Nghiên cứu sản xuất cây giống lan kim tuyến (anoectochilus roxburghii (wall ) lindl) nuôi cấy mô trong điều kiện vườn ươm tại bán đảo sơn trà, đà nẵng

Ảnh hưởng của các thành phần trong môi trường nuôi cấy đến khả năng tạo rễ in vitro của cây lan kim tuyến .... Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện ươm trồng đến khả năng sống sót và sin

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

ĐÀO THỊ THẢO

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CÂY GIỐNG LAN KIM TUYẾN (Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl) NUÔI CẤY MÔ TRONG

ĐIỀU KIỆN VƯỜN ƯƠM TẠI BÁN ĐẢO SƠN TRÀ, ĐÀ NẴNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM

Đà Nẵng – 2023

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

LỜI CAM ĐOAN ii

TRANG THÔNG TIN LUẬN VĂN THẠC SĨ iii

MỤC LỤC v

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii

DANH MỤC HÌNH ẢNH viii

DANH MỤC BẢNG ix

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3

4 Bố cục đề tài 3

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Giới thiệu về cây lan kim tuyến 4

1.1.1 Nguồn gốc và phân bố 4

1.1.2 Đặc điểm hình thái cây lan kim tuyến 4

1.1.3 Điều kiện sinh thái 5

1.1.4 Giá trị kinh tế và dược liệu của lan kim tuyến 5

1.2 Khái quát về nuôi cấy mô thực vật trong nhân giống in vitro 8

1.2.1 Các giai đoạn trong quy trình nhân giống in vitro ở thực vật 8

1.2.2 Các yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến nhân giống vô tính in vitro ở thực vật 10

1.3 Tình hình nghiên cứu về cây lan kim tuyến 13

1.3.1 Nghiên cứu ở Thế giới 13

1.3.2 Nghiên cứu ở Việt Nam 14

1.4 Giới thiệu sơ lược về điều kiên tự nhiên của bán đảo Sơn Trà – Đà Nẵng 16

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, PHẠM VI VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Đối tượng nghiên cứu 18

2.2 Phạm vi nghiên cứu 18

2.3 Nội dung nghiên cứu 18

2.4 Phương pháp nghiên cứu 19

2.4.1 Phương pháp tạo rễ từ chồi in vitro của lan kim tuyến 20 2.4.2 Phương pháp tạo cây giống lan kim tuyến in vitro trong điều kiện vườn ươm 20 2.4.3 Phương pháp xử lí số liệu 21

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 22

3.1 Ảnh hưởng của các thành phần trong môi trường nuôi cấy đến khả năng tạo rễ

in vitro của cây lan kim tuyến 22

3.1.1 Ảnh hưởng của chất ĐHST đến khả năng ra rễ của lan kim tuyến 22 3.1.2 Ảnh hưởng của than hoạt tính đến khả năng tạo rễ in vitro của lan kim tuyến 26 3.1.3 Ảnh hưởng của hàm lượng môi trường khoáng MS đến khả năng tạo rễ

in vitro lan kim tuyến 28 3.2 Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện ươm trồng đến khả năng sống sót và

sinh trưởng cây lan kim tuyến in vitro trong điều kiện vườn ươm tại bán đảo Sơn

Trà - Đà Nẵng 30 3.2.1 Ảnh hưởng của thời gian thích nghi đến khả năng sống của cây lan kim tuyến in vitro 31 3.2.2 Ảnh hưởng của thời gian che phủ bầu ươm đến khả năng sống của cây lan kim tuyến in vitro 32 3.2.3 Ảnh hưởng của cơ chất ươm trồng đến khả năng sống và sinh trưởng của cây lan kim tuyến in vitro 34 3.2.4 Ảnh hưởng của chế độ tưới nước đến khả năng sinh trưởng của cây lan kim tuyến in vitro trong vườn ươm 37 3.2.5 Ảnh hưởng của che sáng đến khả năng sinh trưởng của cây lan kim tuyến in vitro 39

KẾT LUẬN 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ in vitro

của lan kim tuyến

23

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ IBA đến khả năng tạo rễ in vitro

của lan kim tuyến

25

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của than hoạt tính đến khả năng tạo rễ in vitro

của lan kim tuyến

27

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của môi trường khoáng MS đến khả năng tạo rễ

in vitro của lan kim tuyến

29

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của thời gian làm thích nghi đến khả năng sống

của cây con in vitro trong vườn ươm

31

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của thời gian phủ túi nilon lên bầu ươm đến khả

năng sống của cây in vitro trong vườn ươm

33

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của cơ chất ươm trồng đến khả năng sống sót và

sinh trưởng của lan kim tuyến in vitro

35

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của nước tưới đến khả năng sinh trưởng của cây

lan kim tuyến in vitro trong vườn ươm

37

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của che sáng đến khả năng sinh trưởng của cây

lan kim tuyến in vitro trong vườn ươm

39

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Cây lan kim tuyến (a) Cây ngoài tự nhiên, (b) Cụm chồi

lan kim tuyến nuôi cấy in vitro

18

Hình 3.1 Rễ hình thành từ chồi in vitro cây lan kim tuyến sau 6 tuần

nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung NAA (a) 1,0 mg/L NAA; (b) 0,75 mg/L NAA; (c) không có NAA

24

Hình 3.2 Rễ hình thành từ chồi in vitro cây lan kim tuyến sau 6 tuần

nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung IBA (a) không IBA;

(b) 0,25 mg/L IBA; (c) 1 mg/L IBA; (d) 0,75 mg/L IBA

26

Hình 3.3 Rễ hình thành từ chồi in vitro cây lan kim tuyến sau 6 tuần

nuôi cấy trên môi trường MS + 1 g/L NAA bổ sung than hoạt tính (a) 1,0 g/L than hoạt tính; (b) 1,5 g/L than hoạt tính

28

Hình 3.4 Rễ hình thành từ chồi in vitro cây lan kim tuyến sau 6 tuần

nuôi cấy trên môi trường MS (a) MS đầy đủ; (b) ½ MS;

Hình 3.6 Các túi nilon chứa các cây lan kim tuyến in vitro được làm

thích nghi trong điều kiện vườn ươm ở bán đảo Sơn Trà –

Đà Nẵng

32

Hình 3.7 Che phủ ly nhựa trong suốt lên bầu ươm cây trong vườn

ươm (a) Cây trước khi phủ ly nhựa; (b) Cây sau khi phủ ly nhựa

33

Hình 3.8 Cây lan kim tuyến in vitro sinh trưởng trên cơ chất trồng

100% vụn xơ dừa

36

Hình 3.9 Cây giống lan kim tuyến in vitro sinh trưởng trong điều

kiện tưới nước 2 lần/ngày trong vườn ươm

38

Hình 3.10 Cây giống lan kim tuyến nuôi cấy mô sinh trưởng trong

điều kiện vườn ươm với độ che sáng 60% (bằng lưới chắn sáng) tại bán đảo Sơn Trà-Đà Nẵng

40

Hình 3.11 Cây giống lan kim tuyến nuôi cấy mô sinh trưởng trong

điều kiện vườn ươm tại bán đảo Sơn Trà-Đà Nẵng sau 2 tháng ươm trồng

41

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Từ xa xưa phương thuốc chữa bệnh từ những loại cây có các thành phần dược liệu tốt cho sức khỏe, vừa có khả năng bồi bổ cơ thể, vừa hỗ trợ điều trị bệnh Các cây thuốc xuất hiện khắp mọi nơi trên thế giới, chẳng hạn như ở châu Âu hiện nay có tới 1482 cây được công nhận là có chứa dược tính chữa bệnh Hay vùng Châu Á nhiệt đới có 3650 cây chữa bệnh với nhiều nhóm công dụng khác nhau Và ngay tại Việt Nam tính đến năm 2005 đã xác định được 3948 loài thực vật và nấm,

52 loài tảo biển, 408 loài động vật và 75 loại kháng vật có công dụng làm thuốc Đa

số các cây thuốc mọc tự nhiên, tập trung chủ yếu trong các quần xã rừng, chỉ có gần 10% trong số đó là cây thuốc trồng [3]

Họ lan (Orchidaceae) là họ thực vật đa dạng nhất của Việt Nam, với tổng số

865 loài thuộc 154 chi Thông thường lan được sử dụng làm cảnh Ngoài ra, có

nhiều loài lan còn được sử dụng làm thuốc Chi lan kim tuyến Anoectochilus ở Việt Nam hiện thống kê được 12 loài, trong đó có loài lan kim tuyến Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl được biết đến như một thảo dược quý có thể chữa nhiều

bệnh và còn tăng cường sức khỏe con người [15] Trong y học cổ truyền Trung Hoa, lan kim tuyến được dùng để điều trị bệnh tiểu đường, làm tan khối u, phòng ngừa các bệnh u bướu và tim mạch, [28, 45] Nghiên cứu về Trung y tuyên bố năm 1924: toàn thân cây thuốc được dùng để tăng cường sức khỏe, trị bệnh phổi, di tinh, xuất tinh sớm, yếu gan, yếu tỳ và các vết thương do rắn cắn; ngoài ra lan kim tuyến còn có tác dụng bổ máu, giải nhiệt

Ngày nay, y học hiện đại đã phân tích và xác định được lan kim tuyến chứa các thành phần hoạt chất có dược tính cực kỳ quan trọng bao gồm: Flavonoid, steroid, trierpenoids, acid amin và các loại khoáng đa vi lượng khác có thể chữa các bệnh như: trị lao phổi, ho do viêm phế quản, chấn thương, viêm dạ dày mãn tính, suy nhược thần kinh, làm khí huyết lưu thông, kháng khuẩn, đau bụng, đau ngực, viêm thận, sốt cao, đắp vết thương do bị rắn cắn

