Nghiên cứu quy trình dịch hóa, đường hóa và lên men ethanol đồng thời ở nồng độ chất khô cao từ gạo

Nghiên cứu quy trình dịch hóa, đường hóa và lên men ethanol đồng thời ở nồng độ chất khô cao từ gạo.Nghiên cứu quy trình dịch hóa, đường hóa và lên men ethanol đồng thời ở nồng độ chất khô cao từ gạo.Nghiên cứu quy trình dịch hóa, đường hóa và lên men ethanol đồng thời ở nồng độ chất khô cao từ gạo.Nghiên cứu quy trình dịch hóa, đường hóa và lên men ethanol đồng thời ở nồng độ chất khô cao từ gạo.Nghiên cứu quy trình dịch hóa, đường hóa và lên men ethanol đồng thời ở nồng độ chất khô cao từ gạo.Nghiên cứu quy trình dịch hóa, đường hóa và lên men ethanol đồng thời ở nồng độ chất khô cao từ gạo.Nghiên cứu quy trình dịch hóa, đường hóa và lên men ethanol đồng thời ở nồng độ chất khô cao từ gạo.Nghiên cứu quy trình dịch hóa, đường hóa và lên men ethanol đồng thời ở nồng độ chất khô cao từ gạo.Nghiên cứu quy trình dịch hóa, đường hóa và lên men ethanol đồng thời ở nồng độ chất khô cao từ gạo.Nghiên cứu quy trình dịch hóa, đường hóa và lên men ethanol đồng thời ở nồng độ chất khô cao từ gạo.Nghiên cứu quy trình dịch hóa, đường hóa và lên men ethanol đồng thời ở nồng độ chất khô cao từ gạo.Nghiên cứu quy trình dịch hóa, đường hóa và lên men ethanol đồng thời ở nồng độ chất khô cao từ gạo.Nghiên cứu quy trình dịch hóa, đường hóa và lên men ethanol đồng thời ở nồng độ chất khô cao từ gạo.Nghiên cứu quy trình dịch hóa, đường hóa và lên men ethanol đồng thời ở nồng độ chất khô cao từ gạo.Nghiên cứu quy trình dịch hóa, đường hóa và lên men ethanol đồng thời ở nồng độ chất khô cao từ gạo.Nghiên cứu quy trình dịch hóa, đường hóa và lên men ethanol đồng thời ở nồng độ chất khô cao từ gạo.Nghiên cứu quy trình dịch hóa, đường hóa và lên men ethanol đồng thời ở nồng độ chất khô cao từ gạo.Nghiên cứu quy trình dịch hóa, đường hóa và lên men ethanol đồng thời ở nồng độ chất khô cao từ gạo.Nghiên cứu quy trình dịch hóa, đường hóa và lên men ethanol đồng thời ở nồng độ chất khô cao từ gạo.Nghiên cứu quy trình dịch hóa, đường hóa và lên men ethanol đồng thời ở nồng độ chất khô cao từ gạo.

Hà Nội - 2023

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

TIỀN TIẾN NAM

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH DỊCH HÓA, ĐƯỜNG HÓA VÀ LÊN MEN ETHANOL ĐỒNG THỜI Ở NỒNG ĐỘ CHẤT KHÔ

CAO TỪ GẠO

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Hà Nội - 2023

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

TIỀN TIẾN NAM

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH DỊCH HÓA, ĐƯỜNG HÓA VÀ LÊN MEN ETHANOL ĐỒNG THỜI Ở NỒNG ĐỘ CHẤT KHÔ

CAO TỪ GẠO

Ngành: Công nghệ Thực phẩm

Mã số: 9540101

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 PGS TS Chu Kỳ Sơn

2 TS Phạm Tuấn Anh

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả nghiên cứu trong Luận án này là trung thực và chưa được các tác giả khác công bố

Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ trong việc hoàn thành Luận án đã được cảm ơn

và các thông tin trích dẫn trong Luận án đã được ghi rõ nguồn gốc

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những số liệu trong Luận án này

Hà Nội, ngày tháng năm 2023

Tiền Tiến Nam

Tập thể GVHD

1 PGS.TS Chu Kỳ Sơn

2 TS Phạm Tuấn Anh

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các Thầy giáo hướng dẫn khoa học làPGS TS Chu Kỳ Sơn và TS Phạm Tuấn Anh đã tận tình chỉ dẫn, giúp đỡ và độngviên trong suốt thời gian thực hiện luận án

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới quý thầy, cô giáo Bộ môn Công nghệ Thực phẩm

- Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm - Đại học Bách khoa Hà Nộicũng như bạn bè, đồng nghiệp đã hết sức giúp đỡ và hướng dẫn, chỉ bảo trong suốtthời gian thực hiện luận án Tôi cũng xin cảm ơn Phòng Đào tạo của Đại học Báchkhoa Hà Nội đã luôn ủng hộ tinh thần và tạo điều kiện thuận lợi để tôi có thể hoànthành luận án

Tôi xin chân thành cảm ơn Trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm TP HồChí Minh đã tạo mọi điều kiện để tôi tham gia học tập và luôn ủng hộ vật chất, tinhthần trong quá trình thực hiện luận án Tôi xin chân thành cám ơn Trung tâm thựchành thí nghiệm - Trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm TP Hồ Chí Minh cùngcác sinh viên đã giúp đỡ tôi trong các nghiên cứu của mình

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn những người thân trong gia đình, những ngườibạn đã động viên và khích lệ cho tôi có được sự chuyên tâm và động lực phấn đấuthực hiện luận án này

Hà Nội, ngày tháng năm 2023

Tiền Tiến Nam

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC HÌNH viii

DANH MỤC BẢNG x

MỞ ĐẦU 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

Tình hình sản xuất cồn trên thế giới và Việt Nam 4

Tình hình sản xuất cồn trên thế giới 4

Tình hình sản xuất cồn ở Việt Nam 5

Một số công nghệ sản xuất cồn từ nguyên liệu chứa tinh bột hiện nay 6

Công nghệ sản xuất cồn không gia nhiệt 7

Nguyên liệu sản xuất cồn 11

Nguồn cơ chất trong sản xuất cồn 11

Nguyên liệu gạo trong sản xuất cồn 12

Enzym trong sản xuất cồn từ nguyên liệu chứa tinh bột 16

Nấm men dùng trong công nghệ sản xuất cồn 22

Các yếu tố công nghệ và cơ chế thủy phân nguyên liệu trong quy trình sản xuất cồn không gia nhiệt nồng độ chất khô cao 26

Ảnh hưởng của chế độ nghiền và kích thước nguyên liệu 26

Ảnh hưởng của nồng độ enzym thủy phân nguyên liệu sống 27

Cơ chế thủy phân của enzym trên nguyên liệu trong quy trình SLSF-VHG 27

Động học trong quy trình sản xuất cồn không gia nhiệt 30

Ảnh hưởng của nồng độ chất khô 31

Ảnh hưởng của mật độ nấm men 32

Ảnh hưởng của một số yếu tố công nghệ khác 32

Tình hình ứng dụng quy trình sản xuất cồn không gia nhiệt 33

Ứng dụng chân không tách cồn đồng thời trong quá trình lên men 34

NGUYÊN VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU 38

Nguyên vật liệu 38

Gạo 38

Chế phẩm enzym 38

Chế phẩm nấm men 39

Chất bổ sung 39

Hóa chất, thiết bị, địa điểm nghiên cứu 39

Nội dung nghiên cứu 40

Nội dung 1: Lựa chọn loại gạo, enzym, nấm men cho quy trình sản xuất cồn không gia nhiệt ở nồng độ chất khô cao 40

Nội dung 2: Nghiên cứu điều kiện công nghệ, động học và cơ chế biến đổi thành phần dịch lên men trong quy trình SLSF-VHG 40

Nội dung 3: Nghiên cứu ứng dụng quy trình SLSF-VHG để sản xuất cồn ở quy mô 100 L dịch lên men 40

Nội dung 4: Nghiên cứu lên men và chưng cất chân không tách cồn đồng thời trong quy trình SLSF-VHG 41

Phương pháp nghiên cứu 41

Bố trí thí nghiệm 42

Phương pháp phân tích 49

Phương pháp thống kê và xử lý số liệu thực nghiệm 53

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 54

Lựa chọn loại gạo, enzym, nấm men cho quy trình SLSF-VHG 54

Lựa chọn gạo cho quy trình SLSF-VHG 54

Lựa chọn enzym đường hóa phụ trợ cho quy trình SLSF-VHG 57

Lựa chọn chế phẩm nấm men 59

Nghiên cứu điều kiện công nghệ, động học và cơ chế biến đổi thành phần dịch lên men trong quy trình SLSF-VHG 64

Lựa chọn kích thước lưới nghiền bột gạo 64

Ảnh hưởng của nồng độ enzym đường hóa chính (Stargen 002) 66

Ảnh hưởng nguồn nitơ 69

Ảnh hưởng của nồng độ chất khô 81

Ảnh hưởng của mật độ nấm men 83

Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất cồn SLSF-VHG ở quy mô phòng

thí nghiệm (1 L dịch lên men) 85

Động học của quá trình sản xuất cồn không gia nhiệt ở nồng độ chất khô cao 87

Hình thái, cấu trúc bột gạo trong quy trình SLSF-VHG 91

Nghiên cứu ứng dụng quy trình SLSF-VHG để sản xuất cồn ở quy mô 100 L dịch lên men 95

Nghiên cứu quy trình SLSF-VHG quy mô 100 L dịch lên men 96

Thống kê điện, nước và chi phí sản xuất cồn ở quy mô 100 L 100

Nghiên cứu lên men và chưng cất chân không tách cồn đồng thời trong quy trình SLSF-VHG 102

Ảnh hưởng của thời gian chưng cất chân không đến hiệu suất và thời gian lên men 102

Nghiên cứu nâng cao nồng độ chất khô trong quy trình SLSF-VHG bằng chưng cất chân không 104

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 112

Kết luận 112

Kiến nghị 113

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN 114

TÀI LIỆU THAM KHẢO 115

PHỤ LỤC 1

DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

SLSF Simultaneous liquefaction,saccharification and

fermentation

Dịch hóa, đường hóa và lênmen đồng thời

SSF Simultaneous saccharification and fermentation Đường hóa và lên menđồng thời

DP Degree of polymerization Độ trùng hợp (chiều dàimạch)

SEM Scanning electron microscope Kính hiển vi điện tử quét

μmax Maximum specific growth rate Tốc độ tăng trưởng riêngcực đại

YP/S The yield coefficient of ethanol

production Hiệu suất tạo sản phẩm/đơnvị cơ chất

GAU Glucoamylase unit Đơn vị hoạt độ enzymglucoamylaseSAPU Spectrophotometric acidprotease units Đơn vị hoạt độ enzymprotease

HPLC High-performance liquidchromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao

TCVN Vietnamese National Standards Tiêu chuẩn Việt Nam

SLSFD Simultaneous liquefaction, saccharification and

fermentation and distillation

Dịch hóa, đường hóa và lênmen chưng cất đồng thời

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Tình hình sản xuất cồn trên thế giới 4

Hình 1.2 Sản lượng cồn nhiên liệu theo quốc gia năm 2021 5

Hình 1.3 Quy trình sản xuất cồn tiết kiệm năng lượng 7

Hình 1.4 Quy trình dịch hóa, đường hóa và lên men đồng thời ở nồng độ chất khô cao 10

Hình 1.5 Hình ảnh tinh bột gạo [73] 14

Hình 1.6 Cấu tạo bột gạo [68,73] 16

Hình 1.7 Cấu tạo enzym α-amylase [99,102] 17

Hình 1.8 Cơ chế phân cắt nhóm glycosyl của α-amylase từ vi khuẩn Bacillus [104] 18

Hình 1.9 Cấu tạo glucoamylase từ A niger [96] 18

Hình 1.10 Cơ chế thủy phân của glucoamylase [109,110] 19

Hình 1.11 Cơ chế thủy phân của enzym Stargen 001 trên tinh bột ngô [32] 28

Hình 1.12 Hình thái bột sắn bị thủy phân [162] 29

Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm xác định loại gạo, enzym đường hóa phụ trợ, nấm men 42

Hình 2.2 Mô hình thí nghiệm lên men và chưng cất cân không tách cồn đồng thời [173] 48

Hình 3.1 Biến đổi nồng độ cồn theo loại gạo trong quy trình SLSF-VHG 55

Hình 3.2 Ảnh hưởng enzym phụ trợ đến đường tổng, độ cồn 58

Hình 3.3 Biến đổi độ cồn và đường tổng (a), đường khử (b) theo loại nấm men 60

Hình 3.4 Đường cong sinh trưởng của nấm men ER, TD và AS 62

Hình 3.5 Hình ảnh tế bào nấm men ER, TD và AS 63

Hình 3.6 Phân bố kích thước hạt theo kích thước lưới nghiền 64

Hình 3.7 Nồng độ cồn theo kích thước lưới nghiền 65

Hình 3.8 Biến đổi đường tổng-độ cồn (a), đường khử (b) theo nồng độ enzym Stargen 002 67

