Bài giảng xu hướng phát triển thực phẩm các phương pháp xác định gmogmf

Sự biến đổi đoạn AND chuyển chèn vàprotein tương ứng •Trong GMO: •ADN đoạn chèn tồn tại ở mọi tế bào trên mọi bộ phận •Protein tương ứng được biểu hiện không đồng đều và phụ thuộc tác độ

Nguyễn Tiến ThànhApril, 2015

CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH GMO/GMF

Nội dung chính

1 Tại sao phải xác định/phát hiện GMO

2 Xác định GMO dựa trên cơ sở nào?

3 Các phương pháp xác định

TẠI SAO PHẢI PHÁT HIỆN GMO

TẠI SAO?

•Xem sự kiện được chứng nhận hay chưa ở nước sở tại

•Xác nhận sản phẩm hữu cơ/GMF

•Liên quan tới dán nhãn

•Liên quan tới việc nghiên cứu phát triển giống mới: tính

ổn định di truyền, đánh giá khả năng phát tán gen vào môi

trường…

Sự khác biệt về mặt di truyền giữa GMO và đối

chứng non-GMO

•GMO = non GMO + đoạn gen được

chuyển vào (chèn vào)

Đoạn chèn có thể bị biến đổi  mất

chức năng dự kiến, ví dụ kháng

thuốc trừ cỏ)

1 cá thể được chọn cuối cùng (dựa trên các

ưu thế) để phát triển tiếp Trong cá thể này,

vị trí chèn của đoạn chèn là cụ thể và đặc trưng (sự kiện chuyển gen).

Đoạn gen chuyển trong GMO hoạt

động/biến đổi như thế nào

Đoạn ADN chuyển

chuột, động vật, sâu bọ (ADN, protein bị biến đổi?)

Sản phẩm chế biến  ADN, protein bị biến đổi, có mặt trong sản phẩm cuối hay không?

Sản phẩm không qua chế biến

Phát tán ra môi trường,

sang sinh vật khác (ví dụ

phấn hoa sang cây trồng

khác)

Sự biến đổi đoạn AND chuyển chèn và

protein tương ứng

•Trong GMO:

•ADN đoạn chèn tồn tại ở mọi tế bào trên mọi bộ phận

•Protein tương ứng được biểu hiện không đồng đều và phụ thuộc tác

động bên ngoài (môi trường, điều kiện dinh dưỡng)

•Từ GMO khi qua quá trình chế biến, ADN và protein có thể giữ

nguyên, bị biến đổi hoặc phân giải hoàn toàn tới sản phẩm cuối

cùng

Trong GMO và các sản phẩm có chứa GMO có thể còn tồn

tại ADN ngoại lai chèn vào và sản phẩm protein tương ứng

của nó  phát hiện GMO/sản phẩm chứa GMO thông qua

sự có mặt của 2 đối tượng này

Tại sao phải kiểm tra GMO ?

•Đánh giá sự di truyền qua các thế hệ: ổn định hay không?

•Đánh giá khả năng phát tán gen trôi gen?

•Kiểm tra xem trong lô sản phẩm có mang sự kiện được chứng

nhận an toàn ở nước sở tại hay chưa

•Dán nhãn sản phẩm

Các bước phân tích GMO

Sản phẩm nghi

chứa GMO?

Kiểm tra GMO hay

không phải GMO?

Các vấn đề cần quan tâm với một phương pháp

kiểm tra GMO/GMF

•Mục đích phép kiểm tra: định tính hay định lượng?

•Chi phí: tăng lên khi độ chính xác yêu cầu tăng

•Sản phẩm ở dạng gì: nguyên liệu, sản phẩm trung gian, hay sản

phẩm cuối:

•Sản phẩm là đồng nhất hay không? Sản phẩm đồng nhất cho

phép độ chính xác cao hơn, quyết định cỡ mẫu…

Phân loại nhóm phương pháp

•Theo đối tượng xác định

• Dựa trên protein

• Dựa trên DNA

Phương pháp định tính sàng lọc

•Trả lời câu hỏi: YES /NO

•Xác định phổ các sự kiện biến đổi gen nhưng không xác định cụ

thể được gen chuyển sử dụng và sự kiện

•Thường dựa trên các trình tự phổ biến cùng được dùng trong

các sự kiện chuyển gen như promoter 35S, trình tự kết thúc

Nos 3 80% các sự kiện chuyển gen sử dụng 2 trình tự này

Phương pháp định tính xác định

•Gen chuyển là gì: Dựa trên gen chính

được chuyển vào cây trồng chủ: ví

dụ gen cry1b (tạo δ-endotoxin) từ vi

khuẩn Bt đưa vào ngô kháng sâu

cánh vẩy  xác định qua ADN là gen

cry1b hoặc qua protein là

δ-endotoxin (B)

•Cấu trúc đoạn chèn: thường dựa

trên ADN là vùng giữa promoter

hoặc Terminator với gen chuyển (B)

•Xác định sự kiện chuyển gen: dựa

trên ADN vùng tiếp giáp giữa đoạn

chèn và hệ gen sinh vật chủ (C)

Phương pháp định lượng

•Xác định số lương tuyệt đối GMO có mặt trong sản phẩm

hoặc tỷ lệ tương đối GMO trong tổng số lượng sản phẩm (để

dán nhãn)

•Các phương pháp có thể dựa trên ADN hay protein

Giới hạn phát hiện (LOD)

•Thể hiện độ nhạy của phương pháp xác định

•Là ngưỡng mà phương pháp sử dụng có thể phát hiện được: ví dụ

LOD 1%, trên 1% mới có thể phát hiện được

•Xác định LOD cho sản phẩm chứa nhiều thành phần khác nhau sẽ

phức tạp hơn:

•tỷ lệ GMO sử dụng thấp hơn rất nhiều, ví dụ bánh sử dụng bột đậu nành 1%,

trong đó có 1% trong lượng bột đậu nành là đậu nành chuyển gen  0.01 %

trong khối lượng bánh

•Sử dụng thông qua ADN, protein: khi tách chiết từ mẫu, sẽ có ADN và

protein từ thành phần khác không phải là cùng loại nguyên liệu: ví dụ từ

ngô, đậu nành, bột mì, ADN tổng từ 3 nguồn khác nhau

Giới hạn phát hiện (LOD)

•Ở Úc: mặc dù luật dán nhãn là ngưỡng tính theo từng thành phần,

nhưng có thể thông qua tỷ lệ/tổng số để quyết định dán nhãn hay

không?

•Ví dụ: nếu đặt ngưỡng dán nhãn là 1% trên tổng sản phẩm thì nếu 1

nguyên liệu GM dưới 1% tổng sản phẩm  không cần kiểm tra

•Và LOD của phương pháp cần đảm bảo ít nhất là 0.01%

•Ở Nhật: ngưỡng dán nhãn là 5% trên tổng sản phẩm

•Đậu tương: sản phẩm dạng bột đậu tương ; nếu chiếm 5% trong số

đậu tương hạt là GM  dán nhãn

•Bột Đậu tương làm bánh (bao gồm cả bột nguyên liệu khác): tính

trên tổng khối lượng bánh: nếu lượng đậu tương chuyển gen dưới

chiếm dưới 5% không phải dán nhãn (mặc dù có thể sử dụng toàn

bộ là đậu tương chuyển gen)

•Nếu ngưỡng dán nhãn 5% trong tổng số sản phẩm, và lượng nguyên

liệu sử dụng là 5% trong tổng số sản phẩm, thì LOD yêu cầu ít nhất =

0.25%

Giới hạn phát hiện (LOD)

Nhóm các phương pháp dựa trên protein

•Xác định dựa trên đặc tính kích thước, pH: chạy điện di SDS 1

chiều, 2 chiều để phân tách protein thành các băng riêng biệt,

sau đó có thể xác định tiếp bằng cách phương pháp khác

•Mỗi protein thường có các kháng thể đặc hiệu cho nó (liên kết với

protein) do đó có thể sử dụng các kháng thể đặc hiệu để phát hiện

protein đó

•Enzyme Linked Immunosorbent Assay: phản ứng miễn dịch liên

kết enzyme

ELISA - kết quả

Cơ chất S được chuyển hoá bởi Enzyme tạo ra các sản phẩm có màu

(hấp phụ UV vis)  định lượng sản phẩm  lượng protein

ELISA – ưu điểm

•Chuẩn bị mẫu không phức tạp

Nhanh (2-4 tiếng, bao gồm chuẩn bị mẫu)