Do bị thu hái nhiều để bán làm thuốc từ rất lâu nên loài lan kim tuyến đang

bị đe doạ nghiêm trọng, rất có thể sẽ bị tuyệt chủng ngoài tự nhiên nếu chúng ta không có biện pháp bảo tồn hữu hiệu Hiện nay, Lan kim tuyến được xếp trong nhóm IA của Nghị định 32/2006/NĐ-CP, nghiêm cấm khai thác từ tự nhiên vì mục đích thương mại và nhóm thực vật đang nguy cấp EN A1a,c,d trong sách đỏ Việt

Nam năm 2007, phần thực vật [1,2] Nhằm bảo tồn và phát triển nguồn tài nguyên quý này, nhiều đơn vị nghiên cứu trong cả nước đã tập trung vào việc nhân giống

và nuôi trồng lan kim tuyến Ở nước ta, loại cây này thường mọc ở các vùng núi cao miền Tây Bắc như: Lào Cai, Yên Bái, Lai Châu, Cao Bằng, Hòa Bình, Tuyên Quang Tuy nhiên hiện nay khu vực phân bố của loài bị thu hẹp và số lượng của loài bị suy giảm nghiêm trọng Theo phương pháp nhân giống cổ truyền, lan kim tuyến được nhân giống bằng cách gieo hạt, tách mầm nhưng những phương pháp này vẫn còn nhiều nhược điểm như mất thời gian, nguồn vật liệu ban đầu cần nhiều, hệ số nhân thấp, dễ bị thoái hóa qua nhiều thế hệ, khả năng lây truyền bệnh cao, chất lượng cây không đảm bảo, việc nhân giống mang tính thời vụ Hiện nay cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật việc ứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật trong nhân giống đã trở nên phổ biến Nuôi cấy mô tạo cây trồng sạch bệnh, chất lượng tốt, độ đồng đều cao Hiện nay, chưa có nghiên cứu nào về sản xuất cây

giống lan kim tuyến in vitro để trồng tại Đà Nẵng Để đáp ứng nhu cầu sử dụng

cũng như bảo tồn nguồn gen cây thuốc quý, việc nghiên cứu sản xuất nhanh cây giống lan kim tuyến chất lượng cao, phục vụ sản xuất trên quy mô lớn là cần rất thiết

Xuất phát từ những lý do trên, tôi quyết định lựa chọn đề tài “Nghiên cứu

sản xuất cây giống lan kim tuyến (Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl) nuôi

cấy mô trong điều kiện vườn ươm tại bán đảo Sơn Trà, Đà Nẵng”

2 Mục tiêu nghiên cứu

2.1 Mục tiêu tổng quát

Xác định các điều kiện thích hợp cho sản xuất cây giống lan kim tuyến nuôi cấy mô trong điều kiện vườn ươm tại bán đảo Sơn Trà, Đà Nẵng

2.2 Mục tiêu cụ thể

- Xác định được môi trường nuôi cấy thích hợp để tạo rễ, hình thành cây lan

kim tuyến in vitro hoàn chỉnh

- Xác định được các điều kiện ươm trồng thích hợp cho sinh trưởng của cây lan kim tuyến nuôi cấy mô trong vườn ươm bán đảo Sơn Trà, Đà Nẵng

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

3.1 Ý nghĩa khoa học

- Cung cấp những dẫn liệu khoa học mới về sản xuất cây giống lan kim tuyến nuôi cấy mô trong điều kiện vườn ươm tại Bán đảo Sơn Trà – Đà Nẵng, góp phần làm phong phú hơn cơ sở dữ liệu về kỹ thuật nhân giống cây dược liệu quý này tại Việt Nam

- Là nguồn tài liệu tham khảo có giá trị cho công tác giảng dạy, học tập và nghiên cứu khoa học trong sinh học, công nghệ sinh học thực vật, nông nghiệp công nghệ cao, sản xuất nguyên liệu dược liệu

4 Bố cục đề tài

Luận văn gồm 3 chương:

Chương 1 Tổng quan tài liệu

Chương 2 Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu

Chương 3 Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về cây lan kim tuyến

1.1.1 Nguồn gốc và phân bố

Chi lan kim tuyến (Anoectochilus) thuộc họ lan (Orchidoideae) được

Carlvon Blume mô tả đầu tiên năm 1810, trong đó loài lan kim tuyến (A

roxburghii (Wall.) Lindl) được biết đến chủ yếu với công dụng làm thuốc (Sách đỏ

Việt Nam, 2007) [1] Các loài lan kim tuyến sinh sống trên các triền núi đá vôi, dọc

theo khe suối, dưới các tán cây to trong rừng ẩm ở độ cao 500 - 1600 m Cây ưa ẩm

và bóng râm, thích hợp với đất nhiều mùn, tơi xốp và thoáng khí [23] Trên thế

giới, lan kim tuyến khoảng 30 - 40 loài, phân bố ở Trung Quốc (vùng Vân Nam,

Quảng Đông), Đài Loan, Ấn Độ, Lào, Thái Lan, Campuchia, Indonesia, Nepal,

Butan, Myama, Malaysia) [1] Nhìn chung, chúng phân bố rộng khắp các vùng

nhiệt đới từ Ấn Độ thông qua dãy Hymalaya tới các dãy núi ở Đông Nam Á, Nhật

Bản, In-đô-nê-xi-a và một số đảo ở Thái Bình Dương [33, 45] Ở Việt Nam, lan

kim tuyến được xác định khoảng 12 loài, nó phân bố khá rộng ở các vùng miền núi

như: Lào Cai (Sa Pa: Phăng Xi păng, Văn Bàn: Liêm Phá), Hà Tĩnh (Hương Sơn:

Rào Àn), Quảng Trị, Kom Tum (Đắk Glie: núi Ngọc Linh, Sa Thầy: núi Chư Mom

Ray), Đắk Lắk (Knông Bông: núi Chư Yang Sinh), Lâm Đồng (Lạc Dương, núi Bì

Đúp) [1, 23]

1.1.2 Đặc điểm hình thái cây lan kim tuyến

Cây lan kim tuyến hay còn gọi là cây kim cương, lan gấm, mộc sơn thạch

tùng, là cây thân thảo, mọc ở đất, có thân rễ mọc dài, thân trên đất mọng nước,

mang các lá mọc xòe sát đất Thân rễ nằm ngang sát mặt đất, đôi khi hơi nghiêng,

bò dài Thân rễ dài từ 5 - 12 cm, đường kính từ 3 - 4 mm, có khoảng 3 - 7 lóng

(chiều dài của lóng từ 1 - 3 cm); thường có màu xanh trắng, đôi khi có màu nâu

đỏ, thường nhẵn, không phủ lông [23] Rễ được mọc ra từ các mấu (nơi mắt lá)

trên thân rễ Đôi khi rễ cũng được hình thành từ thân khí sinh Rễ thường đâm

thẳng xuống đất Thông thường mỗi mấu chỉ có một rễ, đôi khi có vài rễ.mấu Số

lượng và kích thước rễ cũng thay đổi tuỳ theo cá thể Số rễ trên một cây thường từ

3 - 10 Chiều dài của rễ thay đổi từ 0,5 - 8 cm, rễ dài nhất trung bình là 6,07 cm

và ngắn nhất trung bình là 1,22 cm, chiều dài trung bình của các rễ trên một cây là 3,82 cm [23]

Thân khí sinh thường mọc thẳng đứng trên mặt đất, ít khi mọc nghiêng Chiều dài thân khí sinh từ 4 - 8cm Đường kính thân khí sinh từ 3 - 5 mm Thân khí sinh mang nhiều lóng, các lóng có chiều dài khác nhau Số lóng trên thân khí sinh thay đổi từ 2 - 4 lóng Chiều dài mỗi lóng từ 1 - 4 cm Thân khí sinh thường mọng nước, nhẵn, không có lông, thường có màu xanh trắng, đôi khi có màu hồng nhạt [23]

Lá mọc cách xoắn quanh thân, xoè trên mặt đất Lá hình trứng, gần tròn ở gốc, đầu lá hơi nhọn và có mũi ngắn, thường dài từ 3 - 5cm và rộng từ 2 - 4cm Lá

có màu nâu đỏ ở mặt trên và phủ lông mịn như nhung Hệ gân lá mạng lưới lông chim, thường có 5 gân gốc Các gân này thường có màu hồng ở mặt trên và nổi rất

rõ Đôi khi gân ở giữa có màu vàng nhạt Mặt dưới lá có màu nâu đỏ nhạt, nhẵn với 5 gân gốc nổi rõ Các gân bên ở phía rìa lá nổi rõ, gân ở giữa lá ở mặt dưới không rõ

Cuống lá dài 0,6 - 1,2 cm, thường nhẵn và có màu trắng xanh, đôi khi hơi đỏ tía ở bẹ lá Bẹ lá nổi rõ và nhẵn Số lá trên một cây từ 2 - 6 lá, thông thường có 4 lá Kích thước của lá trên một cây khác nhau rõ rệt [23]

Cụm hoa dài 10 - 20 cm ở ngọn thân, mang 4 - 10 hoa mọc thưa Lá bắc hình trứng, hoa thường màu trắng, dài 2,5 - 3 cm, các mảnh bao hoa dài khoảng 6mm, môi dài 1,5 cm, ở mỗi bên gốc mang 6 - 8 dải hẹp, chóp phiến rộng, chẻ hai sâu, hốc chứa mật dài 7 mm, bầu dài 1,3 cm màu lục có nhiều lông mềm Cây ra hoa một lần vào tháng 10 - 12 Mùa quả chín từ tháng 12 tới tháng 3 năm sau [1; 23]

