dại tại Paris vào năm

1882 Thông qua việc cấy chuyển liên tục qua nhiều thế hệ (trên não thỏ), chủng virus nàytrở nên thích ứng với vật chủ mới và mất dần khả năng gây bệnh ban đầu (Wu et al., 2011).Chủng PV cũng đã được giải trình tự toàn bộ hệ gen (GenBank accession number:

M13215) Chủng PM được cho là có cùng nguồn gốc với chủng PV nhưng đượcthích ứng với vật chủ khác (2061 lần cấy chuyển ở não thỏ, 19 lần cấy chuyển ở dòng tế bàoVero và 5 lần cấy chuyển ở dòng tế bào BSR) (Sacramento et al., 1992) Chủng PM đượcphát triển bởi các nhà khoa học tại Viện nghiên cứu Wistar vào những năm 1960, 1970, và

đã được áp dụng rộng rãi trên thế giới để sản xuất vắcxin điều trị sau phơi nhiễm Các hạtvirus PM có thể được thu hoạch từ tế bào lưỡng bội người (được nhiễm chủ động), làm giàu

Nuôi cấy

tế bào Vero

Mỹ (Georgia) 1939

Nuôi cấy

tế bào Vero

Mỹ (Alabama) 1935

Nuôi cấy tế bào thận chuột đất vàng

Phôi gà

Não gà

Dại ở chó Dại ở người

và bất hoạt để sản xuất vắcxin Nếu được bảo quản đúng cách, vắcxin loại này có hoạt tínhtrong vòng 3,5 năm Theo sự hiểu biết của chúng tôi, cho đến thời điểm tháng 3 năm 2019,trình tự hệ gen của chủng PM chưa được công bố.

Các thử nghiệm trên chuột cho thấy chủng virus dùng trong sản xuất vắcxin quyết địnhkhả năng bảo vệ đối với các chủng dại không thuộc kiểu gen 1 Các kết quả cho thấy vắcxinsản xuất từ chủng PM và LEP thường tạo miễn dịch đối với virus dại kiểu gen 1 yếu hơn sovới vắcxin sản xuất từ chủng PV Chỉ 73% bệnh nhân sản sinh được kháng thể bảo vệ saukhi được tiêm phòng với chủng vắcxin sản xuất từ chủng PM (Rupprecht and Gibbons,2004; Hanlon et al., 2005; Wilde and Hemachudha, 2006)

* Các vắcxin thế hệ thứ nhất

Các vắcxin thế hệ thứ nhất đều sử dụng mô động vật để có được hỗn dịch chứa virút Các vắcxin này đều đã được sử dụng rộng rãi cho cả người và động vật Các loại vắcxin chủ yếu thuộc thế hệ thứ nhất được sử dụng cho người và thú y bao gồm:

Mô được sử dụng Chủng virút Loại vắcxin Phương pháp bất hoạt Sử dụng cho người Dạng vắcxin

Mô thần kinh: Cừu, dê Pasteur Bất hoạt Phenol (1 ngày) Có Dung dịch

Mô thần kinh: Thỏ, cừu, dê Past ur

Bất hoạt

Phenol, 30 0 C Có Dung dịch

Mô thần kinh: Cừu Pasteur Bất hoạt Ether-Phenol Có Dung dịch

Mô thần kinh: Cừu Pasteur Bất hoạt Phenol (14 ngày) Có Đông khô

Mô thần kinh: Cừu PV11 Bất hoạt -propiolactone Có Đông khô Não chuột nhắt chưa dứt sữa CVS, 51, 91 Bất hoạt Tia cực tím Có Dung dịch Não thỏ chưa dứt sữa PV Bất hoạt Tia cực tím Có Đông khô Não chuột chưa dứt sữa PV Bất hoạt Phenol (14 ngày) Có Đông khô

sử dụng cho chó)

Đông khô

sử dụng cho chó)

Đông khô

dụng cho gia súc, mèo)

Đông khô

Dựa trên các loại mô được sử dụng để sản xuất khác nhau, các vắcxin thế hệ thứ nhất

có thể được xếp loại theo:

Vắcxin sản xuất từ mô thần kinh động vật trưởng thành

Các vắcxin này có rất nhiều các nhược điểm như:

- Còn virút sống tồn dư: các vắcxin như vắcxin Fermi thường có chứa virút sống do

chưa được bất hoạt hoàn toàn bởi phenol nên được coi như là vắcxin hỗn hợp có cả virútsống tồn dư và virút đã bất hoạt, do vậy vắcxin này nguy hiểm khi sử dụng.

- Phản ứng não tủy sau khi tiêm vắcxin: một số vắcxin thuộc nhóm này như vắcxinSemple và vắcxin Hempt tuy đã được bất hoạt hoàn toàn và đáp ứng được yêu cầu về mặtcông hiệu nhưng những phản ứng não tủy nghiêm trọng do tiêm vắcxin vẫn xảy ra tronghoặc sau khi tiêm phòng Phản ứng do yếu tố gây phản ứng trong não (một protein cơ bảnliên quan đến myelin) tăng cao khi sử dụng các mô thần kinh động vật trưởng thành Nhữngphản ứng này là các tai biến liệt thần kinh từ liệt nhẹ thoáng qua đến các thương tổn thầnkinh vĩnh viễn và thậm chí là tử vong

- Hàm lượng kháng nguyên cho một liều tiêm thấp: đặc tính này đòi hỏi phải có mộtliệu trình điều trị kéo dài với một số lượng lớn các mũi tiêm Các vắcxin này thường đượcđóng dưới dạng dung dịch nên có tính ổn định thấp chỉ trong vòng gần 6 tháng

