nghiên cứu chế tạo kit phát hiện nhanh aflatoxin b1 trong thức ăn chăn nuôi

Aflatoxin là chất chuyển hóa thứ cấp sản sinh bởi nấm mốc, chủ yếu là cácchủng Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus 57, đƣợc tìm thấy trong mộtloạt các nông sản nhƣ hạt ngô, lạc, gạo, ngũ cốc40, 64. Đây là nhóm độc tố nấmmốc nguy hiểm nhất gây độc cho ngƣời và động vật, có thể gây bệnh cấp tính (tổnthƣơng gan, viêm gan, phù nề, hoại tử xuất huyết) hoặc ung thƣ biểu mô mãn tính(ung thƣ gan, phổi, thận và ức chế miễn dịch), thậm chí với liều lƣợng cao có thểdẫn tới tử vong

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN

VIỆN THÚ Y

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI CẤP BỘ

Tên đề tài:NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO KIT PHÁT HIỆN NHANH

AFLATOXIN B1 TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI VÀ AFLATOXIN

M1 TRONG SỮA TƯƠI

Cơ quan chủ quản: Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn

Cơ quan chủ trì: Viện Thú y

Chủ nhiệm đề tài: Phạm Thị Ngọc

Thời gian thực hiện: 36 tháng

HÀ NỘI – 2020

DANH SÁCH NHỮNG NGƯỜI THAM GIA THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

2 Ths Trương Thị Quý Dương Viện Thú y

3 TS Nguyễn Thị Bích Thủy Viện Thú y

4 TS Nguyễn Thị Lan Anh Viện Thú y

5 TS Nguyễn Thị Thu Hằng Viện Thú y

6 BSTY Trần Thị Nhật Viện Thú y

7 PGS.TS Trương Quốc Phong ĐHBK HN

8 PGS.TS Khuất Hữu Thanh ĐHBK HN

9 TS Nguyễn Tiến Thành ĐHBK HN

11 KTV Nguyễn Hồng Minh Viện Thú y

12 ThS Trần Thị Thu Hằng Viện Thú y

1

Tóm tắt kết quả thực hiện đề tài

Nước ta là một nước nhiệt đới với khí hậu nóng ẩm nên sẽ là điều kiện thuận lợi

cho các loài nấm mốc phát triển, trong đó có loài Aspergillus flavus có khả năng

sinh độc tố Aflatoxin cao Do đó nguy cơ nhiễm độc tố này trong chuỗi các sản phẩm nông sản, thức ăn chăn nuôi, sữa và các sản phẩm từ vật nuôi là rất cao Vì Aflatoxin là một độc tố nguy hiểm nên việc kiểm tra sự có mặt của độc tố này trong các sản phẩm nêu trên là rất cần thiết KIT thử nhanh dạng que thử là một trong số các công cụ hữu hiệu được sử dụng để phát hiện Aflatoxin Phương pháp này có nhiều tính năng ưu việt như nhanh, đơn giản, có thể sử dụng tại hiện trường, giá thành thấp hơn các phương pháp khác Tuy nhiên, hiện nay chúng ta hoàn toàn phải nhập ngoại loại sinh phẩm này Nghiên cứu tạo que thử nhanh có khả năng phát hiện Aflatoxin trong thức ăn chăn nuôi và sữa tươi là một hướng nghiên cứu mới tại Việt Nam và là một bước đột phá trong ứng dụng công nghệ nano kết hợp với hóa sinh miễn dịch để tạo que thử nhanh Trong nghiên cứu này, chúng tôi cũng xây dựng quy trình và tự sản xuất kháng nguyên, kháng thể đạt yêu cầu để tạo que thử

Từ đó, chế tạo được que thử phát hiện được 5ppb Aflatoxin B1 trong thức ăn chăn nuôi và 5ppb Aflatoxin M1 trong sữa tươi với độ nhạy và đô đặc hiệu cao Việc tự sản xuất được các thành phần quan trọng của que thử sẽ giúp chủ động được nguồn nguyên vật liệu, kiểm soát chất lượng đầu vào, giảm chi phí sản xuất dẫn tới giảm giá thành được sản phẩm

2

MỤC LỤC

MỤC LỤC 2

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 6

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

MỤC TIÊU ĐỀ TÀI 3

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN VỀ AFLATOXIN 4

1.1 Lịch sử phát hiện Aflatoxin 4

1.2 Điều kiện sản sinh Aflatoxin 5

1.3 Đặc điểm của Aflatoxin 6

1.3.1 Cấu trúc hóa học và phân loại 6

1.3.2 Tính chất hóa học và tính chất vật lý 9

1.3.3 Sự chuyển hóa và bài tiết Aflatoxin 10

1.3.4 Độc tính của Aflatoxin 13

1.4 Tình hình nhiễm độc Aflatoxin trên thế giới và ở Việt Nam 15

1.4.1 Trên thế giới 15

1.4.2 Tại Việt Nam 16

1.5 Quy định hiện hành về Aflatoxin 19

1.6 Các phương pháp loại bỏ và kiểm soát Aflatoxin 19

1.7 Các dung môi tách chiết Aflatoxin 21

1.8 Các phương pháp phát hiện Aflatoxin 21

1.8.1 Phương pháp sắc kí 21

1.8.2 Phương pháp quang phổ 24

1.8.3 Phương pháp miễn dịch 25

1.8.4 Phương pháp que thử sắc kýmiễn dịch 28

1.9 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về que thử 30

1.9.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước .30

1.9.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 32

3

1.10 Đặc tính que thử 33

1.10.1 Hạt nano vàng (GNPs) 33

1.10.2 Cộng hợp kháng thể - hạt nano vàng 33

1.10.3 Sắc ký miễn dịch cạnh tranh .34

1.10.4 Miếng thấm mẫu 35

1.10.5 Miếng cộng hợp 36

1.10.6 Màng 36

1.10.7 Miếng thấm hút 36

1.11 Que thử phát hiện Aflatoxin 37

1.11.1 Cộng hợp Aflatoxin với chất mang 37

1.11.2 Aflatoxin B1 38

1.11.3 CMO 39

1.11.4 Chất mang 39

1.11.5 Các phương pháp tạo cộng hợp hapten AFB1 và BSA 42

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 47

2.1 Vật liệu, hóa chất và thiết bị .47

2.1.1 Vật liệu 47

2.1.2 Hóa chất 47

2.1.3 Các kháng thể sử dụng 48

* Kháng thể cho tạo que thử 48

* Kháng thể cho ELISA và Dot-blot 48

2.1.4 Thiết bị 48

2.2 Phương pháp nghiên cứu 49

2.2.1 Phương pháp gắn AF-CMO 49

2.2.2 Phương pháp loại CMO dư 50

2.2.3 Phương pháp sắc kí bản mong TLC 50

2.2.4 Phương pháp quang phổ hồng ngoại FT-IR 51

4

2.2.5 Phương pháp gắn AFB1-CMO với BSA/KLH và AFM1-CMO với BSA/KLH 52

2.2.6 Phương pháp dot-blot 53

2.2.7 Phương pháp sản xuất kháng thể .55

2.2.8 Phương pháp tinh sạch kháng thể kháng AFbằng sắc ký ái lựcProtein A .55

2.2.9 Phương pháp điện di SDS – PAGE 56

2.2.10 Phương pháp ELISA gián tiếp 57

2.2.11 Phương pháp tạo cộng hợp kháng thể - hạt nano vàng và cố định trên miếng cộng hợp 57 2.2.12 Phương pháp cố định protein và kháng thể lên màng 58

2.2.13 Phương pháp phân tích mẫu bằng que thử 59

2.2.14 Phương pháp chiết mẫu 59

2.3 Địa điểm nghiên cứu 60

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 61

3.1 Nghiên cứu tạo phức cộng hợp Aflatoxin với protein chất mang 61

2.3.1 Nghiên cứu điều kiện gắn AFB1-CMO 62

3.1.2 Nghiên cứu điều kiện gắn AFB 1 -CMO với BSA 70

3.1.3 Kết quả gắn AFB1-KLH, AFM1-BSA và AFM1-KLH 76

3.2 Nghiên cứu tạo kháng thể đặc hiệu Aflatoxin B1 và M1 .77

3.2.1 Nghiên cứu gây đáp ứng miễn dịch tạo và thu nhận kháng huyết thanh kháng AFB1 và AFM1 .77

3.2.2 Tinh sạch kháng thể kháng AFB 1 và AFM 1 80

3.2.3 Đánh giá đặc tính của kháng thể tinh sạch 85

3.3 Nghiên cứu chế tạo các thành phần KIT thử .89

3.3.1 Nghiên cứu chế tạo dung dịch kéo vàng .89

3.3.2 Nghiên cứu điều kiện chế tạo que thử phát hiện Aflatoxin B1 90

3.3.3 Nghiên cứu điều kiện chế tạo que thử phát hiện Aflatoxin M1 110

3.3.4 Tăng cường độ tín hiệu vạch và giảm thời gian đọc kết quả 126

3.4 Nghiên cứu chế tạo và xác định thông số của KIT 130

5

3.4.1 Nghiên cứu chế tạo thử nghiệm KIT 130

3.4.2 Nghiên cứu xây dựng quy trình sử dụng KIT 131

3.4.3 Đánh giá một số thông số KIT 139

3.5 Nghiên cứu thử nghiệm KIT 155

3.5.1 Nghiên cứu thử nghiệm tại phòng thí nghiệm 155

3.5.2 Kiểm nghiệm que thử 156

CHƯƠNG VI: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 161

TÀI LIỆU THAM KHẢO 162

: :

:

:

: :

: :

:

:

:

: :

: :

:

:

:

Aflatoxin Aflatoxin B1

5 –Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate disodium salt

Bovine Serum Albumine 1-cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl)

O–(Carboxymethyl) hydroxylamine hemihydrochloride

dicyclohexylmethanediimine 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide

Gold Nanoparticles (hạt nano vàng)

High – performance liquid chromatography

Immunoglobulin

:

: :

:

: :

