[Kl-Hup] Chiết Xuất, Phân Lập Một Số Hợp Chất Từ Dược Liệu Chè Vằng (Jasminum Subtriplinerve Blume).Pdf

BỘ YTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRÀN HUYỀN TRANG CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ DƯỢC LIỆU CHÈ VẲNG uas minum subtrỉplỉnerve Blume) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC sĩ HÀ NỘI 2022 BỘ YTÉ TRƯỜNG ĐẠI[.]

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC sĩ

HÀ NỘI - 2022

(Jasminum subtriplỉnerve Blume)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC sĩ

Người hướng dẫn:

1 TS Hà Vân Oanh

2 ThS Hoàng Thị Diệu Hưong

Nơi thực hiện:

1 Bộ môn Dưực học cổ truyền

2 Khoa Hóa Phân tích - Tiêu chuẩn

- Viện Dưọc liệu

HÀ NỘI - 2022

Lời đầu tiên, bằng tất cả lòng chân thành, em xin bày tỏ sự biết ơn sâu sắc tới:

TS Hà Vân Oanh, người nhà giáo đáng kính, là người dẫn dắt định hướng em đến với nghiên cứu khoa học, cô luôn tạo điều kiện, quan tâm và hỗ trợ em rất nhiều trong suốt quá trình thực hiện khóa luận

ThS Hoàng Thị Diệu Hương, người đã luôn tận tình hướng dẫn, quan tâm, chỉ bảo, truyền động lực cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS TS Đỗ Thị Hà, ThS Nguyễn Thị Thu, ThS Vũ Thị Diệp, Dược sĩ Nguyễn Trà My và các nhà khoa học tại Khoa Hóa Phân tích

- Tiêu chuẩn - Viện Dược liệu đã tạo điều kiện về cơ sở vật chất và nhiệt tình giúp đỡ em

về mọi mặt từ những ngày đầu thực hiện khóa luận cho đến khi hoàn thành Những tháng ngày nghiên cứu ở Viện Dược liệu đã giúp em trưởng thành hơn và hoàn thiện bản thân hơn cả về kiến thức lẫn kỹ năng trong cuộc sống

Em xin cảm ơn đề tài "Nghiên cứu phân lập và phát triển phương pháp định

hồ trợ kinh phí để em thực hiện đề tài này

Em xin gửi sự biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè đã luôn sát cánh, động viên, giúp

đờ đề em có thể hoàn thành đề tài khóa luận này

Cuối cùng, em xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu cùng toàn thể các Thầy Cô giáo, các cán bộ Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện và dạy dỗ em trong suốt khoảng thời gian học tập tại trường Em xin kính chúc Thầy Cô luôn mạnh khỏe và công tác tốt

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 20 thảng 06 năm 2022

Sinh viên

Trần Huyền Trang

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

ĐẶT VẤN ĐÈ 1

CHƯƠNG I: TỐNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về chi Jasminum 2

1.1.1 Vị trí, phân loại 2

1.1.2 Đặc điểm thực vật 2

1.1.3 Sinh thái và phân bố 2

1.1.4 Thành phần hóa học 3

1.1.5 Tác dụng sinh học 6

1.1.6 Công dụng 9

1.2 Tổng quan về cây Chè vằng 9

1.2.1 Đặc điểm thực vật và phân bố 9

1.2.2 Thành phần hóa học 10

1.2.3 Tác dụng sinh học 11

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 13

2.1 Đối tượng nghiên cứu 13

2.2 Hóa chất, dung môi 13

2.3 Máy móc, trang thiết bị nghiên cứu 14

2.4 Nội dung nghiên cứu 14

2.5 Phương pháp nghiên cún 14

2.5.1 Phương pháp định tính các nhóm chất thường gặp trong mẫu dược liệu 14

2.5.2 Phương pháp chiết xuất 17

2.5.3 Phương pháp phân lập họp chất 18

2.5.4 Phương pháp xác định cắn trúc của các hợp chất 20

CHƯƠNG III: THỤC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21

3.1 Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ thường gặp có trong dược liệu 21

3.2 Kết quả chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc của các hợp chất 21

3.2.1 Kết quả chiết xuất và phân lập 21

3.2.2 Xác định câu trúc của các hợp clỉât phân lập 25

3.3 Bàn luận 29

3.3.1 Vê kêt quá định tính 29

3.3.2 về kết quả chiết xuất 29

3.3.3 về kêt quả phân lập các họp chất 30

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 33

Kết luận 33

Kiến nghị 33

TÀI LIỆU THAM KHẢO 34

PHỤ LỤC 43

DANH MỤC CÁC KỶ HIỆU, CHỮ VIẾT TẲT

Magnetic ResonanceSpectroscopy

Phổ cộng hưởng từ hạtnhân cacbon 13

Resonance Spectroscopy

Phố cộng hưởng từ hạt nhân proton

Bond Correlation qua nhiều liên kết

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Một số hợp chắt iridoid glycosid phân lập từ chỉ Jasminum 3