Vắcxin sản xuất trên trứng có phôi

Thích ứng các chủng vắcxin dại trên trứng có phôi (chủng Pitman Moore) đã phát triểnđược các vắcxin dại sử dụng cho người an toàn hơn, giảm thiểu các phản ứng não tủy sautiêm vắcxin Tỷ lệ có các phản ứng thần kinh thấp hơn (dưới 3/100.000 mũi tiêm) ở cácvắcxin dùng cho người được sản xuất trên phôi vịt so với các vắcxin được sản xuất trên môthần kinh Tuy nhiên các phản ứng tại chỗ lại rất hay gặp như có đến 70% gặp ở các liệutrình tiêm vắcxin dự phòng và 100% ở các liệu trình tiêm điều trị với 14 liều tiêm Tính sinhmiễn dịch của loại vắcxin này cần được xem xét thêm do trong một số trường hợp lượngkháng thể đạt được rất thấp Các chủng virút cố định Flury và Kelev đã thích ứng trên phôi

gà được cấy chuyển nhiều đời (180 đối với Flury và 70 đối với Kelev) tạo ra các chủng virútgiảm độc lực Các vắcxin sản xuất với các chủng giảm độc lực trên phôi gà đã được sử dụngcho chó, mèo và bò

Trứng có phôi sử dụng trong sản xuất vắcxin đòi hỏi một chất lượng rất cao, phải đảmbảo loại trừ được tất cả virút ngoại lai (bệnh đốm trắng ở gia cầm) và vi khuẩn (Salmonella)

Vắcxin sản xuất từ não động vật chưa dứt sữa

Yếu tố gây phản ứng trong não là nguyên nhân của các tai biến thần kinh sau tiêmvắcxin có trong mô thần kinh động vật trưởng thành nhưng có không đáng kể hoặc không có

ở trong các mô thần kinh của một số động vật chưa dứt sữa Thêm vào đó, một lượng lớnhơn virút có được khi nhân nuôi trên các mô thần kinh của động vật sơ sinh, do đó vắcxindại đã được phát triển trên những động vật này Vắcxin đầu tiên thuộc loại này được pháttriển bởi Fuenzalida và Palacios trên não chuột ổ với việc sử dụng 3 chủng virút dại cố định(CVS, 51 và 91) Dù đã có những cải tiến bằng cách nhân nuôi virút trên não các động vật

sơ sinh trước khi myelin phát triển, các vắcxin bất hoạt sản xuất trên não động vật chưa dứtsữa vẫn có thể có các phản ứng thần kinh không mong muốn Khoảng 0,3 - 0,8 trên 1.000 cáthể được tiêm vắcxin có biểu hiện viêm não tủy nặng do trong vắcxin vẫn tồn dư cácprotein thần kinh Thêm vào đó, các vắcxin trên mô thần kinh có hiệu lực thấp hơn so vớivắcxin trên nuôi cấy tế bào nên đòi hỏi một liệu trình tiêm phòng dài hơn Trong những nămgần đây, Ấn Độ và Nepal đã dần thành công trong việc ngừng sản xuất và sử dụng vắcxintrên mô thần kinh Tuy nhiên, với giá thành rẻ và điều kiện kinh tế còn khó khăn, vắcxintrên mô thần kinh hiện vẫn được sử dụng tại một số nước chủ yếu là tại vùng Đông Namchâu Á

Hiện nay các vắcxin trên nuôi cấy tế bào được chia thành 3 nhóm chính tùy thuộc vào

hệ thống tế bào được sử dụng trong sản xuất:

- Nhóm 1: Nhóm này gồm các vắcxin sử dụng các dòng tế bào động vật có vú nguyênphát như thận chuột đất vàng, thận chó, thận bê bào thai hoặc các nuôi cấy tế bào của giacầm như phôi gà, phôi chim cút dựa theo phương pháp của Kissling

- Nhóm 2: Nhóm này gồm các vắcxin được sản xuất trên các dòng tế bào lưỡng bội chủyếu có nguồn gốc từ người (W138, MRC5) và một số có nguồn gốc động vật như bào thai

WI 38 PM 1503 Siêu ly tâm TNBP/tween-80 - 0, 7, 21, 28 0, 3, 7, 14, 30, 90 MRC-5 PM 1503 Siêu ly tâm -pr piolact

one -

0, 28 0, 3, 7, 14, 30, 90

MRC-5 PM 1503 Ly tâm phân

vùng -propiolactone - 0, 30, 60 0, 3, 7, 14, 30, 90MRC-5 SAD-60 Siêu ly tâm -propiolactone - Thử nghiệm Thử nghiệm VERO PM 1503 Siêu ly tâm -

Ly tâm phân vùng

-propiolactone - 0, 7, 28 0, 3, 7, 14, 30, 90

HKC

Vnukovo-32 Ly tâm Tia cực tím - 0, 3, 7, 28 0, 3, 7, 14, 30, 90HKC Beijing-31 Ly tâm Formol/Phenol Al(OH)

PCEC Flury HEP Siêu ly tâm -

Ly tâm -propiolactone hoặc tia cực tím - 0, 28, 180 0, 2, 4, 6, 8, 14, 28PCEC Flury LEP Siêu ly tâm - Ly tâm

-propiolactone

- 0, 28, 180 0, 2, 4, 6, 8, 14, 28

HKC: Tế bào thận chuột đất vàng nguyên phát; DKC: Tế bào thận chó nguyên phát; FBKC:

Tế bào thận bào thai bê nguyên phát; PCEC: Tế bào phôi gà nguyên phát; TNBP: phosphate.

