Bài giảng vi sinh vật đại cương biên soạn phạm thị mỹ lệ

1.2.1 Giai đoạn phát hiện ra vi sinh vật Việc Leewenhoek tự chế tạo ra trên 400 chiếc kính hiển vi cầm tay, trong đó có cái có độ phóng đại đến 270 lần với đầy đủ cấu tạo các bộ phận:

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CỬU LONG

KHOA NÔNG NGHIỆP – THỦY SẢN

PHẠM THỊ MỸ LỆ

BÀI GIẢNG

VI SINH VẬT ĐẠI CƯƠNG

Vĩnh Long, 2022

MỤC LỤC

DANH SÁCH HÌNH v

DANH SÁCH BẢNG vii

Chương 1 GIỚI THIỆU KHÁI QUÁT VỀ ĐỐI TƯỢNG, LỊCH SỬ NGÀNH VI SINH VẬT HỌC 1

1.1.Đối tượng của vi sinh vật học đại cương 1

1.2Lược sử ngành vi sinh vật học 2

1.2.1 Giai đoạn phát hiện ra vi sinh vật 3

1.2.2 Giai đoạn về vi sinh vật học thực nghiệm với Pasteur 4

1.2.3 Giai đoạn sau Pasteur và vi sinh vật học hiện đại 5 Chương 2 PHƯƠNG TIỆN VÀ THỦ THUẬT DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU VI SINH VẬT 8

2.1 Phương tiện sử dụng trong nghiên cứu vi sinh vật 8 2.1.1 Kính hiển vi (microscopy) 8

2.1.2 Máy ly tâm (centrifuge) 19

2.1.3 Tủ cấy vô trùng 20

2.1.4 Tủ hấp tiết trùng (autoclave) 20

2.1.5 Tủ sấy (thiết bị khử trùng khô) 21

2.2 Các thủ thuật cơ bản dùng trong nghiên cứu vi sinh vâ ̣t 22

2.2.1 Phương pháp thanh trùng, tiệt trùng 22

2.2.2 Phương pháp nhuộm màu vi sinh vật 23

2.2.3 Phương pháp tách ròng (phân lập) VSV 26

CÂU HỎI GỢI Ý ÔN TẬP 30

Chương 3 SỰ DINH DƯỠNG, TĂNG TRƯỞNG CỦA

VI SINH VẬT VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN

NGOẠI CẢNH 31

3.1 Dinh dưỡng của vi sinh vâ ̣t 31

3.2 Sự tăng trưởng của vi sinh vâ ̣t 32

3.2.1 Tinh ròng mẻ nuôi cấy 32

3.2.2 Đo lường sự tăng trưởng 33

3.2.3 Cách tăng trưởng của vi sinh vật 35

3.2.4 Ảnh hưởng của điều kiện ngoại cảnh tác động đến sự tăng trưởng của vi sinh vật 35

CÂU HỎI GỢI Ý ÔN TẬP 39

Chương 4 VI SINH VẬT NHÂN NGUYÊN (PROKARYOTES) 40

4.1 Vi khuẩn 40

4.1.1 Hình dạng và kích thước của vi khuẩn 40

4.1.2 Cấu tạo tế bào của vi khuẩn 42

4.1.3 Hình thức sinh sản của vi khuẩn 50

4.2 Xạ khuẩn 51

4.2.1 Đặc điểm cấu tạo của xạ khuẩn 51

4.2.2 Vai trò của xạ khuẩn 52

4.3 Ricketxia 52

4.3.1 Đặc điểm cấu tạo của Rixketxia 52

4.3.2 Tác hại của Rixketxia 53

4.4 Dạng L của vi khuẩn 54

4.4.1 Đặc điểm cấu tạo 54

4.4.2 Các yếu tố ức chế việc thành lập vách 54

4.5 Clamydia 54

4.5.1 Đặc điểm cấu tạo 54

4.5.2 Tác hại 56

4.6 Tảo lam (vi khuẩn lam) 56

CÂU HỎI GỢI Ý ÔN TẬP 56

Chương 5 VI SINH VẬT NHÂN THỰC 57

5.1 Tổng quan về nhóm vi sinh vâ ̣t nhân thực 57

5.2 Cấu tạo tế bào 57

5.2.1 Vách tế bào 57

5.2.2 Màng nguyên sinh chất 58

5.3 Tế bào chất 59

5.3.1 Hệ thống nội mạc 59

5.3.2 Bộ Golgi 59

5.3.3 Không bào 60

5.3.4 Lysosome 60

5.3.5 Ty thể 61

5.3.6 Lục lạp 62

5.3.7 Nhân 63

5.4 Các vi sinh vâ ̣t đại diện trong nhóm nhân thực 64

5.4.1 Tảo 64

5.4.2 Nấm 65

5.4.3 Protozoa 66

CÂU HỎI GỢI Ý ÔN TẬP 68

Chương 6 VIRUS 69

6.1 Giới thiệu tổng quan về virus 69

6.2 Đặc điểm chung của virus 69

6.2.1 Kích thước và hình dạng 69

6.2.2 Cấu tạo 70

6.2.3 Đặc tính của virus 71

6.2.4 Ảnh hưởng của điều kiện môi trường tác động đến virus 72

6.3 Sự tái sản của virus 73

6.3.1 Sự tái sản ở thực khuẩn thể 73

6.3.2 Sự tái sản ở virus thực vật và động vật 74

CÂU HỎI GỢI Ý ÔN TẬP 77

Chương 7 MIỄN DỊCH HỌC 78

7.1 Khái niệm miễn dịch và các loại miễn dịch 78

7.1.1 Khái niệm miễn dịch 78

7.1.2 Miễn dịch bẩm sinh 79

7.1.3 Miễn dịch tạo được 79

7.2 Cơ chế của sự miễn dịch 80

7.2.1 Miễn dịch không đặc hiệu 81

7.2.2 Miễn dịch đặc hiệu do kháng thể đàm nhiệm 86

7.3 Ứng dụng của miễn dịch học 89

7.3.1 Trong sản xuất kháng huyết thanh trị bệnh 89

7.3.2 Trong sản xuất vaccine ngừa bệnh 91

7.3.3 Trong chẩn đoán bệnh bằng phương pháp Elisa 92 TÀI LIỆU THAM KHẢO 96

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1 Kính hiển vi đầu tiên của Leewenhoek 4

Hình 2 Cấu tạo kính hiển vi quang học thường 10

Hình 3 Đặc điểm của tia sáng đi qua vật kính dầu 12

Hình 4 Đường đi của tia sáng trong tụ quang nền đen 14

Hình 5 Kính hiển vi điện tử soi nổi 16

Hình 6 Phương pháp cấy ria 28

Hình 7 Phương pháp cấy chan 29

Hình 8 Phương thức hấp thu dinh dưỡng vào tế bào của vi sinh vật 32

Hình 9 Phương pháp đếm trên lame đếm 34

Hình 10 Phương pháp đếm bằng pha loãng huyền phù vi sinh vật34 Hình 11 Phương pháp đếm qua màng lọc 34