1.1.3 Điều kiện sinh thái

Lan kim tuyến thường mọc rải rác hoặc các đám nhỏ lẫn trong lớp thảm mục hoặc ở hốc đá, dưới tán rừng kín thường xanh ẩm Cây sinh trưởng mạnh trong mùa mưa ẩm, chịu được thời tiết có sương mù dài ngày Phân bố ở những nơi có khí hậu nhiệt đới ẩm Lượng mưa trung bình năm là 1,826 mm Độ ẩm không khí trung bình 85% Nhiệt độ trung bình năm từ dưới 20˚C - 23˚C

1.1.4 Giá trị kinh tế và dược liệu của lan kim tuyến

1.1.4.1 Giá trị dược liệu

Lan kim tuyến không chỉ đơn thuần là loài hoa đẹp làm cảnh mà người ta

còn sử dụng lan kim tuyến để chế tạo các loại thảo dược, làm thuốc chữa bệnh có giá trị cao

Trước đây, loài lan kim tuyến là một trong những dược thảo quý, được sử dụng để bổ máu, dưỡng âm, chữa trị nóng phổi và nóng gan (Tạ A Mộc và Trần Kiến Đào, 1958) Hiện nay, lan kim tuyến được xác định có chứa nhiều loại dược chất giá trị cao như acid 4-hydroxycinnamic, β-sitosterol, β-D-glucopyranoside, 3-glucosides butanoic acid, kinsenoside Chúng được sử dụng để điều trị huyết áp, kháng viêm, xơ vữa động mạch, tiểu đường; bảo vệ gan rối, lá lách, tim, phối, thận; chống khối u, ung thư và kháng virus; ngoài chúng còn có tác dụng điều trị hen phế quản, chống loãng xương, chống mệt mỏi [36,33, 35, 37, 50, 38, 34, 49] Lan kim tuyến còn chứa nhiều nguyên tố vi lượng như Fe, Co, Cu, Mn, Zn, Cr đóng vai trò quan trọng trong nâng cao hiệu quả chống lão hóa; các polysaccharide nâng cao khả năng miễn dịch ở người [37] Lan kim tuyến là loài cây thuốc rất đặc biệt có tác dụng tăng cường sức khỏe, lưu thông khí huyết, có tính kháng khuẩn, chữa các bệnh viêm khí quản, viêm gan mãn tính, chữa suy nhược thần kinh Loài lan này được dùng để chữa bệnh trị lao phổi, phong thấp, đau nhức khớp xương, viêm dạ dày mãn tính [4]

Theo các tài liệu nghiên cứu của Trung Quốc công bố gần đây, sử dụng các

kỹ thuật quang phổ đã xác định được 8 hợp chất hóa học Các hợp chất này đều có hoạt tính sinh học mạnh, có khả năng làm giảm các gốc tự do trong cơ thể nên có khả năng phòng bệnh rất tốt Đặc biệt có hai acid hữu cơ được phân lập là olenolic acid và ursolic acid có khả năng chống ung thư, giảm cholesterol máu, chống tăng huyết áp, kháng khuẩn (Tạp chí Sinh học thực vật tổng hợp Trung Quốc tập 48 số 3 tháng 3 (2006), trang 359-363)

Theo Zeng và cs (2020), xác định polysaccharide là một thành phần quan trọng của lan kim tuyến, có tác dụng bảo vệ gan và góp phần điều trị trực tiếp Mười một chất chuyển hóa phosphocholine, phenylalanin, hippuric acid, α-ketoisovaleric acid, metyrosine, leucinic acid, ketoleucine, Cer (d18: 1/19: 0), α-kamlolenic acid và 4-formyl indole được tìm thấy ở các mẫu huyết thanh Tám chất chuyển hóa: valine, phosphohydroxypyruvic acid, phosphocholine, ornithine, indole, xanthine, uridine và glucose 6-phosphate được tìm thấy trong các mẫu mô gan Các chất chuyển hóa nội sinh có tác dụng bảo vệ gan của polysaccharide và tham gia vào chuyển hóa acid amin, chuyển hóa lipid, hỗ trợ vi khuẩn tiêu hóa, chuyển hóa năng lượng và methyl hóa [54]

Theo Li và cs (2016), lan kim tuyến được sử dụng để điều trị bệnh tiểu đường trong một thời gian dài giúp chống tăng lipid máu, chống tăng đường huyết (Du và cs, 2001), tác dụng kích thích miễn dịch (Tseng và cs, 2006) Polysaccharose của lan kim tuyến thúc đẩy sự chuyển hóa glucose và lipid và giảm stress oxy hóa ở chuột mắc bệnh tiểu đường (Zhang và cs, 2015) Ngoài ra polysaccharose có tác dụng cải thiện rối loạn chức năng thận trong điều kiện giàu chất béo và bệnh tiểu đường do Streptozotocin [42]

Trung y sư Thái Cát Hùng, Chủ tịch Hội đồng quản trị của Hội nghiên cứu cây thuốc thực vật thành phố Gia Nghĩa cho rằng, lan kim tuyến là một vị thuốc hết sức quý giá trong tiệm thuốc bắc Đài Loan, là cây thuốc mang tính mát và có vị ngọt, thanh nhiệt, thanh huyết, giải trừ u uất, tiêu đờm, giải độc, hạ huyết áp, trợ tim, lợi tiểu, trị bệnh đái tháo đường, chữa viêm gan, trị mụn dùng cây tươi sắc uống Nghiên cứu của Đại học Y Tapei (Đài Loan) chứng minh dịch chiết từ lan kim tuyến có khả năng làm ngưng sự phát triển của tế bào ung thư Chính vì lan kim tuyến có nhiều công dụng chữa các loại bệnh khác nhau như vậy nên trở thành thảo dược quý hiếm cần được bảo tồn

1.1.4.2 Giá trị kinh tế

Nhờ quý hiếm, có tính dược liệu cao và làm cây cảnh nên giá cây lan kim tuyến tươi được bán trên thị trường Thế giới từ 200 - 300 USD/kg (thân, rễ, lá, hoa), cây khô có giá từ 3.200 USD/kg, nếu thu hái tự nhiên giá cao gấp 3 lần hoặc nhiều hơn nữa [35, 50, 49] Tại Trung Quốc, Đài Loan, Nhật Bản đã trồng và xuất khẩu lan kim tuyến mang lại nguồn thu lớn, tiềm năng sản xuất và xuất khẩu cây lan này rất lớn nếu được đầu tư đúng mức Ở Việt Nam, lan kim tuyến cũng được biết đến những năm gần đây là cây có giá trị kinh tế cao với khoảng 2 - 2,5 triệu đồng/kg tươi, 40 - 50 triệu đồng/kg khô, nhưng chủ yếu khai thác trong rừng tự nhiên Việc tổ chức trồng sản xuất lan kim tuyến cũng đã thành công ở một số nơi như Cao Bằng, Lạng Sơn, Hà Giang, Thanh Hóa, Quảng Trị, Gia Lai, Komtum… nhưng chỉ dừng lại ở mô hình, trồng sản xuất nhỏ lẻ, trên quy mô hẹp do nguồn cây giống lan kim tuyến cung cấp chưa có số lượng lớn, liên tục với chất lượng tốt và

ổn định

1.2 Khái quát về nuôi cấy mô thực vật trong nhân giống in vitro

1.2.1 Các giai đoạn trong quy trình nhân giống in vitro ở thực vật

Nhìn chung, khi tiến hành nhân giống một loài thực vật nào đó trong điều

kiện in vitro, cần phải trải qua 5 giai đoạn cơ bản sau

+ Giai đoạn 1: Chuẩn bị cây làm vật liệu gốc

Trong giai đoạn này, việc chọn cây mẹ để lấy làm mẫu nuôi cấy thường là cây khỏe, có giá trị kinh tế cao Chọn cơ quan để lấy mẫu thường là chồi non, đoạn thân có chồi ngủ, hoa non, lá non…Mô chọn để nuôi cấy thường là các mô có khả năng tái sinh cao, sạch bệnh, giữ được các đặc điểm sinh học quý của cây mẹ và ổn định Tùy điều kiện giai đoạn này có thể kéo dài 2 – 6 tháng

+ Giai đoạn 2: Thiết lập hệ thống nuôi cấy vô trùng, tạo nguyên liệu

khởi đầu

Khử trùng bề mặt mẫu vật và chuẩn bị môi trường nuôi cấy Cấy mẫu vô trùng vào môi trường nhân tạo trong ống nghiệm hoặc bình nuôi Giai đoạn nuôi

cấy này gọi là cấy gây mẫu in vitro Các mẫu nuôi nếu không bị nhiễm khuẩn,

nấm hoặc virus sẽ được đặt trong phòng nuôi với điều kiện nhiệt độ, ánh sáng phù hợp Sau một thời gian nhất định, từ mẫu nuôi cấy ban đầu xuất hiện các cụm tế bào hoặc cơ quan (chồi, cụm chồi, rễ) hoặc phôi vô tính có đặc tính gần như phôi hữu tính Trong giai đoạn này, việc đưa mẫu vật từ bên ngoài và nuôi cấy vô trùng phải đảm bảo các yêu cầu sau: Tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, tốc độ sinh trưởng nhanh

