PHÂN LẬP HỆ VI KHUẨN LACTIC CÓ HOẠT TÍNH BACTERIOCIN TRONG HẠT KEFIR VÀ ỨNG DỤNG

Với mục tiêu tìm hiểu thêm về tổ hợp vi khuẩn lactic trong hạt kefir và khả năng sinh bacteriocin của chủng LAB nên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Phân lập hệ vi khuẩn lactic có

TP HỒ CHÍ MINH, 1/2011

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HOÁ HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP HỆ VI KHUẨN LACTIC CÓ HOẠT TÍNH BACTERIOCIN TRONG HẠT KEFIR VÀ ỨNG DỤNG

CBHD: ThS TRẦN THỊ TƯỞNG AN

KS QUÁCH ĐỨC TÍNH SVTH: NGUYỄN HỮU DOÃN

MSSV: 60600311

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN

LỜI CẢM ƠN

Trong khoảng 4 tháng làm luận văn, tôi xin chân thành cảm ơn sâu sắc đến:

Phó Giáo Sư, Tiến Sĩ Nguyễn Thúy Hương – Bộ môn Công nghệ Sinh học, Đại học Bách Khoa Tp HCM đã nhiệt tình giúp đỡ các vấn đề liên quan và tặng giống vi sinh vật dùng trong đề tài

Thạc Sĩ Trần Thị Tưởng An đã ân cần hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ trong suốt quá trình làm luận văn

Kỹ Sư Quách Đức Tính đã tặng giống và hướng dẫn tận tình trong quá trình thực hiện đề tài này

Các cán bộ phòng thí nghiệm 102, 108 và 117B2 đã tạo điều kiện cho tôi có thể

sử dụng các thiết bị và dụng cụ phục vụ cho đề tài

Cha mẹ và người thân đã giúp đỡ về mặt tinh thần và kinh tế để tôi có thể an tâm hoàn thành luận văn

Các bạn sinh viên lớp HC06BSH – Đại học Bách Khoa Tp HCM đã cùng giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu

Và cuối cùng là gửi đến các quý thầy cô trong hội đồng phản biện đã giành thời gian đọc và nhận xét luận văn này

Tp HCM, ngày 10 tháng 01 năm 2011

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Hữu Doãn

TÓM TẮT

Bacteriocin là một loại protein do vi khuẩn lên men tạo ra Với mục tiêu tìm hiểu thêm về tổ hợp vi khuẩn lactic trong hạt kefir và khả năng sinh bacteriocin của chủng

LAB nên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Phân lập hệ vi khuẩn lactic có hoạt tính

bacteriocin trong hạt kefir và ứng dụng” Quá trình thí nghiệm chúng tôi đã thực hiện

những nội dung và đạt kết quả như sau:

Nội dung đề tài:

1 Phân lập hệ vi khuẩn lactic từ hạt kefir có nguồn gốc từ bộ môn Công nghệ sinh học – Đại học Bách Khoa Tp HCM, thử khả năng sinh hoạt tính bacteriocin, định danh chủng mục tiêu bằng bộ kit API 50 CHL

2 Lên men thu nhận bacteriocin

3 Ứng dụng bảo quản cá Diêu Hồng sơ chế

3 Kết quả khảo sát hoạt tính bacteriocin: Hoạt tính bacteriocin thô của chủng

Lactobacillus acidophilus (L2) là 457 AU/ml

4 Khảo sát bảo quản cá Diêu Hồng:

So với mẫu đối chứng (không tác nhân bảo quản) thì mẫu bảo quản bằng dịch bacteriocin thô kết hợp với dịch chitosan 1% bảo quản tối đa ba ngày

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

CÁC TỪ VIẾT TẮT iii

DANH MỤC BẢNG iv

DANH MỤC HÌNH v

DANH MỤC SƠ ĐỒ vi

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 Kefir 2

1.1.1 Nguồn gốc và sự hình thành 2

1.1.2 Cấu tạo hạt kefir 2

1.1.3 Hệ vi sinh vật trong hạt kefir 4

1.2 Vi khuẩn lactic 6

1.2.1 Khái niệm 6

1.2.2 Phân loại 6

1.2.3 Đặc điểm chung 7

1.3 Bacteriocin 8

1.3.1 Giới thiệu chung 8

1.3.2 Phân loại 9

1.3.3 Tính chất 11

1.3.4 Hoạt động của bacteriocin 12

1.3.5 Tính kháng khuẩn và phương pháp xác định tính kháng khuẩn 14

1.3.6 Một số loài vi khuẩn khác sinh bacteriocin 15

1.3.7 Ứng dụng của bacteriocin 16

1.4 Các nghiên cứu trong và ngoài nước về sản xuất bacteriocin 17

1.4.1 Các nghiên cứu trong nước 17

1.4.2 Các nghiên cứu nước ngoài 20

1.5 Cá Diêu Hồng 22

1.5.1 Giới thiệu sơ lược 22

1.5.2 Tình hình nuôi ở Việt Nam 22

1.5.3 Hệ vi sinh vật cá 23

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 25

2.1 Vật liệu 25

2.1.1 Giống vi sinh vật 25

2.1.2 Môi trường nuôi cấy 25

2.1.3 Hóa chất 25

2.1.4 Thiết bị và dụng cụ 25

2.2 Nội dung đề tài 25

2.3 Phương pháp thí nghiệm 26

2.3.1 Phân lập hệ LAB trong hạt kefir 26

2.3.2 Quan sát đặc điểm đại thể và vi thể 27

2.3.3 Thử khả năng sinh acid lactic 28

2.3.4 Khảo sát đặc điểm sinh lý 28

2.3.5 Các thử nghiệm sinh hóa 28

2.3.6 Khảo sát khả năng sinh bacteriocin 29

2.3.7 Xác định hoạt tính bacteriocin 30

2.3.8 Định danh vi khuẩn bằng bộ kit định danh API 50 CHL 30

2.3.9 Thăm dò việc sử dụng bacteriocin thô để bảo quản cá Diêu Hồng sơ chế 31

2.4 Phương pháp phân tích 32

2.4.1 Phương pháp đánh giá cảm quản 32

2.4.2 Phương pháp phân tích tổng số vi khuẩn hiếu khí 34

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ & THẢO LUẬN 35

3.1 Hệ vi khuẩn lactic phân lập từ hạt kefir 35

3.1.1 Đặc điểm đại thể và vi thể 35

3.1.2 Khảo sát khả năng sinh acid lactic 38

3.1.3 Đặc điểm sinh lý 39

3.1.4 Đặc điểm sinh hóa 40

3.1.5 Kiểm tra hoạt tính bacteriocin 42

3.1.6 Định danh vi khuẩn lactic bằng bộ kit API 50 CHL 45

3.2 Ứng dụng bacteriocin để bảo quản cá diêu hồng sơ chế tối thiểu 45

3.2.1 Khảo sát khả năng kháng khuẩn của dịch bacteriocin 45

3.2.2 Sử dụng bacteriocin để bảo quản cá diêu hồng 46

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN & KIẾN NGHỊ 53

4.1 Kết luận 53

4.2 Kiến nghị 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO 54

PHỤ LỤC 57

CÁC TỪ VIẾT TẮT

ATP : adenosine triphosphate

CFU : colony forming unit – Đơn vị hình thành một khuẩn lạc

DNA : deoxy nucleotide acid

ĐC: đối chứng

LAB : lactic acid bacteria - Vi khuẩn sinh acid lactic

rRNA : ribosome ribonucleotide acid

TSVKHK : tổng số vi khuẩn hiếu khí

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần hóa học và giá trị dinh dưỡng trong 100g kefir 3

Bảng 1.2 Tóm tắt hệ vi sinh vật phân lập trong hạt kefir 5

Bảng 1.3 Một số đặc điểm phân loại LAB theo Orla-Jensen (1919) 7

Bảng 1.4 Bacteriocin của một số chủng vi khuẩn 15

Bảng 2.1 Các mẫu khảo sát phương pháp bảo quản cá 32

Bảng 2.2 Bảng đánh giá chất lượng cảm quan bảo quản cá sơ chế 33

Bảng 3.1 Đặc điểm đại thể và vi thể của hệ vi khuẩn lactic phân lập từ hạt kefir 35

Bảng 3.2 Đặc điểm sinh lý của hệ vi khuẩn lactic phân lập được từ hạt kefir 39

Bảng 3.3 Kết quả thử khả năng sinh catalase của các chủng vi khuẩn lactic phân lập được từ hạt kefir 40

Bảng 3.4 Khả năng sinh hơi của các chủng vi khuẩn lactic phân lập được từ hạt kefir 40 Bảng 3.5 Khả năng kháng khuẩn của chủng Lactobacillus acidophilus (L2) 45

Bảng 3.6 Các phương pháp bảo quản cá sơ chế tối thiểu 47

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hạt kefir 3

Hình 1.3 Hạt kefir dưới kính hiển vi điện tử 4

Hình 3.1 Đặc điểm đại thể của hệ vi khuẩn phân lập từ hạt kefir 36

Hình 3.2 Đặc điểm vi thể của hệ vi khuẩn phân lập từ hạt kefir 37

Hình 3.3 Khả năng sinh acid làm tan CaCO3 trên môi trường carbonate agar của 6 chủng phân lập 38