Keyhole Limpet Hemocyanin Lateral Flow Immunoassay

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 3.1 Sơ đồ tạo cộng hợp AFB 1 -BSA 62 Hình 3.2 Sắc ký bản mỏng sản phẩm tối ưu gắn AFB 1 -CMO theo tỷ lệ AFB 1 : CMO 64 Hình 3.3 Sắc ký bản mỏng sản phẩm tối ưu nồng độ AFB 1 KC, Kiểm chứng-AFB1; đường chạy 4-1 là kết quả phản ứng ở các nồng độ 1, 2, 4, 8 mM tương ứng .65 Hình 3.4 Sắc ký bản mỏng sản phẩm tối ưu gắn AFB 1 -CMO theo nhiệt độ (1 70 oC, 2 80 oC, 3 90 oC, 4

100 oC, 5 110 oC) 66 Hình 3.5 Sắc ký bản mỏng sản phẩm tối ưu gắn AFB1 - CMO theo thời gian 66 Hình 3.6 Sắc ký bản mỏng sản phẩm tối ưu chiết loại bỏ CMO dư theo tỷ lệ nước: ethylacetate KC AFB1;

1 AFB1-CMO trong NaOH 0.1M;2 Pha nước, chiết 1:1;3 Pha nước, chiết 1:2;4 Pha nước, chiết 1:3;5 Pha ethylacetate, chiết 1:1, 6 Pha ethylacetate, chiết 1:2;7 Pha ethylacetate, chiết 1:3 .68 Hình 3.7 Phổ sắc ký lỏng HPLC của AFB1(A) và AFB1-CMO (B) 69 Hình 3.8 Kết quả phân tích FT-IR của AFB1 (đường liền) và AFB1-CMO (đường nét đứt) 70 Hình 3.9 Phân tích dot blot sản phẩm từ các phản ứng cộng hợp AFB1-CMO với BSA với tỷ lệ nồng độ khác nhau (10:1, 20:1, 30:1, 40:1 và 50:1); AFB1-BSA, chất chuẩn .72 Hình 3.10 Phân tích dot-blot sản phẩm tối ưu nồng độ EDC/sulfo-NHS gắn AFB1-BSA 73 Hình 3.11 Phân tích dot blot sản phẩm từ phản ứng gắn AFB1-CMO với BSA ở các điều kiện đệm pH khác nhau: đệm actate pH 4,5 (Ace); đệm phosphate pH 7,4 (PBS) và đệm carbonate pH 9,5 (Car) .74 Hình 3.12 Phân tích dot blot sản phẩm phản ứng gắn AFB1-CMO với BSA ở 25oC và 37oC BSA, bovine serum albumin; B1-BSA, cộng hợp chuẩn 75 Hình 3.13 Phân tích dot blot sản phẩm phản ứng gắn AFB1-CMO với BSA theo thời gian khác nhau 0,5; 1,0; 2,0; 3,0 và 4,0 giờ .75 Hình 3.14 Kết quả kiểm tra sản phẩm gắn Aflatoxin với protein chất mang bằng dot blot BSA, Bovine serum albumin; KLH, Keyhole limpet hemocyanin; AFB1-BSA, sản phẩm gắn AFB1 với BSA; AFB1-KLH, sản phẩm gắn AFB1 với KLH; AFM1-BSA, sản phẩm gắn AFM1 với BSA; AFM1-KLH, sản phẩm gắn AFM1 với KLH 76 Hình 3.15.Biểu đồ ELISA về quá trình gây đáp ứng miễn dịch ở thỏ bằng AFB 1 -KLH B1-45, Kháng huyết thanh kháng lại AFB 1 ở loạt tiêm 45 µg AFB1-KLH; B1-75, Kháng huyết thanh kháng lại AFB 1 ở loạt tiêm

75 µg AFB1-KLH; KLH-45, Kháng huyết thanh kháng lại AFB 1 ở loạt tiêm 45 µg KLH; KLH-75, Kháng huyết thanh kháng lại AFB 1 ở loạt tiêm 75 µg KLH .78 Hình 3.16.Biểu đồ ELISA về quá trình gây đáp ứng miễn dịch ở thỏ bằng AFM 1 -KLH M1-45, Kháng huyết thanh kháng lại AFM 1 ở loạt tiêm 45 µg AFM1-KLH; M1-75, Kháng huyết thanh kháng lại AFM 1 ở loạt tiêm 75 µg AFM1-KLH; KLH-45, Kháng huyết thanh kháng lại AFM 1 ở loạt tiêm 45 µg KLH; KLH-75, Kháng huyết thanh kháng lại AFM 1 ở loạt tiêm 75 µg KLH .79 Hình 3.17 Sắc ký đồ tinh sạch IgG từ huyết thanh thỏ sử dụng cột Protein A-Sepharosevới thể tích gel 1 ml, tốc độ 1 ml/phút .81

Hình 3.18 Phổ điện di protein tinh sạch kháng thể kháng AFB 1 1-Thang protein chuẩn (Intron, Hàn Quốc), 2-Huyết thanh, 3- Protein không bám cột (đỉnh 1, Hình 3.17), 4-Phân đoạn sau khi đẩy bằng glycine (đỉnh 2,

Hình 3.17) 82

Hình 3.19.Sắc ký đồ tinh sạch IgG từ huyết thanh thỏ sử dụng cột Protein A-Sepharosevới thể tích gel 1 ml, tốc độ 1 ml/phút .83

Hình 3.20 Phổ điện di protein tinh sạch kháng thể kháng AFM 1 M - Thang protein chuẩn (Intron, Hàn Quốc), 1-Huyết thanh, 2- Protein không bám cột (đỉnh 1, Hình 3.19), 3-Phân đoạn sau khi đẩy bằng glycine (đỉnh 2, Hình 3.19) 84

Hình 3.21 Đánh giá tính đặc hiệu của kháng thể kháng AFB 1 tinh sạch (a) Đánh giá tính đặc hiệu của kháng thể kháng AFB 1 tinh sạch (Anti-AFB 1 ) với AFB 1 -BSA bằng ELISA (Anti-KLH: kháng thể kháng KLH, Anti-AFB 1 : kháng thể kháng AFB 1 ; (b) ELISA so sánh tính đặc hiệu của kháng thể kháng AFB 1 tinh sạch và kháng thể kháng AFB 1 chuẩn (thương mại); (c) Dot-blot so sánh tính đặc hiệu của kháng thể kháng AFB 1 tinh sạch và kháng thể kháng AFB 1 chuẩn (thương mại) .86

Hình 3.22 Đánh giá tính đặc hiệu của kháng thể kháng AFM 1 tinh sạch (Anti- AFM 1 ) với AFM 1 -BSA bằng ELISA (Anti-KLH: kháng thể kháng KLH, Anti- AFM 1 : kháng thể kháng AFM 1 ) 87

Hình 3.23 Kết quả ELISA so sánh tính đặc hiệu của kháng thể kháng AFM 1 tinh sạch và kháng thể kháng AFM 1 chuẩn (thương mại) 88

Hình 3.24 Kết quả Dot-blot so sánh tính đặc hiệu của kháng thể kháng AFM 1 tinh sạch và kháng thể kháng AFM 1 chuẩn (thương mại) .89

Hình 3.25 Kết quả điều chế hạt nano vàng A, hình ảnh dung dịch hạt nano vàng sau điều chế; B, phổ hấp thụ của dung dịch nano vàng; C, hình ảnh TEM của hạt nano vàng .90

Hình 3.26.Kiểm tra hoạt động của que thử với điều kiện thiết lập ban đầu 91

Hình 3.27 Xác định hàm lượng kháng thể kháng AFB 1 cộng hợp với GNPs thích hợp a) Màu sắc của dịch cộng hợp ở các hàm lượng kháng thể khác nhau; b) Que thử với các hàm lượng kháng thể cộng hợp với hạt nano vàng khác nhau; c) Kiểm tra đồng thời mẫu âm tính và dương tính (5ppb) ở nồng độ kháng thể trong miếng cộng hợp là 5ng .92

Hình 3.28 Xác định pH thích hợp tạo cộng hợp kháng thể với hạt nano vàng 94

Hình 3.29 Phản ứng tạo cộng hợp giữa kháng thể và hạt nano vàng ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau .95

Hình 3.30 Xác định thời gian phản ứng cộng hợp kháng thể và hạt nano vàng 96

Hình 3.31 Ảnh hưởng của các công thức đệm cộng hợp đến tín hiệu que thử 97

Hình 3.32 Kết quả thử nghiệm các loại vật liệu khác nhau làm miếng cộng hợp 98

Hình 3.33 Nhiệt độ cố định cộng hợp 99

Hình 3.34 Thời gian sấy miếng cộng hợp 100

Hình 3.35 Ảnh hưởng của vật liệu màng đến kết quả nghiên cứu 101

Hình 3.36 Tối ưu hóa hàm lượng kháng thể cố định lên vạch kiểm tra 102

Hình 3.37 Thay đổi thể tích phun AFB 1 -BSA trên màng Nitrocellulose 103

Hình 3.38 Xác định nhiệt độ xử lý màng nitrocellulose 104

Hình 3.39 Xác định thời gian sấy màng nitrocellulose ở 37 o C 105

Hình 3.40 Xác định hàm lượng kháng thể cố định trên vạch kiểm chứng 106

Hình 3.41.Kết quả về độ lặp lại của que thử đối với mẫu âm tính với AFB 1 (Mũi tên đỏ: vạch phun kháng thể

kháng kháng thể thỏ, mũi tên đen: vạch phun kháng nguyên AFB 1 -BSA) 107

Hình 3.42 Kết quả về độ lặp lại của que thử đối với mẫu dương tính với AFB 1 107

Hình 3.43 Đánh giá ngưỡng phát hiện của que thử 108

Hình 3.44 Các mẫu nguyên liệu và thức ăn chăn nuôi (DDGS: bã rượu khô, 6410: cám chim cút, 2100: cám gà thịt, 1100: cám lợn cai sữa) 109

Hình 3.45 Kết quả que thử que thử với 7 âm tính và mẫu dương tính AFB 1 109

Hình 3.46.Kiểm tra hoạt động của que thử với điều kiện thiết lập ban đầu 110

Hình 3.47.Màu sắc của dụng dịch công hợp tại các nồng độ kháng thể AFM 1 khác nhau 111

Hình 3.48.Kết quả thử que với các hàm lượng kháng thể cộng hợp với hạt nano vàng khác nhau 111

Hình 3.49.Kiểm tra đồng thời mẫu âm tính và dương tính (5ppb) ở nồng độ kháng thể trong miếng cộng hợp là 5ng 112

Hình 3.50.Xác định pH thích hợp tạo cộng hợp kháng thể với hạt nano vàng 113

Hình 3.51.Phản ứng tạo cộng hợp giữa kháng thể và hạt nano vàng ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau 114