Kết quả bước cấy này phụ thuộc rất nhiều vào cách lấy mẫu Quan trọng nhất vẫn là đỉnh sinh trưởng, chồi nách, sau đó là đoạn hoa tự, hoa, đoạn thân, mảnh lá, rễ… Chọn đúng phương pháp khử trùng sẽ đưa lại tỷ lệ sống cao và môi trường dinh dưỡng thích hợp sẽ đạt được tốc độ sinh trưởng nhanh Giai đoạn này thường yêu cầu khoảng 2 - 12 tháng hoặc ít nhất 4 lần cấy chuyền

+ Giai đoạn 3: Nhân nhanh chồi in vitro

Thành phần và điều kiện môi trường phải tối ưu hóa nhằm mục đích nhân nhanh Quy trình cấy chuyền để nhân nhanh chồi khoảng 1 - 2 tháng tùy loại cây

Hệ số nhân nhanh là 2 - 8 lần/1 lần cấy chuyền Nhìn chung giai đoạn 3 thường yêu cầu 10 - 36 tháng và cũng không nên kéo dài quá lâu Những khả năng tạo chồi đó là: phát triển chồi nách, tạo phôi vô sinh, tạo đỉnh sinh trưởng mới

Trong giai đoạn này cần nghiên cứu các tác nhân kích thích phân hóa cơ quan, đặc biệt là chồi như: Bổ sung tổ hợp phytohormone mới (tăng cytokinin giảm auxin) Tăng tỷ lệ auxin/cytokinin sẽ kích thích mô nuôi cấy tạo rễ và ngược lại sẽ kích thích phát sinh chồi; tăng cường thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày, tối thiểu

1000 lux Trong thực tế nghiên cứu, người ta nhận thấy khó tách biệt ảnh hưởng của chu kỳ chiếu sáng khỏi ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng Ánh sáng tím là thành phần quan trọng kích thích phân hóa mạnh Ánh sáng đỏ có ảnh hưởng giống cytokinon, nó tạo nên sự tích luỹ cytokinin trong mô của một số loài, lượng xytokinin này đã góp phần kích thích quá trình phát sinh cơ quan và tạo chồi từ mô

nuôi cấy invitro Đảm bảo chế độ nhiệt độ trong phòng khoảng 20 - 30o

C

Mục đích quan trọng nhất của giai đoạn này là xác định được phương thức nhân nhanh nhất bằng môi trường dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy tối thích

+ Giai đoạn 4: Tạo rễ từ chồi in vitro, hình thành cây con

Các chồi hình thành trong quá trình nuôi cấy có thể phát sinh rễ tự nhiên, nhưng thông thường các chồi này cần phải cấy chuyền sang một môi trường khác

để kích thích tạo rễ Giai đoạn 4 thông thường cần 2 - 8 tuần

+ Giai đoạn 5: Làm thích nghi cây in vitro và chuyển cây in vitro ra đất

trồng (nhà lưới, nhà kính)

Đây là giai đoạn đầu tiên, trong đó cây được chuyển từ điều kiện vô trùng của phòng thí nghiệm ra ngoài tự nhiên Đối với một số loài có thể chuyển chồi chưa có rễ ra đất, nhưng đa số chỉ sau khi chồi đã ra rễ và tạo cây hoàn chỉnh mới được chuyển ra vườn ươm Quá trình thích nghi với điều kiện bên ngoài của cây cần được chăm sóc đặc biệt Vì cây chuyển từ môi trường bão hòa hơi nước sang vườn ươm với những điều kiện khó khăn hơn, nên vườn ươm cần phải đáp ứng các yêu cầu sau: cây được che phủ bằng nilon, tưới phun sương đảm bảo cung cấp độ

ẩm và làm mát; các cơ chất trồng cây có thể là đất mùn hoặc các hỗn hợp nhân tạo không chứa đất, mùn cưa và bọt biển Giai đoạn 5 thường đòi hỏi 4 - 16 tuần

Thời gian tối thiểu cho sự thích nghi là 2 - 3 tuần, trong thời gian này cây phải được chăm sóc và bảo vệ trước những bất lợi sau: Mất nước nhanh làm cho cây bị héo khô, nhiễm vi khuẩn và nấm gây nên hiện tượng thối nhũn, cháy lá do nắng [25]

1.2.2 Các yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến nhân giống vô tính in vitro ở thực vật

1.2.2.1 Môi trường nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy là điều kiện cần thiết, là yếu tố quyết định cho sự phân hóa tế bào và cơ quan nuôi cấy Môi trường dinh dưỡng có đầy đủ các chất dinh dưỡng, các chất cần thiết cho sự phân chia, phân hóa tế bào cũng như sự sinh trưởng bình thường của cây

Thành phần hóa học của môi trường đóng vai trò quyết định đến sự thành công hay thất bại của nuôi cấy tế bào và mô thực vật Mỗi một vật liệu khác nhau đòi hỏi khác nhau về thành phần môi trường, khi bắt đầu nghiên cứu một số loài mới hoặc giống mới cần phải chọn lựa cho đối tượng nghiên cứu một loại môi trường cơ bản phù hợp Chất dinh dưỡng được cung cấp cho tế bào thực vật trong

nuôi cấy in vitro lấy từ môi trường nuôi cấy Thành phần cấu tạo nên môi trường

nuôi cấy được chia thành 4 nhóm: nước cất (95%), môi trường cơ bản bao gồm nguồn cacbon và chất khoáng, chất điều hoà sinh trưởng và các chất khác như agar, agarose Vì vậy, vấn đề việc lựa chọn môi trường thích hợp cho sinh trưởng, phát triển tối ưu cho từng giai đoạn của hệ mô trong nuôi cấy mô rất quan trọng Sự sinh trưởng và phân chia của tế bào thực vật bị tác động mạnh mẽ bởi sự điều chỉnh của nguồn carbon, photpho, nitơ và các chất ĐHST (Eibl và cs, 2009)

Môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) được sử dụng phổ biến nhất

trong nuôi cấy in vitro Đây là môi trường giàu dinh dưỡng, gồm các khoáng đa

lượng, vi lượng cần thiết cho sự phát triển của cây Các nguyên tố đa lượng: bao gồm sáu nguyên tố: nitơ (N), phốt pho (P), kali (K), canxi (Ca), magie (Mg) và lưu huỳnh (S), tồn tại dưới dạng muối khoáng, là thành phần của các môi trường dinh dưỡng khác nhau, được sử dụng ở nồng độ trên 30 ppm (tỷ lệ phần nghìn) Môi trường nuôi cấy phải chứa ít nhất 25 mmol/l nitrate và kali Các nguyên tố chính khác, như: Ca, P, S và Mg, nồng độ thường dùng trong khoảng 1 - 3 mmol/l [7] Nhóm nguyên tố vi lượng: Fe, Cu, Bo, Zn, Mn, Co, I…là các nguyên tố rất quan trọng cho sự phát triển của mô và tế bào do chúng đóng vai trò quan trọng trong các hoạt động của enzym Chúng được dùng ở nồng độ thấp hơn nhiều so với các nguyên tố đa lượng để đảm bảo sinh trưởng và phát triển bình thường của cây Nói chung, nồng độ thường được sử dụng đối với Cu và Co là 0,1 µmol/L, Fe và Mo là

1 µmol/L, I là 5 µmol/L, Zn là 5 - 30 µmol/L, Mn là 20 - 90 µmol/L được bổ sung

vào môi trường nuôi cấy tùy thuộc vào yêu cầu của từng thí nghiệm (Lê Văn Hoàng, 2008) [7]

1.2.2.2 Nguồn carbon

Các tế bào in vitro chưa có khả năng quang hợp để tổng hợp nên chất hữu cơ

do vậy người ta phải đưa vào môi trường một lượng hợp chất cacbon nhất định để cung cấp năng lượng cho tế bào và mô [7] Thông thường, saccharose (2 –5%) được sử dụng phổ biến nhất trong nuôi cấy mô thực vật Saccharose sẽ được enzyme ngoại bào thuỷ phần tạo ra các đường đơn là glucose và fructose trong quá trình nuôi cấy (Eibl và cs, 2009)

1.2.2.3 Các chất ĐHST

Bên cạnh các chất cung cấp dinh dưỡng cho mô nuôi cấy, việc bổ sung một hoặc nhiều chất ĐHST như auxin, cytokinin và giberellin là rất cần thiết để kích thích sự sinh trưởng, phát triển và phân hoá cơ quan, cung cấp sức sống tốt cho mô

và các tổ chức Tùy theo từng loài thực vật, loại mô mà yêu cầu hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng khác nhau Auxin là nhóm chất kích thích ra rễ được sử dụng phổ biến nhất hiện nay Các hormon là những chất có tác dụng ĐHST ở thực vật

Sự phối hợp hay lựa chọn nồng độ các chất kích thích sinh trưởng sẽ là yếu tố quyết định đến sự thành công của quá trình nuôi cấy

Auxin có vai trò kích thích sự tăng trưởng và kéo dài tế bào Auxin có khả năng khởi đầu sự phân chia tế bào… Đặc điểm chung của các auxin là tính chất phân chia tế bào Các hormone thuộc nhóm này có các hoạt tính như tăng trưởng chiều dài thân, lóng (gióng), tính hướng (sáng, đất), tính ưu thế ngọn, tạo rễ và phân hóa mạch dẫn Cytokinin liên quan tới sự phân chia tế bào, phân hóa chồi…Trong môi trường nuôi cấy mô, cytokinin cần cho sự phân chia tế bào và phân hóa chồi từ mô sẹo hoặc từ các cơ quan, gây tạo phôi vô tính, tăng cường phát sinh chồi phụ Gibberellin đóng vai trò quan trọng đối với nhiều quá trình sinh lý như: sinh lý ngủ nghỉ của hạt và chồi, sinh lý phát triển của hoa, làm tăng sinh trưởng chiều dài của thực vật ABA thuộc nhóm các chất ức chế sinh trưởng tự nhiên gây ra sự ngủ nghỉ của chồi, làm chậm sự nảy mầm của hạt và sự ra hoa, đóng khí khổng ABA còn có tác dụng tăng cường khả năng chống chịu của tế bào thực vật đối với điều kiện ngoại cảnh bất lợi