Hình 3.4 Khả năng sinh acid lactic làm đổi màu thuốc thử unphenmen của sáu chủng phân lập 39

Hình 3.5 Khả năng lên men đường lactose của sáu chủng vi khuẩn 41

Hình 3.6 Khả năng lên men đường sucrose của sáu chủng vi khuẩn 41

Hình 3.7 Khả năng lên men đường sorbitol của sáu chủng vi khuẩn 41

Hình 3.8 Khả năng lên men đường glucose của sáu chủng vi khuẩn 42

Hình 3.9 Khả năng tạo vùng kháng khuẩn của các chủng phân lập 44

Hình 3.10 Kết quả bộ kit định danh chủng L2 phân lập từ hạt kefir 45

Hình 3.11 Khả năng kháng khuẩn của dịch bacteriocin của chủng Lactobacillus acidophilus (L2) đối với E coli 46

Hình 3.12 Bảo quản cá diêu hồng sơ chế tối thiểu bằng dịch bacteriocin thô 48

Hình 3.13 Biểu đồ so sánh điểm chung đánh giá cho các mẫu khảo sát 49

Hình 3.14 Biểu đồ tổng số vi khuẩn hiếu khí của các mẫu khảo sát trong ngày thứ nhất49 Hình 3.15 Biểu đồ tổng số vi khuẩn hiếu khí của các mẫu khảo sát trong ngày thứ hai 50 Hình 3.16 Biểu đồ tổng số vi khuẩn hiếu khí của các mẫu khảo sát trong ngày thứ ba 51 Hình 3.17 Biểu đồ phần trăm độ hao hụt khối lượng của các mẫu khảo sát 51

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 1.1 Phân loại bacteriocin của vi khuẩn Gram dương theo Cotter và cộng sự 9

Sơ đồ 2.1 Nội dung các bước thí nghiệm của đề tài 26

Sơ đồ 2.2 Tiến trình thí nghiệm bảo quản cá Diêu Hồng sơ chế 31

MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây, khi cuộc sống con người ngày càng được nâng cao thì yếu tố sức khỏe là một vấn đề quan trọng So với việc bảo quản thực phẩm bằng kháng sinh đã gây ra nhiều tác động tiêu cực như khả năng kháng lại thuốc kháng sinh và những dư lượng trong thực phẩm làm ảnh hưởng không tốt đến sức khỏe con người thì bảo quản bằng tác nhân sinh học mà tiêu biểu là bacteriocin đã thu hút được nhiều chú ý

ở các nước phát triển Do đó việc bảo quản thực phẩm bằng bacteriocin ngày càng được thay thế cho việc sử dụng chất kháng sinh Tuy nhiên chỉ có nisin thu được từ

Lactococcus lactis và pediococin từ Pediococcus được FAD và WHO công nhận và ứng

dụng rộng rãi trong việc bảo quản Việc tìm ra những loại bacteriocin mới để có thể ứng dụng đã làm tốn rất nhiều công sức của các nhà khoa học Trong khi đó, kefir với tổ hợp các vi sinh vật sống cộng sinh với nhau mà chúng ta có thể xét đến đó là tổ hợp LAB có trong hạt kefir có hoạt tính bacteriocin mạnh

Do đó, nhiệm vụ của luận văn được giao: “ PHÂN LẬP HỆ VI KHUẨN LACTIC CÓ HOẠT TÍNH BACTERIOCIN TRONG HẠT KEFIR VÀ ỨNG DỤNG ” Luận văn gồm ba phần chính:

+ Phân lập hệ vi khuẩn lactic trong hạt kefir, khảo sát khả năng sinh bacteriocin, định danh chủng mục tiêu

+ Lên men thu nhận bacteriocin

+ Ứng dụng bảo quản cá Diêu Hồng sơ chế

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Kefir

1.1.1 Nguồn gốc và sự hình thành

Kefir là một sản phẩm truyền thống có nguồn gốc cách đây hàng ngàn năm từ vùng núi Caucasian của đông Châu Âu Kefir được biết đến như một thứ dùng chữa bệnh, nó xuất xứ từ cách nuôi riêng của các tu sĩ Ấn Tạng Đây là loại nấm có thể làm biến đổi sữa nhờ một hệ vi sinh vật phức tạp gồm nhiều loài vi khuẩn và nấm men được chứng minh là rất có lợi cho sức khoẻ Sản phẩm kefir được những người dân tộc Moslem của Caucasian xem như một loại thuốc có thể chữa rất nhiều loại bệnh vào khoảng thế kỉ 18 [8]

Tháng 9/1908, trung tâm sản xuất sữa tại Moscow đã tiến hành sản xuất những chai kefir uống đầu tiên Một số lượng nhỏ kefir đã được sản xuất ở vài thành phố ở Nga,

và mọi người sử dụng kefir như một loại thuốc chữa bệnh

Năm 1930 kefir đã được tiến hành nghiên cứu sản xuất hàng loạt Tuy nhiên, quy trình này cho chất lượng sản phẩm cũng không tốt như cách truyền thống Vào 1950, viện nghiên cứu của Nga đã phát triển quy trình sản xuất kefir thương mại

Hiện tại kefir là một trong những loại sữa lên men rất được yêu thích ở Nga Ngoài ra kefir cũng đang được sản xuất một số lượng lớn ở Cộng Hòa Séc, Phần Lan, Hungary, Na Uy, Hà Lan, Thụy Điển, Thụy Sĩ, Đan Mạch, Mĩ, Pháp, Canada,…[5]

1.1.2 Cấu tạo hạt kefir

FAO/WHO (2001) đã định nghĩa kefir dựa trên thành phần hệ vi sinh vật của cả hạt kefir và trong sản phẩm kefir cuối cùng Trong sản xuất kefir, người ta sử dụng tổ hợp giống vi sinh vật dưới dạng hạt kefir Các hạt kefir có màu từ trắng đến vàng nhạt, hình dạng không ổn định và thường kết thành chùm với nhau tạo dạng tương tự hoa chou-fleur với đường kính trung bình 0.3÷2 cm Thành phần hóa học hạt kefir bao gồm 89-90% nước, 0.2% lipid, 3% protein, 6% đường (chủ yếu là polysaccharide) và 0.7% chất tro

Hạt kefir là phức hệ vi sinh vật gắn với nhau bởi chất polysaccharide Các giống

này bao gồm vi khuẩn lactic (Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc ) và nấm men Đôi khi, còn tìm thấy vi khuẩn Acetobacter cùng với các vi sinh vật khác tổ chức thành

khối cầu vi sinh vật

Tuy vẫn chưa được làm sáng tỏ hoàn toàn nhưng từ hàng nghìn năm qua sự tiêu thụ đã chứng minh được rằng hệ vi sinh vật trong kefir là không gây bệnh mà còn có khả

năng ngăn chặn sự phát triển của vi sinh vật gây bệnh như Salmonella hay Sigella [8]

Hình 1.1 Hạt kefir [29]

Bảng 1.1 Thành phần hóa học và giá trị dinh dưỡng trong 100g kefir

Amino acid cần thiết Acetaldehyde

1.1.3 Hệ vi sinh vật trong hạt kefir

Nhóm vi khuẩn Lactobacillus chiếm khoảng 65-80% tổng số vi sinh vật trong hạt

Chúng gồm những loài ưa ấm và ưa nhiệt Nhóm Lactococcus chiếm 20% tổng số tế

bào Nấm men chiếm 5-10% trong tổng số vi sinh vật trong hạt bao gồm những loài lên men hoặc không lên men được đường lactose Mật độ nhóm vi khuẩn lactic

Lactobacillus đạt 108–5x109 (cfu/g) gồm nhóm lên men đồng hình và dị hình Nhóm vi

khuẩn lactic Lactococcus và Leuconostoc với mật độ 108 –109 (cfu/g) và nấm men với mật độ 106–108 (cfu/g) gồm nhóm nấm men có khả năng chuyển hóa đường lactose và

nhóm nấm men không có khả năng chuyển hóa đường lactose

Ngoài ra, một số nghiên cứu còn phát hiện sự hiện diện của nhóm vi khuẩn

Acetobacter với mật độ 105 – 106 (cfu/g) Tỉ lệ vi khuẩn lactic: nấm men thường đạt là

250:1 Có sự khác biệt về sự phân bố nấm men và Lactobacillus Ở vùng nấm men chiếm ưu thế thì có ít Lactobacillus và ở vùng Lactobacillus chiếm ưu thế thì có ít nấm

men Nấm men không phân bố dày đặc ở bên ngoài hạt kefir, chủ yếu tồn tại ở bên trong hạt Các loài nấm men lên men được đường lactose thường được tìm thấy tại các vị trí gần bề mặt hạt kefir Ngược lại, các loài nấm men không lên men được đường lactose lại tìm thấy tại các vị trí sâu bên trong tâm hạt [12]

Hình 1.3 Hạt kefir dưới kính hiển vi điện tử [25]