Bảng 1.2 Một sô hợp chất nhóm flavonoid có trong chi Jasminum 5

Bảng 1.3 Một so hợp chat phenol có trong chi Jasminum 5

Bảng 1.4 Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của chi Jasminum 7

Bảng 1.5 Một sỏ họp chât phân lập từ cây Chề văng 10

Bảng 3.1 Kết quả định tính các nhóm chắt thường gặp trong Chè vằng 21

Bảng 3.2 Dữ liệu phố của hợp chất JS1 và acid protocatechuic 26

Bảng 3.3 Dữ liệu phố của JS2 và verbascosid 27

DANH MỤC CÁC HÌNH VÊ

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học một số hợp chất nhóm sesquiterpenoỉd có trong chỉ

Jasminum 4

Hĩnh 1.2 Cấu trúc hóa học một số hợp chất nhóm phenylethanoỉd glycosỉd có trong chỉ Jasininum 6

Hĩnh 1.3 Câu trúc hóa học một sô họp chât có trong tinh dâu của các loài thuộc chi Jasminum 6

Hình 2.1 Thân và lá Chề vãng 13

Hình 3.1 Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn từ thân và lá Chè vẳng 23

Hình 3.2 Sắc kỷ đồ của các hợp chất phân lập 24

Hình 3.3 Sơ đô quy trình phân lập hai hợp chat JS1 và JS2 25

Hình 3.4 Cấu trúc hóa học của họp chat JS1 26

Hình 3.5 Cấu trúc hóa học và tương tác HMBC chỉnh (^>) của hợp chất JS2 29

ĐẶT VẤN ĐÈ

Với lợi thế về điều kiện tự nhiên và khí hậu, Việt Nam có một nguồn tài nguyên thực vật phong phú và đa dạng, trong đó bao gồm nhiều loại cây có thể dùng làm thuốc chừa bệnh cho người Theo cuồn "Danh lục cây thuốc Việt Nam", tính đến cuối năm

2015, tổng số loài cây thuốc đã biết ở Việt Nam đạt tới con số 5117 loài và dưới loài, thuộc 1823 chi, 360 họ của 8 ngành thực vật bậc cao có mạch, cùng với một so taxon thuộc nhóm Rêu, Tảo và Nấm lớn [12] Tuy vậy, các loài cây làm thuốc được sử dụng chủ yếu theo kinh nghiệm dân gian hoặc theo y học cổ truyền mà chưa được nghiên cứu một cách đầy đủ Hiện nay, xu hướng sử dụng các dược phẩm có nguồn gốc tự nhiên đang ngày càng tăng, điều này cho thấy việc nghiên cứu phát triển các sản phẩm thuốc từ dược liệu là hướng đi day hứa hẹn của ngành y dược Việt Nam

Chè vằng có tên khoa học là Jasminum subtrỉplinerve Blume, họ Nhài (Oleaceae) là một cây thuốc khá quen thuộc với người dân Việt Nam Chè vằng đã được sử dụng từ lâu trong dân gian với các tác dụng nổi bật như chống nhiễm trùng, lợi sữa ở phụ nữ sau sinh, trị mụn nhọt, man ngứa, Ớ một số địa phương, nhân dân dùng nước nấu từ Chè vằng để uống hằng ngày thay cho trà xanh Tuy nhiên, mặc dù được sử dụng rộng rãi nhưng tới nay, số lượng các nghiên cứu trong nước về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học cúa cây Chè vằng vẫn còn hạn chế

Do đó, đề góp phần bổ sung vào cơ sở dữ liệu về thành phần hóa học của cây Chè vằng, đề tài "Chiết xuất, phân lập một số họp chất từ dưọc liệu chè vằng (Jasminum

subtriplinerve Blume)" được thực hiện với 2 mục tiêu:

1 Định tính được các nhóm chất thường gặp có trong thân và lá Chè vằng bằng phản

ứng hóa học đặc trung

2 Chiết xuất, phân lập và xác định được cấu trúc của 1-2 hợp chất từ thân và lá Chè

văng

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Tống quan về chi Jasminum L.

1.1.1 Vị trí, phân loại

Theo hệ thống phân loại thực vật của Takhtajian (2009), chi Jasminum L thuộc:

Phân giới thực vật bậc cao

1.1.3 Sinh thái và phân hố

Chi Jasminum L có 197 loài, phân bố rộng khắp thế giới Phạm vi bản địa của chi

Jasminum L bao gồm vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới của thế giới cũ đến miền trung Trung Quốc và khu vực Thái Bình Dưong Ngày nay, chúng đã được du nhập vào Châu Âu, khu vực Caribe, Nam Mỹ, Trung Mỹ, và Hoa Kỳ [41]

Ở Việt Nam, họ Oleaceae có khoảng gằn 74 loài, 8 phân loài và 1 thứ thuộc 9 chi, số

loài nhiều nhất thuộc về chi Jasminum L với 37 loài, 6 dưới loài và 1 thứ Trong đó, có 5

loài là đặc hữu ở Việt Nam: Nhài Hạ Long (Jasminum alongense Gagnep.), Nhài

eberhardt (Jasminum eberhardtii Gagnep.), Nhài hoa thưa (Jasminum laxiflorum

Gagnep.), Nhài cọng ụasminum peduncuỉatum Gagnep.), Nhài Việt Nam ựasminum vietnamense B H Quang & Joongku Lee) [3]

Jasminum L được trình bày ở Bảng 1.1 và Phụ lục 1.1.