Hình 3.9 Ảnh hưởng urea và protease đến độ cồn - đường tổng (a), đường khử (b) 70

Hình 3.10 Biến đổi protein hòa tan (a), FAN (b) trong dịch lên men 72

Hình 3.11 Ảnh hưởng của urea và protease đến đường cong sinh trưởng nấm men

77

Hình 3.12 Ảnh SEM của bột gạo ở 24 h lên men (a)-R, (b)-U, (c)-P và (d)-UP 77 Hình 3.13 Ảnh hưởng của urea và protease đến kích thước lỗ trên bề mặt bột gạo 78 Hình 3.14 Biến đổi cấu trúc bột gạo qua phổ XRD (a)-R, (b)-U, (c)-P, (d)-UP 80 Hình 3.15 Đường cong sinh trưởng theo mật độ nấm men 83 Hình 3.16 Biến đổi nồng độ cồn theo mật độ nấm men 84 Hình 3.17 Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất cồn SLSF-VHG ở quy mô 1 L dịch

lên men 85

Hình 3.18 Biến đổi thành phần đường tan trong dịch lên men 88 Hình 3.19 Biến đổi sinh khối, tỉ lệ tế bào sống, nảy chồi trong quá trình lên men 90 Hình 3.20 Ảnh SEM hình thái bột gạo ở các chế độ khác nhau 92 Hình 3.21 Biến đổi thành phần amylose trong bột gạo 95 Hình 3.22 Biến đổi độ cồn, đường tổng đường khử quy mô 100 L dịch lên men 96 Hình 3.23 Đường cong sinh trưởng nấm men ở quy mô 100 L dịch lên men 97 Hình 3.24 Biến đổi nồng độ cồn theo thời gian chưng cất chân không 102 Hình 3.25 Ảnh hưởng thời gian chưng cất chân không đến mật độ nấm men 103 Hình 3.26 Biến đổi pH trong quá trình áp dụng chưng chân không theo nồng độ

Hình 3.29 Ảnh hưởng của nồng độ chất khô trong lên men và chưng cất chân

không đến mật độ tế bào nấm men 109

Hình 3.30 Biến đổi nồng độ glycerol ở nồng độ chất khô khác nhau trong lên men

và chưng cất chân không 110

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần hóa học của gạo [68] 13

Bảng 1.2 Nguồn vi sinh vật tạo α – amylase 17

Bảng 1.3 Nguồn và đặc điểm một số GA [96] 19

Bảng 1.4 Một số chế phẩm enzym thương mại dùng trong sản xuất cồn 21

Bảng 1.5 Một số chế phẩm enzym protease thương mại dùng trong sản xuất cồn 22 Bảng 1.6 Một số chế phẩm nấm men thương mại dùng trong sản xuất cồn 26

Bảng 1.7 Tình hình ứng dụng công nghệ sản xuất cồn không gia nhiệt 33

Bảng 2.1 Tổng hợp nguyên liệu gạo sử dụng cho nghiên cứu 38

Bảng 2.2 Thông số các enzym sử dụng trong nghiên cứu 38

Bảng 2.3 Các chế phẩm nấm men sử dụng trong nghiên cứu 39

Bảng 2.4 Lựa chọn cố định một số yếu tố trong quy trình SLSF-VHG 41

Bảng 2.5 Hoạt độ và lượng sử dụng của enzym phụ trợ 43

Bảng 2.6 Thành phần thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng nguồn nitơ 44

Bảng 2.7 Chế độ chưng cất chân không với nồng độ chất khô khác nhau 49

Bảng 2.8 Cách tính các thông số hóa lý, vật lý trong quá trình lên men 52

Bảng 3.1 Thành phần dinh dưỡng các loại gạo dùng cho sản xuất cồn 54

Bảng 3.2 Chi phí nguyên liệu cho sản xuất cồn (quy về 1 L cồn tuyệt đối) 56

Bảng 3.3 Ảnh hưởng enzym đường hóa phụ trợ đến đường khử 59

Bảng 3.4 Thông số quá trình lên men của nấm men ER, TD và AS 61

Bảng 3.5 So sánh thời gian và năng lượng nghiền theo kích thước lưới nghiền 66

Bảng 3.6 Tốc độ tạo cồn, hiệu suất sản phẩm theo nồng độ enzym Stargen 002 68

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của urea và protease đến các sản phẩm phụ 74

Bảng 3.8 Ảnh hưởng nồng độ protease đến độ cồn và hiệu suất lên men 81

Bảng 3.9 Ảnh hưởng nồng độ chất khô đến độ cồn và hiệu suất lên men theo thời gian 81

Bảng 3.10 Ảnh hưởng nồng độ chất khô đến nồng độ đường 82

Bảng 3.11 Các thông số công nghệ thích hợp của quy trình SLSF-VHG 86

Bảng 3.12 Biến đổi một số thành phần trong dịch lên men 88

Bảng 3.13 Thông số động học quá trình lên men 91

Bảng 3.14 Độ tinh thể và kích thước tinh thể bột gạo trong quá trình lên men 94

Bảng 3.15 Sản phẩm phụ trong quy trình SLSF-VHG quy mô 100 L 98

Bảng 3.16 Sản phẩm chưng cất 98

Bảng 3.17 Đánh giá chất lượng rượu chưng cất 99

Bảng 3.18 Thống kê điện và nước tiêu thụ quy mô 100 L dịch lên men 100

Bảng 3.19 Chi phí sản xuất cồn trên thiết bị tích hợp SLSF-VHG quy mô 100 L 101 Bảng 3.20 Độ cồn, hiệu suất lên men theo thời gian chưng cất chân không 104

Bảng 3.21 Hiệu suất, thời gian lên men theo nồng độ chất khô ở chế độ chưng cất chân không 108

Bảng 3.22 Thể tích và nồng độ cồn tách ra trong quá trình chưng cất chân không 108

Bảng 3.23 Thành phần bã rượu ở nồng độ chất khô khác nhau trong lên men và chưng cất chân không 111

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của luận án

Ethanol (cồn) là sản phẩm có vai trò quan trọng trong nền kinh tế Trong côngnghiệp thực phẩm, các sản phẩm chứa cồn được sử dụng làm đồ uống có từ lâu đời

và phổ biến trên thế giới Trong công nghiệp cồn được dùng làm dung môi vànguyên liệu cho nhiều lĩnh vực như hóa chất, mỹ phẩm, sinh học, dược, chế biến vàbảo quản nông sản thực phẩm…Ngày nay, khi nhu cầu năng lượng thế giới tiếp tụctăng cao và các nguồn nhiên liệu truyền thống (dầu mỏ, than đá, khí đốt ) đangngày càng cạn kiệt, nhiên liệu sinh học là giải pháp thay thế thích hợp Trong đó,cồn là nhiên liệu thay thế quan trọng nhất và được sử dụng rộng rãi ở hầu hết cácquốc gia trên thế giới

Nguyên liệu để sản xuất cồn là các nguyên liệu chứa đường (đường mía, rỉđường, củ cải đường…), chứa tinh bột (củ, hạt, ngũ cốc), nguyên liệu chứa cellulose

và nguyên liệu từ sinh khối tảo [1] Công nghệ sản xuất và sản lượng cồn hiện naychủ yếu sử dụng nguồn nguyên liệu chứa đường và tinh bột [1,2] Trên thế giớinguyên liệu sản xuất cồn được sử dụng nhiều nhất là ngô, đường mía Các nguyênliệu như cellulose và sinh khối tảo vẫn đang được tiếp tục nghiên cứu và hoàn thiện[2,3] Tại Việt Nam, nguồn nguyên liệu chứa tinh bột thường được sử dụng trongsản xuất cồn thực phẩm là gạo Đây là loại cây lương thực chính, là nguyên liệuchính để sản xuất rượu truyền thống và sản xuất cồn thực phẩm ở nước ta Đây cũng

là cây trồng chủ lực có sản lượng lớn của Việt Nam, và hàng năm nước ta là mộttrong ba nước có sản lượng gạo xuất khẩu cao nhất thế giới [4] Do đó, trong nộidung nghiên cứu của luận án này chủ yếu đề cập đến công nghệ sản xuất cồn từnguyên liệu chứa tinh bột, cụ thể là từ gạo tại Việt Nam

Công nghệ sản xuất cồn truyền thống từ nguyên liệu chứa tinh bột được thựchiện qua bốn giai đoạn: dịch hóa, đường hóa, lên men và chưng cất Quá trình nàybao gồm nhiều công đoạn và sử dụng nhiều thiết bị, năng lượng và tiêu tốn nhiềunước cho các công đoạn chính và các công đoạn trung gian (làm nguội) trong sảnxuất [5] Hiện nay, công nghệ đường hóa và lên men đồng thời (SSF) đang đượcứng dụng phổ biến trong công nghiệp sản xuất cồn Trong công nghệ này quá trình

hồ hóa và dịch hóa thường được thực hiện ở nhiệt độ trên 80oC, quá trình đường hóa

và lên men đồng thời được thực hiện với tác dụng của các enzym thế hệ mới và nấmmen đã giúp nâng cao hiệu suất lên men (HSLM), giảm chi phí sản xuất cồn [3,6,7].Trong những năm gần đây, công nghệ sản xuất cồn tiết kiệm năng lượng không gianhiệt đã được phát triển và nghiên cứu Với việc sử dụng các enzym thế hệ mới, quátrình dịch hóa, đường hóa và lên men đồng thời được thực hiện ở điều kiện nhiệt độthường trong cùng một thiết bị đã làm giảm bớt chi phí sử dụng tài nguyên (nănglượng, nước, thiết bị…), giảm chất thải (nước thải, khí CO2) ra môi trường và giảmgiá thành sản phẩm [5,8] Công nghệ sản xuất cồn không gia nhiệt ở nồng độ chấtkhô cao hay còn gọi là quy trình dịch hóa, đường hóa và lên men đồng thời ở nồng

độ chất khô cao để sản xuất cồn (SLSF-VHG) cũng đã được tập trung nghiên cứu

do những ưu điểm về năng suất, tiết kiệm năng lượng, giảm chi phí đầu tư thiết bị

và giảm thành phần chất thải [8] Tuy nhiên, đây là công nghệ mới phát triển trongthời gian gần đây nên còn ít nghiên cứu hoàn thiện công nghệ trên các loại nguyênliệu khác nhau, chưa có nhiều ứng dụng công nghệ này ở các quy mô pilot và quy

mô công nghiệp

Việc ứng dụng công nghệ SLSF-VHG từ gạo còn một số tồn tại như sau: chưatối ưu nguyên liệu, enzym, chất bổ sung (nguồn nitơ); Hiệu suất lên men còn thấp,thời gian lên men còn dài, cơ chế biến đổi thành phần dịch lên men, cơ chế tấn côngcủa enzym vào nguyên liệu bột gạo sống chưa được giải thích đầy đủ; Chưa cóthống kê năng lượng, đánh giá hiệu quả và chi phí sản xuất của quy trình ở quy môsản xuất nhỏ Xuất phát từ những vấn đề thực tế trên, chúng tôi thực hiện đề tài

“Nghiên cứu quy trình dịch hóa, đường hóa và lên men ethanol đồng thời ở nồng

độ chất khô cao từ gạo”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Nghiên cứu xác định nguyên liệu, các thông số công nghệ và giải thích cơ chếthủy phân lên men bột gạo sống trong quy trình dịch hóa, đường hóa và lên menđồng thời ở nồng độ chất khô cao Phát triển ứng dụng quy trình dịch hóa, đườnghóa và lên men đồng thời ở nồng độ chất khô cao ở quy mô pilot Nghiên cứu ứngdụng chưng cất chân không tách cồn đồng thời để nâng cao hiệu suất, rút ngắn thờigian lên men và nâng cao nồng độ chất khô trong quy trình sản xuất cồn không gianhiệt ở nồng độ chất khô cao từ gạo

3 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Lựa chọn loại gạo, enzym, nấm men cho quy trình sản xuất cồn

không gia nhiệt ở nồng độ chất khô cao

Nội dung 2: Nghiên cứu điều kiện công nghệ, động học và cơ chế biến đổi

thành phần dịch lên men trong quy trình SLSF-VHG

Nội dung 3: Nghiên cứu ứng dụng quy trình SLSF-VHG để sản xuất cồn ở quy

mô 100 L dịch lên men

Nội dung 4: Nghiên cứu lên men và chưng cất chân không tách cồn đồng thời

Luận án đã cung cấp những thông tin khoa học và giải thích khá đầy đủ về độnghọc của quá trình dịch hóa, đường hóa và lên men ethanol trong quy trình SLSF-VHG dưới tác dụng của nhiều yếu tố mới: sử dụng hệ enzym thế hệ mới, nâng caonồng độ cơ chất, phương thức lên men, phương thức giảm ức chế của sản phẩm cuốilàm cơ sở khoa học cho cải tiến công nghệ lên men ethanol Đánh giá hiệu quả việc

sử dụng enzym protease trên cơ sở thủy phân protein trong nguyên liệu và khả năngthay thế hoàn toàn nitơ bổ sung bên ngoài