(A, C) Cấu trúc trong của hạt kefir Tây Tạng (gồm nấm men và họ vi khuẩn Lactobacillus

hình que dài, cong) với mật độ dày đặc

(B, D) Cấu trúc ngoài của hạt kefir Tây Tạng (gồm nấm men và những vi khuẩn Lactobacillus

hình que ngắn) với mật độ thưa thớt hơn

Bảng 1.2 Tóm tắt hệ vi sinh vật phân lập trong hạt kefir

Lb casei subsp rhamnosus

Lb casei subsp pseudoplantarum

Lb paracasei subsp paracasei

Lb cellobiosus

Lb delbrueckii subsp bulgaricus

Lb delbrueckii subsp lactis

Lactococci lactis subsp lactis

Lc lactis var diacetylactis

Lc lactis subsp cremoris Streptococc lactis

St salivarius subsp thermophilus Enterococcus durans

Leuconostoc cremoris Leuc mesenteroides

Các chủng khác

Enterococcus durans Leuconostoc cremoris Leuconostoc mensenteroides Micrococcus sp

Bacillus subtilis Escherichia coli

[6,11]

1.2 Vi khuẩn lactic

1.2.1 Khái niệm

Vi khuẩn lactic (LAB) thuộc vi khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, có khả năng lên men đường để tạo acid lactic Nhóm LAB được xếp chung vào họ

Lactobacteriaceae và được xếp vào bốn chi: Streptococcus, Pediococcus, Lactobacillus

và Leuconostoc Nhóm vi khuẩn này có rất nhiều hình dạng khác nhau: có hình que ngắn

hoặc dài ở dạng đơn, đôi hoặc xếp thành chuỗi; hình cầu ở dạng đơn, đôi, đám hoặc xếp thành chuỗi Khuẩn lạc của LAB tròn nhỏ, bóng trắng sữa, màu trắng đục hoặc màu vàng kem; hoặc khuẩn lạc có kính thước to, hơi tròn lồi trắng đục Đặc biệt khuẩn lạc tỏa

ra mùi chua của acid

1.2.2 Phân loại

Việc phân loại LAB được thực hiện đầu tiên vào năm 1919 bởi Orla-Jensen và cho đến nay vẫn dựa chủ yếu vào các tiêu chuẩn hình học, trao đổi chất và sinh lý LAB gồm một nhóm đa dạng vi sinh vật Gram dương, không hình thành bào tử, hình cầu và hình que không di động, sử dụng năng lượng từ sự oxy hóa của các hợp chất hữu cơ và chỉ phát triển trên môi trường hỗn hợp LAB có thể lên men carbohydrate và lượng cồn cao được sử dụng như là nguồn năng lượng để hình thành nên chủ yếu là acid lactic LAB phân giải hexose thành lactate và những sản phẩm phụ như là acetate, ethanol, CO2, formate hoặc succinate

Những phương pháp nghiên cứu hiện tại được sử dụng cho việc phân loại LAB chủ yếu dựa vào phân tích16S rRNA và giải trình tự Dựa vào những kỹ thuật này, vi khuẩn Gram dương được chia thành hai nhóm tùy thuộc vào lượng G + C của chúng

Actinomyces có lượng G + C trên 50% mol và chứa những loài như là Atopobium, Bifidobacterium, Corynobacterium và Propionibacterium Mặc khác, nhánh Clostridium

có lượng G + C dưới 50% mol và bao gồm những loài LAB tiêu biểu như

Carnobacterium, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus và

Streptococcus [21]

Bảng 1.3 Một số đặc điểm phân loại LAB theo Orla-Jensen (1919)

dạng Catalase

Khử nitrite Lên men Loài hiện tại

Betabacterium Que - - Dị dưỡng Lactobacillus

Weissella Thermobacterium Que - - Tự dưỡng Lactobacillus

Streptobacterium Que - - Tự dưỡng Lactobacillus

Carnobacterium

Streptococcus Cầu - - Tự dưỡng

Streptococcus Enterococcus, Lactococcus Vagococcus

Betacoccus Cầu - - Dị dưỡng Leuconostoc

Oenococcus weissella Microbacterium Que + + Tự dưỡng Brochothrix

Tetracoccus Cầu + + Tự dưỡng Pediococcus

Vi khuẩn Gram dương, bất động và không sinh bào tử

Khả năng tổng hợp nhiều hợp chất của vi khuẩn này rất yếu

Là loại vi khuẩn kỵ khí tùy ý, có khả năng lên men kỵ khí cũng như hiếu khí

Có khả năng chịu đựng cao với môi trường acid

Thu nhận năng lượng nhờ phân giải hydrocacbon và tiết ra acid lactic; chúng là nhóm lên men bắt buộc, không chứa Cytochrom và enzyme Catalase

LAB có thế sống từ kỵ khí tới vi hiếu khí

LAB có nhu cầu về chất sinh trưởng rất phức tạp, không một đại diện nào của nhóm này có thể phát triển trên môi trường muối khoáng thuần khiết chứa glucose và đa

số chúng cần hàng loạt các vitamin (lactoflavin, thiamin, acid pantotenic, acid nicotinic, acid folic, biotin ) và các acid amin,…

LAB lên men được mono và disaccharide

Các LAB không lên men được tinh bột và các polysaccharide khác (Chỉ có loài

L delbrueckii là đồng hóa được tinh bột) Một số khác sử dụng được pentose và acid

citric mà chủ yếu là các vi khuẩn lên men lactic dị hình

Có hoạt tính protease: thủy phân được protein của sữa thành peptide và acid amin Hoạt tính này ở các loài là khác nhau, thường trực khuẩn là cao nhất

LAB có khả năng sinh ra các hợp chất có khả năng ức chế các vi khuẩn gây bệnh

1.3 Bacteriocin

1.3.1 Giới thiệu chung

Trong những năm gần đây, khả năng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn khá phổ biến trong điều trị bệnh của con người và động vật Vì thế việc tiếp tục tìm ra những chất kháng vi khuẩn mới đang trở nên quan trọng trong lĩnh vực y dược Để hạn chế sử dụng quá nhiều thuốc kháng sinh hóa học trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi, một sự lựa chọn hợp lý là ứng dụng của một số protein của vi khuẩn như thuốc kháng sinh Trong số đó, sự sản xuất bacteriocin từ LAB đã thu hút nhiều chú ý

Bacteriocin có bản chất là peptid kháng khuẩn sinh ra bởi vi khuẩn để chống lại

vi khuẩn khác Như vậy, loại vi khuẩn tạo ra loại bacteriocin nào thì có khả năng kháng lại chính bacteriocin đó Bacteriocin được A.Gratia tìm thấy đầu tiên năm 1925 trong quá trình nghiên cứu tìm cách tiêu diệt vi khuẩn, kết quả của công trình này đã thúc đẩy

sự phát triển những nghiên cứu về chất kháng sinh và chất kháng khuẩn sinh ra từ vi

khuẩn Ông gọi chất phát hiện ra đầu tiên là Colicin do E.coli sinh tổng hợp nên

Bacteriocin được sinh tổng hợp bởi cả vi khuẩn Gram âm hoặc vi khuẩn Gram dương với những đặc điểm:

Bacteriocin của vi khuẩn Gram âm: gồm nhiều loại protein khác nhau về kích thước, nguồn gốc chủng vi sinh vật sản xuất, kiểu tác động và cơ chế miễn dịch Bacteriocin của vi khuẩn Gram âm được nghiên cứu nhiều nhất là colicin, do vi

khuẩn E.coli tổng hợp Bacteriocin của vi khuẩn Gram âm có khả năng kháng

khuẩn yếu hơn bacteriocin của vi khuẩn Gram dương

Bacteriocin của vi khuẩn Gram dương: các bacteriocin này cũng nhiều như ở vi khuẩn Gram âm Tuy nhiên chúng khác vi khuẩn Gram âm ở hai điểm sau: việc tạo bacteriocin không cần thiết phải gây chết cho vi sinh vật chủ và sự sinh tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn Gram dương cần nhiều gen hơn ở vi khuẩn Gram

âm

Bacteriocin khác biệt với kháng sinh ở những điểm chủ yếu sau:

- Bacteriocin được tổng hợp nhờ ribosome

- Tế bào chủ miễn dịch với chúng

- Phương thức hoạt động khác biệt với kháng sinh

- Phổ kháng khuẩn hẹp, vì vậy thường chỉ có khả năng tiêu diệt những chủng vi khuẩn có liên hệ gần với chủng sản xuất

Có rất nhiều giống vi khuẩn sinh tổng hợp bacteriocin, trong đó có LAB được quan tâm nhiều nhất do bacteriocin của LAB có phổ kháng khuẩn rộng và có tiềm năng được dùng làm chất bảo quản thực phẩm và ứng dụng trong dược phẩm [1]

Lớp 1a: là những phân tử peptide tích điện dương, dài 43 amino acid Những peptide này hoạt động chủ yếu hoạt động phá vỡ trạng thái nguyên vẹn của màng tế bào đích Có thể chia lantibiotic A thành hai phân nhóm dựa trên kích thước, điện tích và trình tự peptide dẫn

Lớp 3: protein lớn (>10 kDa)

Loại 3b: không phân giải

Loại 2b: đa thành phần Loại 3a:

Lớp 1b: là những phân tử peptide hình cầu, có thể chứa đến 19 amino acid Hoạt động của chúng chủ yếu là phá vỡ chức năng của các enzyme

Lantibiotic được tạo thành ở trạng thái bất hoạt với trình tự peptide dẫn ở đầu N, trình tự này sẽ bị cắt đi trong quá trình trưởng thành để phóng thích phân tử peptide hoạt hóa