Tri(n)-butyl-Các bước chính của quy trình sản xuất vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào bao gồm:

- Nhân nuôi tế bào: Chai nuôi cấy tế bào một lớp hoặc hệ thống lăn chai (roller bottle)

là một trong những giải pháp được sử dụng để nhân nuôi tế bào Để tăng hiệu suất và mởrộng quy mô sản xuất, các chai khuấy (spinner flask) hoặc hệ thống nuôi cấy sinh khối(bioreactor) được sử dụng Các tiểu giá thể (microcarrier) trong hệ thống nuôi cấy sinh khối

là một giải pháp tiên tiến cho phép tăng diện tích bề mặt bám dính của tế bào từ đó làm tăng

số lượng tế bào lên nhiều lần Đánh giá chính xác các chỉ số động học thông qua lượng cácchất dinh dưỡng được tiêu thụ và lượng các chất gây độc sản sinh ra do quá trình chuyểnhóa sẽ cho phép tìm ra các giải pháp làm tăng số lượng tế bào lên đến mức cần thiết để tạo

ra một lượng kháng nguyên virút tối ưu

- Gây nhiễm và nhân nuôi virút: Gây nhiễm virút vào tế bào được tiến hành đối với hỗn

dịch tế bào hoặc trên tế bào đã được nuôi cấy một lớp Để đạt được hiệu suất virút cao nhất

cần lưu ý một số yếu tố liên quan đến việc kết hợp giữa tế bào và virút như nhiệt độ nuôicấy, liều lượng virút gây nhiễm, thời gian và số lần thu hoạch Mối tương quan giữa mật độ

tế bào và nồng độ kháng nguyên đạt được sau khi gây nhiễm là một vấn đề rất phức tạp Vềmặt lý thuyết, khi điều kiện gây nhiễm đã được tối ưu, số lượng tế bào càng nhiều thì lượngvirút được sản xuất ra càng cao Tuy nhiên, điều này không hoàn toàn đúng trong mọitrường hợp do tính không đồng nhất về tình trạng chuyển hóa đối với tất cả các tế bào

- Cô đặc và tinh khiết: Đối với các vắcxin sản xuất trên nuôi cấy tế bào, cô đặc và tính

khiết kháng nguyên virút là những quy trình thường xuyên được tiến hành Một vài phươngpháp hiện được nhiều nhà sản xuất sử dụng là siêu ly tâm, ly tâm phân vùng và sắc ký lỏng

Ở quy mô sản xuất lớn, các kỹ thuật thường được áp dụng là siêu ly tâm và ly tâm tronggradient tỷ trọng

- Bất hoạt virút: Quy trình bất hoạt là bắt buộc đối với các vắcxin sử dụng cho người.

Nếu bất hoạt bằng các chất hóa học thì nhiệt độ và thời gian bất hoạt cần được xác định đốivới mỗi loại vắcxin Một trong những chất được sử dụng có hiệu quả đối với vắcxin trênnuôi cấy tế bào là -propiolactone do bất hoạt tốt virút dại và giảm lượng ADN tồn dư từ tếbào Nhược điểm của phương pháp này là giá thành còn cao và khá độc trước khi được xử lýnhiệt Tia cực tím cũng được sử dụng để bất hoạt virút Trong trường hợp này liều lượng vàthời gian chiếu nên được xem xét kỹ để toàn bộ virút đều được bất hoạt mà không làm giảm

đi lượng kháng nguyên

- Ổn định và đông khô: Phần lớn các vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào được giữ ở dạng

đông khô để có được tính ổn định cao Do vậy, thời hạn sử dụng của vắcxin dạng này kéodài hơn nhiều so với vắcxin được giữ ở dạng dung dịch

Vắcxin sử dụng cho người thường được tiêm với mục đích điều trị sau khi đã phơinhiễm với virút dại (5 liều tiêm hoặc nhiều hơn tùy thuộc vào loại vắcxin) hoặc là dự phòng

do đó các vắcxin này phải đáp ứng được các yêu cầu nghiêm ngặt trong phát triển sản phẩmnhư:

- Virút phải được bất hoạt hoàn toàn

- Các dòng tế bào lưỡng bội hoặc thường trực được sử dụng để nhân nuôi virút khôngđược có các chất gây ung thư hoặc bị chuyển dạng Do vậy, các dòng tế bào sử dụng trongsản xuất và hàm lượng ADN trong một liều tiêm cho người phải đáp ứng được yêu cầu của

Tổ chức Y tế thế giới, AND tồn dư <10ng/liều đối với các vắcxin sản xuất trên nuôi cấy tếbào dùng để tiêm cho người

Đáp ứng miễn dịch và hiệu lực của vắcxin trên nuôi cấy tế bào đã được chứng minh trênđộng vật thí nghiệm và thực địa lâm sàng trên người Ở cả phương pháp tiêm phòng trước

và sau khi bị cắn, các vắcxin này đều tạo được đáp ứng kháng thể ở trên 99% người đượctiêm Sử dụng các vắcxin thế hệ mới kết hợp với xử lý vết cắn đúng cách và tiêm phòngglobulin miễn dịch kháng dại đã tạo ra hiệu quả phòng bệnh dại là 100% thậm chí cả vớinhững trường hợp bị cắn có nguy cơ mắc bệnh cao Tuy nhiên, việc tiêm phòng muộn hoặckhông tiêm phòng đủ mũi đặc biệt với các tổn thương ở đầu, cổ, tay hoặc đa vết cắn có thểvẫn bị tử vong do mắc bệnh dại.