Đã phát triển giải pháp ứng dụng chưng cất chân không tách cồn để nâng caonồng độ chất khô và rút ngắn thời gian lên men trong quy trình sản xuất cồn khônggia nhiệt ở nồng độ chất khô cao

Ý nghĩa thực tiễn

Xác lập được điều kiện công nghệ và thử nghiệm sản xuất cồn không gia nhiệtvới nồng độ chất khô cao quy mô 100 L làm cơ sở phát triển quy trình và nâng caohiệu quả sản xuất cồn từ gạo Việt Nam, tiết kiệm chi phí và giảm thiểu tác động môitrường

5 Những đóng góp mới của luận án

Nghiên cứu đã cho thấy loại gạo IR50404 và các loại gạo có hàm lượngamylose nhỏ hơn 26,32% là phù hợp nhất cho quy trình sản xuất cồn không gianhiệt, đây là cơ sở để lựa chọn nguyên liệu cho sản xuất cồn thực phẩm từ gạo tạiViệt Nam

Luận án đã đề xuất các thông số công nghệ, giải thích được động học của quátrình lên men cồn, giải thích cơ chế hoạt động của tổ hợp enzym thế hệ mới thôngqua công nghệ dịch hóa đường hóa và lên men đồng thời ở nồng độ chất khô cao từgạo, làm cơ sở khoa học cho thiết lập cải tiến công nghệ trong lên men cồn từ gạoViệt Nam Kết quả nghiên cứu của luận án cũng cho thấy ưu điểm nổi bật khi sửdụng enzym protease thay thế urea trong quy trình SLSF-VHG

Đã bước đầu ứng dụng quy trình sản xuất cồn không gia nhiệt ở nồng độ chấtkhô cao quy mô 100 L dịch lên men Hiệu suất lên men 89,07%, nồng độ cồn trongdịch lên men 17,73 %, tạo sản phẩm đảm bảo chất lượng và an toàn thực phẩm đápứng TCVN 7043:2013

Ứng dụng thành công chưng cất chân không tách cồn ở nồng độ chất khô 350g/L đạt nồng độ cồn 19,98% v/v, hiệu suất lên men 89,09% và thời gian lên men 72

h, kết quả này nâng cao được nồng độ chất khô 12,6%, nồng độ cồn tăng 2,16% v/v,rút ngắn thời gian lên men 24 h so với quy trình SLSF-VHG tối ưu (ở nồng độ chấtkhô 310,8 g/L) Lần đầu tiên ứng dụng chưng cất chân không tách cồn nâng caođược nồng độ chất khô trong quy trình SLSF-VHG lên 500 g/L đạt hiệu suất và thờigian lên men tương đương với quá trình lên men ở nồng độ chất khô 310,8 g/L

TỔNG QUAN TÀI LIỆUTình hình sản xuất cồn trên thế giới và Việt Nam

Tình hình sản xuất cồn trên thế giới

Cồn là một thành phần chính trong một số sản phẩm đồ uống có truyền thốnglâu đời Ngày nay, ngoài việc sử dụng làm thức uống, cồn còn được sử dụng làmnhiên liệu thay thế cho các nguồn nhiên liệu truyền thống Theo thống kê trong

Hình 1.1, tính đến năm 2020, tổng sản lượng cồn trên thế giới khoảng 120 tỉ lít

[9,10], trong đó dùng làm thức uống và dùng trong công nghiệp khoảng 13 – 15%,còn lại dùng cho nhiên liệu [11] Theo dự báo của Tổ chức nông lương thế giới(FAO) trong các năm tới lượng cồn sử dụng (đặc biệt trong lĩnh vực làm nhiên liệuthay thế) tiếp tục tăng trưởng đạt khoảng 134,5 tỉ lít vào năm 2024 [12] Ngoài ra,

do các nguồn nhiên liệu truyền thống (dầu mỏ, khí đốt, than đá…) ngày càng cạnkiệt nên cồn đang trở thành nguồn nhiên liệu thay thế quan trọng

Hình 1.1 Tình hình sản xuất cồn trên thế giới

Cồn dùng để pha chế rượu và dùng trong hóa học, y tế, và các ngành côngnghiệp khác Đồ uống chứa cồn là sản phẩm có vị trí quan trọng trong ngành côngnghiệp thực phẩm Cồn được dùng để pha chế các loại rượu cao độ có giá trị caonhư whisky, vodka…

Mỹ và Braxin là hai quốc gia sản xuất cồn hàng đầu thế giới Theo hiệp hộinăng lượng tái tạo (RFA) năm 2021, Mỹ sản xuất sản lượng cồn dùng cho nhiênliệu đạt 15,02 tỉ gallon, chiếm 55% sản lượng cồn nhiên liệu trên thế giới Braxinsản xuất 7,43 tỉ gallon, chiếm 27% sản lượng cồn trên thế giới [13] Kết quả được

thể hiện trong Hình 1.2.

Hình 1.2 Sản lượng cồn nhiên liệu theo quốc gia năm 2021

Tình hình sản xuất cồn ở Việt Nam

Sản xuất cồn ở quy mô công nghiệp tại Việt Nam đã bắt đầu từ năm 1898 khingười Pháp cho xây dựng các nhà máy cồn ở Hà Nội, Hải Dương, Nam Định, CáiRằng, Bình Tây… Hiện nay, Việt Nam có những nhà máy cồn rượu hiện đại vớicông suất lớn như Công ty cổ phần Rượu và Nước giải khát Hà Nội (HALICO) vớicông suất 12 triệu lít cồn/năm, 40 triệu lít rượu/năm, nhà máy rượu Bình Tây (côngsuất 6 triệu lít cồn/năm) và một số nhà máy cồn rượu tại các địa phương khác

Năm 2011, sản lượng rượu công nghiệp là 127 triệu lít, rượu thủ công được cấpphép là 32 triệu lít Theo ước tính hiện nay mỗi năm vẫn còn khoảng 300 triệu lítrượu thủ công có chất lượng chưa ổn định, không nhãn mác, không công bố vàkhông được kiểm soát chất lượng được sản xuất và tiêu thụ, đây là nguy cơ gây mất

an toàn cho sử dụng sản phẩm rượu [14] Hiện nay, theo Tổng cục Thống kê (2021),sản lượng rượu mạnh và rượu trắng Việt Nam năm 2021 là 315,3 triệu lít [15].Cồn nhiên liệu ở Việt Nam đã được chính phủ ưu tiên phát triển và đã triển khainhiều dự án sản xuất lớn Tuy nhiên, tốc độ phát triển năng lượng tái tạo trong đó cósản xuất cồn vẫn chưa đáp ứng được với quy mô nền kinh tế Nguyên nhân do thiếunăng lực tài chính, công nghệ tiên tiến và các chính sách hỗ trợ, đặc biệt quy hoạch

về các vùng nguyên liệu chưa đáp ứng được yêu cầu thực tế nên đã hạn chế sự pháttriển của sản xuất cồn nhiên liệu [10] Một loạt các nhà máy cồn nhiên liệu ra đời đãphải đóng cửa Hiện nay nước ta chỉ có Công ty TNHH cồn Tùng Lâm (công suất

160 triệu lít/năm) hoạt động hiệu quả cung cấp cồn cho pha xăng nhiên liệu

Ngày 21/5/2009 Bộ trưởng Bộ Công Thương ký Quyết định số 2435/QĐ-BCTban hành “Quy hoạch phát triển ngành Bia - Rượu - Nước giải khát đến năm 2015,tầm nhìn đến năm 2025” Mục tiêu phát triển ngành theo bản Quy hoạch đã xácđịnh sản lượng rượu công nghiệp đến năm 2025 đạt 440 triệu lít [16].

Theo “Quy hoạch phát triển ngành bia, rượu, nước giải khát Việt Nam đến năm

2025 và tầm nhìn đến năm 2035” của Bộ Công Thương ngày 12/9/2016, ngành phảiphát triển trên cơ sở áp dụng thiết bị tiên tiến; không ngừng đổi mới nâng cao chấtlượng sản phẩm; nghiên cứu sản phẩm mới có chất lượng cao; phát triển bền vững,đảm bảo an toàn thực phẩm, môi trường và sinh thái Mục tiêu đến các năm 2025,

2035 sản xuất đạt tương ứng 350 triệu lít rượu (trong đó sản lượng dùng cho sảnxuất công nghiệp chiếm tỉ lệ tương ứng là 50% ) [17]

Một số công nghệ sản xuất cồn từ nguyên liệu chứa tinh bột hiện nay

Hiện nay, công nghệ sản suất cồn ở quy mô nhỏ và quy mô công nghiệp đềuđược thực hiện với quá trình có gia nhiệt nguyên liệu Công nghệ sản xuất cồntruyền thống được thực hiện với các công đoạn nghiền nguyên liệu, hồ hóa và dịchhóa bằng enzym amylase (95 – 105oC trong 60-70 phút), làm nguội dịch cháo về60-62oC và đường hóa bằng enzym glucoamylase ở nhiệt độ này, sau đó dịch cháođược hạ nhiệt độ về 28-32oC và thực hiện quá trình lên men [18–21] Nhược điểmcủa quy trình này là tiêu tốn nhiều năng lượng cho quá trình dịch hóa, tốn thời gian

và nước giải nhiệt, tăng chi phí đầu tư thiết bị, tăng nguy cơ nhiễm tạp làm giảmhiệu quả lên men [21] Mặt khác, nồng độ chất khô thấp nên kích thước thiết bị lớn,tăng chi phí chưng cất và thu hồi sản phẩm Tổn thất đường và axit amin do phảnứng Maillard Ngoài ra, quy trình này đòi hỏi thiết bị phức tạp gồm bộ phận cấp hơi,làm nguội, khuấy trộn…

Trong những năm gần đây, công nghệ đường hóa và lên men đồng thời (SSF)

để sản xuất cồn đã được nghiên cứu và ứng dụng để thay thế quy trình truyền thốngtrên nhiều loại nguyên liệu khác nhau như ngô, lúa mạch, sắn Tại Mỹ đây là quytrình được áp dụng trong sản xuất cồn chủ yếu từ nguyên liệu ngô [22] Tại cácquốc gia khác hầu hết các quy trình sản xuất cồn hiện nay đều áp dụng công nghệnày [1] Trong quy trình này, quá trình dịch hóa dưới tác dụng của enzym α-amylase được thực hiện ở nhiệt độ thấp hơn so với phương pháp truyền thống(>80oC) [18,23–25], một số quy trình thực hiện dưới nhiệt độ hồ hóa [24,26,27].Sau khi dịch hóa, dịch cháo sẽ được làm lạnh ngay xuống 30°C [23,25,26] Ở nhiệt

độ này, enzym glucoamylase, nấm men và các chất dinh dưỡng được bổ sung đểthực hiện quá trình đường hóa và lên men đồng thời Đường glucose được giảiphóng đồng thời với quá trình lên men tạo cồn, điều này làm giảm bớt ảnh hưởng

“stress” do nồng độ đường cao cho nấm men Hiện nay, quy trình SSF thường thựchiện ở nồng độ chất khô cao (very high gravity-VHG) Nồng độ chất khô cao trongsản xuất cồn tương ứng với nồng độ chất khô trên 300 g/L [28,29] Ứng với lượngchất khô này nồng độ cồn thu được trong dịch lên men có thể lên đến 18% v/v, một

số nghiên cứu ở điều kiện phòng thí nghiệm quy trình VHG có thể đạt tới nồng độcồn 23,8% v/v [18,30] Quy trình này có ưu điểm là tiết kiệm năng lượng, giảm bớtthiết bị và lượng nước sử dụng [1], có thể lên men ở nồng chất khô cao do ảnhhưởng của áp suất thẩm thấu thấp, giảm giá thành sản phẩm, tăng nồng độ cồn trongdịch lên men, giảm chi phí chưng cất và xử lý chất thải…[89]

Công nghệ sản xuất cồn không gia nhiệt

Hình 1.3 Quy trình sản xuất cồn tiết kiệm năng lượng

Các quy trình sản xuất cồn hiện nay vẫn có những nhược điểm như tiêu tốnnăng lượng (hơi và nhiệt), nước làm nguội, nhiều công đoạn sản xuất phức tạp Việcnghiên cứu, cải tiến quy trình sản xuất cồn nhằm giảm tiêu hao năng lượng, đơngiản quy trình, giảm chi phí đầu tư, tăng giá trị, giảm chất thải được đặt ra Quytrình sản xuất cồn tiết kiệm năng lượng (không gia nhiệt) hay còn gọi là “no-cook”,