Lớp 2: là những phân tử bacteriocin phân tử nhỏ (< 10kDa), thường gồm những phân tử peptide hoạt động ở màng tế bào, không chứa lanthionine và bền nhiệt Bacteriocin lớp hai có phổ kháng khuẩn hẹp Lớp hai có thể chia thành ba phân lớp:

Lớp 2a: bacteriocin lớp này rất đa dạng, điểm đặc trưng là trình tự bảo tồn ở đầu

N và hoạt tính kháng Listeria

Lớp 2b: những bacteriocin này cần có sự kết hợp của hai hoặc nhiều peptide trong hoạt động để có hoạt tính kháng khuẩn hoàn chỉnh Trong hầu hết các trường hợp, các peptide rời cũng biểu hiện hoạt tính bacteriocin, nhưng hoạt tính sẽ cao khi có sự hiện diện của peptide thứ hai Ví dụ như hoạt động của hai peptide enterocin L50A và enterocin L50B

Lớp 2c: bacteriocin phụ thuộc vào nhân tố sec Phân tử bacteriocin lớp 2c được

đưa ra ngoài tế bào xuyên qua màng tế bào chất bằng con đường tiết phụ thuộc nhân tố

sec

Bacteriocin lớp 2a có tiềm năng ứng dụng quy mô công nghiệp do khả năng

kháng Listeria mạnh, thậm chí chúng còn được quan tâm nhiều hơn các bacteriocin lớp

1 (nisin), do chúng có phổ kháng khuẩn không rộng và không tiêu diệt những chủng khởi động Pediocin PA-1 là một ví dụ điển hình và được nghiên cứu phổ biến nhất trong số các bacteriocin lớp 2a

Lớp 3: bacteriocin lớp 3 là những phân tử protein lớn (>30kDa) và bền nhiệt Lớp này gồm những enzyme ngoại bào (hemolysin và muramidase) có hoạt tính sinh lý của

bacteriocin Bacteriocin lớp 3 được thu nhận từ một số giống Lactobacillus Chỉ một vài

bacteriocin thuộc lớp này được định danh

Lớp 4: là những bacteriocin phức hợp, ngoài protein còn có thêm thành phần lipid

và carbohydrate Hiện nay vẫn còn nhiều điều chưa biết về cấu trúc cũng như chức năng của bacteriocin thuộc lớp này vì chưa có phân tử nào thuộc lớp này được tinh sạch Bacteriocin lớp 4 là kết quả của sự tương tác đặc tính kỵ nước và tích điện dương của bacteriocin với các phân tử khác trong dịch mô Lớp này bao gồm cả glycoprotein hoặc lipoprotein

Lc lactis có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin Bacteriocin của Lc lactis gồm

hai loại là lantibiotic và các bacteriocin có kích thước nhỏ, bền nhiệt không phải lantibiotic

Nisin, một loại lantibiotic do Lc lactis sản xuất và là bacteriocin được tổ chức

lương nông thế giới (FAO) và tổ chức y tế thế giới (WHO) chấp nhận cho phép sử dụng như một chất phụ gia thực phẩm (1969) Nisin có phổ kháng khuẩn rộng đối với hầu hết

các chủng LAB, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, tế bào dinh dưỡng của

Bacillus spp và Clostridium spp cũng như ức chế nảy chồi của các bào tử các loài Bacillus và Clostridium

Ngoài lantibiotic, Lc lactis còn có khả năng sinh tổng hợp những phân tử

bacteriocin có kích thước nhỏ và bền nhiệt, điển hình là lactococcin A, B và M Lactococcin có phổ kháng khuẩn hẹp hơn nisin, chúng chỉ có thể ức chế những chủng

Lactococcus khác với chủng sản xuất [1]

1.3.3 Tính chất

1.3.3.1 Thành phần cấu tạo hóa học

Tất cả các loại bacteriocin đều có chứa protein hoặc các peptide trong phân tử Protein hoặc các peptide đóng vai trò quan trọng trong chức năng diệt vi khuẩn của bacteriocin Một số loại bacteriocin chứa tổ hợp nhiều phân tử protein liên kết lại với nhau

Các nhóm amino acid không thường xuyên (unusual amino acid) có trong phân tử của một số loại bacteriocin giúp tạo nên một cấu trúc phân tử bền vững hơn (lanthionine hay -methyllanthionine), hoặc làm tăng hoạt tính sinh học của phân tử (didehydroalanine, didehydrobutyrine, cysteine)

Một số loại bacteriocin còn chứa các amino acid chưa bão hòa trong phân tử như didehydroalanine, didehydrobutyrine Các acid amin này là sản phẩm của phản ứng dehydrate hóa các hydroxylamino acid serine và threonine

Một số loại bacteriocin nhạy cảm với không chỉ protease mà còn nhạy cảm với lipase, phospholipase, amylase Điều đó chứng tỏ ngoài sự có mặt của các chuỗi protein liên kết lại với nhau, trong cấu trúc bacteriocin còn chứa nhiều cấu tử khác như glucid, lipid, phospholipid kết hợp với protein tạo thành một phức hợp phức tạp Ví dụ: Lactocin 27 được cấu tạo từ phức hợp lipocarbohydrate protein Caseicin LSH và leuconocin S là các glycoprotein

Sự hiện diện của cầu nối disulfide hoặc thioether trong cấu trúc ảnh hưởng tới độ bền và hoạt tính của bacteriocin

Thành phần, số lượng, trình tự các amino acid trong phân tử peptide tạo ra những đặc điểm khác nhau giữa các loại bacteriocin, bao gồm khối lượng phân tử, điểm đẳng điện pI, tính kỵ nước, điện tích của phân tử ở một điều kiện pH xác định… Trên cơ sở những đặc điểm này, người ta lựa chọn phương pháp tinh sạch cho từng loại bacteriocin

1.3.3.2 Kháng nguyên

Bacteriocin có khối lượng phân tử lớn, thành phần cấu tạo là protein và nhiều bacteriocin có tính kháng nguyên cao Tuy nhiên hiện nay chỉ có duy nhất một vài báo cáo trong nghiên cứu tính kháng nguyên của bacteriocin sinh bởi loài Gram dương Megacin A- 216 là một kháng nguyên và tế bào cũng sinh ra một kháng thể có khả năng chống lại ảnh hưởng giết chính nó Việc nghiên cứu những kháng thể đến bacteriocin trong huyết thanh của con người có lẽ là một lĩnh vực thú vị cho những nghiên cứu sau này [27]

1.3.3.3 Tính chất ổn định của bacteriocin

Một số nghiên cứu về những đặc tính của bacteriocin cho thấy rằng những phân

tử này có thể hoạt động tốt dưới những khoảng nhiệt độ và độ pH nhất định ST28MS và

ST26MS được sản xuất bởi Lactobacillus plantarum có thể hoạt động ổn định trong 2

giờ tại những giá trị pH từ 2.0 đến 12.0 Không giảm khả năng hoạt động chống vi khuẩn sau 90 phút tại 100ºC hay 20 phút tại 121ºC Đặc tính chịu nhiệt có thể liên quan đến cấu trúc phân tử của bacteriocin

1.3.4 Hoạt động của bacteriocin

1.3.4.1 Phạm vi hoạt động của bacteriocin

Xem xét phạm vi kháng khuẩn, giống vi sinh vật sinh ra, khối lượng phân tử, tính

ổn định, tính chất hóa sinh, và kiểu hoạt động của bacteriocin Hầu hết các bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn gram âm có hoạt tính ức chế các loài cùng họ hàng Đối với bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn Gram dương có hoạt tính ức chế các loại vi khuẩn Gram dương Tuy nhiên một vài loại vi khuẩn Gram âm bị ức chế bởi bacteriocin hay chất giống bacteriocin được sinh ra bởi vi khuẩn Gram dương Những vi

khuẩn Gram dương có khả năng ức chế vi khuẩn Gram âm như Lactobacillus

acidophilus, Bacillus cereus, Streptococci, Staphylococci, Corynebacteria

1.3.4.2 Cơ chế hoạt động của bacteriocin

Bacteriocin có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn khác do sự tạo thành các kênh làm thay đổi tính thấm của màng tế bào, nhiều loại bacteriocin còn có khả năng phân giải ADN, ARN và tấn công vào peptidoglycan để làm suy yếu thành tế bào Đầu tiên với

+

phosphate vô cơ đi ra khỏi tế bào Trong sự nỗ lực để tái tích lũy lại những ion này, những hệ thống hấp thu phụ thuộc ATP dẫn tới thủy phân của ATP bên trong Khi ATP được yêu cầu cho sự duy trì của những chức năng quan trọng tế bào, như gradient pH tại màng tế bào, những chức năng tế bào bị phá vỡ và tế bào dần dần mất năng lượng và chết