Các vắcxin trên nuôi cấy tế bào hiện đại được xem là an toàn cho dù tỷ lệ phản ứngđược báo cáo sau khi tiêm liều ban đầu thay đổi tùy theo hệ thống giám sát Sau khi tiêmbắp với vắcxin trên tế bào lưỡng bội ở người, các phản ứng nhẹ và tự khỏi tại chỗ như đautại chỗ tiêm, đỏ hoặc sưng chiếm 21-74% các trường hợp được tiêm Các phản ứng toànthân nhẹ như sốt, đau đầu, chóng mặt và các biểu hiện tiêu hóa chiếm 5-40% các trường hợpđược tiêm và các phản ứng quá mẫn toàn thân sau khi tiêm liều nhắc lại chiếm 6% cáctrường hợp được tiêm Sau khi bổ xung thêm các bước tinh khiết, các phản ứng quá mẫntoàn thân đã giảm đi nhiều Với các vắcxin trên nuôi cấy tế bào phôi gà và tế bào Vero, tỷ lệ

có các phản ứng tại chỗ và phản ứng toàn thân nhẹ tương tự như với vắcxin trên tế bàolưỡng bội người, nhưng không ghi nhận các trường hợp có phản ứng quá mẫn toàn thân

Xu hướng phát triển các vắcxin dại mới hiện nay là tìm kiếm các công nghệ có giáthành rẻ nhưng vẫn có hiệu quả tốt Một trong những xu hướng được nhiều nhà sản xuất ápdụng là tiến hành nuôi cấy virút trên hệ thống nuôi cấy sinh khối với các tiểu giá thể nuôicấy tế bào và sử dụng các môi trường không chứa huyết thanh (serum-free medium) Môitrường không chứa huyết thanh đã hạn chế được các nhược điểm của các môi trường cóhuyết thanh như dễ gây ra các phản ứng quá mẫn ở người được tiêm, không có tính đồngnhất giữa các mẻ huyết thanh, dễ bị nhiễm bởi các tác nhân vi sinh vật (vi khuẩn, nấm,mycoplasma, virút ở động vật…) và giá thành cao hơn Bên cạnh đó, một số xu hướng ápdụng các công nghệ sinh học tiên tiến như phát triển vắcxin tái tổ hợp của protein G, vắcxinADN cũng đã được nghiên cứu, tuy nhiên hiện các nghiên cứu này chỉ được tiến hành vớimục đích phát triển các vắcxin sử dụng cho động vật chứ không phải là các vắcxin để sửdụng cho người

Một trong những yếu tố quan trọng nhất trong việc kiểm soát một cách hiệu quả bệnhdại ở người là sử dụng các vắcxin có hiệu quả phòng bệnh cao Virút dại là một trong nhữngcăn nguyên truyền nhiễm gây bệnh ở người đầu tiên có thể kiểm soát được bằng vắcxin.Vắcxin sản xuất trên mô thần kinh động vật đã được sử dụng trên 100 năm nay Tuy nhiên,với việc cho ra đời và sử dụng vắcxin trên nuôi cấy tế bào đã làm giảm đáng kể số cáctrường hợp tử vong ở người trên toàn thế giới mà phần lớn là tại các nước mà bệnh dại trên

chó vẫn còn lưu hành phổ biến Một ví dụ điển hình nhất là tại Thái Lan, việc triển khai tiêmphòng vắcxin trên nuôi cấy tế bào cùng với việc giảm liều lượng tiêm bằng liệu trình tiêmtrong da đã làm cho tỷ lệ mắc dại mới ở người giảm đến 80% trong vòng 15 năm Các kếtquả tương tự cũng được báo cáo tại nhiều nước khác khi vắcxin trên mô thần kinh được thaythế bằng vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Do vậy việc nghiên cứu, phát triển, sản xuất và tiếntới đưa ra sử dụng rộng rãi vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào là cần thiết, các nước cần sớm cócác chiến lược để sử dụng và triển khai rộng khắp để tiêm phòng loại vắcxin tiên tiến và cóhiệu quả cao này.

4.2 Thực trạng sản xuất và cung ứng vắc xin dại tại Việt Nam

Ở Việt Nam, trước năm 1974, vắcxin phòng bệnh dại cho người chủ yếu là vắcxin sảnxuất từ não cừu, dê (Fermi, Semple) Các vắcxin này có chứa một lượng virút chưa bất hoạt

và tính sinh miễn dịch thấp nên phải tiêm nhiều mũi (18-21 mũi) cùng với liều tiêm lớn(1,5-2,5 ml/mũi) Do vậy khi tiêm vắcxin dại không chỉ đưa vào 1 lượng kháng nguyên cầnthiết mà còn đưa cả protein - myelin vào cơ thể Đây chính là nguyên nhân gây ra các taibiến viêm não tủy có thể dẫn tới liệt và tử vong

Từ năm 1974, Viện Vệ sinh dịch tễ học Hà Nội đã nghiên cứu sản xuất vắcxin dại trênnão chuột ổ theo phương pháp của Fuenzalida-Palacios được chuyển giao kỹ thuật từ ViệnPasteur Paris (Pháp) Sau khi đất nước thống nhất, nhằm đáp ứng kịp thời nhu cầu của nhândân, việc sản xuất vắcxin dại đã được triển khai tại cả Viện Vắcxin Nha Trang và ViệnPasteur Thành phố Hồ Chí Minh Chủng giống sản xuất là chủng VP-13 (Pasteur Virút) do

cơ quan kiểm định quốc gia cung cấp Chủng sản xuất được gây nhiễm trên não chuột nhắttrắng 1-4 ngày tuổi, bất hoạt bằng -propiolactone, chất bảo quản bằng merthiolate Ưuđiểm chính của vắcxin này là không chứa hoặc chứa rất ít myelin của não nên ít gây các taibiến thần kinh hơn Hiệu giá virút thu hoạch từ não chuột ổ cao hơn do đó tính sinh miễndịch tốt hơn do vậy số liều tiêm giảm còn từ 6-8 mũi tiêm Việc sử dụng vắcxin dại trên nãochuột ổ trong hơn 30 năm qua đã góp phần hạn chế nguy cơ tử vong do bệnh dại Hàng năm,