“cold-cook” hoặc “one-step fermentation” ra đời cũng đã bước đầu giải quyết đượcnhững vấn đề đó Công nghệ sản xuất cồn không gia nhiệt được đề cập bởi Balls vàSchwimmer vào năm 1944 [31] Cơ sở của quá trình là sử dụng hệ enzym có khảnăng thủy phân tinh bột ở nhiệt độ 30-34°C hoặc thấp hơn so với nhiệt độ hồ hóatinh bột [1,32–35] Ứng dụng phương pháp này, cả 3 quá trình dịch hóa, đường hóa

và lên men được kết hợp trong một công đoạn duy nhất, trong cùng một thiết bị và ở

cùng một nhiệt độ như được trình bày trong Hình 1.3 Nguyên liệu, enzym, nấm

men được vào cùng lúc trong thiết bị và xảy ra đồng thời các quá trình thủy phântạo đường, nấm men sử dụng đường tạo cồn và các sản phẩm phụ Ngoài ưu điểmtiết kiệm năng lượng do hoàn toàn không sử dụng nhiệt, đơn giản quy trình (bỏ bớtcác công đoạn dịch hóa, đường hóa), quy trình này còn giảm được thời gian sảnxuất và lượng nước làm mát dịch cháo trước và sau công đoạn đường hóa Quy trìnhcòn có ưu điểm nổi bật là đường lên men tạo ra đến đâu được nấm men sử dụng vàlên men đến đó nên nấm men không phải chịu áp suất thẩm thấu cao như trong quátrình lên men theo một số công nghệ sản xuất cồn hiện nay [8]

1.1.4.1 Công nghệ sản xuất cồn không gia nhiệt với nồng độ chất khô dưới 300 g/L

Công nghệ sản xuất cồn không gia nhiệt đã được nghiên cứu trên các loạinguyên liệu khác nhau Đối với nguyên liệu ngô, Matsumoto và cs (1982) thửnghiệm quy trình sản xuất cồn không nấu từ bột ngô (nồng độ chất khô 20-30%) vớihỗn hợp enzym (dịch hóa, đường hóa, protease, cellulase, pectinase), trong đó

enzym đường hóa chính từ Rhizopus sp Quá trình lên men thực hiện trong 96 h,

nồng độ cồn đạt được khi kết thúc lên men là 14,2% v/v Nghiên cứu cho thấy hiệusuất lên men tương đương với quy trình sản xuất cồn có gia nhiệt, giảm nhiên liệu

sử dụng, tiết kiệm năng lượng so với quy trình truyền thống [36] Shigechi và cs

(2004) đã sản xuất cồn từ bột ngô (20% chất khô) bằng cách sử dụng nấm men S cerevisiae, glucoamylase

(Rhizopus oryzae) và α-amylase (Streptococcus bovis) có khả năng thủy phân tinh

bột sống với đặc tính cấu trúc miền liên kết “C-terminal-half” và vùng chức năng

“Flo1p” của các enzym tương ứng Trong quá trình lên men ở 30oC, 72 h, các chủngnày tạo ra cồn với nồng độ 61,8 g/L, hiệu suất lên men 86,5% trên cơ sở lượng cồntheo lý thuyết [33] Ngoài ra, tác giả cũng kết luận rằng đặc tính cấu trúc của enzym

có ảnh hưởng lớn đến quá trình sản xuất cồn bằng phương pháp không gia nhiệt.Cũng trên nguyên liệu ngô ở nồng độ chất khô 25%, Shihadeh và cs (2013) đã thựchiện sản xuất cồn không gia nhiệt đạt được hiệu suất lên men khá cao với nồng độcồn đạt 12,5% v/v [37] Các thí nghiệm sản xuất cồn không gia nhiệt được thực hiệntrong thiết bị lên men 5 L chứa 4 L bột ngô nồng độ 250 g/L, pH 5,0, dùng axitprotease (GC106) và Stargen 001 để thủy phân nguyên liệu, sử dụng chế phẩm nấmmen Ethanol Red Quá trình lên men ở 35°C, tốc độ khuấy trộn liên tục 200vòng/phút trong 72 h Dịch sau chưng cất được ly tâm lấy phần nước sử dụng lạicho các lần lên men tiếp theo Tác giả tiếp tục nghiên cứu mở rộng ở quy mô 5, 30,

150, 1500 và 8000 L kết quả nồng độ cồn đạt 117, 109, 101, 93 và 76 g/L tươngứng Nghiên cứu cũng đưa ra kết luận việc tái sử dụng dịch sau chưng cất ảnhhưởng không đáng kể đến các kết quả thí nghiệm [38]

Đối với nguyên liệu gạo Ấn Độ và hạt kê ở trong quy trình sản xuất cồn khônggia nhiệt Quá trình này được thực hiện bằng enzym α-amylase, glucoamylase kếthợp với nấm men từ AB Mauri (MIDC−415 722, India) Ở nồng độ chất khô 25%đối với gạo cho nồng độ cồn thu được trên 11% v/v sau 72 h lên men Đối vớinguyên liệu là bột kê ở nồng độ chất khô và thời gian lên men tương tự cho nồng độcồn trên 9,6% v/v [5] Masiero và cs (2014) dùng enzym Stargen 002 lên men khoailang với nồng độ 200 g/L Khoai được tiền xử lý ở các nhiệt độ 30 - 62°C trong 1 htrước khi thủy phân và lên men Quá trình lên men ở 30°C trong 96 h với sự cố định

pH và không cố định pH Kết quả cho thấy kiểm soát pH có hiệu suất lên men cao(hơn 54% so với không kiểm soát pH) Tiền xử lý 60 phút với Stargen 002 ở nhiệt

độ 52oC cho lượng đường glucose cao nhất, nhưng ở 62°C khả năng thủy phân lạigiảm, tác giả nhận định rằng có thể do hiện tượng hồ hóa tinh bột làm ảnh hưởngđến khả năng thủy phân của Stargen 002 [39]

Tinh bột sắn được thủy phân bởi Stargen 002 ở nhiệt độ 40°C và pH 4,0 Quátrình này đã chuyển đổi 81,19% tinh bột sắn thành glucose ở nồng độ 176,41 g/Ltrong 72 h với tốc độ tạo glucose 2,45 g/L/h Thực hiện lên men ở quy mô 5 L và

200 L với nấm men S cerevisiae ở nhiệt độ và thời gian trên đạt được nồng độ cồn

là 8,0 và 8,2% w/v tương ứng với tốc độ tạo cồn là 1,12 và 1,14 g/L/h hiệu suất lênmen đạt 71,44 và 72,47% Những kết quả này cho thấy quy trình sản xuất cồn “mộtcông đoạn” từ tinh bột sắn có thể được nâng lên cho quy mô sản xuất công nghiệp[40] Graczyk và cs (2019) nghiên cứu công nghệ không gia nhiệt trên nguyên liệulúa mạch, lúa mì và tiểu hắc mạch (triticale) với nồng độ chất khô 280 g/L đạt nồng

độ cồn tương ứng là 94,5; 97,22 và 98,7 g/L Đây là giải pháp sản xuất cồn tiềmnăng có chi phí thấp, thân thiện môi trường và có thể ứng dụng để sản xuất rượumạnh, cồn thực phẩm ở quy mô công nghiệp [41]

Ở Việt Nam cũng đã có nghiên cứu về thủy phân, lên men không gia nhiệt ởnồng độ chất khô tương đối thấp Nghiên cứu của Hoàng Kim Anh thủy phân tinhbột sắn (1% chất khô) bằng các enzym khác nhau và quan sát cấu trúc hạt tinh bộttrên kính

hiển vi điện tử quét (SEM), kết quả nghiên cứu này cho thấy một số enzym có khảnăng thủy phân tinh bột sống nhưng hiệu suất còn thấp và ở nồng độ chất khô rấtthấp (1%), nghiên cứu này cũng là cơ sở để cho thấy khả năng phát triển công nghệthủy phân tinh bột sống bằng enzym [42] Khi nghiên cứu quy trình sản xuất cồnkhông gia nhiệt từ sắn lát ở nồng độ chất khô 184,8 g/L đã thu được kết quả nồng

độ cồn sau 96 h đạt 10,8% v/v, tương ứng với hiệu suất thu hồi 91,3% [43] Mộtnghiên cứu khác về quy trình sản xuất cồn không gia nhiệt ở nồng độ chất khô19,8% bằng enzym thế hệ mới Stargen 001 (Dupont) với nguyên liệu là gạo sốngtrong thời gian lên men 70 h nồng độ cồn đạt gần 11% v/v [43] Quy trình dịch hóa,đường hóa và lên men đồng thời trên nguyên liệu gạo ở nồng độ chất khô 186,9 g/L,với enzym Stargen 002 và các enzym phụ trợ cho kết quả nồng độ cồn sau 72 h đạt10,8% v/v, tương ứng với hiệu suất thu hồi 88,5% [8]

1.1.4.2 Công nghệ sản xuất cồn tích hợp không gia nhiệt ở nồng độ chất khô cao

Công nghệ tích hợp sản xuất cồn không gia nhiệt ở nồng độ chất khô cao làcông nghệ sản xuất cồn kết hợp hai yếu tố lên men hoàn toàn không gia nhiệt vànồng độ chất khô cao (VHG) Theo Thomas và cs (1993), khái niệm VHG là trong100g dịch lên men có nhiều hơn 27 g chất khô, nếu quy về đơn vị thể tích thì tươngđương với nồng độ chất khô lớn hơn 300 g/L [44], nồng độ cồn khi kết thúc quátrình lên men đạt nồng độ trên 15% v/v [28,45] Ở 20oC, Thomas và Ingledew(1992) đã thực hiện quá trình lên men có công đoạn dịch hóa với nồng độ chất khô35% w/v đạt được nồng độ cồn 21,5% v/v Tuy nhiên ở điều kiện nhiệt độ lên menthông thường nồng độ VHG ảnh hưởng tiêu cực đến nấm men, enzym và quá trìnhlên men bởi áp suất thẩm thấu và nồng độ cồn cao [28,46] Ngược lại, VHG lại cólợi thế về sản lượng, năng suất thiết bị, giảm chi phí năng lượng và xử lý chất thải[3,6,28] nên đây là công nghệ đang được nhiều quan tâm nghiên cứu

Sự kết hợp của công nghệ tích hợp không gia nhiệt ở nồng độ chất khô cao đểsản xuất cồn hứa hẹn mang đến những thành tựu trong việc phát triển công nghệ sảnxuất cồn trên thế giới Nghiên cứu về quy trình sản xuất cồn không gia nhiệt của Xu

và Duan (2010) sử dụng enzym thủy phân tinh bột thế hệ mới kết hợp với chế độkiểm soát ở nhiệt độ thấp, nguyên liệu sử dụng là lúa miến với nồng độ chất khôtrong dịch lên men là 35%, thời gian lên men là 90 h, nồng độ cồn thu được lên đến20% v/v [47] Đánh giá ảnh hưởng của urea và protease trong sản xuất cồn khônggia nhiệt, Wang và cs (2009) lên men bột ngô ở nồng độ 32% chất khô với các nồng

độ khác nhau của enzym Stargen 001, GC106 (protease), urea Kết quả cho thấycùng lượng Stargen 001 và protease là 0,4 mL/100 g bột ngô cho độ cồn cao nhấtđạt 18% v/v sau 72 h lên men, sử dụng urea kết hợp với protease không cho thấyhiệu quả trọng việc nâng cao nồng độ cồn trong dịch lên men [48] Mặt khác, cơ chếcủa tác động của protease và urea đến hiệu suất lên men của quy trình chưa đượcgiải thích và đề cập đến Ngoài ra, các nghiên cứu này sử dụng lượng enzym khálớn trong điều kiện chi phí enzym cao nên việc ứng dụng công nghệ không gia nhiệt

để sản xuất cồn ở quy mô lớn còn hạn chế Các nghiên cứu về công nghệ sản xuấtcồn không gia nhiệt ở nồng độ chất khô cao còn chưa nhiều, hiệu suất lên men cònthấp, việc nâng cao nồng độ chất khô thực sự là một rào cản của công nghệ này.Điển hình là một nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất khô trong quy trình khônggia nhiệt, ở các nồng độ 30, 40 và 45% hiệu suất lên men sau 72 h chỉ đạt tươngứng là 78,1; 62,3 và 45,2%

Fermgen(600 SAPU/kg RF)

Amigase Mega L(0,035% w/w)

Dịch hóa, Đường hóa và Lên men đồng thời30°C, 120 h

Bã

CồnChưng cất

[49] Kết quả này cho thấy công nghệ tích hợp không gia nhiệt sản xuất cồn ở điềukiện VHG trên ngô còn nhiều vấn đề phải cải thiện công nghệ và hiệu suất lên men.Như vậy đã có một số nghiên cứu trên thế giới về công nghệ sản xuất cồn không gianhiệt ở nồng độ chất khô cao chủ yếu trên nguyên liệu ngô, tuy nhiên hiệu quả (hiệusuất, chi phí) chưa cao nên công nghệ này hiện nay vẫn chưa được triển khai ứngdụng trong thực tế

Chu-Ky và cs (2016)