1.3.4.3 Sự miễn dịch của bacteriocin

Một thuộc tính cần thiết để bảo đảm sự sống sót của vi sinh vật sinh bacteriocin là

có sự miễn dịch đặc biệt Theo Koponen (2004) tế bào vi khuẩn có một số cơ chế miễn dịch, đây là khả năng của tế bào trong việc bảo vệ chính nó để chống lại bacteriocin sinh

ra bởi sự trao đổi chất của chính mình Cả cấu tạo thành tế bào và thành phần cấu tạo của màng lipid của vi khuẩn cho thấy sự liên quan đến hoạt động của bacteriocin cũng như

sự kháng cự bacteriocin Sự biến đổi nhạy cảm của vi khuẩn Gram dương về phía những bacteriocin đáng kể Hoạt động kìm hãm của bacteriocin có thể thay đổi giữa những gen khác nhau, những loài cùng bộ gen và thậm chí đến môi trường nuôi cấy từ những điều kiện ngoại cảnh khác Hai kiểu miễn dịch được thấy ở lantibiotic Một kiểu miễn dịch dựa vào protein miễn dịch đặc trưng (LanI) trong khi kiểu miễn dịch khác dựa một vật chuyên chở nhiều thành phần riêng biệt (LanEFG) Bacteriocin sẽ nhận biết được vi sinh vật sinh bacteriocin nhờ sự không có mặt của những thụ quan đặc biệt và kết quả là chúng không thể bám vào tế bào vi sinh vật

Di truyền học của sự sản xuất lacticin 3147 và sự miễn trừ Lacticin 3147 được

sản xuất từ vi khuẩn Lactococcus lactis ssp lactis 3147 và được mã hóa trên plasmid

Plasmid mà mã hóa sự sản xuất lacticin 3147 và sự miễn trừ là pMRC01 Plasmid này có

thể sẵn sàng được kết hợp giữa giống Lactococcus và sự biến dạng khác Toàn bộ trình

tự nucleotide 60, 232 của plasmid pMRC01 này được xác định, đại diện cho trình tự lớn

nhất của plasmid Lactococcus cho đến nay Sự phân tích chi tiết của quỹ tích di truyền

học liên quan trong sự sản xuất của lacticin 3147 được cung cấp trong giấy bởi Dougherty v.v , 1998

Những gen này được chia làm hai cụm, với ltnA1, ltnA2, ltnM1, ltnT, ltnM2 và ltnD được sao chép cùng một hướng và ltnH, ltnJ, ltnF và ltnE được sao chép theo hướng ngược lại

Những gen trong cụm lớn, ltnA1 và ltnA2 mã hóa hai peptide tương đối ngắn mà

nó là điểm khởi đầu cho bacteriocin lacticin 3147 hoạt động Những peptide này có lẽ đòi hỏi trải qua một số cải biến trước khi chúng hoạt động Sản phẩm gen ltnM1 và ltnM2 (các protein cải biến) có thể thực hiện vai trò này Lacticin 3147 là khác thường trong trường hợp này cho đến nay, nó là bacteriocin duy nhất được biết có hai protein cải

Sau khi peptide LtnA1 và LtnA2 được cải biến thì tế bào cần đưa chúng ra ngoài để bacteriocin có thể làm làm giảm đi một số ảnh hưởng chống lại vi sinh vật khác Sự vận chuyển này nhờ vào hệ thống vận chuyển ABC (ATP Binding Cassette) mà được mã hóa bởi ltnT Nếu sự tập trung của lacticin 3147 ở sát vùng lân cận của tế bào sản xuất trở nên quá cao, nó có thể giết tế bào sản xuất Để tránh trường hợp này, tế bào sản xuất phải có một mức độ miễn dịch nào đó hoặc chống cự lại những bacteriocin của nó Sự miễn dịch có được bởi sản phẩm của ltnE và ltnF Sản phẩm gen của những gen khác, ltnH, có đặc điểm của protein điều hòa mà DNA cho biết tế bào có một cơ chế điều khiển để thay đổi sự biểu hiện của những genl liên quan đến hoạt động của bacteriocin Chức năng của hai gen ltnD và ltnJ là không được biết Tuy nhiên, những vùng gen của chúng có liên quan đến chức năng của lacticin 3147 Lacticin 3147 được mã hóa bởi plasmid tiếp hợp là pMRCO1 Vùng lacticin 3147 mã hóa ít nhất 10 protein, mà nó liên quan đến chức năng của bacteriocin [28]

1.3.5 Tính kháng khuẩn và phương pháp xác định tính kháng khuẩn

Tính kháng khuẩn là khả năng ức chế sự phát triển của một vi sinh vật nào đó Hiện nay người ta đã xác đinh được nhiều chất có khả năng ức chế sự phát triển của vi sinh vật như bacteriocin, chất kháng sinh, virus xâm nhiễm vi khuẩn Vì vậy trong nghiên cứu bacteriocin thì vấn đề quan trọng là phải xác định xem loại vi khuẩn mà mình nghiên cứu có tính đối kháng đối với một loài vi sinh vật nào đó hay không Hiện nay người ta đã xác định được một số loại bacteriocin có thể kháng đồng thời nhiều loại

vi sinh vật

1.3.5.1 Phương pháp xác định tính kháng khuẩn

Để xác định tính kháng khuẩn, việc thử nghiệm được tiến hành trên môi trường thạch đĩa có chủng chỉ thị Tính kháng khuẩn thể hiện khi chủng chỉ thị bị ức chế trên môi trường đó Hai phương pháp xác định tính kháng khuẩn thường được sử dụng là phương pháp kháng khuẩn đồng thời và phương pháp kháng khuẩn dần dần

Phương pháp kháng khuẩn đồng thời đơn giản nhất do A.Gratia đưa ra Trong phương pháp này chủng thử nghiệm và chủng chỉ thị cùng được nuôi cấy trên một môi trường, và tính kháng khuẩn thể hiện ở việc chất ức chế của chủng thử nghiệm khuếch tán vào môi trường và gây ức chế chủng chỉ thị Sử dụng đĩa thạch đã nuôi cấy chủng chỉ thị, sau đó tạo giếng trên đĩa thạch và cho chủng thử nghiệm đã được nuôi ủ vào giếng Phương pháp này thích hợp đối với kiểm tra những khuẩn lạc riêng lẽ và áp dụng rộng rãi trong nghiên cứu về mặt di truyền

Phương pháp kháng khuẩn dần dần do Frederic đưa ra sau đó được cải tiến thêm Trong phương pháp này, chủng thử nghiệm được nuôi ủ trên đĩa thạch trong một khoảng thời gian Tiếp đó chủng chỉ thị được trải lên bề mặt của đĩa thạch có chủng thử nghiệm Phương pháp này có độ nhạy hơn so với phương pháp kháng khuẩn đồng thời và phương pháp này không phụ thuộc vào thời gian và điều kiện nuôi ủ của chủng chỉ thị và chủng thử nghiệm

Cần kiểm tra cả hai phương pháp này để nhận biết một chủng có hoạt tính kháng khuẩn hay không Điều kiện tối thích cho chủng thử nghiệm phát triển không cần thiết bằng điều kiện để chủng đó sinh tổng hợp chất kháng khuẩn nhiều nhất Việc áp dụng những phương pháp này có thể xác định được loại vi khuẩn nào có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin Hạn chế của những phương pháp này là không xác định

cụ thể hoạt tính của bacteriocin Cần loại bỏ những yếu tố gây ức chế mà không có bản chất là bacteriocin [28]

1.3.5.2 Quan hệ giữa tính kháng khuẩn và khả năng sinh tổng hợp bacteriocin

Khi nghiên cứu bacteriocin cần loại bỏ những hiện tượng giống bacteriocin Một

số loài vi sinh vật có khả năng sinh ra kháng chất giống bacteriocin Một yếu tố quan trọng để phân biệt giữa bacteriophage và bacteriocin là bacteriocin không mang yếu tố di truyền để tự nhân bản Hamon và Peron đã dùng những phương pháp khác nhau để phân biệt bacteriophage và bacteriocin Trong đó bacteriophage kháng trypsin hơn bacteriocin còn bacteriocin không bị ảnh hưởng bởi tia cực tím và nhiều loại bacteriocin chịu nhiệt rất tốt Một số vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme, bacteriolytic có trọng lượng phân tử thấp, có những đặc tính giống bacteriocin và rất khó để phân biệt

Tóm lại có nhiều yếu tố có tính kháng khuẩn không có bản chất bacteriocin Như bacteriophage là một loại virus cũng có khả năng diệt vi khuẩn hay antibiotic là một loại kháng sinh cũng có khả năng diệt vi khuẩn Vì vậy tính kháng khuẩn do nhiều nguyên nhân gây nên và một trong những nguyên nhân tạo nên tính kháng khuẩn giữa các chủng

vi khuẩn là khả năng sinh tổng hợp bacteriocin [28]

1.3.6 Một số loài vi khuẩn khác sinh bacteriocin

Bacteriocin được sinh tổng hợp nên bởi rất nhiều loài vi khuẩn khác nhau Bảng 1.4 mô tả các loại bacteriocin của một số vi khuẩn Gram dương

Bảng 1.4 Bacteriocin của một số chủng vi khuẩn

Bacillus cereus Phospholipase A

Bacillus megaterium 216 Megacin (1954)

Clostridium botulinum Boticin

nay, những bacteriocin thương mại duy nhất là nhóm nisin được sinh bởi Lactoccocus

lactis, và PA-1 pediocin sinh bởi Pediococcus acidilactici

Nhiều nghiên cứu khoa học của các nhà khoa học trên thế giới đều nhận định rằng các LAB có lợi cho sức khoẻ của người cũng như các loài động vật máu nóng