1.2.2.4 Các yếu tố trong giai đoạn vườn ươm cây in vitro

Đây là giai đoạn cuối cùng của quá trình sản xuất một cây giống Mục đích

của giai đoạn này nhằm đưa cây giống in vitro trong phòng nuôi cấy ra ngoài tự

nhiên; huấn luyện cây thích nghi với các điều kiện nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng tự nhiên và chuyển từ chế độ dị dưỡng sang chế độ tự dưỡng Mỗi loài cây có đặc điểm khác nhau, do đó để đạt tỷ lệ cây sống cao cần nghiên cứu để tìm giá thể phù hợp cho cây Giá thể trồng cây có thể là cát, đất mùn hoặc các hỗn hợp nhân tạo

không chứa đất, mùn cưa và bọt biển…Cây nuôi cấy in vitro có đặc điểm là các khí

khổng luôn mở Do đó, khi chuyển cây ra vườn ươm, cây thường bị mất nước rất nhanh, do đó cần phải che phủ cẩn thận và cung cấp đủ độ ẩm cho cây Cần cung cấp lượng nước vừa đủ, lượng nước quá ít hoặc quá nhiều đều có ảnh hưởng không tốt cho cây Ngoài ra, ở giai đoạn đầu đưa ra ngoài vườn ươm, bộ rễ của cây nuôi

cấy in vitro thường chưa có khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng từ giá thể Để

tăng chất lượng của cây giống cần có

Nhiệt độ thích hợp cũng tùy thuộc vào từng loài, tùy thuộc vào địa điểm phát sinh của chúng Nói chung, nhiệt độ lý tưởng cho lan kim tuyến 13° - 16°C vào ban đêm, 24° - 30°C vào ban ngày Cây sẽ chịu được nhiệt độ 10°C và lên tới 38°C trong một thời gian ngắn, ở nhiệt độ cao hơn cần tạo sự thông gió tốt trong vườn

Độ ẩm không khí trong vườn, độ ẩm của cơ chất nuôi cây đều phải thích hợp, cây mới sinh trưởng phát triển tốt Lan kim tuyến yêu cầu độ ẩm cao, độ ẩm không khí thích hợp cho lan kim tuyến 70 - 80% Nếu độ ẩm thấp cây sẽ sinh trưởng kém, độ

ẩm quá cao cây dễ bị nhiễm bệnh

Dùng bất cứ nguồn nước tưới nào cho lan kim tuyến cũng được, miễn là nước sạch, không mặn, không vôi, không có clo và có độ pH 5,5 - 7,0 Đối với những cây lan con trồng trong chậu yêu cầu tưới phun sương nhẹ Lan kim tuyến cần độ ẩm cao, nhưng cũng cần sự thông thoáng tạo ra không gian thích hợp làm cho cây sinh trưởng phát triển Lan kim tuyến không yêu cầu lượng phân bón nhiều Vào mùa xuân và mùa thu bón phân 10 - 15 ngày/lần Vào mùa đông và mùa mưa chỉ bón phân 30 ngày/lần Bón với lượng phân bón có tỷ lệ N:P:K (15-15-15) với ¼ thìa cà phê/4,5 lít nước Phân bón được sử dụng bằng cách phun phân hòa tan trong nước, phun bằng bình có tia mịn, phun đều toàn cây lá và rễ Tưới cây sáng sớm và chiều muộn Trong thí nghiệm nghiên cứu nhân giống và nuôi trồng cây lan

(A lylei) của Phan Xuân Huyên cho thấy, sử dụng phân bón lá hữu cơ sinh học

JIA6 2 ml/L là tốt nhất cho sinh trưởng của cây [21]

1.3 Tình hình nghiên cứu về cây lan kim tuyến

1.3.1 Nghiên cứu ở Thế giới

Chi lan kim tuyến đã nghiên cứu chủ yếu ở Trung Quốc một cách toàn diện

cả về đặc điểm hình thái, kỹ thuật nhân giống, khả năng trồng, thành phần hóa học

Sherif và cs (2012) đã nghiên cứu thành công với số chồi tốt nhất của loài A elatus Lindley quan sát ở nồng độ TDZ 3,0 mg/L và chiều dài chồi đạt cao nhất ở nồng độ KIN 3,5mg/L (với mắt đốt thân), ở 0,01 mg/L đối với chồi đỉnh A elatus

Lindley ra rễ 100% ở môi trường có bổ sung than hoạt tính 0,3g/L [48] Năm 2015,

Zhang và cs đã nghiên cứu về nhân giống in vitro A roxburghii quy mô lớn để ứng

dụng thương mại sản xuất cây dược liệu và cây cảnh Môi trường thích hợp tối ưu nhân chồi là MS + 1,5 mg/L BA với tỷ lệ hình thành chồi đạt 91,67% Chồi được đưa vào môi trường tạo rễ có chứa MS + 0,6 mg/L NAA + 0,3 mg/L IBA+ 100 mg/L chuối nghiền cho tỷ lệ thích ứng đạt 93,33% Các cây con đã ra rễ được chuyển vào giá thể cát và than bùn (1:2) và bề mặt phủ rêu cho tỷ lệ sống sót cao nhất (90,2%) [55]

Luo và cs (2018) đã nghiên cứu thành công tăng hàm lượng 2 hợp chất

kinsenoside và polysaccharide trong loài lan kim tuyến A roxburghii Khi thân rễ

được xử lý với 500 M axit salicylic sau 12 ngày nuôi cấy huyền phù hàm lượng kinsenoside và polysaccharide đạt cao nhất Đối với metyl jasmonate hàm lượng

kinsenoside và polysaccharide đạt tối đa khi thân rễ được xử lý với hàm lượng đạt

550 M sau 14 -16 ngày nuôi cấy huyền phù [41]

1.3.2 Nghiên cứu ở Việt Nam

Những năm gần đây, nước ta đã có một số đề tài nghiên cứu về đặc điểm

hình thái, phân bố và kỹ thuật nhân giống in vitro loài lan kim tuyến Năm 2004, Nguyễn Văn Kiệt cũng đưa ra quy trình nhân giống in vitro thành công cho loài lan kim tuyến A formosanus với vật liệu ban đầu là từ chồi đỉnh tại đại học

Chungbuk, Hàn Quốc Môi trường tạo vật liệu khởi đầu là H3 (Hyponex: 4,5P - 19K 1g/L + 20N - 20P - 20K 1g/L) + 2 g/L peptone Môi trường nhân nhanh là: H3 + 1 mg/L BAP (hoặc 1 - 2 mg/L TDZ) + 1% than hoạt tính [44] Phùng Văn Phê và cs (2010) đã đạt những kết quả bước đầu trong nhân nhanh

6,5N-chồi in vitro loài lan kim tuyến - A roxburghii Kết quả cho thấy thể 6,5N-chồi sau 8

tuần tuổi từ phôi hạt chín và chồi từ thể chồi cao từ 2 - 3cm là phù hợp nhất để nhân nhanh trong môi trường thích hợp Knud bổ sung BAP 0,5mg/L + Kinetin 0,3 mg/L + NAA 0,3 mg/L +ND 100 ml/L+ dịch chiết khoai tây 100 g/L+ sucrose

20 g/L + agar 7 g/L+AC 0,5 g/L [22]

Nguyễn Quang Thạch và cs (2012), đã nghiên cứu thành công quy trình nhân

nhanh in vitro loài lan kim tuyến A setaceus Môi trường thích hợp nhất để nhân

nhanh thể chồi và mắt đốt ngang thân là Knud + BAP 0,5mg/L + kinetin 0,3 mg/L + NAA 0,3 mg/L + sucrose 20 g/L + than hoạt tính 0,5 g/L+ agar 7 g/L cho hệ số nhân chồi là 6,55 chồi/mẫu Các chồi có chiều cao từ 3 - 4 cm được sử dụng để ra

rễ in vitro Tỷ lệ ra rễ là 100% và số rễ/chồi (4,21 rễ/chồi) đạt cao nhất trên môi

trường có bổ sung 1mg/LNAA [20] Phan Ngọc Khoa (2013) đã nghiên cứu ảnh

hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến nhân giống in vitro lan kim tuyến cho

thấy môi trường MS bổ sung 1,0 mg/L Kinetin thích hợp cho đỉnh sinh trưởng và đoạn thân mang chồi nách tái sinh chồi Cụm protocrom sau khi hình thành từ hạt chuyển vào môi trường MS bổ sung 1,0 mg/L cho 5,62 chồi/cụm Môi trường ra rễ tối ưu nhất là môi trường MS + 0,3 mg/L NAA đạt 3,1 rễ/chồi Cây hoàn chỉnh sau khi huấn luyện được trồng trên giá thể với tỷ lệ sống sót 70% [26]

Nghiên cứu ảnh hưởng của Kinetin và sự kết hợp giữa Kinetin và 2,4 - D đến

quá trình hình thành protocom-like bodies ở cây lan kim tuyến A setaceus, tác giả