Hình 1.4 Quy trình dịch hóa, đường hóa và lên men đồng thời ở nồng độ chất khô

cao CK: chất khô, RF: bột gạo

Đối với các nghiên cứu trong nước, Chu-Ky và cs (2016) nghiên cứu công nghệ tích hợp không gia nhiệt trên gạo nghiền nồng độ chất khô 311,5 g/L để sản xuất cồn

ở quy mô phòng thí nghiệm và quy mô pilot (25 L), quy trình được mô tả trong Hình 1.4 Nhiệt độ thực hiện quá trình lên men là 30°C Bột gạo được trộn đều trong

nước và thực hiện quy trình SLSF-VHG trong cùng một thiết bị Nghiên cứu sửdụng hỗn hợp enzym α-amylase và glucoamylase (Stargen 002 ở 992 GAU/kgnguyên liệu), glucoamylase (Amigase Mega L ở 0.035% w/w), protease (Fermgen

600 SAPU/kg nguyên liệu), nấm men khô S cerevisiae (Red Ethanol 3.5 × 107

CFU/mL), KH2PO4 (4.8 mM), và urea (16.0 mM) Thực hiện khuấy trộn liên tụctrong 24 h đầu lên men với tốc độ khuấy 50 vòng/phút Quá trình SLSF-VHG kếtthúc sau 120 h, dịch lên men được đem chưng cất thu hồi cồn và phụ phẩm Kết quảlên men của quy trình này đạt nồng độ cồn 17,6% v/v, hiệu suất lên men 86,3% trêntổng sản lượng cồn theo lý thuyết Mô hình pilot (25 L) đạt được nồng độ cồn17,0% v/v và hiệu suất lên men 83,2% [8] Nghiên cứu này có một số hạn chế làchưa đề cập đến cơ chế và động học thủy phân hạt tinh bột ở nồng độ chất khô cao,chưa khảo sát ảnh hưởng nồng độ cơ chất lên quá trình thủy phân và lên men, hiệusuất quá trình lên men chưa cao (tinh bột sót nhiều, ảnh hưởng nồng độ cồn lên hoạtđộng của nấm men), thời gian kết thúc quá trình lên men dài, chưa tối ưu hóa quytrình sản xuất cồn (enzym, nấm men, thời gian, nồng độ cơ chất) Tuy nhiên, kếtquả nghiên cứu này cho thấy triển vọng khả thi để phát triển công nghệ SLSF-VHG

để sản xuất cồn từ gạo Nghiên cứu này cũng là cơ sở để luận án tiếp tục nghiên cứugóp phần hoàn thiện quy trình công nghệ, giải thích cơ sở khoa học và mở rộng quy

mô sản xuất, tiến tới áp dụng quy trình này trên nguyên liệu gạo tại Việt Nam

Tóm lại, tuy còn chưa được nghiên cứu nhiều nhưng công nghệ này lại cónhững ưu điểm và có tiềm năng để ứng dụng trong sản xuất cồn Đầu tiên là độ nhớtcủa dịch lên men thấp, đường khử được phân giải ra từ từ, nấm men sử dụng ngaynên giảm ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đối với nấm men Công nghệ này tíchhợp được các ưu điểm nổi bật của cả 2 quy trình: (i) nồng độ chất khô ban đầu cao(>300 g/L) nên nồng độ cồn thu được cao hơn đáng kể so với quy trình truyền thống(>17% v/v), nhờ đó làm giảm nguy cơ nhiễm tạp vi sinh vật, đồng thời làm tănghiệu quả sử dụng thiết bị Ngoài ra, với việc thực hiện quá trình dịch hóa, đườnghóa và lên men trong cùng một thiết bị, giúp làm giảm số lượng thiết bị cần sửdụng, qua đó làm giảm chi phí đầu tư ban đầu; (ii) nâng cao năng suất của nhà máy

mà không cần đầu tư bổ sung thiết bị (giảm chi phí đầu tư); (iii) nâng cao hiệu quảsản xuất của nhà máy và giảm chi phí cho 1 lít cồn thành phẩm; (iv) giảm chi phínăng lượng (sử dụng ít nước, giảm năng lượng cho chưng cất, giảm chi phí vệ sinh

và thời gian sản xuất; (v) giảm chi phí xử lý nước thải; (vi) có thể sản xuất thựcphẩm từ phụ phẩm của nhà máy cồn với chất lượng cao và tận thu lượng lớn protein

từ nấm men

Nguyên liệu sản xuất cồn

Nguồn cơ chất trong sản xuất cồn

1.2.1.1 Cơ chất chứa đường

Các nguồn nguyên liệu chính để sản xuất cồn là nguyên liệu chứa đường, chứatinh bột và nguyên liệu chứa cellulose Theo Hoang và Nghiem (2021), trên thế giới60% cồn được sản xuất từ ngô, 25% đường mía, 3% từ lúa mì, 2% từ rỉ đường, vàmột số hạt, củ khác [10] Mía là nguyên liệu chứa đường phổ biến nhất để sản xuấtcồn, tổng sản lượng cồn từ đường mía chiếm 34% sản lượng cồn thế giới Trong đó

Braxin là quốc gia sản xuất cồn từ đường mía lớn nhất thế giới [50] Củ cải đườngđược sử dụng nhiều để sản xuất cồn ở Châu Âu, đặc biệt là ở Pháp [51] Rỉ đườngcũng là nguồn nguyên liệu sản xuất cồn, tuy nhiên chi phí sản xuất từ rỉ đường cao

do phải làm sạch nguyên liệu trước khi sản xuất Tại Việt Nam, nguồn nguyên liệuchứa đường chủ yếu là mía và rỉ đường, sản lượng mía năm 2021 khoảng 10,74triệu tấn [15] Do nhu cầu sử dụng mía làm đường và mật rỉ dùng để lên men sảnxuất mì chính, nấm men… nên cồn sản xuất từ nguyên liệu này ở nước ta khôngcao

1.2.1.2 Cơ chất chứa tinh bột

Tinh bột là nguồn nguyên liệu phổ biến dùng trong sản xuất cồn Ở Mỹ, ngô lànguyên liệu chính để sản xuất cồn và sản lượng cồn từ ngô hàng năm chiếm 44%sản lượng cồn thế giới [52] Bột khoai tây cũng là nguyên liệu được nghiên cứu ứngdụng trong lên men sản xuất cồn [23,53] Một số nghiên cứu sử dụng nguyên liệu làkhoai lang [6,25] Sắn cũng là nguyên liệu chứa tinh bột có tiềm năng lớn đển sảnxuất cồn với nhiều nghiên cứu ứng dụng [40,54–59] Nguyên liệu chứa tinh bột làgạo cũng được quan tâm để sản xuất cồn [5,8,60,61] Và một số loại nguyên liệuchứa tinh bột khác cũng được ứng dụng để tạo sản phẩm cồn như lúa miến, caolương

Ở Việt Nam, gạo được sử dụng trong bữa ăn chính hàng ngày và là sản phẩmnông nghiệp chủ lực có sản lượng sản xuất lớn Hàng năm sản lượng của gạo đápứng đủ nhu cầu tiêu dùng trong nước và phục vụ cho xuất khẩu Đây cũng lànguyên liệu có chứa hàm lượng tinh bột cao, đang được ứng dụng rộng rãi trong sảnxuất cồn thực phẩm ở quy mô công nghiệp và sản xuất rượu quy mô hộ gia đình tạiViệt Nam

1.2.1.3 Cơ chất chứa cellulose và sinh khối tảo

Cồn cũng có thể được sản xuất từ nguyên liệu chứa cellulose, thường được gọi

là cồn sinh học thế hệ thứ hai bao gồm cỏ, gỗ và các phụ phẩm nông nghiệp Tuynhiên, do hiệu suất còn thấp, công nghệ phức tạp, thời gian chuyển hóa thành cồndài nên việc ứng dụng nguyên liệu chứa cellulose để sản xuất cồn còn hạn chế vàchưa có ứng dụng rộng rãi ở quy mô công nghiệp [62] Sử dụng tảo làm nguyên liệusản xuất cồn sinh học có lợi thế vì tảo có thể hấp thụ nhanh chóng CO2, tích tụ nồng

độ chất béo và carbohydrate cao, dễ trồng trọt và cần ít đất hơn so với thực vật trêncạn [63] Giống như cồn sinh học thế hệ thứ hai, sản xuất cồn sinh học thế hệ thứ bacũng đang trong giai đoạn nghiên cứu công nghệ và quy trình nên trong tương laicông nghệ này mới có thể ứng dụng rộng rãi

Nguyên liệu gạo trong sản xuất cồn

1.2.2.1 Tình hình sản xuất và sử dụng gạo trong sản xuất cồn

Thống kê của tổ chức lương thực thế giới (FAO) cho thấy, có 114 nước trồnglúa, trong đó có 18 nước có diện tích trồng lúa trên 1.000.000 ha tập trung chủ yếu ởChâu Á với sản lượng khoảng 90% Năm 2021 sản lượng gạo thế giới là 514 triệutấn, dự kiến năm 2022 sản lượng gạo thế giới là 519,1 triệu tấn [4] Việt Nam làquốc gia sản xuất và xuất khẩu gạo hàng đầu thế giới Sản lượng lúa Việt Nam năm

2021 đạt trên 43,85 triệu tấn [15] (tương đương 27,9 triệu tấn gạo) và là nước sảnxuất lúa thứ 5 thế giới [4] Năm 2021, gạo xuất khẩu của Việt Nam xếp thứ 3 thế

Gạo không chỉ được sử dụng là nguồn thực phẩm chính mà còn là nguồnnguyên liệu sản xuất cồn (rượu) truyền thống ở khu vực châu Á Các quốc gia nhưTrung Quốc, Nhật Bản, Triều Tiên, Việt Nam… đều có những sản phẩm rượu từgạo mang đặc trưng riêng như Sakê, Shochu, Mao Đài, Làng Vân, Bàu Đá Tại ViệtNam, gạo là một trong những nguồn nguyên liệu chính để sản xuất cồn thực phẩm.Điển hình là các nhà máy cồn thực phẩm lớn như Công ty Cổ phần Rượu và Nướcgiải khát Hà Nội (trước đây là Công ty Cổ phần Cồn Rượu Hà Nội-HALICO), Công

ty Cổ phần Rượu Bình Tây, Công ty cổ phần Việt Pháp Victory… đều sử dụng gạolàm nguyên liệu chính [64] Ngoài ra, ở một số quốc gia có sản lượng gạo lớn, một

số nghiên cứu còn ứng dụng gạo cho sản xuất cồn làm nhiên liệu sinh học[5,20,65,66]

Theo Trần Xuân Định và cs (2015), cả nước có 379 giống lúa đạng đang đượcphép sản xuất, lưu thông với 270 giống lúa tẻ và 88 giống lúa lai, 21 giống lúa nếp.Ngoài ra, còn một số giống lúa địa phương, đặc sản đã gieo cấy nhiều năm dokhông có hồ sơ nên sẽ không nằm trong số lượng được thống kê này [67] Trong đó,giống lúa thuần IR50404 có diện tích gieo cấy lớn nhất trên 1,3 triệu ha, giốngOM5451 trên 670 nghìn ha, giống OM6976 trên 540 nghìn ha, giống OM4900 trên

497 nghìn ha và một số giống lúa như IR64, Hàm Châu, Bụi Sữa cũng có sản lượnggieo cấy lớn nên sản lượng gạo thành phẩm cũng rất lớn [67] Theo thông tin về thịtrường lúa gạo, một số loại gạo như IR50404, OM5451, Hàm Châu là những loạigạo có giá thành thấp và được ưa chuộng để sản xuất các sản phẩm thực phẩm nhưbún, phở, bột và tinh bột gạo, bánh kẹo… Nguyên liệu chiếm 40-50% trong tổng chiphí sản xuất cồn, do đó giá thành của nguyên liệu có ảnh hưởng rất lớn đến hiệu quả

và chi phí sản xuất [1] Trong sản xuất rượu truyền thống và sản xuất cồn thựcphẩm hiện nay, việc lựa chọn nguyên liệu để sản xuất chủ yếu dựa vào kinh nghiệm,giống lúa địa phương hoặc hàm lượng tinh bột Chưa có nghiên cứu nào lựa chọnloại gạo phổ biến ở Việt Nam phù hợp cho sản xuất cồn, đặc biệt là loại gạo phùhợp cho sản xuất cồn theo các công nghệ mới

1.2.2.2 Thành phần hóa học của gạo

Bảng 1.1 Thành phần hóa học của gạo [68]

Thành phần hóa học của gạo thay đổi theo vùng, giống, điều kiện canh tác.