Bifidobacteria được tìm thấy như là một phần trong hệ vi sinh vật tự nhiên có mặt trong

hệ tiêu hoá Nghiên cứu cơ chế hoạt động của chúng chỉ ra rằng chúng có lợi cho sức khỏe, không những chúng sản sinh ra các sản phẩm có lợi như: acid lactic, vitamin mà còn sinh ra các kháng sinh vi sinh vật (bacteriocin) làm ức chế và kìm hãm sự phát triển của các vi khuẩn đường ruột có hại Điểm đặc biệt nữa của chúng là có khả năng sống được trong điều kiện môi trường acid cao, khả năng chịu mặn lớn

Bacteriocin được ứng dụng nhiều trong thực phẩm Bacteriocin được ứng dụng

trong giai đoạn đầu của việc ủ bột làm bánh mì, trong lên men xúc xích (kháng Listeria)

và trong sản xuất phomai (kháng Listeria và Clostridium)

Ứng dụng bảo quản thịt:

Listeria monocytogenes là vi khuẩn hình que yếm khí Gram dương, không tạo

bào tử và phân bố rộng trong môi trường sống Nó có thể phát triển ở khoảng pH 4.1 đến 9.6 và nhiệt độ từ 0 đến 450C Hơn thế nữa, nó có thể chịu được độ ẩm cao và có thể phát triển với hoạt độ của nước aw khoảng 0.9 Do đó chính phủ Mỹ đã đưa ra chính sách

liên quan đến L monocytogenes ở mức độ là 0 đối với thực phẩm ăn liền Có rất nhiều nghiên cứu được đưa ra để kiểm soát lượng L monocytogenes trong thịt khi nó rất phổ

biến trong lò giết mổ và khu vực đóng gói thịt

Pawar và cộng sự (2000) đã thử nghiệm bảo quản thịt bò chống lại L

monocytogenes của nisin với hoạt tính 400 và 800 IU/g kết hợp với NaCl 2% Với mẫu

bảo quản, thịt được xay và nuôi cấy với L monocytogenes với mật độ 103 cfu/g và bảo quản ở 40C Lượng L monocytogenes trong mẫu đối chứng tăng từ 3.0 log10 đến 6.4 log cfu/f sau 16 ngày bảo quản Nisin với hoạt tính 400 IU/g làm tăng pha lag của L

monocytogenes, ở hoạt tính 800 IU/g lượng L monocytogenes là 2.4 log10 thấp hơn so với mẫu đối chứng sau 16 ngày bảo quản Khi nhiệt độ bảo quản tăng lên 370C thì khả năng ức chế của nisin giảm đi Thay vào đó lương NaCl 2% kết hợp với nisin đã làm tăng hiệu quả của nisin ở cả hai nhiệt độ bảo quản này [10]

Ứng dụng bảo quản sản phẩm hải sản:

Nilsson và cộng sự (1997) đã khảo sát khả năng ức chế của nisin kết hợp với

carbon dioxide và nhiệt độ thấp lên sự sống sót của L monocytogenes trong cá hồi xông khói Sử dụng nisin có nồng độ 500 và 1000IU/g vào cá hồi được nuôi cấy với L

monocytogenes và bảo quản ở 50C nhưng không phòng ngừa được sự phát triển của L

monocytogenes trong bao gói chân không Lượng L monocytogenes tăng đến 108 cfu/g đối với cá hồi bao gói chân không trong tám ngày, trong khi đó đối với cá hồi xông khói lạnh đóng gói với CO2 thì lượng L monocytogenes trong thời kì pha log của ngày thứ tám đạt được 106 cfu/g trong 27 ngày Việc thêm nisin với nồng độ lần lượt là 500 và

1000 IU/g vào cá hồi xông khói lạnh đóng gói CO2 làm giảm 1 đến 2 log10 lượng L

monocytogenes ở lần lượt ngày thứ 8 và 20 của pha lag Như vậy, lượng L monocytogenes vẫn còn dưới 103 cfu/g trong suốt 27 ngày bảo quản ở hai nồng độ nisin [10]

Ngoài ra còn có những ứng dụng của bacteriocin như:

+ Ứng dụng của bacteriocin trong bảo quản những sản phẩm từ sữa

+ Bảo quản sinh học của sản phẩm trái cây

+ Quá trình lên men rau quả

+ Thức uống chứa cồn

+ Trong sản phẩm dược liệu, thú y và chăm sóc sức khỏe [16]

1.4 Các nghiên cứu trong và ngoài nước về sản xuất bacteriocin

Với khả năng ức chế những vi sinh vật gây bệnh và được ứng dụng trong bảo quản thực phẩm nói riêng và đến sức khỏe con người nói chung nên bacteriocin đã được nhiều nhà khoa học quan tâm

1.4.1 Các nghiên cứu trong nước

Hiện nay ở nước ta việc nghiên cứu về bacteriocin do vi khuẩn lactic sinh tổng hợp nên đã và đang được nhiều nhà khoa học quan tâm Tuy nhiên các nghiên cứu về ứng dụng của bacteriocin còn ít và chưa thu được những kết quả khả quan

Năm 2007, PGS.TS Trương Nam Hải đã thực hiện đề tài “Nâng cao chất lượng,

hiệu quả bảo quản nông sản bằng chế phẩm Nisin và Enterocin” với kết quả đạt được

là:

Từ 148 mẫu dưa muối, cà muối, sữa chua, sữa tươi, sữa mẹ, nem chua, pho mát

đã phân lập được 148 chủng vi khuẩn lactic Từ 148 chủng vi khuẩn lactic được phân lập

đã tuyển chọn được 12 chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh nisin cao ức chế mạnh

đến sự phát triển của vi khuẩn chỉ thị B cereus Sau khi đánh giá khả năng kháng B

coagulans, C perfrigens, S aureus, Salmonella, E coli, L monocytogenes đã tuyển

chọn được hai chủng L.lactis kí hiệu là C46 và C40 có hoạt tính ức chế mạnh các vi

khuẩn gây bệnh trên Để nâng cao khả năng kháng khuẩn, môi trường nuôi cấy thích hợp cho chủng đó được khảo sát đó là môi trường M17 có bổ sung 0.5% lactose, 1% cao

nấm men, pH6 là tốt nhất cho sự sinh tổng hợp nisin của chủng L lactis Hoạt tính nisin

đạt cực đại sau 24 giờ nuôi cấy và được duy trì lâu hơn so với các thời gian khác Trong khi lên men, oxy hòa tan khoảng 60% bão hòa là thích hợp nhất cho sự sinh tổng hợp

nisin của chủng L lactis C46 Bằng phương pháp sinh học phân tử, đã xác định được chủng C46 chính là Lactococcus lactis C46 và đã chứng minh được hoạt tính kháng

khuẩn có được từ chủng phân lập là nisin

Năm 2008, để nâng cao sản lượng nisin đã áp dụng công nghệ nuôi cấy hỗn hợp

với chủng K marxianus và lên men gián đoạn hai pha Kết quả sản lượng nisin trong dịch nuôi cấy hỗn hợp chủng L lactis C40 và K marxianus tăng gấp khoảng 1.5 lần so với khi nuôi cấy chủng L lactis C40 tự do Hoạt độ nisin đạt cực đại là 5.6x104 AU/ml sau 24 giờ nuôi cấy Hơn nữa, khi lên men gián đoạn hai pha, sau 24 giờ nuôi cấy hoạt

độ nisin trong môi trường đạt được là 6.8x104 AU/ml, tăng 19% so với lên men một pha Đồng thời, đã cố định tế bào lên alginate trong quá trình lên men gián đoạn hai pha nhưng sản lượng nisin tăng không đáng kể, đạt 6.9x104 AU/ml sau 24 giờ nuôi cấy Khi

bổ sung thêm lactose vào môi trường nuôi cấy theo giờ, hoạt độ nisin trong môi trường tăng lên đáng kể, tối đa đạt 38x104 AU/ml sau 24 giờ nuôi cấy

Tác giả cũng đã nghiên cứu thu hồi nisin bằng muối NaCl, ethanol và methanol Kết quả cho thấy ở nồng độ methanol 60%, ethanol 50% và NaCl 1% đều cho hiệu suất thu hồi nisin khoảng 80-85% Đồng thời, khi bổ sung với chất phụ gia như sữa gầy, hoạt tính nisin sau năm tháng bảo quản vẫn giữ được 95%

Năm 2008, tác giả đã tập trung vào biểu hiện enterocin P của E faecium trong nhiều loại tế bào chủ khác nhau đó là E coli, Bacillus và nấm men Mặc dù sản lượng EntP không cao nhưng peptide tái tổ hợp đã có hoạt tính kháng Staphylococcus aureus

Từ các chủng tái tổ hợp nhận được, đã chọn ra một số dòng cho sản lượng EntP tốt để

được cắt bằng DTT hoặc pH để giải phóng EntP có hoạt tính sinh học Điểm thuận lợi là hầu hết protein dạng lai đều ở trạng thái không tan trong nước, do đó đã ly tâm để loại

bỏ các protein tan trong nước để thu protein lai Sau khi cắt bỏ đoạn protein lai, protein lai lại trở thành dạng tan trong nước nên sau khi ly tâm loại bỏ protein pha trên, thu được

lượng EntP khá sạch EntP này có khả năng kháng lại Staphylococcus aureus

Chủng nấm men tái tổ hợp mang gen entP cũng đã được tối ưu lên men Khi sử dụng lên men batch thông thường, OD600 của tế bào chỉ đạt được 0.3 Ở điều kiện này, lượng EntP sinh ra thấp nên khi điện di trực tiếp dịch lên men trên gel polyacrylamide, hầu như băng EntP không phát hiện được Tuy nhiên hoạt tính của EntP trong môi trường nuôi cấy cũng đạt được là 100AU/ml môi trường Tác giả đã tối ưu qui trình lên men để tăng sinh khối Kết quả, khi lên men được bổ sung gián đoạn nguồn dinh dưỡng,