Hình 12 Các giai đoạn tăng trưởng của vi sinh vật trong một mẻ nuôi cấy 35

Hình 13 Chia nhóm vi sinh vật theo điều kiện thích nghi nhiệt độ36 Hình 14 Dãy quang phổ ánh sáng và tác dụng của ánh sáng đến sự sống của vsv 38

Hình 15 Các hình dạng cơ bản của vi khuẩn 41

Hình 16 Cấu tạo tổng quát tế bào vi khuẩn 42

Hình 17 Vi khuẩn Streptococcus pneumoniae với lớp vỏ capsule43 Hình 18 Sự khác biệt trong cấu trúc tế bào của vi khuẩn gram dương và vi khuẩn gram âm 45

Hình 19 Mô hình cấu tạo màng nguyên sinh chất của vi khuẩn 46 Hình 20 Các thành phần của tế bào chất trong vi khuẩn 47

Hình 21 Vai trò của mesosome trong quá trình phân cắt tế bào 48 Hình 22 Các tiểu phần của ribosome 49

Hình 24 Cấu tạo vách tế bào nhiều lớp của Rixketxia 53

Hình 25 Hình thức sinh sản của Clamydia 55

Hình 26 Cơ chế xâm nhập và gây hại tế bào ký chủ của Clamydia 55

Hình 27 Hình dạng của Amib và Paramecium khi không có vách58 Hình 28 Bộ máy Golgi ở tế bào VSV nhân thực 59

Hình 29 Lysosome trong tế bào nhân thực 61

Hình 30 Cấu trúc bên trong ty thể 62

Hình 31 Cấu trúc của nhân tế bào chân hạch 63

Hình 32 Các hình dạng của tảo 64

Hình 33 Các dạng bào tử của nấm tạo ra do sinh sản vô tính 65

Hình 34 Các dạng bào tử của nấm tạo ra do sinh sản hữu tính 66

Hình 35 Một vài loài protozoa gây bệnh cho người 67

Hình 36 Cấu tạo cơ bản của một virus 71

Hình 37 Tinh thể hình lăng trụ của virus TMV trên tế bào cây thuốc lá mắc bệnh khảm 71

Hình 38 Các giai đoạn tái sản ở thực khuẩn thể 74

Hình 39 Các giai đoạn tái sản ở tế bào động vật 75

Hình 40 Sơ đồ hóa quá trình sinh kháng thể ở cơ thể động vật 88 Hình 41 Nguyên tắc của phương pháp Elisa 93

Hình 42 Sơ đồ thử nghiệm Elisa 94

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1 Mối quan hệ giữa nhiệt độ, áp suất tới thời gian tiệt trùng tối thiểu 21Bảng 2 Mối quan hệ giữa nhiệt độ và thời gian tiệt trùng bằng nhiệt khô 22

Chương 1 GIỚI THIỆU KHÁI QUÁT VỀ ĐỐI TƯỢNG, LỊCH SỬ NGÀNH VI SINH VẬT HỌC

Mục tiêu: sinh viên hiểu được khái niệm vi sinh vật

(VSV) là gì, biết được lịch sử nghiên cứu VSV qua các giai

đoạn và tình hình phát triển của ngành VSV học hiện nay

1.1 Đối tượng của vi sinh vật học đại cương

VSV học là ngành nghiên cứu về cấu tạo và đời sống của VSV

VSV (microorganism) là những sinh vật rất nhỏ có cấu tạo đơn bào, nhưng rất kém phân hóa Tùy theo sự tiến hóa của từng nhóm, có thể xếp chúng vào lớp, nhóm, bộ, họ khác nhau Có thể phân loại tổng quát VSV thành nhóm nhân nguyên (prokaryotic) gồm các đại diện: vi khuẩn, xạ khuẩn, mycoplasma, clamydia, rixketxia và tảo lame, nhóm VSV nhân thực (eukaryotic) gồm có: tảo, nấm và nguyên sinh động vật (protozoa), cuối cùng là virut là nhóm VSV tiến hóa thấp nhất

VSV học hiện đại nghiên cứu từng nhóm đối tượng riêng biệt, và trở thành những môn học chuyên sâu: virut học, vi khuẩn học, nấm học, Mặt khác, vi sinh học hiện đại cũng đi sâu nghiên cứu những tính chất riêng biệt của VSV và hình thành các chuyên ngành: tế bào học, sinh lý học, sinh hóa học, di truyền học của VSV

Về mặt ứng dụng, ngành VSV học có những chuyên ngành như: vi sinh học công nghiệp, vi sinh học thực phẩm,

vi sinh học thú y, vi sinh học y học, vi sinh học đất,

1.2 Lược sử ngành vi sinh vật học

Từ xưa, dù chưa nhận thức được sự tồn tại của VSV, nhưng con người đã biết khá nhiều về các tác dụng do VSV gây nên Trong đời sống và sản xuất con người đã tích lũy được nhiều kinh nghiệm về các biện pháp lợi dụng các VSV

có ích và phòng tránh các VSV có hại

Trên những vật giữ lại từ thời Hi Lạp cổ, người ta đã thấy minh họa cả quá trình nấu rượu Những tài liệu khảo cổ cho thấy cách đây trên 6000 năm người dân Ai Cập ở dọc sông Nile đã có tập quán nấu rượu Ở Trung Quốc, rượu đã được sản xuất từ thời đại văn hóa Long Sơn (cách đây trên

4000 năm) Trên các chữ khắc trên xương, mai rùa từ thời

Ân Thương người ta đã thấy chữ “tửu” (thế kỷ XVII – XI TCN) Việc lên men lactic được thực hiện từ năm 3500 TCN

Muối dưa, làm giấm, làm tương, mứt, ướp thịt, ướp cá,

… đều là những biện pháp hữu hiệu để sử dụng hoặc khống chế VSV phục vụ cho chế biến và bảo quản thực phẩm Theo các tài liệu khảo cổ thì nhân dân ta từ thời Hùng Vương đã biết làm mắm bằng thú, làm rượu bằng cốt gạo Việc sáng tạo ra các hình thức ủ phân, ngâm đậy, trồng luân canh với cây họ đậu, … đều là những biện pháp tài tình mà

tổ tiên ta từ lâu đã biết phát huy tác dụng của VSV

Từ những minh chứng trên cho thấy con người đã nhận

ra có sự tồn tại của những sinh vật nào đó mà con người chưa giải thích, chứng minh, và xác định được Cho đến khi một thương gia buôn vải người Hà Lan là Antonie van Leewenhoek (1633 – 1723), phát hiện ra và miêu tả hình thái của VSV bằng kính hiển vi tự chế Từ giai đoạn đó đến nay, lịch sử ngành VSV học đã trải qua các giai đoạn phát triển vượt bậc Có thể tóm tắt thành 3 giai đoạn: giai đoạn

phát hiện ra VSV, giai đoạn VSV học thực nghiệm với Pasteur và giai đoạn sau Pasteur và VSV học hiện đại