Hình 3.52.Xác định thời gian phản ứng cộng hợp kháng thể và hạt nano vàng 115

Hình 3.53.Ảnh hưởng của các công thức đệm cộng hợp đến tín hiệu que thử 116

Hình 3.54.Kết quả thử nghiệm các loại vật liệu khác nhau làm miếng cộng hợp 117

Hình 3.55.Nhiệt độ cố định cộng hợp 118

Hình 3.56.Thời gian sấy miếng cộng hợp 119

Hình 3.57.Ảnh hưởng của vật liệu màng đến kết quả nghiên cứu 120

Hình 3.58.Tối ưu hàm lượng kháng thể cố định lên vạch kiểm tra 121

Hình 3.59.Thay đổi thể tích phun AFM 1 -BSA trên màng Nitrocellulose 121

Hình 3.60.Xác định nhiệt độ xử lý màng nitrocellulose 123

Hình 3.61.Xác định thời gian sấy màng nitrocellulose ở 37 o C 123

Hình 3.62.Xác định hàm lượng kháng thể cố định trên vạch kiểm chứng 124

Hình 3.63.Kết quả về độ lặp lại của que thử đối với mẫu âm tính và dương tính đối với AFM 1 (Mũi tên đỏ: vạch phun kháng thể kháng kháng thể thỏ, mũi tên đen: vạch phun kháng nguyên AFM 1 -BSA) 125

Hình 3.64.Đánh giá ngưỡng phát hiện của que thử 126

Hình 3.65.Miếng cộng hợp kháng thể kháng AFB1 và tín hiệu vạch tương ứng khi thay đổi thể tích vàng tham gia cộng hợp theo chiều tăng dần 50µl - 100µl - 200µl - 400µl 127

Hình 3.66.Giảm thời gian đọc tín hiệu que aflatoxin M1 128

Hình 3.67.Miếng cộng hợp kháng thể kháng M1 và tín hiệu vạch tương ứng khi thay đổi thể tích vàng tham gia cộng hợp theo chiều tăng dần 50µl - 100µl - 200µl - 400µl 129

Hình 3.68.Cân bằng hai vạch loại cộng hơp 400µl AuNP 130

Hình 3.69.Cân bằng hai vạch loại cộng hợp 300µl AuNP 130

Hình 3.70.Sơ đồ quy trình chiết Aflatoxin 132

Hình 3.71.Que thử và vạch tín hiệu khi sử dụng các miếng thấm mẫu khác nhau 134

Hình 3.72.Dung môi chiết methanol và ethyl acetate 135

Hình 3.73.Sơ đồ quy trình chiết Aflatoxin M1 137

Hình 3.74.Tối ưu tỷ lệ dung môi chiết 138

Hình 3.75 Thử nghệm 3 mẫu thức ăn chăn nuôi trên que thương mại 140

Hình 3.76 Quá trình chiết mẫu G221 141

Hình 3.77 Mẫu G221 xác định 5pp 141

Hình 3.78 Mẫu G221 xác định 10ppb 142

Hình 3.79 Quá trình chiết mẫu S900 142

Hình 3.80 Mẫu S900 xác định 5ppb 143

Hình 3.81 Mẫu S900 xác định 10ppb 144

Hình 3.82 Quá trình chiết mẫu A128 144

Hình 3.83 Mẫu A128 xác định 5ppb 145

Hình 3.84 Mẫu A128 xác định 10ppb 145

Hình 3.85 Quá trình chiết mẫu Bảng 3.9.Chiết mẫu Vinamilk 5ppb 146

Hình 3.86 Mẫu Vinamilk 5ppb 147

Hình 3.87 Mẫu Mẫu Vinamilk 10ppb 148

Hình 3.88 Mẫu Dalatmilk 5ppb 149

Hình 3.89.: Mẫu Dalatmilk 10ppb 150

Hình 3.90 Mẫu TH truemilk 5ppb 151

Hình 3.91 Mẫu TH truemilk 10ppb 152

Hình 3.92 Thử que Aflatoxin B1 sau các thời gian bảo quản 154

Hình 3.93 Thử que Aflatoxin M1 sau các thời gian bảo quản 154

Hình 3.94 Thức ăn chăn nuôi G221 (a) trước,(b) sau khi nhiễm nấm A flavus và (c) A oryzae………….151

Hình 3.95 Thử que Aflatoxin B1 với mẫu nhiễm nấm (a) sinh độc tố và (b) không sinh độc tố aflatoxin B1 156

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Lượng Aflatoxin trong nguyên liệu làm thức ăn chăn nuôi ở Việt Nam 18 Bảng 1 2: Mức giới hạn về Aflatoxin B1 trong thức ăn chăn nuôi và Aflatoxin M1 trong sữa của các quốc gia trên thế giới[74] _ 19 ảng 3.1 Điều kiện thiết lập ban đầu để tối ưu gắn AFB 1 -CMO _ 63 ảng 3.2 Đặc điểm vật liệu sử dụng làm miếng cộng hợp que thử _ 98 ảng 3.3 Đặc điểm vật liệu sử dụng làm màng lai _ 101 ảng 3.4.Đặc điểm các vật liệu sử dụng làm miếng thấm mẫu _ 133 ảng 3.5.Tối ưu tỷ lệ dung môi chiết 138 ảng 3.6 Mẫu thức ăn chăn nuôi 139 ảng 3.7.Mẫu sữa 140 ảng 3.8 Chiết mẫu Vinamilk 5ppb 147 ảng 3.9.Chiết mẫu Vinamilk 10ppb _ 148 ảng 3.10 Chiết mẫu Dalatmilk 5ppb _ 149 ảng 3.11.Chiết mẫu Dalatmilk 10ppb 150 ảng 3.12 Chiết mẫu TH truemilk 5ppb _ 151 ảng 3.13.Chiết mẫu TH truemilk 10ppb 152 ảng 3.14 Kết quả về độ đặc hiệu của bộ kít Aflatoxin B1 157 ảng 3.15 kết quả về độ đặc hiệu của bộ kít Aflatoxin M1 _ 158 ảng 3.16 đánh giá giới hạn phát hiện của bộ kít _ 159

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Aflatoxin là chất chuyển hóa thứ cấp sản sinh bởi nấm mốc, chủ yếu là các

chủng Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus [57], được tìm thấy trong một

loạt các nông sản như hạt ngô, lạc, gạo, ngũ cốc[40, 64] Đây là nhóm độc tố nấm mốc nguy hiểm nhất gây độc cho người và động vật, có thể gây bệnh cấp tính (tổn thương gan, viêm gan, phù nề, hoại tử xuất huyết) hoặc ung thư biểu mô mãn tính (ung thư gan, phổi, thận và ức chế miễn dịch), thậm chí với liều lượng cao có thể dẫn tới tử vong [8, 45, 71] Con người tiêu thụ đồng thời trực tiếp các sản phẩm nông sản có Aflatoxin và các sản phẩm sữa, trứng, thịt từ động vật ăn phải Aflatoxin do thức ăn chăn nuôi bị nhiễm nấm mốc, nên sự tích tụ Aflatoxin cuối cùng đều ở con người Cho đến nay đã có hơn 20 loại Aflatoxin được tìm thấy, các nhóm quan trọng nhất gồm AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2 [63] Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Quốc tế (IARC) đã phân loại AFB1 là hợp chất gây ung thư quan trọng nhất (nhóm 1), đặc biệt liên quan đến ung thư gan [41], cũng như khả năng gây quái thai, gây đột biến [46, 52]

Vấn đề nhiễm Aflatoxin là toàn cầu và đặc biệt ảnh hưởng đến các quốc gia đặc trưng bởi điều kiện môi trường và thời tiết thuận lợi cho ô nhiễm và tăng trưởng của nấm mốc trong thu hoạch và bảo quản nông sản Theo đánh giá của Đại học Georgia, Mĩ, ước tính rằng 25% cây lương thực trên thế giới bị nhiễm độc tố nấm,

và hơn 4,5 tỷ người và số lượng động vật không xác định được tiếp xúc với Aflatoxin [17] Tại Việt Nam, nhiều cuộc kiểm nghiệm cho thấy sự có mặt của Aflatoxin trong các mẫu nông sản ở Việt Nam rất cao từ 60% - 65%, đặc biệt ở ngô [4] Hiện nay khuynh hướng phát triển chăn nuôi của nước ta theo quy mô công nghiệp, để nâng cao hiệu quả và lợi nhuận của chăn nuôi cần bảo quản tốt thức ăn chăn nuôi (TĂCN) và các nguyên liệu sản xuất TĂCN do TĂCN chiếm tỷ trọng lớn, khoảng 65-75% giá thành sản xuất thịt, sữa, trứng [2] Sự có mặt của các loại độc tố, nhất là aflatoxin, nhiễm vào TĂCN và ngũ cốc, có thể gây ảnh hưởng rất lớn

2

đối với người tiêu dùng, người chăn nuôi và người sản xuất TĂCN Vì vậy cần xác định sự có mặt của aflatoxin trong TĂCN để có biện pháp xử lý kịp thời

Không những thế, chất chuyển hóa của AFB1 là Aflatoxin M1 (AFM1) có thể

có trong sữa và các sản phẩm sữa khi cho con bú hoặc các động vật có vú khác ăn thức ăn bị ô nhiễm Người ta ước tính rằng khoảng 1% - 3% đến 6% AFB1 trong thức ăn có mặt dưới dạng AFM1 trong sữa trong vòng vài giờ sau khi ăn bữa ăn bị ô nhiễm đến hai ngày sau khi ngừng cho ăn Sữa là một loại thực phẩm giàu dinh dưỡng, và nó là nguồn cung cấp các chất dinh dưỡng và vi lượng cần thiết cho sự tăng trưởng, phát triển và duy trì sức khỏe của con người Tuy nhiên, sự hiện diện của AFM1 sẽ biến sữa và các sản phẩm sữa thành nguồn gây bệnh Chính vì vậy, việc phát hiện sự có mặt của AFM1 trong sữa và các sản phẩm từ sữa rất cần thiết