OD600 của môi trường nuôi cấy đã đạt được trên 0.9 (gấp ba lần so với lên men thông thường) Đồng thời hàm lượng EntP tăng lên đáng kể, thể hiện là một băng protein có kích thước khoảng 4 kDa trên điện di đồ Hoạt độ của EntP trong môi trường nuôi cấy

cũng đã được xác định [2]

Năm 2008, các tác giả Nguyễn Thúy Hương và Trần Thị Tưởng An đã nghiên cứu

thu nhận bacteriocin bằng phương pháp lên men bởi tế bào Lactococcus lactis cố định

trên chất mang Cellulose vi khuẩn (BC) và ứng dụng trong bảo quản thịt sơ chế tối thiểu Kết quả thu được: Hiệu quả sử dụng chế phẩm tế bào vi khuẩn cố định trên BC để lên men thu nhận bacteriocin khá cao: có thể tái sử dụng 9-10 lần mà vẫn đảm bảo về mặt thời gian lên men, số lượng và chất lượng bacteriocin so với đối chứng Bước đầu sử dụng màng mỏng cellulose vi khuẩn (BC) hấp phụ bacteriocin để bảo quản thịt tươi sơ chế tối thiểu: có thể bảo quản thịt tươi đến ba ngày bằng màng BC hấp phụ dịch bacteriocin 200 AU/ml vẫn đảm bảo chất lượng thịt, theo TCVN 7046:2002 Kết quả thu được cũng góp phần thăm dò hai ứng dụng mới của cellulose vi khuẩn (BC): sử dụng

BC làm chất mang trong kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật và sử dụng màng mỏng BC làm màng bao thực phẩm [4]

Năm 2009, Nguyễn Văn Duy đã thực hiện đề tài “Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin nhằm bảo quản thực phẩm” Tác giả đã tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh bacteriocin mạnh từ nước dưa chua ở Việt Nam để tiến tới

sử dụng chúng trong bảo quản cá Giò nguyên liệu tươi Vi khuẩn lactic được phân lập và tuyển chọn trên môi trường MRS và cho thử hoạt tính đối kháng với vi khuẩn đích

Salmonella typhimurium Kết quả cho thấy đề tài đã phân lập được 45 chủng vi khuẩn

lactic trong đó có 12 chủng kháng mạnh nhất với Salmonella Các chủng đều là vi khuẩn

Gram dương, phản ứng âm tính với oxidase và catalase Kết quả này là cơ sở khoa học

quan trọng cho việc nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin trong bảo quản thực phẩm

1.4.2 Các nghiên cứu nước ngoài

Hiên nay việc nghiên cứu, ứng dụng bacteriocin do vi khuẩn lactic sinh tổng hợp nên đang là một hướng nghiên cứu được nhiều nhà khoa học quan tâm Và cũng đã có những công trình nghiên cứu và ứng dụng thành công, góp phần vào việc nâng cao chất lượng cuộc sống của nhân loại Bacteriocin là một chất kháng khuẩn có khả năng ức chế một số vi khuẩn gây bệnh, nhờ khả năng này mà việc ứng dụng của vi khuẩn lactic đa dạng và phong phú hơn

Năm 1999, các tác giả Raf Callewaert và Luc De Vuyst đã nghiên cứu việc sinh

tổng hợp bacteriocin của Lactobacillus amylovorus DCE 471 và có ứng dụng cải tiến và

làm ổn định các sản phẩm lên men Việc sinh tổng hợp thu nhận bacteriocin bị ức chế bởi nồng độ của nguồn nitrogen

Năm 1999, nhóm tác giả Farida Khalid, Roquya Siddiqi và Naheed Mojgani đã nghiên cứu tìm ra một loại bacteriocin mới có tên lactocin LC-09 Lactocin LC-09 được

phân lập từ chủng vi khuẩn Lactobacillus có trong một mẫu bệnh Loại này ức chế được một số loại Lactobacillus và vi khuẩn Gram dương khác như Listeria ivanovii,

Streptococcus agalactii và S peyogenes Đặc tính của Lactocin LC-09 là chịu nhiệt (4

giờ ở 1000C) và thích hợp với môi trường có pH acid Loại bacteriocin này bị khử hoạt tính bằng cách sử dụng enzyme protease Có thể dùng acridine orange, ethidium bromide để gây đột biến trong việc sản sinh ra loại bacteriocin này

Năm 2002, Soore và cộng sự đã nghiên cứu việc tạo ra một chất kháng khuẩn đặc biệt của vi khuẩn lactic gọi là bacteriocin Bacteriocin được sử dụng như một chất bảo quản thực phẩm tự nhiên có khả năng thay thế các loại hoá chất bảo quản khác Bacteriocin có bản chất là protein nên rất an toàn đối với sức khoẻ con người

Năm 2004, nhóm tác giả Todorov SD, Van Reenen CA và Dicks KM đã nghiên

cứu khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của chủng Lactobacillus plantarum ST13BR ,

một chủng được phân lập từ bia Barley Bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn

Lactobacillus plantarum được phân lập từ bia barley (kích thước phân tử 10kDa) ức chế

sự phát triển của vi khuẩn Lactobacillus casei, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus

faecalis, Klebsiella pneumoniae và Escherichia coli Nghiên cứu đã đưa ra được các loại

môi trường có ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp bacteriocin và hỗn hợp các loại môi trường mà việc sinh tổng hợp bacteriocin là lớn nhất

Năm 2006, 50 chủng vi khuẩn lactic được tìm thấy từ sản phẩm lên men truyền thống suan-tsai (mù tạc lên men) của Đài Loan Với các chủng sau khi phân lập tiếp tục nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá và khả năng sinh tổng hợp bacteriocin

Năm 2006, Stefan Marcinowski cho biết kẹo cao su có chứa các chủng vi khuẩn

có lợi Lactobacillus do công ty hoá chất BASF của Đức phát triển Đây là sản phẩm giúp người dùng loại trừ các bệnh về răng miệng Chủng Lactobacillus mới có tên là L

anti-caries có khả năng sinh bacteriocin làm cho vi khuẩn gây sâu răng kết thành khối

không thẻ dính trên bề mặt răng và bị loại bỏ dễ dàng khi súc miệng [28]

Năm 2006, 35 trong số 48 chủng phân lập từ kefir ức chế sự phát triển của

Lb.casei LHS, từ kết quả trên chủng phân lập được có hoạt tính kháng khuẩn cao nhất là

ST8KF Chủng này tạo ra bacteriocin có tên là ST8KF có trọng lượng phân tử 3.5 kDa

có khả năng kháng lại Lb.casei, Lb.curvatus và Listeria innocua BacST8KF nhạy cảm

với enzyme thủy phân, nhưng ổn định giữa pH 2 và 10, chịu nhiệt (20 phút ở 1210C) BacST8KF không hấp thụ bề mặt của tế bào sản xuất Hoạt tính tối đa thu được (25600AU/ml) trong môi trường MRS với glucose, trong môi trường MRS với glucose được thay thế bởi sucrose, và trong môi trường MRS với glucose bổ sung với KH2PO4sau 24 h ở 300C [19]

Năm 2007 nhóm tác giả S.D Todorov và Leon M.T Dicks KM đã nghiên cứu

khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của chủng Lactobacillus pentosus ST712BZ được

phân lập từ boza (nước uống lên men) Bacteriocin ST712BZ (kích thước 14kDa) ức chế

sự phát triển của Lactobacillus casei, E.coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterococus

faecalis, Klebsiella pneumoniae and Lactobacillus curvatus Sự phát triển của chủng

ST712BZ trên môi trường BHI, M17, sữa đậu nành và mật đường tương tự như trên môi trường MRS với việc sinh tổng hợp bacteriocin cực đại (12800AU/ml) được ghi nhận trên môi trường MRS sau 24h Nghiên cứu đã đưa ra được các loại môi trường, nhiệt độ

và pH có ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp bacteriocin và thành phần hỗn hợp các loại môi trường mà việc sinh tổng hợp bacteriocin là lớn nhất

Các nhà nghiên cứu CSIRO để tìm ra một vài bacteriocin và sử dụng chúng để tiêu diệt những chủng vi khuẩn gây bệnh giống trong gà và lợn Bộ gen cho phân tử bacteriocin sẽ được chèn vào gen vi khuẩn không gây bệnh hoặc vi rút mà có thể sinh sản và tiết ra bacteriocin Lợi ích chính của việc sử dụng bacteriocin là nó sẽ giảm mầm bệnh nguy hiểm của con người chống cự lại thuốc kháng sinh Bacteriocin còn bị phân hủy nhanh bởi những động vật để mà không còn cặn bã trong thịt

Các nhà nghiên cứu thuộc Đại học Tổng hợp Klemson vừa phát hiện ra một loại thuốc chống vi khuẩn mới không gây tính lờn thuốc từ chính những vi khuẩn tạo ra loại pho mát Thụy Sĩ