Trần Thị Hồng Thúy và cs (2014) Trong nghiên cứu này, chồi của cây lan kim tuyến được sử dụng làm nguyên liệu ban đầu để cảm ứng hình thành protocorn

trong môi trường Knudson lỏng chứa 100 ml/L nước dừa và bổ sung Kinetin hoặc

sự kết hợp giữa Kinetin với 2,4-D Kết quả cho thấy PLBs được hình thành tốt nhất trên môi trường Knudson lỏng chứa 1% saccarozơ, 100 ml/L nước dừa và 0,5 mg/L Kinetin, tỉ lệ hình thành protocorn đạt 86,25%, protocorn sinh trưởng tốt Trong khi

đó, sự kết hợp giữa 2,4-D ở nồng độ 0,5 mg/L với một số nồng độ của kinetin (0,5; 1,0; 1,5 mg/L) không có tác dụng lớn trong việc cảm ứng hình thành PLBs ở cây lan kim tuyến [24]

Đỗ Mạnh Cường và cs (2015) đã nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố

lên quá trình sinh trưởng và phát triển của cây lan Gấm A Setaceus nuôi cấy in vitro Sau 2 tháng kết quả cho thấy trên môi trường có bổ sung 1,0mg/L BA kết

hợp 1,0mg/L NAA các chồi có sự sinh trưởng và phát triển tốt (chiều cao: 9,03cm;

số đốt: 9,33 đốt/mẫu; khối lượng tươi: 2,63g và khối lượng khô; 0,2187g) Hệ rễ phát triển mạnh (số rễ; 7,33 rễ/mẫu; chiều dài rễ; 1,36cm) Tuy nhiên, mẫu bị nâu hóa do lượng phenol trong mẫu tiết ra nhiều Để tối ưu hóa các chồi trên điều kiện nuôi cấy lỏng có bông gòn sinh trưởng tốt, to khỏe, hệ rễ phát triển mạnh và đặc biệt không có hiện tượng nâu hóa [5]

Năm 2017 Nguyễn Thị Kim Ngân đã nghiên cứu về “Nghiên cứu nhân

nhanh chồi lan kim tuyến (Anoectochilus Setaceus) in vitro phục vụ công tác

chuyển gen tạo rễ tóc” đã xác định được các yếu tố ảnh hưởng lên sự tạo chồi và nhân nhanh chồi lan kim tuyến Môi trường thích hợp cho cây tái sinh chồi là MS + agar (8g/L) + sucrose (30g/L) + NAA (0,5mg/L) + BA (1,0mg/L) là cho kết quả tốt nhất, với có tỷ lệ tái sinh chồi 98,79% Chồi tái sinh được chuyển sang môi trường nhân nhanh chồi có chứa MS + agar (8g/L) + sucrose (30g/L) + NAA (0,1mg/L) +

BA (1,0 mg/L) cho số chồi, số lá nhiều, chồi phát triển đồng đều và khỏe mạnh [13] Võ Thị Thanh Tuyền và cs (2018) đã nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể và phân bón đến sinh trưởng của lan kim tuyến hậu cấy mô tại thành phố Hồ Chí

Minh Kết quả cho thấy trồng cây lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus) từ 0 - 3

tháng tuổi trên hỗn hợp giá thể dớn trắng và dớn tổ quạ (tỷ lệ 1:1) kết hợp với phun

tổ hợp phân bón NPK 30 - 10 - 10 (0,5g/L) luân phiên với phân bón Bio trùn quế

01 (0,5ml/L) và Rootplex (0,5ml/L) thúc đẩy quá trình sinh trưởng của cây và cho

tỷ lệ cây sống đạt 96,0%, chiều cao cây đạt 9,3cm, có 7,6 lá/cây với 3,9 rễ/cây [27]

Nguyễn Thị Hương Xiêm và cs (2019) đã xác định được giá thể trồng thích hợp đến sinh trưởng của cây lan kim tuyến Giá thể trồng thích hợp cho cây lan kim tuyến là vỏ thông + xơ dừa + đất + phân chuồng hoai mục với tỷ lệ 7:1:1:1 với tỷ lệ

cây sống cao (94,00%), sau 150 ngày trồng, cây có chiều cao trung bình là 10,41

cm, có 7,73 lá và ra mới được trung bình 2,52 nhánh và khối lượng cây đạt 25,2 g/10 cây [11] Nguyễn Phương Nam (2019), đã triển khai nghiên cứu thành công đề

tài “Nghiên cứu thành phần hóa học cây lan kim tuyến A setaceus thu hái tại

Thanh Hóa” Kết quả nghiên cứu cho thấy sơ bộ xác định được trong cao lan kim tuyến có chứa một số hợp chất cần quan tâm là Quercetin, Acid ferulic và Isorhamnetin bằng phương pháp đo phổ hấp thụ UV - Vis trên máy NanoDrop -

1000 [9] Nguyễn Thương Tuấn và Nguyễn Văn Hồng (2021) đã nghiên cứu quy

trình chiết xuất phân đoạn giàu hợp chất flavonoid từ cây lan kim tuyến A Setaceus

Cao Bằng Kết quả cho thấy hàm lượng Flavoinoid tổng số thu được từ 100 gram nguyên liệu thân lá lan kim tuyến Cao Bằng đạt 1184,98mg [14]

1.4 Giới thiệu sơ lƣợc về điều kiên tự nhiên của bán đảo Sơn Trà – Đà Nẵng

Sơn Trà là một bán đảo nằm ở phía Đông Bắc thành phố Đà Nẵng, phía Tây Bắc giáp vịnh Đà Nẵng, Đông Bắc và Đông Nam giáp biển Đông, Tây Nam giáp đất liền và Cảng Sông Hàn Về mặt hành chính, bán đảo Sơn Trà thuộc phường Thọ Quang, quận Sơn Trà, thành phố Đà Nẵng, nằm ngang theo hướng Đông Tây và nối với đất liền vùng nội thị của thành phố Đà Nẵng Toạ độ địa lý: 108012'45'' - 108020'48'' kinh độ Đông, 16005'50'' - 16009'06'' vĩ độ Bắc [19] Dãy núi Sơn Trà

có hình dáng như một con cá, dài theo hướng Đông Tây, các sườn chạy theo hướng Bắc Nam có độ dốc lớn từ 250 - 300m, sườn Đông Bắc dốc hơn sườn Tây Nam Địa hình của Khu bảo tồn thiên nhiên Sơn Trà bị chia cắt mạnh bởi hệ thống suối Đỉnh cao nhất bán đảo Sơn Trà là đỉnh Ốc cao 696m, đỉnh truyền hình cao 647m, đỉnh 3 quả cầu thuộc Trạm Rada 29 cao 621m Bán đảo có chiều dài 13 km, chỗ rộng nhất 5km, hẹp nhất 1,5km [19] Trong khu vực bán đảo Sơn Trà có 20 con suối chảy quanh năm hoặc theo mùa, những con suối thường xuyên chảy quanh năm Ở sườn Bắc Sơn Trà: có suối Hải Độ 8, Tiên Sa, Suối Lớn, Suối Sâu, Suối ông Tám, Suối Ông Lưu và suối Bãi Bắc Ở sườn Nam Sơn Trà: có suối Bãi Cồn, bãi Trệm, suối Đá Bằng, suối Bãi Xếp, Suối Heo, Suối Đá, Suối Cầu Trắng [19]

Theo đài khí tượng thủy văn Khu vực Trung Trung bộ (2012), bán đảo Sơn Trà mang đặc điểm khí hậu chung của thành phố Đà Nẵng, tuy nhiên do tính chất bán đảo nên có một số sự khác biệt Mùa hè (tháng 1- 8): nhiệt độ trung bình 28o

đảo Sơn Trà và thành phố Đà Nẵng bắt đầu từ tháng 8 đến cuối tháng 12 hoặc tháng 1 Tổng lượng mưa 3822mm/năm Các tháng có lượng mưa lớn tập trung vào tháng 10, 11 Mùa khô kéo dài từ tháng 2 đến tháng 7 Lượng mưa tại Sơn Trà nhìn chung cao hơn Đà Nẵng, tuy nhiên vào 2 tháng 9, 10 lượng mưa tại Đà Nẵng cao hơn tại Sơn Trà do đây là 2 tháng tại Sơn Trà tốc độ gió cao (13m/s - 14m/s), ảnh hưởng đến sự hình thành lượng mưa tại đây [26] Độ ẩm không khí trung bình 80 - 90%; độ ẩm cao tập trung các tháng 9, 10, 11 (85% - 87%); độ ẩm thấp nhất tập trung tháng 6, 7 (74% - 76%) Tốc độ gió cao tập trung vào tháng 9, 10 (13m/s - 14m/s); thấp tập trung váo tháng 1, 2, 3, 4, 11, 12 (4m/s - 7m/s) [19]

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, PHẠM VI VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu của đề tài: là loài lan kim tuyến A roxburghii (Wall.)