Hiện nay có rất nhiều phương pháp đã được phát triển để phát hiện Aflatoxin với độ nhạy cao như TLC, HPTLC, HPLC, LC-MS/MS, FTIR, RIA, ELISA, SPR, điện hóa, và que thử miễn dịch Đa số các phương pháp đòi hỏi người phân tích phải có kỹ năng tốt, phải tiền xử lý mẫu, tốn thời gian và sử dụng thiết bị đắt tiền, chỉ phù hợp để thực hiện phân tích Aflatoxin trong điều kiện phòng thí nghiệm Những năm gần đây phương pháp que thử miễn dịch với nhiều ưu điểm như dễ dàng thao tác, tiết kiệm thời gian phân tích, phù hợp sử dụng ngoài hiện trường đã được chú trọng phát triển để tiếp cận nhiều đối tượng người tiêu dùng Do đó, chúng tôi đã thực hiện đề tài ―Nghiên cứu chế tạo KIT phát hiện nhanh Aflatoxin B1 trong thức ăn chăn nuôi và Aflatoxin M1 trong sữa tươi‖ để có thể cung cấp công cụ tiện lợi cho việc kiểm tra nhanh Aflatoxin ngoài hiện trường

3

MỤC TIÊU ĐỀ TÀI

Chế tạo thành công KIT phát hiện nhanh Aflatoxin B1 trong thức ăn chăn nuôi

và Aflatoxin M1 trong sữa tươi; sử dụng đơn giản, tiện lợi tại hiện trường

phân lập được nấm Aspergillus flavus và xác định nó là một trong các loài nấm có

khả năng tiết ra độc chất này Loại độc tố này sau đó được đặt theo tên của chủng

nấm này là Aflatoxin (AF) vào năm 1962 [24]

Năm 1966 - 1969, tại Mỹ, nghiên cứu các bệnh nhiễm AF là nguyên nhân gây viêm gan ở chó, ngộ độc ngô mốc ở lợn và chất gây ung thư mạnh trong cá hồi [53, 54] Cũng trong những năm này, mối liên hệ giữa Aflatoxin và bệnh gan ở người cũng đã được thực hiện

Năm 1974, một ổ dịch viêm gan do AF gây ra đã được báo cáo ở các bang Gujrat và Rajasthan ở Ấn Độ, dẫn đến ước tính có 106 ca tử vong [46] Các ổ dịch kéo dài trong 2 tháng và được giới hạn ở những người có lương thực chính là ngô

Các mẫu ngô đã được thử nghiệm và phân tích cho thấy các mẫu chứa Aspergillus

flavus [16, 46] Các triệu chứng trong làng bao gồm cổ trướng và phù nề của vùng

ngoại biên thấp hơn, cả hai triệu chứng của bệnh xơ gan và các bệnh gan khác Bởi

vì Aflatoxin gây ra mối đe dọa nghiêm trọng như chất gây ung thư, IARC đã đặt Aflatoxin B1 vào danh sách các chất gây ung thư ở người vào năm 1988 Đây là một

số nghiên cứu dịch tễ học được thực hiện ở châu Á và châu Phi đã chứng minh mối liên quan tích cực giữa AF và tế bào gan Một đợt bùng phát Aflatoxin khác ảnh hưởng đến cả người và chó đã được báo cáo ở Tây Bắc Ấn Độ năm 1974 [16] Một đợt bùng phát phơi nhiễm Aflatoxin chính sau đó được ghi nhận ở Kenya vào năm

5

1981 [49, 55] Từ những phát hiện ban đầu này, các nghiên cứu chuyên sâu đã cho thấy nguy cơ tiếp xúc với Aflatoxin gây ra các vấn đề nghiêm trọng cho sức khỏe con người và động vật trên toàn thế giới Khám phá này cũng giúp nâng cao nhận thức về mối nguy hiểm tiềm tàng của nấm mốc trong các ca ngộ độc thức ăn Các nghiên cứu khác sau đó còn chỉ ra rằng, Aflatoxin còn được nhiều chủng nấm khác

như A Parasiticus, A Nomius và A niger

1.2 Điều kiện sản sinh Aflatoxin

Aflatoxin được sinh ra từ các loài nấm thuộc chi Aspergillus, chủ yếu là

Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus (Hình 1.1) Ngoài ra nó cũng được

sinh ra từ một số ít loài thuộc chi Penicillium Aspergillus phân bố rộng rãi trong tự

nhiên, sinh trưởng dễ ràng trong đất, thực vật mục nát và ngũ cốc đang bị giảm sức

đề kháng vi sinh vật và nó xâm nhập tất cả các loại chất hữu cơ trong điều kiện độ

ẩm cao (ít nhất là 7%) và nhiệt độ cao Nấm Aspergillus sản sinh Aflatoxin trong

điều kiện nhiệt độ từ 8 - 37 độ , tối ưu ở 25-28 độ; độ ẩm tương đối 83-88% (độ ẩm càng cao càng thuận lợi) Khí hậu nhiệt đới nóng ẩm như ở nước ta tạo điều kiện

thuận lợi cho nấm mốc Aspergillus phát triển và sản sinh Aflatoxin

Chúng có thể tạo khuẩn lạc và gây nhiễm vào các loại hạt trước khi thu hoạch, trong thu hoạch và trong quá trình bảo quản Các loại nông sản thường bị nhiễm Aflatoxin là ngũ cốc (ngô, kê, lúa miến, gạo, lúa mì), hạt có dầu (lạc, đậu tương, hạt hướng dương, hạt bông), gia vị (ớt, hạt tiêu đen, rau mùi, nghệ, gừng) và các loại quả hoặc hạt khác như hạt dẻ, dừa… Chính vì thế, khi sử dụng các nông sản nhiễm nấm mốc này làm thực phẩm hoặc chế biến thức ăn chăn nuôi thì rất nguy hiểm Cho đến nay đã có hơn 20 loại Aflatoxin được tìm thấy, trong đó Aflatoxin B1 là độc nhất Sau khi Aflatoxin B1 vào cơ thể động vật có vú, ngoài việc trực tiếp chuyển hóa gây độc gan, gây ung thư thì chúng tiếp tục chuyển hóa thành AFM1 bài tiết qua sữa Chính vì vậy AFM1 còn được gọi là ―độc tố sữa‖ Mặc dù tính độc AFM1 chỉ bằng 10% tính độc của AFB1 nhưng khả năng gây ung thư, gây đột biến

và các nguy cơ suy giảm hệ miễn dịch, chậm lớn tiếp tục ảnh hưởng sức khỏe người

6

tiêu dùng khi họ sử dụng sữa và các sản phẩm sữa, nhất là trẻ em AFM1 lần đầu được phát hiện có trong sữa Tỷ lệ Aflatoxin từ thức ăn nhiễm vào sữa ở bò sữa trung bình là 1 – 2% Tuy nhiên, bò tiêu thụ một lượng thức ăn lớn, tỷ lệ mang AFM1 vào sữa có thể đạt 6,2%

Aspergillus flavus

Aspergillus parasiticus Hình 1.1 Nấm Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus và các bào tử nấm được nhìn

dưới kính hiển vi, độ phóng đại 600 lần [75, 76]

1.3 Đặc điểm của Aflatoxin

1.3.1 Cấu trúc hóa học và phân loại

Aflatoxin là một độc chất thuộc nhóm mytocoxin, có khả năng gây ngộ độc, tổn thương gan và ung thư cho động vật và con người nếu tiêu thụ thường xuyên.Có khoảng 20 chất chuyển hóa nấm liên quan đến Aflatoxin được sản xuất chủ yếu bởi

loài Aspergillus flavus, A nomus và A Parasiticus, trong đó 6 loại điển hình bao

7

gồm AFB1, AFB2, AFG1, AFG2, AFM1 và AFM2 [28] Chúng là các phân tử difuranocoumarins với hai chuỗi cấu trúc hóa học quan trọng bao gồm chuỗi difurocoumarocyclopentenone (AFB1, AFB2, AFM1, AFM2 và aflatoxicol) và chuỗi difurocoumarolactone (AFG1, AFG2) Chữ ―B‖ và ―G‖ đề cập đến màu huỳnh quang xanh lam (Blue) và xanh lục (Green) được tạo ra bởi Aflatoxin dưới ánh sáng tia cực tím trên bản sắc ký lớp mỏng, trong khi số chỉ số 1 và 2 cho biết các hợp chất lớn và nhỏ, tương ứng AFM1 và AFM2 là các chất chuyển hóa tương ứng của AFB1 và AFB2 xuất hiện trong dịch cơ thể [33, 36]

Hình 1.2 Cấu trúc 2 nhóm Aflatoxin điển hình và G [19]

Aflatoxin B1 và B2 được sinh ra bởi nấm A flavus và A parasiticus, còn

Aflatoxin G1 và G2 được sinh ra bởi nấm A parasiticus Cấu trúc của chúng được

khám phá bởi nhóm nghiên cứu của Büchi vào năm 1963 (AFB1 và AFG1), năm

1965 (AFB2 và AFG2) [9, 10] Nhóm nghiên cứu này cũng đã làm sáng tỏ hoàn toàn hóa học lập thể của Aflatoxin nhóm B và G bằng sự phân dã hóa học Về mặt cấu trúc, những hợp chất Aflatoxin gồm 5 vòng, có một vòng furo furan (B và C), một

8

vòng thơm 6 cạnh (A), một vòng lactone 6 cạnh (D) và một vòng pentanone 5 cạnh hoặc một vòng lactone sáu cạnh (E) Các Aflatoxin nhóm B có một vòng cyclopentane trong khi đó nhóm G có chứa vòng lactone [33] Trong số các Aflatoxin được đề cập thì Aflatoxin B1 là loại phổ biến nhất và có mặt trong hơn 75% các mẫu thực phẩm và thức ăn chăn nuôi được kiểm tra có nhiễm Aflatoxin [12, 25, 37]

Hình 1.3 Các nhóm Aflatoxin khác[16]

Aflatoxin M1 và M2 là các dẫn xuất hydroxyl hóa của Aflatoxin B1 và B2, thường được gọi là ―độc tố sữa‖ Aflatoxin M1 là chất chuyển hóa của Aflatoxin B1 trên người và động vật (trong sữa mẹ có thể phơi nhiễm tới mức ng) còn Aflatoxin M2 là chất chuyển hóa của Aflatoxin B2 trong sữa của bò được cho ăn thức ăn nhiễm độc

tố Aflatoxin B2 Trong cấu trúc của chúng có nhóm hydroxy ở điểm giao nhau của hai vòng furan Mặc dù là dẫn xuất của Aflatoxin B1 và B2, Aflatoxin M1 và M2 vẫn giữa được tính bền nhiệt trong quá trình chế biến sữa [66]