•Sử dụng tốt cho định tính và bán định lượng

•Chi phí rẻ (AUS$10-50)

•Phương pháp thực hiện đơn giản

•Có tính kinh tế hơn sơ với pp dựa trên ADN

•Cần ít kỹ năng hơn so với pp dựa trên ADN

•Thiết bị đơn giản, rẻ tiền hơn

ELISA –nhược điểm

•Độ nhạy thấp hơn phương pháp dựa trên ADN, chỉ khoảng 0.5%-1%

•ELISA Kit cần bảo quản tốt 4°C

•Chi phí thiết bị ở mức trung bình (máy đọc vi phiến ELISA)

•Cần kháng thể đặc hiệu: không có, hoặc mất thời gian mới tạo ra kháng

thể đặc hiệu cho nó

•Định lượng dựa trên protein đôi khi không chính xác bởi sự biến thiên

hàm lượng này do tác động bên ngoài như thời tiết, điều kiện dinh

dưỡng

•Chỉ áp dụng cho trưòng hợp protein biểu hiện được tạo ra lượng đủ

phát hiện, không áp dụng được với truờng hợp có protein nội sinh

giống protein mới đưa vào

•Yêu cầu cao về cấu trúc protein: không biến tính, không bị gắn thêm các

đoạn protein hay polysacharite khác

Sắc ký miễn dịch – Nguyên tắc

Sắc ký miễn dịch – Kết quả

Sắc ký miễn dịch – Ưu điểm

•Đơn giản, sử dụng trên thực địa

•Không cần đào tạo

•Chuẩn bị mẫu nhanh đơn giản

•Phép thử định tính nhanh (5-10 minutes)

•Rẻ (AUS$5-20)

•Bảo quản que thử ở nhiệt độ thường

•Không cần thiết bị đắt tiền

Sắc ký miễn dịch – Nhược điểm

•Độ nhạy thấp (~1% (w/w) GM protein)

•Cần kháng thể đặc hiệu và thời gian tạo kháng thể thường kéo dài vài

tháng, vài năm

•Mỗi que thử chỉ được 1 phép kiểm tra

•Nhiều GMO không biểu hiện đủ lượng protein tái tổ hợp cho phép thử

•Chỉ phù hợp cho phép thử nhanh, trên các đối tượng chưa qua các công

đoạn chế biến

Phương pháp khác

•Sử dụng trong ống nghiệm: kháng thể được cố định trên chất

mang, ví dụ hạt nano carbon, phản ứng miễn dịch tốt hơn do có

sự di chuyển của hạt chất mang kháng thể

Phương pháp dựa trên protein – Ưu điểm chung

•Rẻ tiền, đơn giản

•Chuẩn bị mẫu đơn giản

•Không đòi hỏi kỹ năng cao

•Phù hợp cho các sản phẩm chưa qua chế biến (đặc biệt là tác

•Hàm lượng protein trong các tế bào (từ các phần của sinh vật)

khác nhau, chỉ áp dụng khi protein mới biểu hiện

•Thường cho con số tuyệt đối về lượng protein, thực tế để quyết

định sản phẩm có phải dán nhãn hay không, cần tỷ lệ tương đối

• Không phù hợp sử dụng để kiểm soát sự trôi gen bởi protein có

thể bị thay đổi từ khi gen được chuyển từ cá thể này sang cá thể

khác

Phương pháp dựa trên protein – nhược

điểm chung

Các phương pháp dựa trên DNA

•Sử dụng các trình tự ADN đặc trưng cho GMO trong các

thành phần khác của thực phẩm

•ADN có thể được khuyếch đại về số lượng = PCR, do vậy các

phương pháp dựa trên DNA có độ nhạy cao

Tách chiết ADN từ mẫu

•Công đoạn tốn thời gian nhất, nhưng quyết định chất lượng ADN và

có thể ảnh hưởng tới công đoạn tiếp theo: sự có mặt các thành

phần khác như lipid, protein, polysacharide có thể ảnh hưởng tới

phản ứng khuếch đại ADN

•1st: bổ sung hoá chất để phá tế bào giải phóng ADN (thường là chất tẩy rửa

anion, lysozyme)