có từ 3,5 đến 4 triệu liều vắcxin Fuenzalida được sản xuất và 150.000 liều vắcxin Verorabđược nhập để tiêm phòng cho người Theo kết quả nghiên cứu về nguyên nhân tử vong, tácgiả Đinh Kim Xuyến, Trần Văn Tiến cho thấy 87-90% số trường hợp tử vong là do khôngđược điều trị bằng vắcxin và huyết thanh kháng dại sau khi bị súc vật dại cắn; tuy nhiên 10-13% trường hợp tử vong được ghi nhận ở các bệnh nhân đã được tiêm phòng vắcxinFuenzalida đầy đủ, nguyên nhân có thể là do vết cắn quá nặng và đi tiêm muộn Theo tác giảHoàng Minh Hiền, 78% người được tiêm có các phản ứng phụ như sưng đỏ, ngứa tại chỗtiêm, mệt mỏi, nhức đầu Kết quả báo cáo từ các Trung tâm Y tế Dự phòng trên cả nước

cũng cho thấy trên 80% các trường hợp có các phản ứng không mong muốn sau khi tiêmvắcxin Fuenzalida, các phản ứng không mong muốn nghiêm trọng như viêm não tủy gây liệtvĩnh viễn và tử vong gặp với tỷ lệ 1-2 trường hợp/10.000 mũi tiêm Do các phản ứng khôngmong muốn nghiêm trọng này, nên từ năm 2007, Bộ Y tế đã ra quyết định ngừng việc sửdụng vắcxin dại Fuenzalida trên toàn quốc Do tỷ lệ bệnh nhân được tiêm phòng bằngvắcxin trên nuôi cấy tế bào được nhập ngoại trước đây chỉ chiếm 15% số người được tiêmvắcxin dại và giá thành cho một liệu trình tiêm loại vắcxin này rất đắt (gần 800.000 đồng)nên cơ hội để các bệnh nhân nghèo, vùng sâu, vùng xa được tiêm loại vắcxin này là rất ít.Điều này phần nào lý giải tại sao số ca tử vong do bệnh dại đã tăng lên trong năm 2007 Từnăm 2004, Việt Nam cũng đã bắt đầu áp dụng phác đồ tiêm trong da đối với vắcxin Verorab

- một vắcxin trên nuôi cấy tế bào nhập ngoại được dùng phổ biến tại Việt Nam để làm giảmbớt chi phí cho tiêm phòng vắcxin dại Theo phác đồ này giá thành của liệu trình đã giảmxuống khoảng 300.000 đồng cho 8 mũi tiêm, tuy nhiên vấn đề kỹ thuật tiêm và chi phí vẫn

là một thách thức đối với các vùng kinh tế còn kém phát triển

Đứng trước yêu cầu cần sớm có được vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào được sản xuấttrong nước nhằm làm giảm chi phí tiêm phòng cho bệnh nhân, để nhiều người có cơ hộiđược tiêm phòng vắcxin dại từ đó giảm tỷ lệ tử vong do bệnh dại, nhiều cơ quan nghiên cứutại Việt Nam đã tiến hành các nghiên cứu phát triển vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Viện Vệsinh dịch tễ Trung ương đã có những thành công bước đầu trong việc nghiên cứu vắcxin dạitrên nuôi cấy tế bào thận chuột đất vàng nguyên phát Chủng Vnukovo-32 dùng trong sảnxuất và công nghệ được tiếp thu từ Liên bang Nga Tuy nhiên, hạn chế của công nghệ này lànguồn cung cấp động vật (chuột đất vàng) có chất lượng và số lượng đảm bảo cho sản xuấtvắcxin Do vậy, việc phát triển vắcxin theo công nghệ này hiện chưa được triển khai trênquy mô lớn hơn để có được sản phẩm hoàn chỉnh Để khắc phục hạn chế về nguồn tế bàonguyên phát cho sản xuất vắcxin, các nghiên cứu sử dụng dòng tế bào thường trực mà đặcbiệt là tế bào Vero đã được các nhà khoa học đề cập đến Cũng từ chủng Vnukovo-32, Viện

Vệ sinh Dịch tễ Trung ương đã gây thích ứng trên dòng tế bào Vero với mong muốn cóđược chủng virút đạt được yêu cầu để sử dụng trong sản xuất vắcxin dại Hiện nghiên cứunày đang tiếp tục được tiến hành tại Viện Vệ sinh Dịch tễ trung ương

Sử dụng chính dòng tế bào Vero, nhóm nghiên cứu trong đề tài này của Công tyVắcxin và sinh phẩm số 1 (VABIOTECH) đã tiến hành các đề tài nghiên cứu cấp cơ sở từnăm 2005 để lựa chọn chủng virút, điều kiện nuôi cấy và quy trình sản xuất phù hợp.Nghiên cứu đầu tiên là nghiên cứu lựa chọn chủng có khả năng tạo được hiệu giá virút caonhất trong số hai chủng virút dại cố định nhận được từ Trung tâm Kiểm soát bệnh tật và Dự

phòng Hoa kỳ (CDC) đều đã thích ứng trên dòng tế bào Vero - Pasteur virút-PV và Moore Cùng một điều kiện là được gây nhiễm vào tế bào Vero loạt gốc của TCYTTG vàduy trì nhân nuôi virút trong môi trường tối ưu - MEM có chứa 0,3% albumin huyết thanhngười, chủng PV luôn cho hiệu giá virút cao trong tất cả các mẻ gặt đơn từ ngày nuôi cấythứ 6 đến ngày nuôi cấy thứ 21 (từ 10-6 LD50/ml đến 10-7 LD50/ml) so với chủng PM (chỉ từ