AFM1 là dẫn xuất 4- hydroxyl của AFB1 và được tạo ra dưới tác dụng của Cytochrom P450, từ đó nó có thể đi vào tuần hoàn động vật có vú và được bài tiết vào sữa của động vật cho con bú Công thức phân tử của AFM1 là C17H12O7 Khối lượng phân tử là 328,276 g/mol

9

AFM1 có cấu trúc gồm 5 vòng, có một vòng furo furan (B và C), một vòng thơm 6 cạnh (A), một vòng lactone 6 cạnh (D) và một vòng pentanone 5 cạnh (E) Trong cấu trúc của chúng có nhóm hydroxy ở điểm giao nhau của hai vòng furan

Các Aflatoxin được tìm thấy khác có nhóm hydroxyl thay vì nhóm cacbonyl ở vòng

E (R0, RB1, RB2, H1) Chúng được hình thành bằng chuyển hóa sinh học hoặc hóa học với natri borohydride Ở một số Aflatoxin, vòng D hoặc E mở Aflatoxin B3 còn

được gọi là parasiticol, vì nó là lần đầu tiên phân lập từ Aspergillus parasiticus Tất

cả các Aflatoxin thể hiện trong Hình 1.3 là các sản phẩm chuyển hóa trao đổi chất

bị phá hủy khi đun nấu thông thường hay thanh trùng, dễ bị tia tử ngoại phá hủy, đun trong nồi áp suất, xử lý bằng các chất oxy hóa Aflatoxin nhóm B có tính phát huỳnh quang màu xanh lam, trong khi đó nhóm G lại có khả năng phát huỳnh quang màu xanh lục dưới ánh sáng tử ngoại Do đó, chúng ta có thể dựa vào tính phát quang này để nhận biết và phân biệt giữa nhóm B và G AFM1 phát huỳnh quang mạnh, phát ra ánh sáng xanh tím

1.3.2.2 Tính chất hóa học

Trong phân tử Aflatoxin có vòng lactone nên dễ bị thủy phân bởi các bazo mạnh, nên có thể dùng kiềm để xử lý thực phẩm nhiễm Aflatoxin Tuy nhiên khi axit hóa thì các Aflatoxin lại được tái tạo Ở nhiệt độ cao sẽ làm mở vòng decarboxylation, dẫn đến mất mát các nhóm methoxy từ vòng thơm

10

Nhiều tác nhân oxy hóa như hypochloride natri, thuốc tím, chlorine, H2O2, ozone,… phản ứng với Aflatoxin và thay đổi cấu trúc phân tử của chúng, một số phản ứng làm mất huỳnh quang

1.3.3 Sự chuyển hóa và bài tiết Aflatoxin

Quá trình loại bỏ (trao đổi chất và bài tiết) của các chất hóa học khỏi cơ thể liên quan đến hai giai đoạn chính Giai đoạn I chuyển hóa các chất hóa học có liên quan đến việc bổ sung một nhóm cực nhỏ chứa cả các điện tích dương và âm được thêm vào xenobiotics giống như Aflatoxin bởi quá trình oxy hóa, acetyl hóa và thủy phân

và làm cho nó vô hại Giai đoạn I chủ yếu được trung gian bởi các hệ thống enzyme Cytochrome P450 (CYP450) Chuyển hóa giai đoạn II liên quan đến các phản ứng liên hợp sulfate, glucuronide, glutathione và amino acid

Sự chuyển hóa của AFB1 đã được nghiên cứu bởi Wild và cộng sự, 2002; Gallagher và cộng sự, 1996; Vondracek và cộng sự, 2001 (Hình 1.4) [31, 69, 70].Aflatoxin trải qua quá trình chuyển hóa pha I bởi phản ứng oxy hóa bao gồm phản ứng epoxid hóa, hydrat hóa, hydroxyl hóa và phản ứng oxy hóa O-demethyl hóa liên quan đến siêu họ enzyme Cytochrome P450s (CYP450s) để tạo AFB1-exo-8,9-epoxide (AFBO), AFB2a, AFM1, AFQ1 và AFP1 AFBO là chất gây ung thư trong khi các chất chuyển hóa khác ít độc hơn và được liên kết với các phân tử khác

để nhanh chóng bài tiết qua mật và nước tiểu

mà được bài tiết qua nước tiểu [70]

Các chất chuyển hóa AFB1 của giai đoạn I chuyển hóa qua quá trình chuyển hóa enzym giai đoạn II bởi glutathione S-transferases (GST), chủ yếu xúc tác phản ứng liên hợp AFB1-exo-8,9-epoxide có thể được chuyển hóa ngược lại hoặc thành Aflatoxin-mercapturic acid thông qua con đường trung gian cộng hợp GST hoặc thành Aflatoxin-glucuronide thông qua con đường Aflatoxin-dihydrodiol Dạng hoạt hóa của AFB1 (exoeposide và endoepoxide) bị khử độc thông qua quá trình

12

cộng hợp trung gian GST (glutathione S-transferase) sử dụng glutathione dạng khử (GSH) để tạo thành các cộng hợp AFB1 exoepoxidep-GSH và endoexposide-GSH tương ứng [42] Các exoeposide và endoeposide dạng hoạt động cũng sẽ bị thủy phân nhanh chóng (không bởi enzyme) để tạo thành Aflatoxin B1-8,9-dihydridiol

rồi nhanh chóng chuyển hóa thành một ion dialdehyde phenolate [42, 70]

Ion dialdehyde phenolate sau đó bị thủy phân bởi Aflatoxin aldehyde reductase (AFAR) tạo thành một dialcohol trong phản ứng khử phụ thuộc NADPH Aflatoxin

B1 dialdehyde cũng tạo phản ứng với nhóm amin bậc một của các gốc axit amin như lysine trong phân tử protein như albumin để tạo thành dạng cộng hợp Aflatoxin B1- albumin [70] Cộng hợp này tồn tại trong hệ thống mạch máu dưới dạng một dẫn xuất Aflatoxin B1-albumin bền vững

Ngoài gan, Aflatoxin cũng được chuyển hóa trong các tế bào ruột của biểu mô ruột non có chứa hàm lượng enzyme CYP3A cao và điều này có thể làm giảm sự hấp thu toàn thân của chúng Các lipoxygensase và prostaglandin H synthase cũng cung cấp một con đường quan trọng của sự trao đổi chất Aflatoxin trong các cơ quan ngoài gan khác

Bằng chứng về việc bài tiết Aflatoxin đã được tìm thấy trong thịt, sữa và trứng, cho thấy nguy cơ tiếp xúc với Aflatoxin của con người, một nguyên nhân tiềm ẩn của bệnh aflatoxicosis thứ phát AFM1 đại diện cho 95% Aflatoxin được phát hiện trong sữa AFM1 thường được phát hiện trong sữa trong vòng 12 giờ sau khi sử dụng thức

ăn có chứa AFB1 Nồng độ của AFM1 trong sữa tăng tuyến tính trong vài ngày trước khi đạt được trạng thái ổn định cuối cùng, khi trạng thái cân bằng giữa lượng và bài tiết được thiết lập, và đã được chứng minh là giảm khi thức ăn bị ô nhiễm được rút

ra, đạt đến mức không thể phát hiện sau 4 ngày 5 ngày Mức độ bài tiết qua sữa ở

bò sữa bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố dinh dưỡng và nội sinh, bao gồm giống, sức khỏe của động vật, khả năng biến đổi sinh học của gan, giai đoạn cho con bú và sản xuất sữa thực tế Do đó, sự bài tiết của AFM1 trong sữa có thể khác nhau rất nhiều giữa các con vật, từ ngày này sang ngày khác và từ lần vắt sữa này sang lần khác

13

Từ dữ liệu thu được trong các nghiên cứu khác nhau, tỷ lệ AFM1 trong sữa của bò sữa được thiết lập nằm trong khoảng từ 0,3% đến 6,2% Tỷ lệ cao hơn được ghi nhận ở những con bò có năng suất cao, do mức tiêu thụ thức ăn đậm đặc cao hơn đáng kể

1.3.4 Độc tính của Aflatoxin

Độc tính gây ung thư do Aflatoxin đã được báo cáo ở cả người và động vật trên toàn cầu và trong các nghiên cứu thực nghiệm ở nhiều loài động vật khác nhau đã cung cấp bằng chứng về khả năng gây ung thư của Aflatoxin Tính gây ung thư của Aflatoxin đã được phân loại dựa trên các bằng chứng được quan sát thấy ở động vật thí nghiệm là ―bằng chứng đầy đủ về khả năng gây ung thư của AFB1, AFG1 và AFM1 tự nhiên , bằng chứng giới hạn cho AFB2 và bằng chứng không đầy đủ cho AFG2‖ AFB1 có độc tính gây ung thư mạnh nhất đặc biệt là ung thư gan, ung thư biểu mô tế bào gan (HCC) và AFB2 là chất gây ung thư gan ít nhất Khả năng gây ung thư và độc tính của AFB1, AFG1, AFM1, AFB2 và AFG2 có liên quan đến sự chuyển hóa sinh học trong các loài động vật khác nhau bao gồm con người, chuột, vịt và nhiều động vật khác

AFB1 trải qua quá trình oxy hóa trong gan để tạo AFB1-8,9-epoxide (AFBO, còn được gọi là AFB1-2,3-epoxide trong các tài liệu cũ) để gây tác dụng gây ung thư cho gan, đặc biệt là HCC Hiệu lực gây ung thư của AFB1 tương quan chặt chẽ với mức độ liên kết cộng hóa trị của AFBO với DNA, khả năng kích hoạt các cơ chế biểu sinh và sự ức chế gen P53 (gen ức chế khối u) Sự hình thành AFBO đã được báo cáo là một yếu tố quyết định quan trọng của sự khác biệt về tính nhạy cảm của Aflatoxin đối với ung thư đặc biệt là HCC ở các loài động vật khác nhau Ở vịt, chúng dễ bị nhiễm độc AFB2 so với các loài động vật khác AFB2 gây độc tính cho gan đối với vịt và điều này là do gan của vịt có khả năng chuyển hóa sinh học AFB2 thành AFB1 sau đó tiếp tục kích hoạt bằng các phản ứng trao đổi chất thông qua con đường epoxid hóa như AFB1 AFB2 được kích hoạt trong gan bằng 2,3 desaturation thành AFB1 Ở người và động vật gặm nhấm, sự mất bão hòa