Lindl có nguồn gốc từ rừng tự nhiên của huyện Kongplong, tỉnh Kom Tum

- Nguyên liệu nghiên cứu: sử dụng chồi in vitro của cây lan kim tuyến được

cung cấp bởi phòng thí nghiệm Nuôi cấy mô và tế bào thực vật, trường Đại học Sư phạm - Đại học Đà Nẵng để làm nguyên liệu cho các thí nghiệm trong nghiên cứu sản xuất cây giống lan kim tuyến nuôi cấy mô tại bán đảo Sơn Trà - Đà Nẵng

Hình 2.1 Cây lan kim tuyến (a) Cây ngoài tự nhiên, (b) Cụm chồi lan kim

tuyến nuôi cấy in vitro

2.2 Phạm vi nghiên cứu

- Nghiên cứu nhân giống in vitro, tạo cây con lan kim tuyến tại Phòng thí

nghiệm Nuôi cấy mô và tế bào thực vật, khoa Sinh - Môi trường, Đại học Sư phạm

- Đại học Đà Nẵng

- Nghiên cứu ươm trồng sản xuất cây giống lan kim tuyến nuôi cấy mô (in vitro) tại vườn ươm ở Bán đảo Sơn Trà - Đà Nẵng

- Thời gian nghiên cứu được thực hiện thực hiện: từ 11/2021 đến 11/2022

2.3 Nội dung nghiên cứu

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường đến khả năng tạo rễ in vitro lan kim

b

a

tuyến

- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ in vitro

- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ IBA đến khả năng ra rễ in vitro

- Nghiên cứu ảnh hưởng của than hoạt tính đến khả năng ra rễ in vitro

- Nghiên cứu ảnh hưởng của khoáng MS đến khả năng ra rễ in vitro

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố trong điều kiên vườn ươm đến khả năng sống và sinh trưởng cây lan kim tuyến in vitro tại bán đảo Sơn Trà, Đà Nẵng

- Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian làm thích nghi cây in vitro trong nhà lưới đến khả năng sống sót, sinh trưởng của cây lan kim tuyến

- Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian che phủ nilon bầu ươm cây in vitro đến khả năng sống sót của cây lan kim tuyến in vitro trong vườn ươm

- Nghiên cứu ảnh hưởng của loại cơ chất ươm trồng đến khả năng sống sót, sinh trưởng của cây lan kim tuyến in vitro trong vườn ươm

- Nghiên cứu ảnh hưởng của chế độ tưới nước tưới đến khả năng sinh trưởng của cây lan kim tuyến in vitro trong vườn ươm

- Nghiên cứu ảnh hưởng độ che sáng tự nhiên đến khả năng sinh trưởng của cây lan kim tuyến in vitro trong vườn ươm

2.4 Phương pháp nghiên cứu

Hình 2.2 Sơ đồ thí nghiệm

Chồi in vitro lan kim

tuyến

Thích nghi cây in vitro trong vườn ươm

Tạo cây giống lan kim tuyến ngoài vườn

ươm

Tạo rễ từ chồi in vitro

2.4.1 Phương pháp tạo rễ từ chồi in vitro của lan kim tuyến

Các chồi in vitro nuôi cấy trên môi trường tối ưu để phát triển cụm chồi, sau

3 tháng chồi in vitro có chiều cao từ 2,5 - 3,0 cm (có 2 - 3 lá/chồi màu xanh tía hơi

đỏ nhung) được dùng làm nguyên liệu để nghiên cứu nuôi cấy tạo rễ in vitro

Các chồi in vitro được tách ra từ cụm chồi được nuôi cấy trên các môi

trường MS có bổ sung riêng lẻ các chất ĐHST với các nồng độ khác nhau: IBA (0,1; 0,25; 0,5; 0,75; 1,0 mg/L) và NAA (0,1; 0,25; 0,5; 0,75; 1,0 mg/L) để cảm

ứng tạo rễ Các chồi in vitro cũng được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung than hoạt tính với các nồng độ: 0,5; 1,0 và 1,5 g/L Nuôi cấy tạo rễ in vitro trên môi

trường MS được điều chỉnh hàm lượng khác nhau: MS, ½ MS và ¼ MS để khảo sát

khả năng ra rễ của chồi in vitro Sau 6 tuần nuôi cấy, đánh giá khả năng tạo rễ từ chồi in vitro thông qua thời gian chồi bắt đầu hình thành rễ, tỷ lệ chồi ra rễ, số

rễ/chồi, chiều dài rễ

Các môi trường nuôi cấy in vitro đều được chỉnh pH = 5,8 trước khi khử trùng

ở 121°C; 1,0 atm trong 20 phút Các thí nghiệm nuôi cấy in vitro được duy trì ở

nhiệt độ 25 ± 2°C, điều kiện chiếu sáng 3000 Lux và thời gian chiếu sáng 12h/ngày

2.4.2 Phương pháp tạo cây giống lan kim tuyến in vitro trong điều kiện vườn ươm

Việc chuyển cây từ điều kiện in vitro ra điều kiện tự nhiên bên ngoài vườn

ươm là giai đoạn rất quan trọng Trong giai đoạn này, sự thay đổi đột ngột của điều kiện sống, từ môi trường dị dưỡng ra môi trường tự dưỡng hoàn toàn đòi hỏi cây phải có quá trình thích nghi Sự thành công của giai đoạn này góp phần quan trọng cho sự thành công của phương pháp nhân giống Để phù hợp về độ ẩm trong quá trình cây thích nghi với môi trường sống ngoài tự nhiên là rất cần thiết Để cho cây lan có quá trình thích nghi tốt cần được luyện cây trước khi đưa cây ra cơ chất phù hợp

Cây lan kim tuyến in vitro sau 6 tuần nuôi cấy trên môi trường ra rễ thích

hợp nhất (cao 3 - 4cm, 2 - 3 rễ dài 1 - 1,5cm; 3 - 4 lá) được chuyển ra trồng trong vườn ươm tại Bán đảo Sơn Trà - Đà Nẵng

Các chai lọ hoặc các túi nilon có chứa các cây con in vitro được đặt trong

vườn ươm ở các khoảng thời gian khác nhau: 3, 5, 7, 10 ngày để làm thích nghi cho

cây in vitro với điều kiện tự nhiên Sau khi ươm trồng khoảng 3 tuần, đánh giá tỷ lệ cây in vitro sống sót trong các khoảng thời gian thích nghi khác nhau

Sau khi làm thích nghi, cây in vitro được lấy ra khỏi chai lọ nuôi cấy, rửa sạch agar và môi trường Để cây in vitro ráo nước, tiến hành ươm trồng cây lan kim tuyến in vitro dưới các điều kiện ươm trồng khác nhau trong vườn ươm: che phủ

nilon túi bầu ươm, cơ chất trồng, nước tưới, độ che sáng tự nhiên

- Tạo cơ chất ươm trồng: Sử dụng các loại cơ chất khác nhau như: Đất sét,

vụn xơ dừa, dớn, phân chuồng mục Các cơ chất được xử lý với chế phẩm tricoderma (ủ trong 7 ngày) để ức chế các vi sinh vật gây bệnh trước khi phối trộn theo các công thức cơ chất trồng khác nhau: Đất sét và phân chuồng mục (1:1); đất sét và vụn xơ dừa (1:1); vụn xơ dừa (100%); vụn xơ dừa và phân chuồng mục (1:1)

và vụn xơ dừa và dớn (1:1) Cây in vitro sau khi làm thích nghi, được trồng trên các

cơ chất có công thức khác nhau, che phủ nilon với thời gian thích hợp Sau 2 tháng

ươm trồng, đánh giá khả năng sống và sinh trưởng của cây con in vitro thông qua tỷ

lệ (%) cây sống; chiều cao cây

- Chế độ nước tưới: Cây in vitro sau khi làm thích nghi, được trồng trên các

cơ chất phù hợp đã khảo sát Nước tưới được sử dụng là nguồn nước suối chảy tự nhiên tại Bán đảo Sơn Trà Tưới nước theo cách tưới phun, thời gian tưới 3 phút, theo các công thức tưới khác nhau: 1 lần/ngày; 2 lần/ngày; 1 lần/2 ngày 1 lần/3 ngày Sau 2 tháng ươm trồng, đánh giá khả năng sinh trưởng của cây con in vtro thông qua chiều cao cây, số lá, chất lượng cây con

- Che sáng bằng lưới chắn sáng: Cây in vitro sau khi làm thích nghi, được

trồng trên các cơ chất phù hợp đã khảo sát với nước tưới thích hợp Sử dụng lưới

che sáng để tạo ra các độ che sáng tự nhiên khác nhau: 40, 50, 60 và 70% Cây in vitro được ươm trồng trong vườn ươm dưới các độ che sáng khác nhau Sau 2

tháng ươm trồng, đánh giá khả năng sinh trưởng của cây con thông qua: chiều cao cây, số lá, chất lượng cây con

2.4.3 Phương pháp xử lí số liệu

Mỗi thí nghiệm được bố trí lặp lại 3 lần Số liệu thực nghiệm được tính toán

và phân tích thống kê Ducan’s test (p <0,05) bằng chương trình SAS

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Ảnh hưởng của các thành phần trong môi trường nuôi cấy đến khả năng

tạo rễ in vitro của cây lan kim tuyến

Mỗi loại mẫu vật nuôi cấy in vitro khác nhau đòi hỏi sự khác nhau về thành

phần môi trường Khi bắt đầu nghiên cứu một số loài mới hoặc giống mới cần phải nghiên cứu chọn lựa một loại môi trường cơ bản phù hợp Chất dinh dưỡng được

cung cấp cho tế bào thực vật trong nuôi cấy in vitro lấy từ môi trường nuôi cấy

Thành phần tạo nên môi trường nuôi cấy được chia thành 4 nhóm: nước cất (95%), môi trường cơ bản bao gồm nguồn cacbon và chất khoáng, chất ĐHST và các chất khác như các chất hữu cơ bổ sung, than hoạt tính, agar… Vấn đề việc lựa chọn môi trường thích hợp cho sinh trưởng, phát triển tối ưu cho từng loại mô, giai đoạn nuôi cấy của mô thực vật trong nuôi cấy mô là rất quan trọng