Pitman-<10-4,5 LD50/ml cho tới 10-6 LD50/ml) Từ kết quả này, chủng PV được lựa chọn là chủng đểtiếp tục nghiên cứu và phát triển vắcxin tại Việt Nam do có hiệu giá virút cao kéo dài, duytrì được nhiều mẻ gặt đơn đáp ứng được yêu cầu về hiệu giá virút và thể tích đầu vào choquá trình sản xuất vắcxin Từ chủng virút PV được lựa chọn, nhóm nghiên cứu đã xây dựng

hệ thống chủng virút dại giống gốc (Master seed virus-MSV) và chủng virút dại giống sảnxuất (Working seed virus-WSV) đủ để nghiên cứu và sản xuất vắcxin dại trong vòng nhiềunăm tiếp theo tại VABIOTECH Toàn bộ quá trình nhân chủng và chuẩn độ hiệu giá củachủng virút đều được thực hiện và ghi chép lại thành hồ sơ chủng theo đúng khuyến cáo củaTCYTTG cho vắcxin dại bất hoạt sử dụng cho người được sản xuất trên nuôi cấy tế bào

(Recommendations for inactivated rabies vaccine for human use produced in cell substrates and embryonated eggs WHO Expert Committee on Biological Standardization, 2005, Annex 2) (Xem hồ sơ sản xuất chủng virút dại cố định PV được đính kèm trong phần phụ lục các văn bản khác) Đồng thời, dòng tế bào Vero loạt gốc của TCYTTG cũng được nhóm nghiên

cứu nhân nuôi và xây dựng thành ngân hàng tế bào Vero sản xuất của VABIOTECH(Working cell bank - WCB) - Tế bào giống gốc của TCYTTG đời 134 được nhân nuôi vàtiếp tục cấy chuyển đến đời 137, sau đó được đóng ống và bảo quản trong dung dịch bảoquản tế bào Các ống tế bào được làm đông băng và bảo quản trong nitrogen lỏng Toàn bộquá trình nhân nuôi tế bào và pha các môi trường để nhân nuôi cũng như bảo quản tế bàođều được ghi chép lại để xây dựng thành hồ sơ tế bào Vero sản xuất theo đúng quy định củaTCYTTG về việc sử dụng các tế bào động vật cho sản xuất các sản phẩm sinh học

(Requirement for the use of animal cells as in vitro substrates for the production of biologicals WHO Expert Committee on Biological Standardization, 1998, Annex 1, WHO Technical Report Series, No 878) và khuyến cáo của TCYTTG cho vắcxin dại bất hoạt sử dụng cho người được sản xuất trên nuôi cấy tế bào (Recommendations for inactivated rabies vaccine for human use produced in cell substrates and embryonated eggs WHO Expert Committee on Biological Standardization, 2005, Annex 2) (Xem hồ sơ xây dựng ngân hàng

tế bào Vero sản xuất được đính kèm trong phần phụ lục các văn bản khác).

Nghiên cứu tiếp theo được tiến hành là lựa chọn môi trường nhân nuôi virút tối ưunhất trong số các môi trường dinh dưỡng được chấp nhận cho sản xuất vắcxin Kết quả

nghiên cứu đã cho thấy hiệu giá virút dại của toàn bộ các mẻ gặt đơn sau khi thu hoạch đốivới từng môi trường nuôi cấy lần lượt là 10-6 LD50/ml cho môi trường chứa albumin huyếtthanh người, 10-6,33 LD50/ml cho môi trường không chứa huyết thanh của VABIOTECH, 10- 5,34 LD50/ml cho môi trường MEM không chứa huyết thanh, 10-5,66 LD50/ml cho môi trườngkhông chứa huyết thanh SFM của Gibco và <10-3 LD50/ml cho môi trường M199 khôngchứa huyết thanh Với hiệu giá virút cao, môi trường không chứa huyết thanh củaVABIOTECH được lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu sản xuất vắcxin Đặc biệt môi trườngnày sẽ có giá thành thấp hơn, dễ tinh khiết virút hơn và hạn chế được các nguy cơ lây nhiễmbởi các tác nhân vi sinh vật so với các môi trường dinh dưỡng có chứa huyết thanh

Sau khi có được tế bào Vero, chủng virút PV và môi trường nuôi cấy không huyếtthanh đạt các yêu cầu cho sản xuất, nhóm nghiên cứu đã bước đầu xây dựng quy trình côngnghệ sản xuất vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào ở quy mô phòng thí nghiệm Quá trình nhânnuôi virút được tiến hành trong chai nuôi cấy tế bào một lớp để thu hoạch được hỗn dịchvirút có hiệu giá đạt yêu cầu cho các quá trình sản xuất tiếp theo Hỗn dịch virút sau khi thuhoạch đã được thử nghiệm tinh khiết theo các phương pháp khác nhau (sắc ký cột, siêu lytâm) và phương pháp siêu ly tâm gradient đã được lựa chọn Kỹ thuật siêu ly tâm trongđường đã tinh chế được các hạt virút và sản phẩm này tạo được đáp ứng miễn dịch hiệu quảtrên chuột (công hiệu của bán thành phẩm sau khi tinh chế có công hiệu đạt tới 20 IU/ml).Đồng thời, phương pháp này tận dụng được các hệ thống máy siêu ly tâm sẵn có củaVabiotech đã từng được sử dụng thành công trong sản xuất các vắcxin virút khác như vắcxinviêm gan B, vắcxin viêm não Nhật Bản B Đây cũng là một phương pháp tinh chế phù hợp

hy vọng sẽ làm giảm giá thành của vắcxin trong tương lai

Quy trình công nghệ sản xuất vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero cần được tiếp tụcnghiên cứu về tính ổn định các thông số và hiệu suất của từng bước của quy trình sản xuấtnày Đồng thời, sau khi có được quy trình công nghệ ổn định, sản phẩm của quá trình sảnxuất thử nghiệm phải đạt được chất lượng theo yêu cầu của TCYTTG và tương đương vớicác vắcxin nhập ngoại như vắcxin Verorab