14

AFB2 trong gan không xảy ra và điều này làm giảm tiềm năng gây ung thư của nó hơn 150 lần so với AFB1 Ở người và các động vật khác, AFB1 được kích hoạt trong gan dẫn đến sự hình thành AFB1-2,3-epoxide là một hợp chất hóa học gây ung thư mạnh AFB2 không trải qua cùng một lộ trình trao đổi chất như AFB1 do thiếu sự liên kết đôi 2,3 trong hợp chất Biến đổi sinh học của AFB2 thành AFB1-2,3-epoxit xảy ra thông qua sự hình thành trung gian AFB1 bằng sự khử bão hòa ở 2,3-cacbon của AFB2 Và do đó, tỷ lệ chất bổ sung axit nucleic được hình thành từ hai hợp chất (AFB1 và AFB2) được báo cáo là tương tự với các chất gây ung thư của hai Aflatoxin đến khoảng 1: 100 (AFB2 : AFB1) Tuy nhiên, sự hình thành một lượng nhỏ AFB1 từ AFB2 được cho là nguyên nhân gây ung thư của AFB2 ở người và động vật AFB1, AFM1 và AFG1 được báo cáo là gây ra nhiều loại ung thư khác nhau ở các loài động vật khác nhau Tuy nhiên, sự khác biệt về khả năng gây ung thư của các Aflatoxin này phụ thuộc vào sự thay đổi tế bào khi chúng liên kết với các DNA và các phân tử sinh học khác trong cơ thể AFG1 liên kết với DNA và làm sai nhiễm sắc thể ở loài gặm nhấm được điều trị trong cơ thể AFB1 chủ yếu gây ung thư gan ở người và động vật gặm nhấm trong khi AFG1 ngoài ra gây ung thư thận ở động vật gặm nhấm thí nghiệm

Ban đầu, AFM1 được phân loại là chất gây ung thư ở người 2B theo IARC Các nghiên cứu tiếp theo, được cải thiện về thiết kế, kích thước và độ chính xác của phép đo dấu sinh học phơi nhiễm, cho phép phân loại lại AFM1 như một chất gây ung thư ở nhóm 1 Mặc dù đã chứng minh rằng AFB1 phải được chuyển đổi thành epoxide để liên kết với protein và gây ra tác dụng độc cấp tính, quá trình này dường như không quan trọng đối với độc tính tế bào của AFM1 Trong các dòng tế bào người (MCL5), AFM1 đã chứng minh tiềm năng độc hại trực tiếp khi không có hoạt hóa chuyển hóa, trái ngược với AFB1 Gần đây, độc tính tế bào trực tiếp AFM1 đã được xác minh trong tế bào ruột người nuôi cấy (Caco-2) Kết quả độc tế bào liên quan đến việc tạo ra các loại oxy phản ứng nội bào (ROS) cũng đã được quan sát Các phát hiện được mô tả ở trên cho thấy rằng việc tiếp xúc với AFM1 trong sữa có thể đóng một vai trò quan trọng gây bệnh trong các trường hợp quan sát thấy bệnh

15

aflatoxicosis Sự hiện diện của AFM1 và các sản phẩm phụ trong sữa là mối quan tâm toàn cầu vì một lượng nhỏ chất này có thể gây nguy hiểm đối với người tiêu dùng một lượng lớn sữa, như trẻ em, hơn nữa, dễ bị ảnh hưởng bởi tác động bất lợi của độc tố nấm mốc Ở Kenya, trẻ nhỏ được cai sữa bằng sữa bò khi còn nhỏ; tiêu thụ sữa bị nhiễm AFM1 có thể làm giảm sự phát triển như thiếu cân, giảm khả năng miễn dịch khiến trẻ dễ mắc các bệnh khác, gây tổn thương thần kinh và thậm chí tử vong cao

1.4 Tình hình nhiễm độc Aflatoxin trên thế giới và ở Việt Nam

1.4.1 Trên thế giới

Từ năm 2004, nhiều đợt bùng phát aflatoxicosis đã được báo cáo trên toàn thế giới, dẫn đến 500 bệnh cấp tính và 200 ca tử vong [13, 49] Ngộ độc cấp do tiêu thụ lượng lớn Aflatoxin gấp hàng ngàn lần hàm lượng cho phép hiếm khi xảy ra nhưng gây tử vong cao, với vụ dịch gần nhất được ghi nhận tại Kenya, 2004 (317 ca mắc và 125 tử vong) và trước đó tại Ấn Độ, 1974, với tổng lượng Aflatoxin từ ngô ước tính trung bình là 2-6 mg/người/ngày (397 ca mắc và 106 tử vong) [55] Năm

2013, nhiễm Aflatoxin ở sữa cũng được ghi nhận một số nước châu Âu như tại Romania, Serbia và Croatia

Trên thế giới, Aflatoxin cũng được cho nguyên nhân của 25200-155000 trường hợp ung thư tế bào gan hàng năm, chiếm 5-28% tổng số gan ung thư tế bào gan trên thế giới Aflatoxin hiện diện ở nhiều loại thực phẩm và theo ước tính, khẩu phần ăn của người sống tại vùng Đông Nam Á có tổng lượng Aflatoxin trung bình một ngày là 30-100 ng/kg thể trọng/ngày Hàm lượng phơi nhiễm trung bình này có liên quan đến nguy cơ ung thư tế bào gan do chất này là 3-10 ca/1 triệu dân/năm So với người không nhiễm, người đồng nhiễm viêm gan siêu vi B và Aflatoxin có nguy

cơ ung thư tế bào gan cao gấp 30 lần

Sữa là một loại thực phẩm giàu dinh dưỡng và vi lượng cần thiết cho sự tăng trưởng, phát triển và duy trì sức khỏe của con người Tuy nhiên, sự tồn tại của AFM1 trong sữa là nguy cơ tiềm ẩn đối với sức khỏe cộng đồng Ở những quốc gia

16

có khí hậu khô hoặc vào mùa khô hạn, tỷ lệ và mức độ nhiễm AFM1 cao vì có điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của nấm mốc do đó gây nhiễm AFB1 trong thức ăn chăn nuôi Trẻ em dưới 15 tuổi đặc biệt dễ bị nhiễm độc tố mycotoxin, bao gồm AFM1, chủ yếu là do khả năng loại bỏ độc tố thấp, tốc độ tăng trưởng nhanh, lượng thức ăn và nước uống cao trên một đơn vị trọng lượng cơ thể Từ tập hợp dữ liệu có sẵn của các quốc gia, hàm lượng AFM1 được định lượng trong các mẫu sữa nguyên liệu Costa Rica, Ethiopia, Jordan và Iran là những quốc gia có tỷ lệ nhiễm cao Một

số tác giả đã báo cáo sự hiện diện của AFM1 trong sữa mẹ trên khắp thế giới như ở Nigeria, Thổ Nhĩ Kỳ, Ai Cập, Iran và Ý, với sự khác biệt lớn về mức độ ô nhiễm AFM1 (0,13 đến 1,730 ng/L) Ở Brazil, nồng độ AFM1 thấp trong sữa mẹ đã được báo cáo

Nghiên cứu khảo sát về sự xuất hiện của AFM1 trong các mẫu sữa đã được thực hiện ở Ardabil, Iran Các mẫu được lấy từ các cửa hàng địa phương của thành phố Ardabil trong các mùa khác nhau để giải quyết dữ liệu đại diện về AFM1 trong sữa được tiêu thụ bởi người dân ở thành phố này Tất cả các mẫu (100%) đều bị nhiễm AFM1 ở nồng độ dao động từ 2,9 đến 85 ng/kg Trong 30 mẫu (33% tổng số mẫu), mức AFM1 cao hơn 50 ng/kg, giới hạn dư lượng tối đa (MRL) được Liên minh Châu Âu chấp nhận cho AFM1 trong sữa Sự khác biệt của mức AFM1 giữa các mùa có ý nghĩa thống kê (p< 0,05) Mức độ ô nhiễm cao nhất và thấp nhất được phát hiện trong mùa đông và mùa hè lần lượt là 17,4 và 56,3 ng/kg Đây là báo cáo đầu tiên về sự xuất hiện của AFM1 trong các mẫu sữa của Ardabil, một trong những khu vực sản xuất sữa chính ở Iran

1.4.2 Tại Việt Nam

Tại Việt Nam chưa có khảo sát diện rộng về nhiễm độc AFM1 trong sữa, tuy nhiên việc nhiễm độc AFB1 trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi đã được công bố trong nhiều nghiên cứu

17

Năm 1988, Viện Dinh dưỡng đã báo cáo kết quả nghiên cứu thăm dò afltoxin

B1 trong lạc và sản phẩm từ lạc: kết quả cho thấy 7/55 mẫu lạc nhân có chứa

Aflatoxin, chiếm 13%

Trong giai đoạn 1990-1995, Viện Dinh dưỡng đã kiểm tra 387 mẫu lương thực thực phẩm trong đó có 73 mẫu (19%) bị nhiễm Aflatoxin và 19 mẫu (4,9%) có hàm lượng Aflatoxin vượt quá giới hạn cho phép của Bộ Y tế

Kết quả khảo sát phân tích trên 243 mẫu ngô, lạc và sản phẩm chế biến làm thức ăn chăn nuôi tại 3 xã thuộc huyện Tân Kỳ - Nghệ An đã phát hiện mức độ và nguy cơ nhiễm Aflatoxin khá cao: trên 95,4% (232/243) số mẫu lấy tại các hộ gia đình đang bảo quản phát hiện có nhiễm Aflatoxin và tỷ lệ vượt giới hạn cho phép theo quy định của Bộ Y tế là > 23% (56/243 mẫu) Trong số 243 mẫu, có 56 mẫu có hàm lượng Aflatoxin > 10 ppb; 22 mẫu có hàm lượng AF từ 5-10 ppb; 50 mẫu có hàm lượng AF từ 2-5 ppb [4]

Theo nghiên cứu của Đậu Ngọc Hào và các cộng sự, mức nhiễm nấm mốc và Aflatoxin trên ngô của các tỉnh Sơn La và Thanh Hóa cho thấy 50-80 % số mẫu (24

mẫu ngô hạt và 24 mẫu ngô bột) bị nhiễm Aspergillus flavus [1]