1.2.1 Giai đoạn phát hiện ra vi sinh vật

Việc Leewenhoek tự chế tạo ra trên 400 chiếc kính hiển vi cầm tay, trong đó có cái có độ phóng đại đến 270 lần với đầy đủ cấu tạo các bộ phận: gương hội tụ ánh sáng, ốc điều chỉnh để cho vật định quan sát rơi đúng vào tiêu điểm

và bằng cách ghé mắt vào khe nhỏ có gắn kính mài rấ t nhỏ Leewenhoek đã quan sát được mọi thứ xung quanh có kích thước rất nhỏ mà mắt thường không nhìn thấy Năm 1674, ông nhìn thấy vi khuẩn và các nguyên sinh động vật trong kẽ răng của mình và ông gọi chúng là những “động vật vô cùng nhỏ bé” Ông viết rằng trong miệng của ông những “động vật” này còn đông hơn cả dân số của vương quốc Hà Lan

Hình 1 Kính hiển vi đầu tiên của Leewenhoek

1934, chiếc kính hiển vi điện tử đầu tiên ra đời Đó là loại kính hiển vi không dùng ánh sáng khuếch đại nhờ các thấu kính mà nhờ dùng chùm điện tử khuếch đại lên nhờ các điện

từ trường

1.2.2 Giai đoạn về vi sinh vật học thực nghiệm với Pasteur

Từ thập kỷ 60 của thế kỷ XIX, bắt đầu thời kỳ nghiên cứu về sinh lý của các VSV Người có công to lớn trong việc này về sau trở thành ông tổ của ngành VSV học là một nhà khoa học người Pháp Louis Pasteur (1822 – 1895) Những

công trình của ông đã đem lại những biến đổi quan trọng trong các lĩnh vực khoa học về công nghiệp, nông nghiệp và

+ Chứng minh vi khuẩn là nguồn gốc gây bệnh than (1863)

+ Phát hiện ra các phẩy khuẩn gây bệnh (1877)

+ Phát hiện ra các tụ cầu khuẩn và liên cầu khuẩn gây bệnh (1880)

+ Tìm ra vaccine chống bệnh dịch tả gà nhờ sử dụng vi khuẩn đã chuyển sang dạng mất độc lực (1880)

+ Nghiên cứu vaccine chống bệnh dại (1880 – 1885),

1.2.3 Giai đoạn sau Pasteur và vi sinh vật học hiện đại

Sau Pasteur L., nhà bác học Đức Robert Koch (1843 – 1910) là người tìm ra vi khuẩn lao và vi khuẩn tả Ông còn tìm ra phương pháp phân lập VSV thuần khiết trên môi trường đặc Ông cũng là người tìm ra phương pháp nhuộm màu tế bào VSV

Petri J R (1852 – 1921) đã phát minh ra loại hộp lồng làm bằng thủy tinh, sau này người ta đặt tên cho dụng cụ này

là đĩa petri Đây là dụng cụ phổ biến nhất dùng trong phân lập và nuôi cấy VSV

Người có công đầu tiên trong việc chứng minh có sự tồn tại của loại VSV nhỏ bé hơn vi khuẩn nhiều lần là nhà sinh lý học thực vật người Nga D.I Ivanovskii (1864 – 1920) Loại VSV ký sinh đó là nguyên nhân gây ra bệnh khảm trên cây thuốc lá Đến năm 1897 nhà khoa học người

Hà Lan M.W Beijerink gọi loại VSV này là virus Đến năm

1917, F.H d’ Herelle phát hiện ra các virus của vi khuẩn và đặt tên là thực khuẩn thể

Mặc dù Pasteur là người đầu tiên chứng minh cơ sở khoa học của việc chế tạo vaccine nhưng thuật ngữ vaccine

do bác sĩ người Anh Edward Jenner (1749 – 1823) đặt ra Ông là người đầu tiên nghĩ ra phương pháp chủng mủ đậu

bò cho người lành để phòng bệnh đậu mùa

Người đầu tiên phát hiện ra chất kháng sinh là bác sĩ người Anh Alexander Fleming Năm 1928 ông là người đầu tiên tách chủng nấm sinh chất kháng sinh penicillin, mở ra một kỷ nguyên mới cho khả năng đẩy lùi các bệnh nhiễm khuẩn Sau đó hàng loạt chất kháng sinh quan trọng khác được phát hiện bởi các nhà khoa học vào các năm tiếp theo: Bacitracin (1945) là kháng sinh polypeptid tạo ra bởi

Bacillus subtilis Cloramphenicol (1947) được phân lập từ Streptomyces venezuelae Clotetracylin (1948) lấy từ Streptomyces aureofaciens Gentamycin (1963),

Năm 1897 Eduard Bunchner lần đầu tiên chứng minh vai trò của enzyme trong quá trình lên men rượu Ông đã nghiền nát tế bào nấm men bằng cát thạch anh và lấy chất dịch vô bào chiết rút từ men cho vào một dung dịch chứa 37% đường, sau vài giờ đã thấy sản sinh CO2 và rượu ethylic Sau đó ngành khoa học về enzyme hình thành và phát triển hàng loạt các thành công tiếp theo, đến 1984 người ta đã biết đến 2477 loại enzyme khác nhau và enzyme

đã có mặt trong rất nhiều hoạt động sản xuất và đời sống của con người

Các nhà VSV còn tạo ra bước ngoặc của di truyền học D.T Avery; C.M Macleod; M Mc Carty với thực nghiệm trên vi khuẩn (1944) đã chứng minh quá trình biến nạp được thực hiện thông qua AND Quá trình “lắp ráp” virus gây bệnh khảm trên thuốc lá (1957) của nhà khoa học H Franenkel – Conrat và B Singer đã chứng minh thêm vai trò của acid nucleic trong việc chuyển giao thông tin di truyền Như vậy, cùng với phát hiện vĩ đại về cấu trúc của AND xoắn kép của J.D Watson và F.H.C Crick con người đã đủ nhận thức để có được bức tranh toàn cảnh về cấu trúc, chức năng và các qui luật vận động của vật liệu di truyền, mở ra

kỷ nguyên tạo ra các cơ thể hoàn toàn mới lạ mô ̣t cách chủ động nhờ mang gen tái tổ hợp Các chủng VSV được tạo ra nhờ thao tác di truyền sẽ có mặt trong đời sống nhân loại ở các lĩnh vực khác nhau Đó là hy vọng để tháo gỡ mọi khó khăn về lương thực, thực phẩm, thuốc men, bảo vệ môi trường, Mặt khác cũng là mối đe dọa khủng khiếp trong chiến tranh nhân loại, vì nếu các VSV được thay đổi gen sẽ trở thành một thứ vũ khí sinh học vô cùng nguy hiểm