15.2 Luận giải về việc đặt ra mục tiêu và những nội dung cần nghiên cứu của đề tài

Theo Tổ chức Y tế Thế giới (TCYTTG), hàng năm có khoảng 50.000 ca tử vong dobệnh dại và hơn 10 triệu người bị súc vật nghi dại cắn hoặc do tiếp xúc với nguồn truyềnbệnh dại phải điều trị dự phòng bằng huyết thanh/vắc xin (VX) dại Bệnh dại lưu hành ở 70nước trên thế giới, nhưng tập trung chủ yếu ở các nước đang phát triển thuộc khu vực châu

Á, Đông Nam Á và châu Phi (70-80%) Điều đáng phải quan tâm là từ năm 2004 đến nay,hầu hết các nước thuộc khu vực châu Á, Đông Nam Á, bệnh dại đã tăng lên đột biến cả về

số lượng và vùng địa lý Diễn biến của bệnh có nhiều bất thường như: bệnh tăng nhanh trênnhiều địa dư, tăng nhiều ở các tỉnh miền núi; hình ảnh lâm sàng bệnh dại trên súc vật và trênngười, thời gian xuất hiện bệnh có nhiều điểm khác trước v.v

Các căn cứ đề xuất nghiên cứu “Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học bệnh dại và dịch tễ học phân tử vi rút dại - đề xuất chủng vi rút dại để sản xuất vắc xin”, gồm:

1 Căn cứ pháp lý

- Luật bảo vệ sức khoẻ nhân dân ban hành ngày 30 tháng 06 năm 1989

+ Nghiêm cấm việc thả rông chó ở thành phố, thị xã và thị trấn; chó nuôi phải đượctiêm phòng theo quy định của cơ quan thú y (khoản 2 Điều 11)

- Luật Phòng, chống bệnh truyền nhiễm số 03/2007/QH12 ban hành ngày 21/11/2007.+ Bệnh Dại thuộc Nhóm B gồm các bệnh truyền nhiễm nguy hiểm có khả năng lâytruyền nhanh và có thể gây tử vong (điểm b, khoản 1 Điều 3) - Luật thú y số 79/2015/QH13ngày 19/6/2015 quy định:

+ Trong từng thời kỳ, Nhà nước có chính sách cụ thể đầu tư, hỗ trợ kinh phí cho cáchoạt động kiểm soát, khống chế, thanh toán các bệnh truyền nhiễm nguy hiểm của độngvật, các bệnh truyền lây giữa động vật và người (điểm c khoản 1 Điều 5);

+ Khoản 1 Điều 18 của quy định “Việc khống chế, thanh toán một số bệnh truyềnnhiễm nguy hiểm ở động vật, bệnh truyền lây giữa động vật và người phải được xâydựng thành chương trình, kế hoạch trong từng thời kỳ”

+ Điểm a khoản 4 Điều 18 quy định Bộ trưởng Bộ Nông nghiệp và PTNT có tráchnhiệm xây dựng chương trình, kế hoạch khống chế, thanh toán một số bệnh truyền nhiễmnguy hiểm ở động vật, bệnh truyền lây giữa động vật và người trình Thủ tướng Chínhphủ phê duyệt;

+ Khoản 3 Điều 8 quy định Bộ trưởng Bộ Y tế có trách nhiệm phối hợp với Bộtrưởng Bộ Nông nghiệp và PTNT trong việc phòng, chống các bệnh truyền lây giữađộng vật và người

+ Khoản 6 Điều 8 quy định Bộ trưởng Bộ Tài chính có trách nhiệm hướng dẫn địaphương bố trí kinh phí, sử dụng ngân sách hằng năm và bảo đảm kinh phí cho công tácphòng, chống dịch bệnh động vật

+ Khoản 6 Điều 18 quy định Bộ trưởng Bộ Tài chính có trách nhiệm đảm bảo kinh phíthực hiện chương trình, kế hoạch quy định tại điểm a khoản 4 Điều 18;

+ Khoản 7 Điều 18 quy định Chủ tịch Ủy ban nhân dân các cấp có trách nhiệm tổchức thực hiện chương trình, kế hoạch khống chế, thanh toán một số bệnh truyền nhiễmnguy hiểm ở động vật, bệnh truyền lây giữa động vật và người

- Nghị quyết số 63/NQ-CP ngày 22/07/2016 của Chính phủ về Chương trình hànhđộng của Chính phủ thực hiện Nghị quyết của Quốc hội về Kế hoạch Phát triển kinh tế -

xã hội 5 năm 2016-2020, theo đó có giao cho Bộ Nông nghiệp và PTNT chủ trì trìnhChính phủ ban hành Chương trình quốc gia phòng, chống bệnh Dại giai đoạn 2016-2020.Ngoài ra, các văn bản liên quan đến công tác phòng, chống bệnh Dại trên người vàđộng vật bao gồm:

- Nghị định 35/2016/NĐ-CP ngày 15/5/2016 của Chính phủ quy định chi tiết thi hànhmột số điều của Luật thú y

- Thông tư số 07/2016/TT-BNNPTNT ngày 31/5/2016 của Bộ Nông nghiệp vàPhát triển nông thôn quy định về phòng, chống dịch bệnh động vật trên cạn