Thành phần chính của gạo là tinh bột, protein, xơ được trình bày trong Bảng 1.1

[68] Trong đó tinh bột được xem là thành phần quan trọng nhất để lựa chọn cho sảnxuất cồn Hàm lượng tinh bột của gạo để sản xuất cồn thường yêu cầu trên 70%[69] Ngoài ra, hàm lượng protein trong gạo khá cao, đây là một nguồn dinh dưỡngquý cho cả nấm men và chất lượng phụ phẩm Tuy nhiên thành phần này chưa đượckhai thác và sử dụng hiệu quả trong trong công nghệ sản xuất cồn từ gạo hiện nay

Do đó gạo là nguyên liệu rất thích hợp để dùng cho công nghiệp sản xuất cồn, nhất

là cồn dùng cho thực phẩm và đồ uống

1.2.2.3 Cấu tạo của tinh bột gạo

Theo Gallant và cộng sự (1997), cấu tạo chung của tinh bột có bản chất bán tinhthể với nhiều mức độ tinh thể hóa khác nhau Thành phần tinh thể của tinh bột chủyếu là amylopectin, thành phần vô định hình trong tinh bột chứa amylose Lớp tinhthể của tinh bột được tạo thành từ mạch xoắn kép amylopectin sắp xếp theo phươngtiếp tuyến với bề mặt hạt Các thành phần vô định hình sắp xếp theo chu kỳ 9-10

nm Trong lớp tinh thể, các đoạn mạch thẳng liên kết với nhau thành các sợi xoắnkép xếp thành dãy và tạo thành chùm trong khi phần mạch nhánh nằm trong các dãy

vô định hình [70] Cấu trúc của tinh bột có hai loại phổ biến, loại A tìm thấy tronggạo và các loại ngũ cốc, loại B tìm thấy trong các loại củ như khoai tây, và loại C làhỗn hợp của hai dạng A và B tìm thấy trong các loại cây họ đậu và các loại cây cho

củ nhiệt đới như sắn [71,72] Hạt tinh bột được cấu tạo từ các lớp tinh thể cứng vàcấu trúc tinh thể mềm (bán tinh thể) với chiều dày khoảng vài trăm nanometer Lớptinh thể cứng được tạo thành từ các hạt cầu có kích thước lớn 50-500 nm Lớp bántinh thể được tạo thành từ các hạt cầu có kích thước nhỏ 20-50 nm [70]

Hình 1.5 Hình ảnh tinh bột gạo [73]

Tinh bột gạo có kích thước khoảng 3-5 µm, hình đa giác được thể hiện trong

Hình 1.5 [73] Các chuỗi polyme của các phân tử glucose được liên kết với nhau

bằng liên kết glycosidic α-1,4 và/hoặc α -1,6 để tạo thành amylose mạch thẳng vàamylopectin mạch nhánh Amylose của gạo chứa các phân tử mạch thẳng với mức

độ trùng hợp (DP) tương ứng là 1100–1700 và 700– 900 đơn vị glucose [73] Cấutrúc amylose của gạo vẫn chưa được làm sáng tỏ đầy đủ Theo nghiên cứu củaJuliano (1998) trong tinh bột gạo chứa 40%-67% (khối lượng) là amylose mạchthẳng và 33%-60% (khối lượng) là phân nhánh [74] Hàm lượng amylose của gạo

có thể thay đổi từ 0% đến 33% Dựa trên hàm lượng amylose có thể phân loại gạo:nếp (0–2%), amylose rất thấp (3–12%), amylose thấp (13–20%), amylose trungbình (21–25%) ), và amylose cao (> 25%) [68,75,76] Amylopectin trong gạo có DP

từ 5.000–15.000 đơn vị glucose, với mỗi phân tử bao gồm 220–700 chuỗi [73].Phân tích cấu trúc tinh bột gạo qua phổ XRD, gạo có cấu trúc loại A với các đỉnhtinh thể 2θ = 15, 17, 18, 20 và 23o, và độ tinh thể trong tinh bột gạo có giá trị từ 15đến 45% [68,73] Trong khi hầu hết các hạt tinh bột được tạo ra thành các hạt riêngbiệt, tinh bột gạo gồm nhiều hạt được tạo ra đồng thời trong một hạt bột lớn Do đó,hạt tinh bột gạo được phân loại là hợp chất, tương tự như hạt tinh bột của yến mạch

và đậu Hà Lan [73]

Ảnh hưởng của hàm lượng amylose trong nguyên liệu đến hiệu suất quá trìnhthủy phân và lên men đã được nhiều nghiên cứu công bố [77–80] Hàm lượngamylose trong bột gạo tăng làm chỉ số thủy phân (hydrolysis index) dưới tác độngcủa enzym amylase giảm [77] Wu và cs (2006) báo cáo kết quả lên men từ bột ngô

có công đoạn dịch hóa, mẫu có hàm lượng amylose 5,6; 18,0 và 35,0% amylose chohiệu suất lên men giảm tương ứng là 89,57; 88,25 và 85,04% Kết quả tương tự trênlúa mì nếp và lúa mì thông thường cũng được Zhao và cs (2009) báo cáo [79] Cácnghiên cứu lên men truyền thống trên nguyên liệu gạo nếp có hàm lượng amylosethấp cũng cho kết quả hiệu suất lên men cao hơn đáng kể so với gạo tẻ [80,81] Tuynhiên, gạo có hàm lượng amylose bao nhiêu thì thích hợp trong quy trình sản xuấtcồn, đặc biệt là trong công nghệ sản xuất cồn không gia nhiệt ở nồng độ chất khôcao vẫn chưa thấy có nghiên cứu công bố

1.2.2.4 Cấu tạo của bột gạo

Bột gạo chứa chủ yếu là tinh bột, protein, một ít chất xơ, polysaccharide (khôngtinh bột), chất béo, và một số khoáng chất Vách thành tế bào chủ yếu là cellulose

và hemicellulose [82] Các tế bào nội nhũ có thành mỏng, thường kéo dài về phíatâm và được bao bọc bởi các amyloplast chứa các hạt tinh bột và các protein được

trình bày trong Hình 1.6 [68,73] Lớp sub-aleurone có nhiều protein và chất béo, có

các amyloplasts chứa các hạt tinh bột nhỏ hơn so với lớp nội nhũ bên trong Các thểprotein hình cầu (0,5–4,0 mm) và tinh thể (2–3,5 mm) phân bố khắp nội nhũ[83,84]

Cấu trúc hạt gạo cho thấy một dải phân bố cấu trúc từ ngoại vi đến trung tâmcủa nội nhũ tinh bột gạo Ở ngoại vi, các tế bào nội nhũ tương đối nhỏ, và ở đây có

ít hạt tinh bột hơn nhưng lại nhiều protein hơn so với các tế bào ở trung tâm nhân

Di chuyển về phía trung tâm, các tế bào nội nhũ trở nên lớn hơn, số lượng tương đốicủa protein giảm trong khi số lượng các hạt tinh bột tăng lên và các hạt tinh bột hợpchất trở nên lớn hơn [68,73,84] Chính những đặc điểm cấu trúc này của bột gạolàm ảnh hưởng quá trình xử lý và chế biến nguyên liệu, đặc biệt là ứng dụng enzym

để xử lý bột gạo trong quy trình sản xuất cồn.

Hình 1.6 Cấu tạo bột gạo [68,73]

CW: vách thành tế bào, Pr: thành phần protein hình cầu

Enzym trong sản xuất cồn từ nguyên liệu chứa tinh bột

1.2.3.1 Enzym amylase

Enzym amylase là một enzym quan trọng và được sử dụng rộng rãi trong cácngành công nghiệp Đặc biệt là công nghiệp sản xuất bia, rượu, chất tạo ngọt… Đặcđiểm của loại enzym này là thủy phân các liên kết glucosid trong phân tử tinh bột,glycogen, dextrin để tạo thành các dextrin mạch ngắn, oligosaccharide, maltose,glucose Enzym amylase có nguồn gốc từ động vật (nước bọt, dịch tiêu hóa), tronghạt nảy mầm, nấm sợi, nấm men, xạ khuẩn và vi khuẩn Enzym amylase được sửdụng trong công nghiệp chiếm khoảng 25% thị trường [85] với số lượng thứ 2 thếgiới sau enzym protease [86–88] Enzym được phân loại dựa vào dựa vào nguồngốc, khả năng chịu nhiệt, đặc điểm hay cơ chế tác động của enzym trên cơ chất Đốivới enzym amylase, sự phân loại dựa vào cả cơ chế tác động và vị trí xúc tác [89].Theo đó amylase được chia làm hai nhóm [85,86,90,91]: endoamylase (α-amylase,pullulanase) và exoamylase (β-amylase, glucoamylase)

(i) Enzym α-amylase

Enzym α-amylase (1,4-α-D-Glucan glucanohydrolase) là enzym phân cắt liênkết α-1,4-glucosid trong nội mạch tinh bột để tạo thành các dextrin vàologosaccharide [92,93] Các glucose đầu mạch và liên kết nhánh α-1,6-glucosidkhông bị phân cắt bởi α-amylase [94] Có nhiều nguồn để sản xuất loại enzym này[86,87,90,91,95], trong đó chế phẩm enzym α-amylase công nghiệp chủ yếu được

thu nhận từ canh trường vi khuẩn Bacillus hay nấm mốc Aspergillus Kalpana

Hiteshi và Reena Gupta (2014) đã tổng hợp các chế phẩm enzym từ các nguồn vi

sinh vật được trình bày trong Bảng 1.2 [95].

Bảng 1.2 Nguồn vi sinh vật tạo α – amylase

Ominyi Matthias (2013)Ominyi Matthias (2013)

De Moraes et al (1999), Abu et al (2005) Michelin et al (2010)

Deb et al (2013)Babu and Satyanarayan (1995)Ray (2000)

Abdel-Fattah (2013) Lakshmi et al (2013)Feller et al (1994)Enzym α-amylase là protein có phân tử lượng thấp, nằm trong khoảng 10-210kilodalton (kDa), α-amylase từ vi sinh vật thường có khối lượng phân tử trongkhoảng 40 đến 70 kDa [91,96] Về cấu tạo, cơ bản α-amylase gồm ba vùng: vùng A

là lõi có đặc trưng cấu trúc kết vòng có 8 đoạn xoắn α và gấp nếp β xen kẽ liên tiếpnhau (Helix (α/)8-barrel) hoặc cấu trúc TIM barrel chứa vị trí xúc tác, được nối vớivùng C có cấu trúc 8 đoạn β – sheet song song Vùng B gồm 2 đoạn β – sheet đượclồng vào giữa đoạn  - sheet thứ 3 và α - Helix thứ 3 của vùng A [85,86,97–100].Vùng B quyết định khả năng xúc tác của enzym và liên kết enzym – cơ chất[100,101] Có một ion Ca2+ nối giữa vùng A và vùng B, tuy nhiên α-amylase từnấm mốc liên kết này yếu và có thể bị hạn chế khả năng xúc tác Cấu tạo chung của

α-amylase được mô tả trong Hình 1.7 [99,102].

Hình 1.7 Cấu tạo enzym α-amylase [99,102]

Cơ chế hoạt động của enzym α-amylase vi khuẩn được Sauer và cs (2000),

Nielsen và cs (2003) tổng hợp mô tả gồm ba bước trong Hình 1.8: (I) Nguyên tử O

của nhóm glycoside bị proton hóa và tấn công vào C1 của gốc glucose bởi Asp231;(II) Phân tử nước, phân cắt liên kết cộng hóa trị C1-Asp231; (III) Các ion phân tửnước kết hợp tái hình thành phân tử proton ban đầu [103,104]

Hình 1.8 Cơ chế phân cắt nhóm glycosyl của α-amylase từ vi khuẩn Bacillus [104]

Enzym α-amylase hoạt động phụ thuộc vào pH và nhiệt độ tối ưu Gupta và cs(2003), Srivastava và cs (2015) đã báo cáo một số tính chất của α-amylase trong đó

có một số nguồn nấm mốc như A awamori, A oryzae có dải pH tối ưu rộng và

nhiệt độ tối ưu thấp [86,96]

(ii) Enzym γ-amylase

Glucoamylase (GA) là enzym ngoại mạch thủy phân các liên kết α-1,4-glucosid

từ đầu không khử của amylose và amylopectin thành đường glucose [85,86] GAcũng có thể thủy phân các liên kết α-1,6-glucosid nhưng với tốc độ chậm [105].Theo lý thuyết, GA có thể thủy phân hoàn toàn tinh bột thành glucose Ứng dụngchủ yếu của enzym này là trong sản xuất si rô glucose, thủy phân tinh bột thànhglucose ứng dụng trong công nghiệp bánh kẹo, nước giải khát, cồn… [105,106]

GA chủ yếu được thu nhận từ canh trường nấm mốc như A niger [107], A awamori [108], Trichoderma reesei [109] Enzym GA là protein có cấu trúc bậc ba,

khối lượng phân tử nằm trong khoảng từ 25 – 112 kDa Hai loại glucosamylase làGAI và GAII GAI chứa 616 axit amin và có ba vùng: vùng xúc tác (từ axit amin 1 -470), vùng nối (từ 471– 514), và vùng liên kết với tinh bột (từ axit amin 515 – 616)

(Hình 1.9) GAII chỉ có 514 axit amin, và chỉ có GAI có khả năng thủy phân hạt

tinh bột thô [96,107]

Hình 1.9 Cấu tạo glucoamylase từ A niger [96]

Cơ chế hoạt động của GA là sự hình thành ion oxocarbenium, là sự vận chuyểnproton đến O trong liên kết O-Glycosylate từ môṭ chất xúc tác axit, và sự tấn công

ái nhân của nước bởi một xúc tác kiềm như trong Hình 1.10 [109,110].