3.1.1 Ảnh hưởng của chất ĐHST đến khả năng ra rễ của lan kim tuyến

Đây là giai đoạn cuối của quá trình nhân giống vô tính in vitro để tạo cây

hoàn chỉnh (có đầy đủ thân, lá, rễ) khỏe mạnh; có thể sống, sinh trưởng và phát triển tốt khi ra vườn ươm để sản xuất cây giống trên quy mô lớn Nếu hệ rễ kém phát triển sẽ làm cho quá trình hút nước cũng như khả năng bám đất của cây bị ảnh hưởng; ngược lại, bộ rễ phát triển mạnh sẽ làm ảnh hưởng tốt tới chất lượng của các cơ quan khác Với mục đích thiết lập một quy trình sản xuất cây giống lan kim tuyến nuôi cấy mô với chất lượng tốt tại bán đảo Sơn Trà - Đà Nẵng, trước hết chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng các chất ĐHST thuộc nhóm

auxin: NAA, IBA đến khả năng hình thành rễ của chồi in vitro

3.1.1.1 Ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ in vitro

NAA là chất ĐHST thuộc nhóm auxin, được sử dụng hầu hết trong nuôi cấy

mô và tế bào thực vật, có tác dụng tạo rễ từ chồi in vitro NAA được sử dụng khác

nhau phụ thuộc vào mục đích nuôi cấy, loại cây trồng Để cảm ứng tạo rễ, các chồi lan kim tuyến nuôi trong môi trường tạo chồi thích hợp sau 3 tháng nuôi cấy, các chồi cao 3,0 - 3,5 cm (có 4 - 5 lá) được chuyển sang nuôi cấy trên môi trường MS

có bổ sung NAA (0,1 - 1,0 mg/L) để tạo rễ Sau 6 tuần nuôi, đánh giá khả năng

hình thành rễ in vitro của chồi, kết quả được trình bày ở bảng 3.1

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ in vitro

của lan kim tuyến

Số rễ/chồi (cái)

Chiều dài rễ (cm)

Kết quả nghiên cứu cho thấy, NAA bổ sung vào môi trường nuôi cấy có ảnh

hưởng rõ rệt đến sự cảm ứng hình thành rễ của chồi in vitro lan kim tuyến, chồi bắt

đầu hình thành rễ sau 12 ngày nuôi cấy trên tất cả các môi trường được khảo sát

Các chồi in vitro nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung NAA nồng độ tăng dần từ

0,1 - 0,25 mg/L, khả năng tạo rễ không thay đổi nhiều; với số rễ đạt 0,7 - 1,1

rễ/chồi, chiều dài rễ 0,45 - 0,65 cm Trên môi trường có NAA nồng độ tăng 0,5 -

1,0 mg/L; chồi cảm ứng phát sinh rễ mạnh hơn và khả năng tạo rễ cao nhất đạt

được trên môi trường có 1,0 mg/L NAA (2,67 rễ/chồi, chiều dài rễ 1,14 cm) sau 6

tuần nuôi cấy nuôi cấy Rễ khí sinh tạo từ mắt lá, có màu trắng ngà, rất nhiều lông

hút mịn trên rễ chính (Hình 3.1)

Hình 3.1 Rễ hình thành từ chồi in vitro cây lan kim tuyến sau 6 tuần nuôi

cấy trên môi trường MS bổ sung NAA (a) 1,0 mg/L NAA; (b) 0,75 mg/L NAA;

(c) không có NAA

Phan Xuân Bình Minh và cs (2015) đã nghiên cứu nhân giống lan sứa (A lylei), kết quả cho thấy môi trường thích hợp cho giai đoạn ra rễ là MS + 10 g

đường + 8 g agar + 0,5 μM/L NAA với tỷ lệ cây ra rễ là 89,72% với số rễ tái sinh là

2,02 rễ/mẫu [20] Trên loài lan kim tuyến A roxburghii, Nguyễn Quang Thạch và

cs (2019) đã nghiên cứu cho thấy, môi trường ra rễ có bổ sung NAA, tỷ lệ ra rễ đạt 100% và số rễ/chồi thu được cao ở nồng độ 0,5 - 1 mg/L Môi trường tối ưu ra rễ của lan kim tuyến là MS + 1 mg/L NAA với số rễ/chồi đạt 4,21 rễ Trương Thị Bích Phượng và cs (2013) NAA ở nồng độ 0,3 mg/L thì tái sinh rễ đạt 100% và số

rễ tái sinh nhiều nhất là 3,10 rễ/mẫu

Các báo cáo trước đây đã cho biết là auxin tăng cường sự hình thành rễ ở thực vật (Bhojwani và Razdan, 1983) Việc phát triển của cây con bằng NAA trong

môi trường đã được báo cáo ở lan spp như Dendrobium, Cymbidium, Cattleya, Bletilla, Galeola, v.v (Arditti và Ernst, 1984) Việc sử dụng nồng độ chất ĐHST

khác nhau cho hiệu quả ra rễ khác nhau S S Sheelavantmath và cs (2000) đã

nghiên cứu thành công vi nhân giống loài lan Geodorum densiflorum (Lam.) Schltr

cho thấy môi trường MS bổ sung benzyladenine (BA) ở nồng độ 5,0 μM đã tạo ra nhiều chồi Các chồi tái sinh ra rễ trên MS hoặc với NAA ở mức 1,0 μM [47]

Kết quả nghiên cứu hoàn toàn phù hợp khi sử dụng nồng độ NAA 1,0 mg/L

là thích hợp nhất cho sự tạo rễ của chồi in vitro lan kim tuyến sau 6 tuần nuôi cấy

3.1.1.2 Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ của lan kim tuyến

Các chồi in vitro (cao 3,0 - 3,5 cm) tách ra từ cụm chồi nuôi cấy trên môi

trường tạo chồi tốt nhất được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung IBA nồng

độ từ 0,1 - 1,0 mg/L để tạo rễ in vitro Sau 6 tuần nuôi cấy, đánh giá khả năng hình thành rễ từ chồi in vitro, kết quả được trình bày ở bảng 3.2

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ IBA đến khả năng tạo rễ in vitro của lan kim

tuyến

IBA (mg/L)

Khả năng tạo rễ của chồi in vitro

Thời gian hình thành rễ (ngày)

Số rễ/chồi (cái) Chiều

nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung IBA nồng độ tăng dần từ 0,1 - 0,25 mg/L,

các chồi in vitro cảm ứng tạo rễ không nhiều (số rễ chỉ đạt 0,83 - 1,03 rễ/chồi,

chiều dài rễ 0,29 - 0,69 cm) Khi bổ sung IBA nồng độ tăng 0,5 - 0,75 mg/L; chồi cảm ứng phát sinh rễ tăng, chồi tạo rễ cao nhất trên môi trường có 0,75 mg/L IBA (đạt 1,70 rễ/chồi, chiều dài rễ 1,0 cm) Tuy nhiên, khi tăng nồng độ IBA lên 1,0

mg/L thì ức chế sự hình thành rễ của chồi in vitro (chỉ đạt 1,17 rễ/chồi, chiều dài rễ

0,59 cm) sau 6 tuần nuôi cấy (Hình 3.2) Rễ khí sinh tạo từ các mắt lá, có màu trắng ngà, rất nhiều lông hút mịn trên rễ chính

Hình 3.2 Rễ hình thành từ chồi in vitro cây lan kim tuyến sau 6 tuần nuôi

cấy trên môi trường MS bổ sung IBA (a) không IBA; (b) 0,25 mg/L IBA; (c) 1

mg/L IBA; (d) 0,75 mg/L IBA

IBA là auxin có tác dụng kích thích mạnh đến khả năng trao đổi chất của nitơ, tăng khả năng hô hấp của tế bào và mô nuôi cấy, tăng hoạt tính của các enzyme, tăng khả năng hấp thụ và sử dụng đường trong môi trường, kích thích sự sinh trưởng, kéo dài tế bào và điều khiển sự hình rễ [18] Tuy nhiên, khi tăng nồng

độ quá ngưỡng, sẽ ức chế sự sinh trưởng của tế bào do có thể liên quan đến sự tăng cường quá mạnh việc tổng hợp xenlulozo, peptin làm thành tế bào cứng lại, tăng sự tổng hợp etylen, làm cho hormon có tác động ngược lại với auxin làm giảm sự phân chia tế bào và hình thành rễ

Trong nghiên cứu của chúng tôi, khi nuôi cấy chồi in vitro lan kim tuyến trên

các môi trường MS có bổ sung các auxin NAA và IBA đều kích thích thúc đẩy hình thành rễ mạnh hơn trên các môi trường không bổ sung chất ĐHST Nghiên cứu cũng cho thấy trên môi trường nuôi cấy có bổ sung NAA đã kích thích chồi lan kim tuyến tạo rễ tốt hơn IBA

3.1.2 Ảnh hưởng của than hoạt tính đến khả năng tạo rễ in vitro của lan kim tuyến

Theo Poniewozik và cs (2022), các hợp chất phenol tiết ra trong quá trình

nuôi cấy đã làm giảm hiệu quả trong nhân giống vô tính in vitro ở nhiều loài lan

được nghiên cứu [46] Vai trò tích cực của than hoạt tính đã được chứng minh trong nhiều nghiên cứu trên nhiều đối tượng thực vật Than hoạt tính có tác dụng hấp phụ các chất màu, các hợp chất phenol, các sản phẩm trao đổi thứ cấp… Một

số nghiên cứu trong nuôi cấy mô thực vật cho thấy, than hoạt tính vừa hấp phụ các