Chương 2 PHƯƠNG TIỆN VÀ THỦ THUẬT DÙNG

TRONG NGHIÊN CỨU VI SINH VẬT

Mục tiêu: sinh viên biết được những dụng cụ dùng

trong nghiên cứu VSV và thiết bị hỗ trợ, hiểu được chức năng, biết cách sử dụng các dụng cụ và thiết bị cơ bản, cũng như phương pháp chuẩn bị mẫu trước khi nuôi cấy, thao tác nuôi cấy, ủ và thu nhận sản phẩm

2.1 Phương tiện sử dụng trong nghiên cứu vi sinh vật

2.1.1 Kính hiển vi (microscopy)

Kính hiển vi là một thiết bị dùng để quan sát các vật thể có kích thước nhỏ bé mà mắt thường không thể quan sát được bằng cách tạo ra các hình ảnh phóng đại của vật thể đó Kính hiển vi có thể gấp độ phóng đại bình thường lên từ 40 -

3000 lần Ngày nay, kính hiển vi có thể bao gồm nhiều loại

từ các kính hiển vi quang học sử dụng ánh sáng khả kiến, cho đến các kính hiển vi điện tử, hoặc các kính hiển vi phát

xạ quang, Kính hiển vi được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành như vật lý, hóa học, sinh học, khoa học vật liệu, y học và được phát triển không chỉ là công cụ quan sát mà còn

là một công cụ phân tích mạnh Trong phạm vi môn học giới thiệu các loại kính hiển vi phổ thông được sử dụng trong nghiên cứu VSV

 Kính hiển vi quang học

+ Kính hiển vi quang học là kính hiển vi dùng ánh sáng thường hoặc nguồn sáng điện để giúp người ta quan sát vi khuẩn với độ phóng đại 400 – 1500 lần

+ Nghiên cứu VSV phải dùng vật kính dầu vì chỉ vật kính dầu mới có độ phóng đại lớn (900 – 1500 lần)

 Cấu tạo kính hiển vi

Kính hiển vi quang học gồm các bộ phận sau: thân kính, đế kính, mâm kính, bộ di chuyển tiêu bản và quan trọng nhất là bộ phận quang học

* Cấu tạo của bộ phận quang học

Có thể là gương nếu dùng ánh sáng tự nhiên hoặc là đèn dùng ở ngoài Nguồn sáng là đèn gắn vào trong đế kính hiển vi (hiện nay kính hiển vi chủ yếu dùng nguồn sáng loại này)

+ Tụ quang: là hệ thống thấu kính để tập trung ánh sáng, có hai loại: tụ quang thường và tụ quang nền đen (sẽ trình bày ở phần sau)

+ Vật kính: là nơi thu nhận hình ảnh từ tiêu bản

Vật kính có nhiều loại nhưng thông thường có 2 loại sau:

Vật kính thường: độ phóng đại nhỏ, được ký hiệu 4X,

10X, 20X, 40X Khi sử dụng đụng không cần có dầu soi

Vật kính dầu: có độ phóng đại lớn, được ký hiệu 90X,

100X, Khi sử dụng dụng phải cần có dầu soi kính

+ Thị kính: là phần trên nhất của kính hiển vi nơi người ta để mắt vào quan sát tiêu bản Thị kính có nhiều loại

có độ phóng đại khác nhau và được ký hiệu 4X, 6X, 7X, 8X, 10X, 15X

 Có loại kính hiển vi chỉ có một thị kính, có loại hai thị kính, trong huấn luyện có loại kính hiển vi có hàng chục thị kính để nhiều người cùng quan sát

 Kính hiển vi quang học dùng vật kính dầu Đặc điểm của

vật kính dầu:

+ Có độ phóng đại lớn, được ký hiệu trên vật kính là 90X, 100X, 150X,

+ Thân vật kính dài và có vạch đen hoặc đỏ

+ Đường kính của thấu kính ngoài nhỏ

Hình 2 Cấu tạo kính hiển vi quang học thường

(Nguồn: https://microscopetalk.wordpress.com/microscopes/ ngày truy

cập 22/09/2017 )

Đường đi của ánh sáng khi sử dụng vật kính dầu

Ánh sáng được truyền thẳng trong điều kiện chân không Trên thực tế, khi ánh sáng đi qua môi trường có chiết quang đồng nhất ánh sáng cũng truyền thẳng (ví dụ: không khí, nước cất, .) Trong kính hiển vi quang học, ánh sáng được truyền từ nguồn sáng như gương, đèn, qua hệ thống

tụ quang  lam kính (tiêu bản)  vật kính  thị kính 

mắt

Giả sử có nguồn sáng O, các tia sáng Oa và Oa’ cùng truyền đi so với trục quang tâm một góc a, khi đi qua lam kính ánh sáng có độ chiết quang n =1,52 sau đó ra không khí

có độ chiết quang n = 1, tia sáng sẽ bị khúc xạ ra ngoài vật kính nên mắt không nhìn thấy tia sáng đó (không quan sát được tiêu bản)

Khi nhỏ một giọt dầu (dầu bách hương có độ chiết quang n = l,51) lên tiêu bản Tia OX lúc này sau khi qua lam kính không bị khúc xạ mà truyền thẳng vào vật kính Tia sáng này sẽ qua tiêu bản lên thị kính giúp ta quan sát được tiêu bản một cách rõ ràng Như vậy giọt dầu giúp làm tăng

độ sáng của các tia sáng và cho hình ảnh rõ nét của các vi khuẩn có kích thước từ 1 đến vài m (Hình 3)

Hình 3 Đặc điểm của tia sáng đi qua vật kính dầu

(Nguồn: https://

visinhyhoc.net%2Fsu-dung-kinh-hien-vi-trong-nghien-cuu-vi-sinh-vat ngày truy cập 22/09/2017)

 Cách sử dụng kính hiển vi với vật kính dầu

Chọn một tiêu bản đã nhuộm cần quan sát

+ Đặt mâm kính nằm ngang (không để mâm kính nằm nghiêng vì sẽ làm chảy giọt dầu soi khi quan sát)