Hình 1.10 Cơ chế thủy phân của glucoamylase [109,110]

Nguồn gốc và một số tính chất GA được Gupta và cs (2003) tổng hợp trình bày

trong bảng Bảng 1.3 [96] Đa số các GA có nhiệt độ hoạt động từ 40 đến 60oC, pHhoạt động trong khoảng 4,0 đến 4,5

(iii) Enzym thủy phân nguyên liệu (chứa tinh bột) sống

Enzym có thể thủy phân tinh bột sống (không cần gia nhiệt) đã được Balls và

Schwimmer [31] nghiên cứu trên nấm mốc A oryzae từ năm 1944 Tuy nhiên, chỉ

có Nhật Bản sản xuất được enzym thương phẩm để thủy phân tinh bột sống dùngtrong sản xuất rượu Sakê Một lý do quan trọng làm hạn chế sự phát triển của cácloại enzym này là giá thành quá đắt do phải sử dụng phương pháp lên men rắn.Trong khoảng hơn 10 năm trở lại đây, hãng Genencor (nay là Dupont) đã nghiêncứu và phát triển thành công loại enzym thủy phân tinh bột sống với giá thành rẻhơn và có hoạt độ cao Đây là hai yếu tố quan trọng để ứng dụng quá trình thủyphân tinh bột sống trong công nghệ sản xuất cồn Điểm đặc trưng của loại enzymnày là bên cạnh vùng xúc tác (catalytic domain - CD) còn có một cầu nối (linker)chứa nhiều serin và threonin [105] Threonin là một axit amin thiết yếu phân cực.Giống như serin, threonin là một trong hai axit amin mang một nhóm ancol (tyrosinkhông phải là một ancol mà là một phenol do nhóm hydroxyl của nó gắn trực tiếpvào vòng thơm, làm cho nó có tính oxi hóa và tính axit-base khác hẳn) Nó cũng làmột trong hai axit amin thiết yếu mang nhánh bên đối xứng với độ dài thay đổi Vaitrò của cầu nối này chưa

được làm rõ Tuy nhiên, khi chiều dài của cầu nối này ngắn đi thì khả năng hoạtđộng của enzym này sẽ giảm và nếu chiều dài của cầu nối này tăng lên thì hoạt độthủy phân tinh bột của enzym này cũng tăng lên Cầu nối này cũng được liên kết vớivùng liên kết tinh bột (starch binding domain - SBD) [33,111,112] Theo Shigechi

và cs (2004) vùng SBD nằm ở đầu C trong cấu trúc enzym [33] Vùng SBD có chứcnăng chính là đưa vùng CD đến gần cơ chất, từ đó tạo điều kiện thuận lợi hơn đểvùng CD thủy phân cơ chất Enzym amylase không chứa vùng SBD có hiệu suấtthủy phân giảm đi đáng kể đối với tinh bột sống (chưa được hồ hóa) khi so sánh vớihiệu suất thủy phân trong dịch chứa tinh bột đã được hồ hóa [112,113] Đến thờiđiểm hiện tại, phần lớn các loại enzym α-amylase có nguồn gốc từ nấm mốc chỉ cóvùng xúc tác CD mà không có cầu nối (linker) hoặc vùng SBD Gần đây, enzym α-

amylase bền axit (Acid stable α-amylase-ASAA) đã được tìm thấy ở A kawachii.

Khi thay đổi gen mã hóa cho enzym ASAA để làm mất vùng SBD thì enzym mớitạo thành không thể thủy phân tinh bột sống Ngoài ra, enzym có thể thủy phân tinh

bột sống cũng đã được tìm thấy ở A awamori và A nidunlans [113] Sử dụng hệ

enzym thủy phân và đường hóa tinh bột sống (ở nhiệt độ thường) cho phép loại bỏthiết bị dịch hóa và đường hóa tinh bột, tiết kiệm được chi phí đầu tư và năng lượngcần thiết cho quá trình thủy phân tinh bột

Một số chế phẩm enzym thương mại được sử dụng trong sản xuất cồn được

tổng hợp trong Bảng 1.4 Trong quy trình sản xuất cồn có gia nhiệt, enzym

glucoamylase được sử dụng sau công đoạn dịch hóa bởi α-amylase Đã có nhiềunghiên cứu so sánh, lựa chọn enzym glucoamylase cho sản xuất cồn ở nồng độ chấtkhô cao từ nguyên liệu gạo [114–116] Trong công nghệ sản xuất cồn không gianhiệt, enzym thủy phân tinh bột sống là chìa khóa để triển khai ứng dụng công nghệnày Hiện nay đã có một số chế phẩm enzym thế hệ mới có khả năng thủy phân tinhbột sống mà nổi bật là các chế phẩm Stargen 001 và Stargen 002 của nhà sản xuấtDupont (trước đây là Genencor) Enzym Stargen 001 được nghiên cứu sử dụng chonguyên liệu ngô, Stargen 002 có tác dụng hiệu quả trên các nguyên liệu như lúamạch đen, lúa mì và đại mạch [117] Thành phần của các enzym này là hỗn hợp của

enzym α-amylase và glucoamylase được sinh tổng hợp bởi A kawachi và T Reesei.

Theo nhà sản xuất công bố, enzym này có khả năng thủy phân tinh bột thô dạng hạt

mà không cần phải hồ hóa hoặc dịch hóa, có thể lên men sản xuất cồn ở điều kiệnkhông gia nhiệt hoàn toàn và hoạt động hiệu quả ở điều kiện VHG (Dupont) Dohoạt tính glucoamylase giảm nhanh (nhất là lên men ở nồng độ chất khô cao), chiphí các enzym Stargen lớn và để tránh thừa enzym nên một số nghiên cứu đã sửdụng thêm enzym glucoamylase để hỗ trợ khả năng đường hóa [8,118] Trong đó,enzym đường hóa phụ trợ Amigase Mega L (DSM) được sử dụng cho quy trìnhSLSF-VHG để sản xuất cồn từ nguyên liệu gạo với nồng độ 0,035% w/w [8] Thịthường chế phẩm enzym glucoamylase rất đa dạng và phong phú, tuy nhiên chưa cónghiên cứu lựa chọn và đánh giá hiệu quả của các chế phẩm enzym glucoamylasethương mại phụ trợ phù hợp trong quy trình SLSF-VHG từ gạo Đây cũng là mộtyếu tố cần giải quyết trong nội dung của luận án này

Bảng 1.4 Một số chế phẩm enzym thương mại dùng trong sản xuất cồn

Enzym Tên thương mại Nhà sản xuất Nguồn tham khảo

-Alpha-amylase và

Alpha-amylase và

Beta- glucanase Viscozyme Cassava R Novozymes [124]

1.2.3.2 Enzym β-glucanase

Enzym β-glucanase là enzym thủy phân các liên kết 1,3(4)-β-glucosid có trongthành tế bào, cellulose, hemilcellulose Enzym này có thể tìm thấy trong vi khuẩn,thực vật và một số động vật thực vật biển [125] Người ta đã xác định rằng có baloại enzym khác nhau (exo-1,4-glucanase, endo-β-1,4-glucanase và β-glucosidase)tạo thành nhóm enzym cellulase Endoglucanase bắt đầu quá trình thủy phâncellulose, phá vỡ các liên kết β-1,4-glucosid bên trong chuỗi tế bào, làm tăng sốlượng liên kết ngoại mạch cho exoglucanase [126] Những phản ứng thủy phân nàyxảy ra ở các vùng vô định hình của cellulose Exoglucanase sau đó có thể tách ra haiđơn vị cellobiose từ mỗi đầu của các chuỗi cellulose ngắn hơn Các cellobiose vàcellodextrins cuối cùng được thủy phân bởi β-glucosidase thành glucose β-glucosidase đóng một vai trò quan trọng trong quá trình thủy phân cellulose bằngcách loại bỏ cellobiose ức chế hoạt động của exo và endo glucanase [126] Một số

vi sinh vật sản xuất β-amylases là Bacillus polymyxa, B cereus, B megatarium, Streptomyces sp., Pseudomonas sp và Rhizopus japonicus [91].

1.2.3.3 Enzym protease

Protease có nguồn gốc từ thực vật (papain, bromelain, ficin…), động vật(trypsin, pepsin, renin…) và protease có nguồn gốc từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấmsợi ) [127,128] Protease có hai loại: endoprotease và exoprotease Endoproteasethủy phân liên kết peptide ngẫu nhiên trong mạch peptide Exoprotease phá vỡ liênkết peptide ở đầu hoặc cuối của chuỗi protetin từ đó tách axit amin ra khỏi chuỗi[48] Trong công nghệ sản xuất cồn, protease thủy phân protein tạo ra nitơ amin tự

do (FAN) thúc đẩy hiệu quả sự sinh trưởng và trao đổi chất của nấm men [129–132] Đặc điểm, cơ

chế tác động của enzym protease trong quy trình SLSF-VHG sẽ được trình bày

trong mục 1.3.3 của nội dung này.

Bảng 1.5 thống kê một số enzym protease thương mại được dùng trong công

nghệ sản xuất cồn Protease được sử dụng để thủy phân protein có trong nguyên liệuthành nitơ amin cung cấp cho nấm men GC106 được sử dụng cho thủy proteintrong nguyên liệu ngô, enzym này cho thấy hiệu quả trong việc nâng cao độ cồn vàhiệu suất lên men so với các mẫu đối chứng [26,48,133,134] Vidal và cs (2009) sửdụng enzym NS50045 làm giảm 22% lượng tinh bột sót trong nội nhũ nguyên liệungô, tuy nhiên nồng độ cồn không được cải thiện đáng kể so với mẫu không dùngprotease Nguyên nhân có thể do điều kiện hoạt động tối ưu của enzym này khác vớiđiều kiện hoạt động của enzym đường hóa [131] Fermgen là enzym được sử dụngtrong nhiều nghiên cứu về công nghệ sản xuất cồn [5,114,115,123,135,136] Mặtkhác điều kiện hoạt động của Fermgen cũng tương đồng với enzym đường hóa vàđiều kiện lên men Theo nhà sản xuất Dupont, Fermgen là enzym chuyên dụng chosản xuất cồn từ nguyên liệu có chứa tinh bột Fermgen có thể hoạt động tốt được ởđiều kiện pH (3,5

– 5,0), nhiệt độ (28 – 35oC) của enzym đường hóa, và nồng độ chất khô từ 26 –38% Hiệu quả của enzym Fermgen trong sản xuất cồn có gia nhiệt từ gạo đã đượccác tác giả công bố [5,8,114,115,123,135,136] Lượng sử dụng 0,085 kg Fermgencho 1 tấn bột ngô làm nồng độ cồn tăng hơn 1,2% v/v so với dùng urea nồng độ 400ppm Một nghiên cứu khác sử dụng lượng enzym Fermgen là 1kg/tấn nguyên liệucho thấy tốc độ lên men khá hiệu quả tuy nhiên vẫn thấp hơn so với lượng enzym sửdụng là 3,2 và 5 kg/tấn nguyên liệu, trong khi hai nồng độ này không có sự khácbiệt vể tốc độ lên men [135] Lượng sử dụng Fermgen thấp hơn rất nhiều trong quytrình không gia nhiệt Liều lượng sử dụng ở nồng độ 25% chất khô là 0,2 kg/tấnnguyên liệu [5], trong khi ở nồng độ chất khô cao lượng enzym Fermgen sử dụng là

600 SAPU/kg (0,52 mL/kg nguyên liệu) [8] Tuy nhiên chưa có nghiên cứu nồng độtối ưu của enzym này cho quy trình SLSF-VHG trên nguyên liệu gạo

Bảng 1.5 Một số chế phẩm enzym protease thương mại dùng trong sản xuất cồn

Enzym Tên thương mại Nhà sản xuất Nguồn tham khảo

Nấm men dùng trong công nghệ sản xuất cồn

1.2.4.1 Cơ chế tạo các sản phẩm của nấm men

Vào cuối những năm 1850, Louis Pasteur bắt đầu làm việc với quá trình lênmen và là người đầu tiên nhận ra mối quan hệ giữa nấm men và sự chuyển hóa

đường thành ethanol [137] Ngày nay, nấm men Saccharomyces cerevisiae hầu như

là nấm men phổ biến duy nhất sử dụng trong sản xuất cồn [1] Đây cũng là loại nấmmen sử dụng trong sản xuất bia, rượu mạnh và làm bánh Yêu cầu của nấm mendùng trong sản xuất cồn là có năng lực lên men mạnh, biến đường thành rượunhanh, ngoài ra nấm men phải ổn định, chịu được những biến đổi của môi trườnglên men [69]