Viện Vệ sinh Y tế công cộng Tp Hồ Chí Minh đã tiến hành phân tích các mẫu gửi tới kiểm nghiệm Kết quả cho thấy trong 115 mẫu (gồm sản phẩm chế biến

từ đậu phộng, nước tương làm từ đậu nành, đồ hợp chay làm từ các loại đậu phù và bột mì, cà phê, thức ăn chăn nuôi) có 30% mẫu cà phê, 42,9% mẫu nước tương, 66,7% mẫu đồ hộp chay và 68,2% mẫu động phộng và sản phẩm từ đậu phộng bị nhiễm AFB1 Đặc biệt đáng quan tâm là 94,6% mẫu thức ăn chăn nuôi có chứa Aflatoxin AFB1 Hầu hết các mẫu bị nhiễm Aflatoxin đều ở hàm lượng rất cao (>

10 ppb), đặc biệt có mẫu chứa 140 - 300 ppb

Gần đây nhất, trong tháng 5/2017, nhằm giám sát Aflatoxin trong ớt khô, cán

bộ Viện Pasteur TP.HCM đã tiến hành giám sát chủ động có chủ đích, tập trung vào các mẫu ớt khô có nguy cơ cao (ớt khô không có đóng gói, không có xuất xứ rõ ràng) được bày bán ở một số điểm kinh doanh nhỏ lẻ ở một số tỉnh, thành phố Kết

18

quả xét nghiệm phát hiện 20,8% số mẫu vƣợt ngƣỡng AFB1 quy định theo quy chuẩn kỹ thuật Việt Nam Đây là dấu hiệu chỉ điểm, giúp rà soát lại chuỗi thực phẩm từ công tác canh tác, thu hoạch, vận chuyển, chế biến, bảo quản và sử dụng ở

ớt khô không bao bì và không rõ nguồn gốc

Theo nghiên cứu của Trần Văn An (1991), hàm lƣợng Aflatoxin trong một

số nguyên liệu làm thức ăn chăn nuôi ở Việt Nam nhƣ sau:

ảng 1.1 Lượng Aflatoxin trong nguyên liệu làm thức ăn chăn nuôi ở Việt Nam

Tên nguyên liệu Số mẫu Hàm lƣợng Aflatoxin

trung bình (ppb)

Hàm lƣợng Aflatoxin tối đa (ppb)

19

1.5 Quy định hiện hành về Aflatoxin

Theo thống kê của FAO năm 2003 nhiều quốc gia trên thế giới có quy định nghiêm ngặt về hàm lượng Aflatoxin B1 trong thức ăn chăn nuôi của động vật cho sữa và hàm lượng Aflatoxin M1 trong sữa

ảng 1.2: Mức giới hạn về Aflatoxin 1 trong thức ăn chăn nuôi và Aflatoxin M1 trong sữa

của các quốc gia trên thế giới[74]

Mức giới hạn

Aflatoxin B1

50 µg/kg

25 µg/kg

20 µg/kg

15 µg/kg 10 µg/kg 5 µg/kg

Mức giới hạn

Aflatoxin M1

15 µg/kg

5 µg/kg

0,5 µg/kg 0,2 µg/kg

0,05 µg/kg 0

Ở Việt Nam theo quy chuẩn kỹ thuật quốc gia QCVN 01-12:2009/BNNPTNT hàm lượng Aflatoxin tối đa cho phép trong thức ăn hỗn hợp hoàn chỉnh đối với nhóm lợn từ 1-28 ngày tuổi là 10 µg/kg và nhóm lợn còn lại là 50 µg/kg, còn với thức ăn hỗn hợp thủy sản là 10 µg/kg theo QCVN 02 - 31 - 1: 2019/BNNPTNT Sử phương pháp xác định Aflatoxin B1 bằng HPLCtheo TCVN 6953: 2001 (ISO 14718: 1998)hoặc HPLC có dẫn xuất sau cộttheo TCVN 9126: 2011 (ISO 17375:2006) Mức giới hạn tối đa nhiễm độc tố vi nấm Aflatoxin M1 trong sữa tươi nguyên liệu là 0,5 µg/kg theo QCVN 01-186: 2017/BNNPTNT Phương pháp xác định Aflatoxin M1 trong sữa và sữa bộtlà làm sạch bằng sắc kí ái lực miễn dịch và xác định bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao theo TCVN 6685: 2009 (ISO 14501:2007)

1.6 Các phương pháp loại bỏ và kiểm soát Aflatoxin

Aflatoxin có thể được kiểm soát cả trước và sau thu hoạch Can thiệp sau thu hoạch bao gồm các biện pháp phòng ngừa qua việc kiểm soát các điều kiện bảo quản (độ ẩm, nhiệt độ, côn trùng) ảnh hưởng đến ô nhiễm và sản sinh độc tố bởi

20

nấm mốc Các phương pháp vật lý, hóa học và sinh học thường xuyên được sử dụng

để loại bỏ Aflatoxin khỏi thực phẩm đã bị ô nhiễm.Loại bỏ các hạt, hạt hoặc hạt bị

hư hỏng do nấm mốc ra khỏi hàng hóa đã được quan sát thấy làm giảm 40% Aflatoxin [56] Trộn là phương pháp dựa trên việc trộn vật liệu bị ô nhiễm với vật liệu không bị nhiễm bẩn theo tỷ lệ mong muốn dựa trên mức độ ô nhiễm

Ammoniation là một công cụ hữu ích được thực hiện thành công ở nhiều quốc gia [68] Các Aflatoxin AFB1 và AFG1 được loại bỏ hoàn toàn bằng cách xử

lý ozone ở mức 8,5 - 40 ppm ở các nhiệt độ khác nhau, nhưng AFB2 và AFG2không bị ảnh hưởng bởi phương pháp này [5]

Vi khuẩn Flavobacterium aurantiacum đã loại bỏ AFM1 khỏi sữa [72] Các

loài Rhodococcus có khả năng làm suy giảm Aflatoxin [67] Các loại nấm như

Pleurotus Ostreatus, Trametes Verscolor, Trichosporon mycotoxinivorans, S cerevisiae, Trichoderma và Armillariella tabescens được biết là biến đổi AFB1

thành các dạng ít độc hơn [34].Các phương pháp enzyme như sử dụng chitinase, không hiệu quả về mặt kinh tế Tuy nhiên, sử dụng vi sinh vật và enzyme được ưu tiên cho sự phân hủy sinh học của Aflatoxin do tính chất thân thiện với môi trường của nó

Một chiến lược đã nhận được sự chú ý đáng kể để giảm Aflatoxin trước khi thu hoạch là kiểm soát sinh học bằng cách sử dụng các chủng A flavus không có độc tính Những tiến bộ trong nghiên cứu Aspergillus thông qua các phương pháp tiếp cận bộ gen đã giúp hiểu rõ hơn về sự đa dạng phân tử của A flavus trong cơ chế sinh tổng hợp Aflatoxin Các chủng không tạo độc tố xuất hiện tự nhiên, và có

khả năng cạnh tranh và thay thế các chủng độc tố Các chủng A flavus không độc

hại được khai thác để áp dụng cho cánh đồng bông tại Arizona để kiểm soát Aflatoxin [11] Cách tiếp cận này đã được triển khai trên các loại cây trồng như bông, ngô, đậu phộng, quả sung và quả hồ trăn ở Mỹ, ngô ở Châu Phi và đậu phộng

ở Úc, Argentina và Trung Quốc Chiến lược này cũng đã được sử dụng cho ngô ở

và luân canh cây trồng, giúp kiểm soát hiệu quả nhiễm A flavus trên đồng ruộng

[28].Giải pháp ổn định và lâu dài nhất để kiểm soát ô nhiễm Aflatoxin trước thu hoạch là thông qua việc tăng cường khả năng chống nhiễm nấm và ngăn chặn sản xuất Aflatoxin do nấm xâm nhập Điều này có thể đạt được thông qua nhân giống cây trồng hoặc thông qua kỹ thuật di truyền của cây trồng quan tâm Tuy nhiên, các quá trình này rất tốn công và thời gian

Tiếp xúc với Aflatoxin cần phải được giữ ở mức thấp nhất có thể để bảo vệ người tiêu dùng Nhiều quốc gia có quy định quản lý Aflatoxin trong thực phẩm với giới hạn chấp nhận được quy định và hầu hết đều có mức cho phép tối đa hoặc chấp nhận được đối với các loại thực phẩm khác nhau Aflatoxin làm tổn hại sức khỏe và

cơ hội kinh doanh, và các nước nhập khẩu đang áp đặt các quy định ngày càng nghiêm ngặt hơn

1.7 Các dung môi tách chiết Aflatoxin

Việc phát hiện và định lượng Aflatoxin trong các mẫu thực phẩm đòi hỏi một bước chiết xuất hiệu quả Aflatoxin thường hòa tan trong các dung môi như metanol, acetone, chloroform và acetonitril Ngoài ra, người ta còn sử dụng etanol

và ethylacetate pha trộn theo tỷ lệ khác nhau Muối và nước cũng được bổ sung để tăng hiệu quả tách chiết Aflatoxin [44, 51, 61, 65]

1.8 Các phương pháp phát hiện Aflatoxin

1.8.1 Phương pháp sắc kí

Sắc ký lớp mỏng lần đầu tiên được sử dụng bởi de Iongh và cộng sự [20], được chứng nhận bởi Hội các nhà hóa học phân tích (AOAC) như là phương pháp được

22

ưa chuộng từ những năm 1990 [26] TLC đã được sử dụng rộng rãi để xác định Aflatoxin trong các loại thực phẩm khác nhau Phương pháp này bao gồm một pha tĩnh làm từ silica hoặc alumina hoặc cellulose được cố định trên một vật liệu trơ như thủy tinh, hoặc nhựa và được gọi là chất nền Pha động bao gồm hỗn hợp các dung môi methanol, chlorofom, acetone, nước Thời gian phân tích kéo dài từ 45 phút đến 2 giờ Ưu điểm của việc sử dụng phương pháp TLC là nó có thể xác định nhiều loạiAflatoxin trong một mẫu đơn Mặc dù, TLC có độ nhạy cao nhưng nó cũng đòi hỏi người phân tích phải có kỹ năng tốt, phải tiền xử lý mẫu và sử dụng thiết bị đắt tiền Ngoài ra, TLC có thể thiếu chính xác do các vấn đề trong quá trình tra mẫu, hiển thị tín hiệu vàphân tích kết quả Những cố gắng để cải thiện TLC đã được phát triển thành một dạng TLC tự động được gọi là sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) Kỹ thuật HPTLC đã khắc phục được các vấn đề nhược điểm của phương pháp TLC thông thường như nạp mẫu, hiển thị và phân tích kết quả tự động Hiện nay, kỹ thuật HPTLC là một trong số những phương pháp chính xác và hiệu quả trong phân tích Aflatoxin [60] Tuy nhiên, do đòi hỏi người thực hiện phân tích phải có kỹ năng tốt, giá thành của thiết bị cao và tiền xử lý mẫu phức tạp nên

kỹ thuật HPTLC chỉ phù hợp cho phân tích tại phòng thí nghiệm và không thể ứng dụng để phân tích Aflatoxin ngoài hiện trường