- Thông tư liên tịch 16/2013/TTLT-BYT-BNNPTNT của Bộ Y tế - Bộ Nôngnghiệp và PTNT ngày 27/5/2013 về hướng dẫn phối hợp phòng, chống bệnh lây truyền

từ động vật sang người

- Quyết định 1622/QĐ-BYT của Bộ Y tế ngày 08/5/2014 về ban hành hướng dẫngiám sát, phòng chống bệnh Dại trên người

2 Căn cứ khoa học và thực tiễn

Bệnh Dại là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm ở động vật thuộc Danh mục bệnh độngvật phải công bố dịch, đồng thời thuộc Danh mục bệnh truyền lây giữa động vật vàngười Bệnh Dại gây tử vong cho người, tuy nhiên, có thể kiểm soát và loại trừ được bệnhvới các lý do sau đây:

- WHO, OIE, FAO khẳng định bệnh Dại là bệnh có thể kiểm soát và ngăn ngừa đượcbằng cách tiêm phòng vắc-xin (tiêm vắc-xin cho chó để ngăn ngừa truyền bệnh Dại chongười; tiêm dự phòng Dại cho người hoặc điều trị sau phơi nhiễm để ngăn ngừa bệnh nhân

tử vong do lên cơn Dại)

- Kể từ khi bệnh Dại được phát hiện cho đến nay, vi rút Dại ít biến đổi gen; hiện nay

đã có vắc-xin phòng bệnh Dại trên người và động vật với hiệu lực cao, thời gian miễn dịchdài Hiện nay, vắc-xin Dại chủ yếu là vắc-xin nhập khẩu; tuy nhiên để chủ động nguồnvắc-xin, Việt Nam đang nghiên cứu để tự sản xuất vắc-xin Dại tế bào trong nước

+ Vắc-xin phòng bệnh Dại cho người là vắc-xin tế bào nên an toàn và có hiệu lực cao

- Theo khuyến cáo của OIE, bệnh Dại có thể khống chế và loại trừ được khi công tácphòng chống bệnh Dại ở động vật nuôi và trên người bảo đảm các yêu cầu sau đây:

Khống chế bệnh Dại:

+ Bệnh Dại được khai báo

+ Hệ thống giám sát bệnh Dại hoạt động có hiệu quả

+ Các biện pháp phòng và chống bệnh Dại thường xuyên được thực thi.

+ 70% số tỉnh không có ca bệnh Dại trên người và các loài động vật nuôi trong 02năm liên tiếp

Loại trừ bệnh Dại:

+ Bệnh Dại được khai báo

+ Hệ thống giám sát bệnh Dại hoạt động có hiệu quả

+ Các biện pháp phòng và chống bệnh Dại thường xuyên được thực thi

+ 100% số tỉnh không có ca bệnh Dại trên người hoặc ở các loài động vật trong 02năm liên tiếp gần nhất

+ Không có ca bệnh Dại ở động vật ăn thịt xâm nhập trong vòng 6 tháng

- Những người thuộc nhóm nguy cơ cao mắc bệnh Dại (như nhân viên thú y thường xuyên ở thực địa, những người buôn bán và giết mổ chó, những người thực hiện xét nghiệm bệnh phẩm nghi Dại, ) nếu được tiêm phòng Dại trước phơi nhiễm sẽ giảm

nguy cơ mắc bệnh nếu bị phơi nhiễm với vi rút Dại (ví dụ bị chó Dại cắn, nhiễm vi rút Dạikhi xét nghiệm bệnh phẩm, )

- Những người chưa tiêm phòng vắc-xin Dại, nếu bị chó Dại cắn được đưa đến ngay cơ

sở y tế để điều trị dự phòng sau phơi nhiễm kịp thời (bằng kháng huyết thanh và vắc-xin phòng bệnh Dại) thì sẽ không bị phát bệnh Dại.

- Hệ thống giám sát, điều tra và xử lý bệnh Dại của ngành Y tế và Thú y về cơ bản

đã được thiết lập từ Trung ương đến các xã, phường, thị trấn; hai ngành đã có sự phốihợp, trao đổi, chia sẻ thông tin một cách thường xuyên, chủ động, kịp thời theo Thông tưliên tịch số 16/2013/TTLT-BYT-BNNPTNT nên đã xử lý hiệu quả nhiều ổ dịch bệnh Dại

- Bệnh Dại gây tổn thất lớn đến tính mạng con người

Từ năm 2005 đến tháng 11/2016 trên cả nước có 1.055 người bị chết do bệnh Dại,trung bình mỗi năm có trên dưới 100 người bị tử vong, chiếm tỷ lệ cao nhất so với cácbệnh truyền nhiễm gây dịch ở nước ta hiện nay Tỷ lệ chết của bệnh Dại trên người lên tới100% khi đã lên cơn dại Trong giai đoạn 2011- 2015, 48 tỉnh đã có người chết vì bệnhDại Bệnh Dại có nguy cơ lan rộng nếu không có những biện pháp can thiệp kịp thời vàđồng bộ

- Bệnh Dại gây thiệt hại về kinh tế

+ Theo kết quả đánh giá của Đối tác Một sức khỏe - Bộ Nông nghiệp và PTNT vềgánh nặng kinh tế của bệnh Dại (khoảng hơn 4 triệu người bị chó mèo cắn phải điều trị dựphòng bệnh Dại trong 10 năm, từ năm 2005-2014) cho thấy thiệt hại kinh tế lên tới 14.608

tỷ đồng (tương đương 664 triệu đô la Mỹ) do phải chi trả cho việc tiêm vắc-xin, kháng