•2nd: loại protein (kết tủa protein) và các thành phần khác

•3rd: kết tủa chọn lọc ADN bằng alcohol Sau đó có thể tiếp tục tinh sạch

bằng nhựa liên kết AND (tuy nhiên có thể làm tổn thất ADN)

Khuếch đại ADN bằng PCR

• Sử dụng mồi đặc hiệu để khuếch đại vùng nào đó, sự tạo

thành sản phẩm có kích thước dự kiến

• Tuỳ thuộc thông tin về sự kiện cụ thể, dựa trên trình tự đoạn

chèn và vùng kế cận, mồi sử dụng trong các phản ứng nhân

gen PCR sẽ được thiết kế

Phương pháp PCR để sàng lọc

•Dưa trên các trình tự phổ biến, sử dụng trong cây trồng GM,

qua đó có thể sàng lọc 80% cây GM sử dụng 2 trình tự sau:

•Promoter CaMV 35S (A.tumefaciens)

•NOS terminator (A.tumefaciens)

•Thông thường cần kết quả PCR dương tính với cả 2 trình tự

P35S và NOS (tạo ra 2 băng sản phẩm tương ứng)

•Định tính cho nhiều loại GMO (nếu sử dụng cùng các trình tự

này)

•Độ nhạy 0.1% GMO

Phương pháp PCR định tính xác định cấu trúc

đoạn chèn (gen chuyển)

•Dựa trên trình tự vùng tiếp giáp giữa promoter và gen mã

hoá vốn không có sẵn trong tự nhiên

•Định tính

•Độ nhạy 0.1% GMO

•Xác định được gen sử dụng cụ thể

•Có thể sử dụng để phát hiện sự trôi gen vào cây trồng khác

•Không xác định được sự kiện chuyển gen cụ thể

chuyển gen cụ thể

•Dựa trên vùng tiếp giáp giữa hệ gen cây chủ và đoạn chèn vào

•Vùng tiếp giáp đoạn chèn vào hệ gen cây chủ đặc trưng cho sự kiện

chuyển gen

•Ví dụ:

•Một quốc gia chỉ cho chấp thuận sự kiện Bông biến đổi gen A, nhưng

không chấp thuận sự kiện bông biến đôi gen B  xác định bằng phương

•Định lượng tương đối: tỷ lệ lượng ADN đặc trưng cho GMO/lượng

ADN đặc trưng cho non-GMO Tỷ lệ này không thể xác định trực tiếp

từ mẫu ban đầu mà phải nhân lên bằng phương pháp PCR (realtime

PCR), tính toán tỷ lệ sản phẩm sau khuếch đại  tính toán ngược lại

tỷ lệ ban đầu

•Đoạn ADN đặc trưng cho GMO nên là vùng tiếp giáp để đảm bảo độ

chính xác để định lượng

•Đoạn ADN đặc trưng cho non-GMO nên từ một gen nào hoạt động

ổn định trong mọi điều kiện, có mặt trong mọi giống

•Chi phí đắt: thiết bị và hoá chất phát quang

•Đòi hỏi kỹ năng cao

Ưu điểm chung của các phương pháp sử dụng

PCR

•Định tính  định lượng

•sàng lọc GMO đặc trưng sự kiện

•Dựa trên ADN, tất cả tế bào đều có như nhau

•Có thể định lượng tương đối

•Độ nhạy cao

Nhược điểm chung của các phương pháp sử

dụng PCR

•Cần thời gian, kỹ năng

•ADN có thể bị biến đổi, phân giải sau quá trình chế biến

•Phản ứng PCR có thể bị ảnh hưởng bởi các yếu tố bên ngoài

•Dễ bị ảnh hưởng của sự nhiễm tạp

•Yêu cầu về trình tự của đoạn ADN đích

Các bước kiểm tra GMO trong mẫu

•Quy trình lấy mẫu

•Lấy mẫu cần đại diện cho toàn bộ lô mẫu, đặc biệt là mẫu thô (dạng hạt

rời) độ đồng nhất thấp

•Cần quan tâm tới: kế hoạch lấy mẫu, cỡ mẫu, mẫu đại diện, chuẩn bị

mẫu, phân tích và báo cáo kết quả

Cỡ mẫu

•Quyết định độ nhạy của phương pháp (LOD), phải đảm bảo đủ lớn

để cho phép phát hiện được đối tượng cần phân tích ở độ nhạy yêu

cầu, đặc biệt với mẫu không đồng nhất, cỡ mẫu nhỏ, sẽ không đủ

nhạy để phát hiện GMO

•Cỡ mẫu lớn giảm rủi ro cho người bán và người mua Nhưng cỡ

mẫu cần phải phù hợp với số lượng mẫu cần phân tích, chi phí và độ

nhạy phát hiện

•Tỷ lê thành phần cần xác định quyết định cỡ mẫu, quy trình tách

chiết thu nhận thành phần xác định cũng quyết định cỡ mẫu

Cỡ mẫu

•Công thức tính cỡ mẫu của GIPSA (USDA)

•1-(r/100) = (1-(p/100))n

• n: cỡ mẫu (số hạt)

• p: % số hạt biến đổi gen trong mẫu

• r: xác xuất từ chối lô mẫu

•Ví dụ: nếu người mua chấp nhận ngưỡng tỷ lệ hạt GM là 1%, xác

xuất từ chối lô hàng là 5%, số hạt cần lấy mẫu: 299 hạt Nếu

người mua cấp nhận ngưỡng 0.5%, độ tin cậy 95%, thì số hạt

cần cho mẫu 598 hạt Nếu ngưỡng chấp nhận là 5%, cỡ mẫu là

•Phương pháp tách chiết cần đảm bảo thu nhận được đủ lượng và

chất lượng ADN (hoặc protein) để phân tích

•Phân tích mẫu với phương pháp thích hợp tuỳ theo mục đích phân

tích

Ví dụ

•Trong 1 sản phẩm bánh mì sử dụng 5 % bột ngô so với

khối lượng bánh mì, trong đó có chiếm một lượng

nhỏ ngô biến đổi gen MON89034  làm thế nào để

có thể đưa ra yêu cầu dán nhãn với bánh mì này?

Chọn đoạn ADN đặc trưng cho MON89034

•Tính trạng MON89034 là gì? sử dụng gen gì? Cry1A.105 và Cry2Ab2,

•Chọn vùng tiếp giáp giữa đoạn chèn với hệ gen ngô để sử dụng

•Chỉ có một bản sao trên hệ gen

•Có mặt trong tất cả các giống ngô (kể cả ngô thường và ngô GM)

•Trình tự biết rõ

•ví dụ gen hmg

Chọn ADN đặc trưng cho hệ gen của ngô

Thiết kế mồi đặc hiệu để nhân các đoạn ADN đã

chọn

•Dựa trên trình tự các đoạn ADN đặc trưng cho MON89034 và gen

đối chứng, thiết kế mồi

•Mồi phải đảm bảo một số yêu cầu cụ thể: đặc hiệu và tạo sản phẩm

độ dài khoảng 100 -200 bp

•Có thể gắn mồi với các đuôi phát quang hoặc không

Tách chiết ADN tổng số từ mẫu

•Sử dụng các phương pháp tách chiết ADN tổng số từ mẫu bánh mì

sao cho đảm bảo chất lượng ADN tốt, không nhiễm tạp các thành

phần khác có thể ảnh hưởng tới phản ứng PCR

•ADN tổng số bao gồm ADN từ ngô chuyển gen và ADN từ ngô

thông thường và ADN từ các thành phần khác (lúa mì…)

Chạy Real time PCR

•Sử dụng các cặp mồi đã thiết kế để nhân các đoạn đích đặc trưng

cho MON89034 và ngô thông thường

•Theo dõi quá trình nhân gen trên hệ thống máy PCR đặc biệt, tín

hiệu thu được thường xuyên do có các đoạn phát quang, hoặc sử

dụng các chất hiện màu ADN (như SBGR)

•Tính toán ra lượng ADN ban đầu tương ứng với MON89034 và ngô

thường

•Xác định tỷ lệ giữa ADN ban đầu ngô MON89034 và ngô thường =

tỷ lệ lượng ngô sử dụng  dán nhãn hay không

•Ví dụ tỷ lệ là 1%  dán nhãn hay không? (với Việt nam)