Sắc ký lỏng hiệu năng cao là kỹ thuật sắc ký phổ biến nhất dùng để phân tách

và xác định trên 80 % các hợp chất hữu cơ trên thế giới [20] Kỹ thuật HPLC sử dụng một pha tĩnh nằm trong cột thủy tinh/ cột nhựa, còn pha động là hỗn hợp nước

và dung môi hữu cơ có thể chạy qua các chất hấp phụ rắn.Mẫu phân tích thường được bơm vào pha tĩnh và các chất cần phân tích được di chuyển dọc theo pha tĩnh bởi pha động sử dụng áp suất cao Các chất cần phân tích được phân bố khác nhau trong pha tĩnh thông qua tương tác vật lý và hóa học với các pha tĩnh và pha động Tại thời điểm một chất nhất định được thôi ra khỏi cột sẽ được ghi nhận bằng một cảm biến và được ghi nhận theo thời gian trễ của nó Các cảm biến ví dụ như cảm biến huỳnh quang (FLD), cảm biến tử ngoại (UV) hoặc cảm biến dãy diode (DAD)

23

có thể được sử dụng để phát hiện và xác định các Aflatoxin Các phương pháp sắc

ký lỏng hiệu suất cao đã được sử dụng để xác định Aflatoxin trong các loại thực phẩm bao gồm các kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu suất cao cùng pha và ngược pha Phương pháp HPLC ngược pha là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất để phân tách và xác định Aflatoxin Sắc ký lỏng hiệu suất cao được xem là một phương pháp xác định Aflatoxin nhanh, chính xác và thời gian phân tích ngắn Độ nhạy của phương pháp có thể đạt được 0,1 ng/kg sử dụng cảm biến FLD Tuy nhiên, việc sử dụng phương pháp HPLC để xác định Aflatoxin cũng có một số hạn chế như mẫu cần được tinh sạch cao sử dụng cột sắc ký ái lực, cần quá trình tạo dẫn xuất trước và sau cột để giảm ngưỡng phát hiện của Aflatoxin B1 và G1 [50] Do đó, để khắc phục hạn chế trong việc tạo sẫn xuất trước khi phân tích Aflatoxin, phương pháp HPLC cũng đã được cải biến bằng cách kết nối với khối phổ và đây là phương pháp hiện nay thường được sử dụng để xác định Aflatoxin Do phương pháp khối phổ không đòi hỏi sử dụng UV hoặc sự hấp thụ của một chất phân tích nên không cần bước tạo dẫn xuất của các Aflatoxin HPLC - MS/MS là một phương pháp sử dụng một lượng nhỏ mẫu để tạo ra thông tin về cấu trúc và có giới hạn phát hiện thấp Tuy nhiên, HPLC-MS/MS là một hệ thống lớn và rất đắt tiền nên chỉ được thực hiện bởi những người được đào tạo và có kỹ năng tốt Phương pháp này cũng chỉ phù hợp để thực hiện phân tích Aflatoxin trong điều kiện phòng thí nghiệm và hoàn toàn không phù hợp để thực hiện tại hiện trường

 Sắc ký khí

Trong sắc kí khí, pha động là khí mang và pha tĩnh là chất lỏng được phủ lên các hạt rắn trơ Tương tự như các phương pháp sắc ký khác, sắc ký khí phân tích mẫu chủ yếu dựa vào phân tách khác nhau của các chất giữa hai pha Pha tĩnh bao gồm các hạt trơ được phủ một lớp chất lỏng và thường được giới hạn trong một ống thép không gỉ hoặc thủy tinh dài được gọi là cột, duy trì ở nhiệt độ thích hợp Mẫu cần phân tích bay hơi vào pha khí và được truyền qua pha tĩnh bằng khí mang Các thành phần hóa học khác nhau trong mẫu được phân bố giữa pha động và pha tĩnh Các thành phần có ái lực cao với pha tĩnh sẽ di chuyển qua cột chậm hơn, và ngược

24

lại, các thành phần có ái lực thấp với pha tĩnh sẽ di chuyển nhanh hơn Mỗi thành phần khác nhau có một hệ số phân bố riêng biệt, từ đó ta dễ dàng điều chỉnh tốc độ

đi qua cột phù hợp với quá trình cần phân tách [18]

Sau khi tách các chất, việc phát hiện các sản phẩm dễ bay hơi được thực hiện bằng cách sử dụng detector FID, ECD hoặc máy đo khối phổ (MS) Do tính không tan trong tự nhiên, có thể cần tạo dẫn xuất Aflatoxin để phát hiện

Sắc ký khí là một phương pháp có thể dùng để phát hiện Aflatoxin, tuy nhiên được sử dụng ít phổ biến hơn trong phân tích thương mại do có nhiều phương pháp sắc ký khác với giá thành rẻ hơn Bên cạnh đó, sắc ký khí cũng đòi hỏi một bước làm sạch ban đầu trước khi phân tích và do đó phương pháp này hạn chế để phân tích một vài độc tố nấm mốc, chẳng hạn như A-trichothecenes và B-trichothecenes Ngay cả trong các phân tích như vậy, sắc ký khí vẫn có những nhược điểm như khó lập đường chuẩn, kết quả dễ bị ảnh hưởng từ các mẫu trước đó [59]

1.8.2 Phương pháp quang phổ

 Quang phổ huỳnh quang:

Cấu trúc của các loại vật liệu dễ dàng được làm sáng tỏ trong vùng ánh sáng UV-VIS bởi sự hấp phụ ở các bước sóng đặc trưng Tuy nhiên, đối với một số phân

tử quá trình hấp thụ sẽ được xảy ra sau sự phát ra các bước sóng ánh sáng khác nhau Các phân tử như vậy được gọi là các chất huỳnh quang Sự phát huỳnh quang

là rất quan trọng trong việc xác định và phân tích các phân tử có khả năng giải phóng năng lượng ở các bước sóng nhất định và đã được sử dụng để phân tích Aflatoxin trong các loại hạt [14] Phương pháp đo huỳnh quang có thể định lượng Aflatoxin từ 5 – 5000 ppb trong thời gian dưới 5 phút Tuy nhiên, để phân tích tốt hơn đối với các Aflatoxin sử dụng thiết bị đo huỳnh quang, việc tạo dẫn xuất có thể

là cần thiết để tăng khả năng phát quang của Aflatoxin Giới hạn phát hiện cao hơn

so với quy định của Châu Âu (4 ug/kg) và do vậy phương pháp này là không phù hợp để kiểm nghiệm các mẫu từ các sản phẩm xuất khẩu vào Châu Âu

• Quang phổ hồng ngoại:

25

Một phương pháp quang phổ khác có khả năng phân tích Aflatoxin hữu hiệu đó

là quang phổ hồng ngoại (IR) Quang phổ hồng ngoại hoạt động dựa vào sự thay đổi trong dao động phân tử phụ thuộc vào sự kích thích bởi bức xạ hồng ngoại Sự dao động các liên kết trong phân tử có thể được ghi nhận Vì kích thước nguyên tử, chiều dài liên kết và cường độ liên kết là có sự khác biệt lớn giữa các phân tử, nên tốc độ mà ở đó một liên kết nhất định hấp thụ bức xạ hồng ngoại sẽ khác nhau đối với từng liên kết và dạng dao động Hai phân tử hữu cơ khác nhau sẽ có có phổ hồng ngoại khác nhau và do vậy mỗi hợp chất sạch có thể được nhận diện bằng việc xác định phổ hồng ngoại của nó Quang phổ hồng ngoại chuyển đổi Fourier đã được

sử dụng để phân tích Aflatoxin trong hạt đậu và bánh hạt đậu Pearson và cộng sự cũng đã sử dụng quang phổ truyền qua và quang phổ phản xạ để xác định Aflatoxin trong hạt ngô [58] Kết quả phân tích cũng cho thấy rằng hơn 95% các loại hạt được phân tích có chứa Aflatoxin trong đó chia thành hai nhóm đó là nhóm có nồng độ Aflatoxin cao (> 100 ppb) và nồng độ Aflatoxin thấp (< 10 ppb)

1.8.3 Phương pháp miễn dịch

Phương pháp miễn dịch đã phát triển từ những năm 1970 do có nhiều ưu điểm [14] Phương pháp này dựa vào tính đặc hiệu của sự gắn kết giữa các kháng thể và kháng nguyên Sự hình thành liên kết kháng nguyên - kháng thể hoặc phức hợp thụ thể có thể được định lượng bằng cách dựa vào sự thay đổi độ hấp thụ của các photon năng lượng ánh sáng quang phổ Trong các trường hợp khác, sự liên kết này

có thể được khuếch đại để nhận dạng tín hiệu tốt hơn Điều này đã đạt được bằng cách sử dụng các chất đánh dấu khác nhau bao gồm các enzym, fluorophore và đồng vị phóng xạ, Nhờ những tiến bộ, kỹ thuật miễn dịch được áp dụng trong một loạt các lĩnh vực/ngành, bao gồm ngành sinh học, thực phẩm và dược phẩm Ưu điểm của phương pháp miễn dịch là mức độ đặc hiệu và độ nhạy cao của chúng ngay cả khi có các vật liệu nhiễm bẩn, không yêu cầu nhân viên có tay nghề cao, ít tốn sức lao động và tiết kiệm thời gian hơn Các phương pháp miễn dịch chính được

sử dụng trong phân tích Aflatoxin bao gồm xét nghiệm phóng xạ (RIA), xét nghiệm miễn dịch liên kết enzyme (ELISA), que thử sắc ký miễn dịch và immunosensors