+ Mở tụ quang tối đa và nâng lên đến mâm kính

+ Lấy ánh sáng cho phù hợp (bật công tắc đèn hoặc chỉnh gương)

+ Xoay vật kính dầu về vị trí hoạt động (khi xoay nếu nghe thấy tiếng “ca ̣ch” tức là vật kính đã ở đúng vị trí)

+ Nhỏ một giọt dầu lên vùng tiêu bản đã đánh dấu Đặt tiêu bản vào mâm kính

+ Không nhìn vào thị kính, từ từ hạ vật kính dầu xuống sao cho vật kính ngập trong dầu và sát với tiêu bản (chú ý không làm vỡ tiêu bản)

+ Mắt nhìn vào thị kính, từ từ nâng vật kính lên bằng

ốc vi cấp, khi thấy loáng hình tiêu bản thì dừng lại Dùng ốc

vi cấp để điều chỉnh tiêu bản cho rõ nét Nếu không thấy tiêu bản phải lặp lại từ đầu

+ Khi quan sát tiêu bản, có thể dùng núm điều chỉnh sang trái, phải, lên xuống để quan sát các khu vực khác nhau của tiêu bản

+ Quan sát xong, nâng vật kính lên, lấy tiêu bản ra khỏi mâm kính, tắt đèn hoặc xoay gương về vị trí nghỉ

+ Dùng dung dịch xylen hoặc cồn tuyệt đối (100o) lau sạch vật kính, thị kính, tụ quang, các bộ phận khác, lau bằng khăn sạch Đậy áo kính lại

Kính hiển vi với tụ quang nền đen

Kính hiển vi với tụ quang nền đen là kính hiển vi được dùng để soi tươi các vi khuẩn nhỏ di động và các dạng di động mà nếu quan sát bằng kính hiển vi tụ quang thường thì khó hoặc không nhìn thấy được

Nguyên tắc:

 Khi cho một chùm tia sáng đi qua một khe cửa nhỏ trong buồng tối thì thấy được những hạt bụi nhỏ lơ lửng trong không khí, chúng ta có thể quan sát được dễ dàng mà bình thường không nhìn thấy được Điều này được giải thích

là do chùm tia sáng mạnh chiếu vào hạt bụi làm hạt bụi “tán xạ” ra mọi phía Một số tia sáng đó rọi vào mắt khiến chúng

ta nhìn thấy hạt bụi Đây chính là nguyên lý tụ quang nền đen

+ Tụ quang nền đen giống tụ quang thường về hình dáng nhưng khác cơ bản là nó chỉ cho các tia sáng ở gần mép tụ quang được đi qua, các tia ở giữa bị giữ lại Các tia sáng sau khi đi qua tụ quang đều hội tụ ở chỗ vật cần quan sát

+ Dưới tụ quang nền đen chúng ta có thể quan sát các

vi khuẩn có kích thước từ 1 đến 1/10 µm (nhỏ hơn tụ quang thường hàng chục lần) nhưng không quan sát được hình thể thật của chúng Vì vậy kính hiển vi với tụ quang nền đen chỉ dùng để quan sát sự di động của vi khuẩn, nhất là xoắn khuẩn

Hình 4 Đường đi của tia sáng trong tụ quang nền đen

Kính hiển vi soi nổi

+ Khi quan sát các bề mặt môi trường nuôi cấy (quan sát khuẩn lạc) thì phải sử dụng kính hiển vi soi nổi Để quan sát được bề mặt phải có một nguồn sáng “từ trên xuống” vật quan sát và kính hiển vi nhận ánh sáng phản xạ từ vật ấy Đây là điểm khác cơ bản so với các loại kính hiển vi khác nguồn sáng chiếu từ dưới chiếu lên

+ Nguồn sáng từ ngoài rọi vào gương, nhờ một gương phản xạ hoặc một lăng kính phản xạ toàn phần qua các thấu kính hội tụ lại trên bề mặt vật Ánh sáng phản xạ sẽ theo các thấu kính tới mắt người quan sát

Hình 5 Kính hiển vi điện tử soi nổi

(Nguồn:

http://emlab-nihe.blogspot.com/2011/07/kien-thuc-ve-hien-vi-quang-hoc.html ngày truy cập 22/09/2017)

Kính hiển vi đối pha (tương phản pha)

Kính hiển vi đối pha là một hệ thống quang học sử dụng nguyên lý tương phản để quan sát các tiêu bản đục,

mờ, không cần nhuộm Trong cấu tạo của kính hiển vi đối pha, người ta sử dụng nền đen với chắn sáng, vật kính tương phản có độ mờ cao và thường sử dụng dầu làm tăng độ tương phản

 Kính hiển vi đảo ngược

Kính hiển vi đảo ngược là một hệ thống quang học sử dụng trong quan sát các hiện tượng tế bào mọc, phát triển trong nuối cấy tế bào Vật kính trong kính hiển vi đảo ngược được đặt ở phía dưới tiêu bản hoặc phía dưới các ống nuôi cấy tế bào

 Kính hiển vi huỳnh quang

+ Về cơ bản, kính hiển vi huỳnh quang có cấu tạo giống như kính hiển vi quang học thường nhưng khác cơ bản là chúng có sử dụng ánh sáng tia tử ngoại (UV -ultra violet)

+ Kính hiển vi huỳnh quang chỉ quan sát được các tiêu bản có đánh dấu bằng chất huỳnh quang Các chất này sẽ phát huỳnh quang khi chiếu tia tử ngoại vào và mắt chúng ta quan sát được Người ta thường sử dụng kính hiển vi huỳnh quang trong chẩn đoán VSV bằng phản ứng miễn dịch huỳnh quang

 Kính hiển vi điện tử (Electronic microscope)

+ Nhược điểm cơ bản của kính hiển vi quang học là có

độ phóng đại nhỏ, chỉ quan sát được hình thể vi khuẩn Để quan sát được virus và các thành phần dưới tế bào phải sử dụng kính hiển vi điện tử

+ Kính hiển vi điện tử cổ điển có độ phóng đại 22000-

25000 lần Hiện nay với các loại kính hiện đại có độ phóng đại hàng triệu lần giúp ta quan sát được các thành phần dưới

tế bào rất rõ

+ Việc sử dụng kính hiển vi điện tử đòi hỏi trang bị hiện đại, trình độ kỹ thuật cao nên hiện nay chúng ta mới trang bị ở một số phòng thí nghiệm trung tâm chuyên sâu

Bảo quản kính hiển vi quang học

+ Kính hiển vi là một dụng cụ quý, dễ hỏng nếu chúng

ta không bảo quản cẩn thận Bảo quản kính hiển vi cần tuân thủ 3 nguyên tắc sau:

 Các mặt quang học phải luôn luôn sạch sẽ, không xây xát

 Các bộ phận cơ học phải luôn trơn, chuyển động dễ dàng

 Không làm sai lệch, dù chỉ rất ít vị trí các chi tiết quang học

+ Bộ phận quang học (thấu kính, vật kính, thị kính, tụ quang, .): được mài và đánh bóng với mức chính xác rất cao Vết dầu mỡ dù nhỏ cũng làm mất đi nhiều ánh sáng và làm cho các tia sáng bị sai lệch Khi sử dụng cần tuân thủ các quy định sau:

 Không sờ tay vào mặt quang học vì mồ hôi và dầu mỡ trên tay có thể để lại những vết lớn làm độ bóng giảm, bụi

dễ bám vào và nấm mốc phát triển

 Không để bụi bám vào bề mặt quang học

 Không lau chùi các mặt quang học bằng khăn bẩn, khăn vải vì có thể làm bề mặt bị xây xát

 Khi thấy bề mặt có dầu, mỡ cần lau sạch bằng khăn mềm (loại dùng riêng cho lau kính) có tẩm ít cồn hoặc xylen Khi

có bụi, dùng chổi lông quét nhẹ lên bề mặt, không được dùng miệng để thổi

+ Khi điều chỉnh: phải thao tác nhẹ nhàng, nếu thấy trục trặc phải dừng lại kiểm tra, không được vặn cố sức Thường xuyên tra dầu mỡ vào các bộ phận như rãnh trượt, răng cưa, …

+ Hết sức tránh tháo các bộ phận quang học nếu không

có dụng cụ thích hợp vì có thể gây sai lệch vị trí Tránh va đập mạnh khi di chuyển Phải có áo kính trùm lên khi không

sử dụng, đặt kính ở nơi khô ráo, thoáng, không có hoá chất,

…

 Định kỳ bảo dưỡng kính về các mặt quang học và cơ học, do các chuyên viên kỹ thuật quang học thực hiện

2.1.2 Máy ly tâm (centrifuge)

Máy ly tâm là thiết bị dùng để tách các vật thể to hoặc các vật thể có khối lượng riêng khác nhau ra khỏi dung dịch Phân loại theo tốc độ vòng quay, máy ly tâm có thể được chia thành:

- Dụng cụ ly tâm bằng tay: Có cấu tạo đơn giãn từ 4 –

8 ống ly tâm, trục ly tâm quay bằng tay, tốc độ vòng quay kém từ 700 – 1500 vòng/phút Thường được sử dụng để ly tâm tách tuyến trùng, bào tử nấm, vi khuẩn

- Máy ly tâm thường: số lượng các ống ly tâm cũng thay đổi theo thể tích buồng ly tâm Trục ly tâm được điều khiển bằng động cơ điện Tốc độ vòng quay cao nhất có thể đạt tới 16.000 vòng/phút Trong phòng thí nghiệm vi sinh thường sử dụng ở tốc độ 3.000 vòng/phút để đảm bảo tính

an toàn cho thiết bị khi vận hành

- Máy ly tâm siêu tốc (ultracentrifuge): có vận tốc quay rất nhanh tối đa có thể đạt 100.000 vòng/phút Tuy nhiên, khi vận hành thiết bị ở tốc độ 25.000 vòng/phút máy cần có

bộ phận tạo chân không cho lồng quay để hạn chế ma sát với không khí, tránh nguy hiểm khi vận hành Ngoài ra máy còn được trang bị bộ phận làm lạnh ở nhiệt độ cố định khi làm việc Máy rất cần trong nghiên cứu về virus

Khi sử dụng máy ly tâm siêu tốc cần hết sức lưu ý, trọng lượng của hai ống ly tâm đối xứng phải cân bằng nhau, nếu có một sự chênh lệch về trọng lượng dù rất nhỏ cũng gây nguy hiểm trong khi vận hành

2.1.3 Tủ cấy vô trùng

Tủ cấy vô trùng hay tủ cấy nấm, tủ cấy mô là một thiết

bị cần thiết quan trọng trong quá trình nuôi cấy, giúp quá trình nuôi cấy, phân lập VSV được tiến hành trong điều kiện

vô trùng, mẫu nuôi cấy không bị nhiễm VSV tạp

Cấu tạo cơ bản một tủ cấy phải được trang bị gồm có: quạt hút, đèn cực tím, đèn neon chiếu sáng, … bề mặt vách

tủ và sàn được làm bằng vật liệu không rỉ hoặc kính chịu lực

Thao tác với tủ cấy tiệt trùng bao gồm vấn đề vệ sinh trước, trong và sau khi làm việc Trước khi tiến hành làm việc trong tủ cấy cần sử dụng cồn 70o lau chùi, vệ sinh mặt trong của tủ cấy thật kỹ Sau khi vệ sinh xong, đặt những vật dụng cần thiết cho việc nuôi cấy VSV vào tủ (trừ mẫu cấy), bật đèn cực tím thanh trùng trong tủ Sau đó bước ra ngoài và bật đèn cực tím thanh trùng phòng nuôi cấy (lưu ý: sau khi bật đèn cực tím cần di chuyển nhanh khỏi thiết bị và tránh nhìn vào ánh sáng cực tím) Thời gian thanh trùng với đèn cực tím khoảng 30 phút

Trong quá trình làm việc thỉnh thoảng lau cồn xung quanh khu vực nuôi cấy và thao tác gần ngọn lửa đèn cồn Sau khi nuôi cấy xong gom hết các dụng cụ sử dụng ra khỏi

tủ, tiến hành lau sạch bề mặt bên trong 1 lần nữa bằng cồn Tắt các thiết bị hỗ trợ cần thiết

2.1.4 Tủ hấp tiết trùng (autoclave)

Tủ hấp tiệt trùng là một thiết bị được ứng dụng trong khử trùng dụng cụ, vật liệu và môi trường trong nuôi cấy VSV bằng cách sử dụng áp suất cao trong hơi nước bão hòa

121oC, trong khoảng thời gian 15 – 20 phút tùy thuộc vào kích thước và dung tích của đối tượng cần hấp khử trùng

Nồi hấp được sử dụng rộng rãi trong vi sinh, y học, y

tế, dược phẩm, thú y VSV và ứng dụng trong phòng thí nghiệm Với rất nhiều kích cỡ và tính năng hỗ trợ tùy thuộc vào đối tượng cần khử trùng Ứng dụng điển hình như hấp khử trùng các dụng cụ trong phòng thí nghiệm, thiết bị, các mẫu nhiễm thải, dụng cụ phẫu thuật và chất thải y tế, Các VSV được tiếp xúc với hơi nước bão hòa sẽ làm chúng bị tiêu diệt hoàn toàn do sự biến tính đảo ngược của các enzyme và cấu trúc protein Tiệt trùng hơi nước bão hòa đòi hỏi phải kiểm soát chính xác về thời gian, nhiệt độ và áp suất Thông số để nghị sử dụng trong nồi hấp khử trùng là:

121oC trong vòng 15 phút (200kPa) Nhiệt độ dùng để kiểm soát quá trình còn áp suất để tạo ra nhiệt độ hơi nước theo yêu cầu (áp suất càng lớn thì nhiệt độ càng lớn)

Bảng 1 Mối quan hệ giữa nhiệt độ, áp suất tới thời gian tiệt trùng tối thiểu

Nhiệt đô ̣ oC Khoảng áp suất kPa Thời gian tiệt trùng tối tiểu

126 - 129 250 (~2.5 atm) 10 phút

134 - 138 300 (~3.0 atm) 5 phút

(Nguồn: y-te/ ngày truy cập 6/10/2017)

http://innotec.com.vn/phuong-phap-tiet-trung-dung-cu-vat-tu-2.1.5 Tủ sấy (thiết bị khử trùng khô)

Trong quá trình tiệt trùng, gia nhiệt khô được coi là quá trình oxy hóa của các thành phần tế bào Việc này đòi hỏi nhiệt độ cao hơn nhiệt ẩm và thời gian phơi sáng lâu hơn Phương pháp này thuận tiện hơn cho vật liệu không chứa nước mà không thể tiệt trùng bằng hơi nước (do tác hại của hơi nước sẽ làm hỏng các vật liệu) ví dụ như: thủy tinh,

dụng cụ kim loại, bột, đất, Khi đó tủ sấy được lựa chọn như mô ̣t cách thông dụng nhất

Bảng 2 Mối quan hệ giữa nhiệt độ và thời gian tiệt trùng bằng nhiệt khô

Nhiệt độ tiệt trùng tối thiểu (oC) Thời gian tiệt trùng (phút)

(Nguồn: y-te/ ngày truy cập 6/10/2017)

http://innotec.com.vn/phuong-phap-tiet-trung-dung-cu-vat-tu-2.2 Các thủ thuật cơ bản dùng trong nghiên cứu vi sinh

vâ ̣t

2.2.1 Phương pháp thanh trùng, tiệt trùng

Việc quan trọng trong nuôi cấy VSV là tạo ra những

mẽ nuôi thuần chủng, không lẫn các VSV tạp Do đó, để tạo

ra một mẽ thuần chủng ngoài việc nuôi cấy được tiến hành trong điều kiện vô trùng thì môi trường và dụng cụ nuôi cấy cũng phải được vô trùng

Các nguyên tắc trong khử trùng: thanh trùng hay tiệt trùng, tẩy độc và kiềm hãm

 Thanh trùng (Sterilization): tiêu diệt tất cả VSV trên và trong dụng cụ cần thanh trùng Các phương pháp thường sử dụng như nhiệt ướt (hơi nước nóng) thanh trùng ở nhiệt độ

121oC trong thời gian 15 – 20 phút, nhiệt khô, dùng các hóa chất tẩy trùng, tia cực tím, …

 Tẩy độc: phương pháp này chỉ tiêu diệt 1 phần VSV có thể gây nhiễm trùng, không cần phải tách hoặc diệt tất cả Một phương pháp tẩy độc mà Pasteur đã áp dụng trước đó là nâng nhiệt sữa đến 71 – 80oC trong thời gian 15 – 30 giây, mục đích nâng nhiệt này là tiêu diệt nhóm VSV chịu lạnh và chịu mát Sau đó bảo quản sữa ở nhiệt độ 4 – 10oC để ức chế nhóm VSV chịu ấm và chịu nhiệt Việc xử lý nhiệt thấp hơn nhiệt độ điểm sôi của sữa giúp bảo vệ được các chất dinh dưỡng trong sữa không bị mất đi trong quá trình xử lý nhiệt

2.2.2 Phương pháp nhuộm màu vi sinh vật

Trong quan sát VSV qua kính hiển vi quang học, phần lớn các bộ phận cấu tạo bên trong của VSV có chiết suất gần bằng nhau, nên rất khó quan sát các chi tiết bên trong Để dễ dàng quan sát, chúng ta cần phải nhuộm màu mẫu vật, khi nhuộm màu các bộ phận con sẽ ăn màu thuốc nhuộm làm thay đổi chiết suất nên có thể quan sát được mẫu Phương pháp nhuộm trên từng đối tượng VSV cũng khác nhau, có thể phân chia theo nhóm nhân thực (nấm) và nhân nguyên (vi khuẩn)

A Nhuộm nấm

Phương pháp nhuộm tương đối đơn giản, thuốc nhuộm

sử dụng ít độc hoặc không độc Huyền phù bào tử nấm được pha loãng ở hệ số thích hợp để đảm bảo mật số cho việc quan sát và VSV vẫn sống Tiêu bản quan sát có thể tạm thời hoặc khi cần bảo quản tiêu bản lâu hơn phục vụ cho công tác nghiên cứu và giảng dạy mà có thể thay đổi thuốc nhuộm khác nhau

 Tiêu bản tạm thời: Nhỏ 1 giọt thuốc nhuộm xanh Methylen lên lame (đối với bào tử nấm không màu, riêng bào tử nấm có màu thì không cần phải nhuộm), tiếp theo nhỏ

1 giọt huyền phù VSV cần quan sát lên trên giọt màu, đậy lamelle lại, quan sát lần lượt ở vật kính 10X rồi chuyển sang 40X

 Tiêu bản cần bảo quản: thực hiện tương tự như tiêu bản tạm thời, nhưng trong thuốc nhuộm xanh Methylen có pha thêm lactophenol để bảo quản cho mẫu không bị mất nước Sau khi đậy lamelle cần dán lại bằng 1 loại keo đặc biệt là baume canada

B Nhuộm vi khuẩn

Nhuộm vi khuẩn đòi hỏi qui trình và kỹ thuật nhuộm phức tạp hơn Bước đầu tiên cần thực hiện vết bôi huyền phù vi khuẩn trên lame, sau đó tiến hành cố định mẫu bằng nhiệt hoặc hóa chất (rượu và aceton) để không gây biến đổi cấu trúc màng tế bào và không làm đứt các tiên mao Cuối cùng nhuộm màu tiêu bản cố định

Về nguyên tắc thuốc nhuộm vi khuẩn có khả năng thẩm thấu qua màng tế bào và kết hợp với các thành phần khác nhau của tế bào thành những hợp chất màu đặc trưng bền vững Tùy theo mục đích nghiên cứu và khả năng bắt màu khác nhau của các thành phần tế bào mà chọn loại thuốc nhuộm và phương pháp nhuộm thích hợp Có 2 phương pháp nhuộm cơ bản được sử dụng trong nhuộm vi khuẩn:

- Nhuộm đơn: chỉ sử dụng một loại thuốc nhuộm trên 1 tiêu bản

- Nhuộm kép: dùng đồng thời 2 hay nhiều loại thuốc nhuộm trên 1 tiêu bản

Nguyên tắc của nhuộm kép: các cấu trúc khác nhau, thậm chí các phần khác nhau của 1 cấu trúc thường có tính chất lý học, hóa học thậm chí khả năng bắt màu khác nhau

Do đó, việc áp dụng đồng thời các loại thuốc nhuộm trên cùng 1 tiêu bản cho phép chúng ta có thể quan sát và phân biệt các cấu trúc dễ dàng hơn Trong kỹ thuật nhuộm kép, có các phương pháp nhuộm sau: nhuộm gram, nhuộm nha bào, nhuộm roi, nhuộm vỏ nhầy, …

Phương pháp nhuộm gram: nguyên tắc của phương

pháp nhuộm này là dựa trên khả năng bắt màu của tế bào chất và màng tế bào với thuốc nhuộm Crystal violet và iodine mà hình thành 2 loại phức chất khác nhau Loại phức chất thứ nhất giữ nguyên màu của thuốc nhuộm nên không

bị rửa trôi khi xử lý bằng cồn VSV có phức chất này thuộc loại gram dương

Loại phức chất thứ hai không còn giữ nguyên màu của thuốc nhuộm khi bị rửa bằng cồn, và bắt màu của thuốc nhuộm bổ sung VSV có phức chất này thuộc loại gram âm

Phương pháp nhuộm nha bào (nhuộm bào tử): nguyên

tắc của phương pháp này dựa trên cấu trúc đặc biệt của lớp

vỏ bào tử (dày, chắc, khó bắt màu, chứa nhiều lipid, .) Trước hết cần xử lý phần tế bào chất của vi khuẩn để dễ bắt màu bằng nhiệt và acid Sau đó, nhuộm màu cả tế bào chất

và bào tử bằng thuốc nhuộm có hoạt tính mạnh Tẩy màu tế bào chất và nhuộm màu bằng thuốc nhuộm bổ sung Nhờ vậy tế bào chất và nha bào của vi khuẩn bắt 2 màu phân biệt

Phương pháp nhuộm roi: đường kính roi của vi khuẩn

rất nhỏ nên khó quan sát được qua kính hiển vi quang học,

để quan sát được cần nhuộm màu đặc biệt Nguyên tắc là trước hết phủ lên roi một lớp hóa chất đặc biệt cho roi to ra

và hóa chất này cũng giữ màu của thuốc nhuộm Hóa chất để phủ phần roi của vi khuẩn là tannic acid, màu nhuộm có thể dùng pararosaniline

2.2.3 Phương pháp tách ròng (phân lập) VSV

Khái niệm: phân lập hay tách ròng là quá trình tách riêng các loại VSV từ quần thể ban đầu đến khi tạo ra 1 chủng thuần khiết

VSV thuần khiết là giống VSV được tạo ra từ một tế bào ban đầu Trong tự nhiên hoặc trong các vật phẩm nghiên cứu, vi sinh vật thường tồn tại ở dạng hỗn hợp gồm nhiều loại khác nhau Do đó, nếu chúng ta muốn nghiên cứu về hình thái, đặc điểm sinh lý, lý hóa và sử dụng vào thực tiễn với mục đích nào đó thì cần phải đưa chúng về dạng thuần khiết

Nguyên tắc: tách rời các tế bào VSV; nuôi chúng trong môi trường dinh dưỡng đặc trưng để cho các khuẩn lạc riêng

lẻ và tách biệt nhau

Phương pháp: quá trình phân lập VSV gồm các bước

cơ bản như sau

- Tạo ra các khuẩn lạc riêng lẻ từ quần thể VSV ban đầu,

- Phân lập VSV thuần khiết,

- Kiểm tra độ thuần khiết của các khuẩn lạc

A Tạo ra các khuẩn lạc riêng le ̉ từ quần thể VSV ban đầu trên các môi trường phân lập chuyên biệt

Chuẩn bị mẫu

- Đối với mẫu dạng rắn: Cân một lượng mẫu nhất định (g) nghiền nhỏ, hòa tan vào nước cất vô trùng hoặc dung dịch nước muối sinh lý với tỉ lệ pha loãng 1:10

- Đối với mẫu dạng lỏng: hút trực tiếp V(ml) dung dịch pha loãng vào nước cất vô trùng với hệ số pha loãng giảm đi

10 lần so với mẫu ban đầu

Tiếp tục pha loãng ở các nồng độ cần thiết, cấy mẫu trên môi trường đặc trưng của nó Để có được mẫu thuần chủng, cần tiến hành lập lại nhiều lần các kỹ thuật pha loãng nêu trên cho đến khi các khuẩn lạc đơn xuất hiện trên môi trường đồng nhất

Phương pháp tạo khuẩn lạc đơn

Có nhiều phương pháp khác nhau trong việc tạo ra khuẩn lạc đơn trong phân lập VSV Thông thường người ta thực hiện theo các phương pháp như sau

 Phương pháp cấy ria

Dùng que cấy vòng thực hiện thao tác vô trùng thu giống, tiến hành ria thành các đường trên đĩa petri chứa môi trường thích hợp Thường ria theo hình Zig Zag, sau mỗi đường ria đốt và khử trùng que cấy rồi mới thực hiện đường ria tiếp theo Sau khi thực hiện xong thao tác, bao gói đĩa petri lại và đặt mẫu vào tủ ủ để cho khuẩn lạc phát triển trong điều kiện nhiệt độ ổn định Phương pháp này thường được sử dụng trong tách ròng VSV

Hình 6 Phương pháp cấy ria

 Phương pháp cấy chan

Dụng cụ hỗ trợ cho phương pháp cấy này là que chan (bằng kim loại, hoặc thủy tinh) vô trùng Khi tiến hành cấy, dùng micropipet hút 1 hoặc 0,1 ml huyền phù vi khuẩn cho lên bề mặt môi trường đã đươc chuẩn bị Huyền phù vi khuẩn đã được pha loãng đến độ pha loãng thích hợp đảm bảo sao cho khi cấy lên môi trường thạch trong đĩa petri các khuẩn lạc mọc lên sẽ riêng lẻ

Hình 7 Phương pháp cấy chan

Lấy que chan xoa đều huyền phù vi khuẩn trên bề mặt thạch Sau đó đậy nắp đĩa lại và đem mẫu ủ ở điều kiện nhiệt

độ thích hợp Đây là phương pháp được sử dụng trong tách ròng và đếm mật số VSV