Những vi khuẩn này tiết ra một loại protein có tên bacteriocin, tạo nên tính chất của pho mát Các thử nghiệm sơ bộ cho thấy chúng có tác dụng chống lại hơn 150 loại vi khuẩn thường gặp

Y học hiện phải đối mặt với thực tế nhiều loại thuốc đang mất dần hiệu quả trong điều trị do bị sử dụng quá thường xuyên Thêm vào đó, các chất có tính kháng khuẩn được đưa vào cả chất tẩy rửa đến xà phòng, mỹ phẩm, kích thích sự lờn thuốc ở các vi khuẩn cần tiêu diệt

Bởi vậy, phát hiện ra loại thuốc kháng sinh chống lại được sự lờn thuốc được xem như một hy vọng của ngành dược phẩm tương lai Các nhà nghiên cứu chuẩn bị đưa ra thị trường một loại thuốc kháng vi khuẩn có chứa loại protein này với tên gọi Jensenin P [28]

1.5 Cá Diêu Hồng

1.5.1 Giới thiệu sơ lược

Cá diêu hồng (cá điêu hồng) hay còn gọi là cá rô phi đỏ là một loài cá nước ngọt có tên khoa học là Red Tilapia, thuộc họ Cá rô phi (Cichlidae) Thuật ngữ diêu hồng hay điêu hồng được xuất phát từ việc dịch từ tiếng Trung Quốc Ở Việt Nam, người dân bản

xứ còn gọi cá diêu hồng là cá rô vì chúng có hình dạng và màu sắc giống nhau

Cá diêu hồng thực chất là “con lai” của cá rô phi đen, thịt của hai con cá này có thành phần dinh dưỡng như nhau Cá diêu hồng được người Trung Quốc phát hiện và phổ biến ở Việt Nam đặc biệt là được nuôi khá phổ biến ở vùng đồng bằng sông Cửu Long và được nhiều người tiêu dùng ưa chuộng nên giá bán cao hơn cá rô phi đen Hiện nay giá cá diêu hồng đã khá rẻ là do ngày càng có nhiều người nuôi, năng suất cũng khá cao [29]

1.5.2 Tình hình nuôi ở Việt Nam

Cá diêu hồng được chăn nuôi chủ yếu ở miền Nam bộ mà tập trung ở đồng bằng sông Cửu Long, nơi có những điều kiện về thổ nhưỡng, thủy lưu thích hợp nhất cho loài

cá này

Trước đây, người dân ở đồng bằng sông Cửu Long nuôi cá diêu hồng chủ yếu là thả tự nhiên trong ao, thức ăn đơn giản chỉ là rau, cám Cá lớn lên trong môi trường tự nhiên nên thời gian nuôi kéo dài, trung bình 6-7 tháng mới thu hoạch Trọng lượng và

Khi thị trường tiêu thụ mạnh các loại cá này, người nuôi bắt đầu áp dụng kỹ thuật chăn nuôi theo quy trình khép kín từ khâu chọn giống, dựng bè đến chăn thả thức ăn, do

đó cá lớn rất nhanh

Tiền Giang hiện có gần 1.600 lồng bè nuôi cá, chủ yếu là nuôi cá điêu hồng với sản lượng cá thịt cung cấp cho thị trường hàng năm khoảng 18.000 tấn, tập trung chủ yếu ở Thành phố Mỹ Tho và huyện Châu Thành, loại cá này được người dân trong tỉnh thả nuôi ở hầu hết các khu vực ven sông Tiền, trên ao và cả trên ruộng lúa Chúng ăn tạp và tương đối dễ nuôi, nay được nuôi bằng thức ăn công nghiệp, đầy đủ dinh dưỡng nên cá lớn nhanh và mập như béo phì

Việc chăn nuôi theo hình thức bán thâm canh, bằng việc nuôi đơn trong Bể xi măng nước ngọt Mật độ trung bình khoảng 180-200 con/m2 mặt nước Thức ăn của cá chủ yếu là thức ăn viên bán nhiều trên thị trường của các hãng quen thuộc như Cargill,

CP, Masster, Vĩnh Tường , thành phần cơ bản bao gồm các chất dinh dưỡng cần thiết như đạm, vitamin, lipid Thông thường cá con trọng lượng 120 con/kg, nuôi 4÷4.5 tháng là thu hoạch cá đạt 1 kg/con [29]

Hệ vi sinh vật của cá chủ yếu gồm các vi sinh vật tự nhiên của cá, mà thành phần

và số lượng của chúng thường phụ thuộc vào các điều kiện sống (nước, bùn trong sông ngòi, ao hồ, biển…ở các vùng khí hậu khác nhau), các vi sinh vật nhiễm từ các dụng cụ đánh bắt, chứa đựng, chuyên chở, từ không khí,…Như vậy, thành phần và số lượng vi sinh vật của cá tươi sống, cá chết nhưng còn tươi, cá bảo quản, cá ươn thối, hư hỏng rất khác nhau

Hệ vi sinh vật của cá rất đa dạng Trên bề mặt của cá thường có một lớp nhầy chứa một lượng lớn chất protein Lớp nhầy này là môi trường dinh dưỡng tốt đối với vi sinh vật Số lượng vi sinh vật trên bề mặt ngoài cá mới bắt có khoảng 10 đến 107 tế bào/cm2 Những vi sinh vật này thường là trực khuẩn sinh bào tử hoặc không sinh bào tử,

cầu khuẩn nhỏ, Sarcina và một số nấm men, nấm mốc có ở trong nước Các vi khuẩn ở

đây thường thấy là Pseudomonas fluorescens liquefaciens, Proteus vulgaris,

Micrococcus roseus và E coli

Ở mang cá đặc biệt nhiều vi sinh vật hiếu khí Sau khi các chết, các vi sinh vật

này phát triển rất mạnh Trong số này dễ tìm thấy Pseudomonas fluorescens liquefaciens

Trong ruột cá hệ vi sinh vật tương đối đa dạng và là nguồn gây thối rữa sau khi cá chết Vi sinh vật xâm nhập vào đây từ trước, từ bùn cùng với các loại thức ăn Ở đây tìm thấy tất cả các loại vi sinh vật cư trú trong nước và bùn, kể cả các dạng sinh bào từ

Trong ruột cá có Clostridium putrificus và nhóm E coli, cũng thấy có các loại gây ngộ độc thực phẩm – Salmonella và Clostridium botulinum Số lượng vi khuẩn thường dao

động rất lớn từ vài nghìn tới vài chục triệu tế bào trên 1gram chất chứa trong ruột

Trong thịt của cá tươi sống thường không có vi khuẩn Còn trường hợp cá ốm yếu hoặc sau khi kết vi khuẩn xâm nhập vào các mô của thịt cá từ ruột, từ mang cũng như từ ngoài da

Nhiều kết quả nghiên cứu đã xác định thành phần hệ vi sinh vật của cá không khác biệt với hệ vi sinh vật của môi trường nước chung quanh cá sống Trong các mô và

các cơ quan của các tươi thường gặp Sarcina lutea, Sarcina flava, Sarcina alba,

Micrococcus flavus, Micrococcus cereus Proteus vulgaris, Chromobacterium prodigiosum, Pseudomonas fluorescens liquefaciens, Bacterium putidium, Bacillus putrificus, Cl Sporogens cũng như các nấm mốc Penicilium glaucum, Aspergillus niger, Mucor Trong này có thể tới 20 loài có hoạt tính protease Chúng có thể phân hủy

protein và là nguồn gây thối rữa cá sau khi chết Trong cá tươi sống rất ít vi khuẩn tạp nhiễm Thành phần hệ vi sinh vật tự nhiên của cá không thay đổi, nếu như loại trừ được những nguồn tạp nhiễm từ môi trường chung quanh Vì vậy, sau khi đánh bắt cá cần có những biện pháp xử lý, cất giữ và vận chuyển thích hợp [7]

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Vật liệu

2.1.1 Giống vi sinh vật

- Hạt kefir

- Chủng vi khuẩn chỉ thị cho hoạt tính kháng khuẩn của bacteriocin: Bacillus

subtilis, Escherichia coli

Các giống vi khuẩn trên được cung cấp từ bộ môn Công Nghệ Sinh Học Trường Đại Học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh

2.1.2 Môi trường nuôi cấy

- Môi trường MRS: dùng để phân lập, nuôi cấy, khảo sát và giữ giống LAB (phụ lục 1)

- Môi trường NA (nutrient agar) và NB (nutrient broth): dùng để nuôi cấy, giữ giống vi khuẩn chỉ thị và khảo sát hoạt tính bacteriocin của các chủng phân lập (phụ lục 1)

2.2 Nội dung đề tài

Các bước thí nghiệm trong đề tài được thực hiện theo sơ đồ 3.1

Sơ đồ 2.1 Nội dung các bước thí nghiệm của đề tài

2.3 Phương pháp thí nghiệm

2.3.1 Phân lập hệ LAB trong hạt kefir

2.3.1.1 Nguyên tắc

Dựa và nguyên tắc Kock, tiến hành phân lập các vi sinh vật từ các khuẩn lạc riêng

lẻ Tiếp tục cấy ria các khuẩn lạc này trên các đĩa môi trường đến khi thu được chủng

Lên men thu nhận bacteriocin thô