Cơ chế quá trình lên men cồn etylic là quá trình phân giải yếm khí đường thànhcồn dưới tác dụng của hệ enzym có trong nấm men Phương trình phản ứng tổngquát của quá trình lên men cồn được trình bày như sau:

C6H12O6 + 2ADP + 2H3PO4 = 2C2H5OH + 2CO2 + 2ATP + 2H2O

Đường cùng với chất dinh dưỡng khác của môi trường lên men được hấp thụtrên bề mặt và sau đó khuếch tán qua màng tế bào và vào bên trong tế bào nấm men

Sự chuyển hóa đường thành cồn trong tế bào nấm men xảy ra ở điều kiện kỵ khí vớihàng loạt các phản ứng với sự tham gia của nhiều loại enzym khác nhau, bước cuốicùng của quá trình lên men là sự chuyển hóa axit pyruvic thành cồn và CO2

[138,139] Bên cạnh cồn và khí CO2, tế bào nấm men còn tổng hợp tạo ra hàng trămsản phẩm phụ và sản phẩm trung gian khác trong quá trình lên men Những hợpchất này được tìm thấy trong dịch lên men với hàm lượng nhỏ: glycerol, rượu bậccao (higher alcohols), aldehyt, axit lactic, axit axetic và este [1,69,138–140]

1.2.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến nấm men

(i) Ảnh hưởng bởi nhiệt độ

Nhiệt độ có ảnh hưởng lớn đến hoạt động trao đổi chất của nấm men Đối với

nấm men Saccharomyces nhiệt độ tối ưu nằm trong khoảng 28-32oC [69] Walker

và Stewart (2016) cho biết nhiệt độ tốt nhất để nấm men phát triển từ 28-32oC[140] Còn theo Ingledew và cs (2009) nhiệt độ tối ưu trong quá trình lên men dưới34-35oC [1] Nhiệt độ thấp khả năng lên men cao nhưng thời gian kéo dài, hạn chế

sự phát triển của tạp khuẩn Nhiệt độ cao hoạt tính nấm men giảm nhanh, khả năngnhiễm tạp cao Ngoài ra, nhiệt độ cao làm tăng sản phẩm phụ (este, aldehyt…) vàtổn thất cồn theo CO2 tăng [69]

(ii) Ảnh hưởng bởi pH

Nồng độ ion H+ làm thay đổi điện tích các chất của vỏ tế bào, tăng hoặc giảmmức độ thẩm thấu các chất dinh dưỡng cũng như chiều hướng quá trình lên men.Đối với lên men từ tinh bột, pH tối ưu thường từ 4,5-5,0 [69] và 4,0-5,0 [141] Theo

nghiên cứu của Walker và Stewart [140], pH thích hợp cho nấm men S cerevisiae

trong khoảng 4,5-6,5 Một số nấm men có thể sống và phát triển ở pH 2,75-4,25[141] Nếu pH tăng môi trường lên men dễ bị nhiễm khuẩn, glycerin tạo ra nhiềulàm giảm hiệu suất quá trình lên men Trong điều kiện lên men giống, pH môitrường có thể điều chỉnh trong khoảng 3,8 - 4,0 để hạn chế sự phát triển của vikhuẩn lactic và vi sinh vật nhiễm tạp khác [69]

(iii) Ảnh hưởng của nồng độ chất khô trong dịch lên men

Nồng độ đường trong dịch lên men cao làm tăng áp suất thẩm thấu và mất cânbằng sinh lý của nấm men [140] Nấm men bị ức chế hoạt động có thể làm tăng tổnthất cơ chất và kéo dài thời gian lên men Thông thường nồng độ chất khô trongdịch lên men từ 16-18% tương đương với nồng độ đường khoảng 13-15% [69].Nồng độ đường trên 250 g/L khó thực hiện được quá trình lên men ở quy mô côngnghiệp do lên men không hoàn toàn ở điều kiện nhiệt độ 30-32oC [44] Nồng độđường ban đầu lớn hơn 30% w/v làm chậm quá trình lên men và giảm hiệu suất lênmen [28] Một báo cáo của Jacques và cs (1999) cho thấy nồng độ gây “stress” đốivới nấm men là 38% carbohydrate [30] Những năm gần đây, một số loại nấm men

có khả năng hoạt

động ở nồng độ chất khô cao (VHG) đã được nghiên cứu và đưa vào sản xuất.Puligundla và cs [28] đã tổng hợp một số nghiên cứu ứng dụng nấm men thươngmại ở nồng độ chất khô trên 30% w/v cho nồng độ cồn trong dịch dấm chín lên đến17% v/v Ngoài ra, để phản ứng lại với điều kiện nồng độ đường cao trong dịch lênmen, nấm men sản sinh ra lượng thừa glycerol để bảo vệ tế bào và màng tế bàochống lại sự mất nước Điều này làm giảm hiệu suất tạo cồn của quá trình lên men[140].

(iv) Ảnh hưởng của nồng độ cồn đến nấm men

Nấm men sử dụng đường glucose tạo ra cồn, tuy nhiên chính nồng độ cồn nàylại là tác nhân ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm men Cồn có thểlàm giảm nhiệt độ tối ưu và nhiệt độ tối đa cho sự phát triển, giảm khả năng sinhsản và khả năng lên men, phá hủy thành tế bào và tăng khả năng đột biến cho nấmmen [1] Theo Pornpukdeewattana và cs (2014), khảo sát ảnh hưởng của nồng độ

cồn lên nấm men S cerevisiae (SC90) ở nhiệt độ 30oC, kết quả cho thấy nồng độcồn 15% v/v nấm men phát triển chậm, ở nồng độ cồn 20-25% v/v nấm men hầunhư không phát triển [142], điều này cũng phù hợp với công bố của Puligundla và

cs (2011) về ảnh hưởng của nồng độ cồn (>15% v/v) đến sự ngừng phát triển củanấm men [28] Tương tự Hajar và cs (2017), cũng cho biết ở nồng độ cồn trên 20%

có thể ức chế khả năng lên men của nấm men [141] Ngoài ra khi nghiên cứu về ảnhhưởng của nồng độ cồn lên sự nảy chồi của nấm men, Kubota và cs (2004) đã chobiết ở nồng độ cồn 6 % v/v khả năng sinh trưởng của nấm men giảm 50 %, tác giảcũng chỉ ra rằng nấm men có mã gen khác nhau có khả năng phát triển ở nồng độcồn tương ứng là 6, 8, và 11% v/v [143]

(v) Dinh dưỡng cho nấm men

Nitơ là nguồn dinh dưỡng cần thiết cho nấm men, đặc biệt là giai đoạn sinhtrưởng Chất bổ sung có thể rút ngắn thời gian lên men, tăng sức chịu đựng của nấmmen trước sự ảnh hưởng của axit hữu cơ, nhiệt độ, pH và các yếu tố môi trườngkhác [1,132] Trong hầu hết các loại nguyên liệu để sản xuất cồn như ngô, lúa mì vàmột số nguyên liệu khác có chứa một lượng nitơ (dạng protein) khá lớn, nhưng hàmlượng nitơ amin nấm men có thể sử dụng được khá thấp, hầu như không đủ cho quátrình lên men thông thường Ngày cả khi tăng nồng độ chất khô lên 20-33% thìlượng nitơ amin cũng không đủ để tăng tốc độ lên men [1] Để giải quyết vấn đềnày, nguồn nitơ bổ sung bên ngoài có thể được dùng cho lên men là (NH4)2SO4,urea, pepton và chiết xuất nấm men [144,145] Li và cs (2106) so sánh hiệu quả cácnguồn nitơ trong sản xuất cồn ở điều kiện VHG cho thấy hiệu suất và thời gian lênmen phụ thuộc vào nguồn nitơ (chiết xuất nấm men > pepton > urea > (NH4)2SO4)[145] Tuy nhiên do vấn đề chi phí cao nên chiết xuất nấm men và pepton khôngđược ưu tiên sử dụng Urea là nguồn bổ sung nitơ thích hợp cho công nghệ sản xuấtcồn, nó cho thấy hiệu quả bởi giá thành rẻ và hiệu suất lên men khá cao Theo một

số tác giả nghiên cứu, nồng độ urea tối ưu sử dụng trong khoảng 8 mM đến 16 mM,trong đó nồng độ 16 mM thích hợp nhất cho lên men ở nồng độ chất khô cao[1,48,146] Còn theo Johnston và McAloon [135], nồng độ urea tối ưu cho lên mentrong khoảng 400 – 1200 ppm, trên 1200 ppm có khả năng ức chế quá trình lên menlàm giảm hiệu suất lên men Với nồng độ 16mM trong dịch bột mì nồng độ chất khô

350 g/L, Jones và Ingledew (1994) nghiên cứu cho kết quả lên men đạt nồng độ cồn21,1% v/v ở nhiệt độ 20oC [147] Do đó các nghiên cứu trong luận án này sử dụng

urea với nồng độ 16 mM Tuy nhiên,

urea có khả năng phản ứng với cồn để tạo ra etyl carbamate, một chất được cho là

có khả năng ảnh hưởng không tốt đến sức khỏe nếu dùng làm cồn thực phẩm[116,138,140] Ngoài ra, để sử dụng nguồn nitơ có trong protein của nguyên liệu,enzym protease được dùng để thủy phân protein thành các axit amin[1,116,131,135] Đây được xem là dinh dưỡng có hiệu quả cao đối với hoạt độngcủa nấm men và giảm được chi phí do bổ sung nitơ bên ngoài [139,140]

Photpho có vai trò quan trọng trong quá trình tạo protein, enzym và quá trìnhtrao đổi chất của nấm men, đặc biệt là tạo nên axit nucleic [18] Các chất khoángkhác như lưu huỳnh, kali, magie và các khoáng vi lượng cũng là yếu tố quan trọngảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm men [21] Nghiên cứu củaIngledew và cs (1994) cho thấy khi bổ sung diammonium phosphate vào dịch lênmen chứa đường ở nồng độ cao thì hiệu suất, nồng độ cồn và tỉ lệ sống của nấmmen đều tăng đáng kể [148] Sử dụng Zn với nồng độ 0,4-1 ppm có thể giúp quátrình lên men diễn ra nhanh hơn [149]

(vi) Ảnh hưởng của một số yếu tố khác đến hoạt động của nấm men

Lượng tế bào nấm men trong dịch lên men càng thấp thì thời gian lên men sẽkéo dài và dễ bị nhiễm khuẩn Số lượng tế bào nấm men trong dịch lên men cao thờigian lên men sẽ ngắn hạn chế được khả năng nhiễm khuẩn Tuy nhiên lượng tế bàonấm men quá cao sẽ dẫn đến sự cạnh tranh dinh dưỡng làm ảnh hưởng không tốtđến quá trình lên men Để hạn chế nhiễm tạp khuẩn trong lên men một số nhà sảnxuất đưa ra khuyến cáo sử dụng chất kháng sinh Chế phẩm Allpen specialTM củahãng Lallemand với chất nền là penicillin, chất này chống lại các vi khuẩn gram

dương như Lactobacillus, Pediococcus và một số vi khuẩn khác bằng ức chế tổng

hợp thành tế bào vi khuẩn Ngăn ngừa vi khuẩn cạnh tranh đường glucose Allpenspecial bị phân hủy ở 52oC và bị mất hoạt tính khi chưng cất Lactrol® chứavirginiamycin ức chế tổng hợp protein bình trong vi khuẩn gram dương

(Lactobacillus sp.) Virginiamycin có cấu trúc tự nhiên của hai phân tử (M & S) ức

chế protein tổng hợp tại hai vị trí tiểu đơn vị ribosome khác nhau trong tế bào vikhuẩn, làm gián đoạn chức năng và có thể dẫn đến chết tế bào Theo nhà sản xuất,lượng dùng Lactrol là 2 và 2,5 ppm Tuy nhiên, các chất khử trùng Na2SiF6,penicilin, formalin là những chất có thể ảnh hưởng đến hoạt động của nấm men nếu

sử dụng quá nồng độ [69]

Các axit hữu cơ, các sản phẩm của quá trình lên men cũng ảnh hưởng đến hoạtđộng của nấm men Trong lên men rượu, axit lactic và axit axetic là hai loại axithữu cơ thường hay gặp và có ảnh hưởng lớn đến hoạt động lên men [1] Các axitnày sinh ra do sự nhiễm tạp trong quá trình lên men Theo Narendranath và cs(2001), nồng độ ức chế tối thiểu của axit axetic cho sự tăng trưởng nấm men là0,6% w/v (100mM) và axit lactic là 2,5% w/v (278 mM) Tuy nhiên, axit axetic ởnồng độ 0,05-0,1% w/v và axit lactic ở nồng độ 0,2-0,8% w/v bắt đầu gây “stress”cho nấm men, giảm tốc độ tăng trưởng và giảm tỉ lệ tiêu thụ glucose [1,150].Furfural là một chất có mặt trong dịch lên men, chất này có thể làm giảm khả năngnảy chồi và giảm kích thước tế bào