Bảng 1.1 Một sô hợp chầt iridoid glycosid phân lập từ chi Jasminum L.

[70] ,[71]

Nhiều nghiên cứu đã xác định sự có mặt của các hợp chat flavonoid ở nhiều loài thuộc chi Jasminum L (Bảng 1.2) cấu trúc hóa học của các họp chất được trình bày ở

Phụ lục 1.2.

Bảng 1.2 Một sô hợp chât nhóm flavonoid có trong chi Jasminum L.

multiflorum, J officinale, J

sambac

[28],[36]

Bảng 1.3 Một sô họp chãt phenol có trong chi Jasminum

1 Hydroxytyrosol (48) J azoricum, J humile, J multiflorum,

J officinale

2 Acid p-hydroxybenzoic (49) J multiflorum, J officinale, J sambac

3 Acid chlorogenic (50) J azoricum, J humile, J officinale

[28]

4 Acid syringic (51) J azoricum, J humile, J officinale, J

sambac

5 Acid /7-coumaric (52) J azoricum, J humile, J multiflorum,

8 Acid protocatechuic (55) J azoricum, J multiflorum, J

officinale

[28],[47]

1.1.4.5 Nhóm phenyỉethanoỉd glycosỉd

Phần lớn các loài Jasminum đều có chứa verbascosid (56), là một hợp chất thuộc nhóm phenylethanoid glycosid có trong một vài bộ phận của cây Trong nghiên cứu của Claude Andary và cộng sự (năm 1992), verbascosid được tìm thấy ở một số loài thuộc chi

Jasminum L đó là J nudijiorum, J sambac, J mesnyi, J oficinale, J azoricum, J grandiflorum Hoa của loài J mesnyỉ và J nudijiorum có chứa forsythosid B (57) và

poliumosid (58) Ngoài ra, hợp chất echinacosid (59) được tìm thấy ở loài J mesnyi [16]

Geraniol (60), linalool (61), nonanal (62), eugenol (63), và nhiều chất khác có

trong thành phần tinh dầu của các loài thuộc chi Jasminum L.,

kháng khuẩn, kháng nấm, kháng các khối u, bảo vệ gan và túi mật, loại trừ và giảm những cơn đau do co thắt, tăng cường hệ miễn dịch, giảm nguy cơ đái tháo đường và tăng lipid trong máu Một số tác dụng nổi bật của chi Jasminum L đã được nghiên cứu trên thế giới:

1.1.5.1 Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm

Nhiều loài Jasminum đã được ghi nhận về hoạt động chống lại các chủng vi khuấn

và nấm gây bệnh trong các thử nghiệm in vitro (Bảng 1.4)

Bảng 1.4 Tác dụng kháng khuân, kháng nâm của chỉ Jasminum L.

Jasminum abyssinicum

Lá/ethanol

Bacillus cereus Listeria monocytogenes Staphylococcus epidermidis Streptococcus pyogenes

[54]

Jasminum angustifolium Lá và thân/ethanol Enterococcus faecalis

Bacillus subtilis

[14]

Jasminum auriculatum Lá/ethanol

Bacillus subtilis, Staphyloccocus aureus Pseudomonas aeruginosa

Micrococcus luteus Escherichia coll

[18]

Jasminum grandiflorum Toàn cây/ethanol

Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus epidermidis Staphylococcus aureus

[60]

Staphylococcus saprophytỉcus

Shigella flexneri Shigella boydii Shigella sonnie Jasminum officinale Tinh dầu từ hoa Trichosporon ovoides [66]

Chiết xuất ethanol từ lá của J grandiflorum thê hiện khả năng ức chế hiệu quả gồc

tự do DPPH (IC50 = 15 pg/mL) tương đương với acid ascorbic (IC50 = 12 pg/mL) Hơn nữa, dịch chiết ethanol cũng cho thấy khả năng thu dọn goc oxit nitric (NO) với IC50 = 98 pg/mL so với tiêu chuẩn là curcumin (IC50 = 92 pg/mL) [81]

Chiết xuất methanol từ hoa của loài J multiflorum cho thấy hoạt động thu dọn gốc

tự do DPPH với giá trị IC50 là 81 pg/mL [42]

Ngoài ra, một nghiên cứu năm 2019 cho thấy chiết xuất methanol 80% từ lá của các loài J multiflorum, J azoricum, J humile, J officinale và J sambac từ hai địa điểm khác

nhau có khả năng thu dọn gốc tự do DPPH cao với các giá trị IC50 lần lượt là 5034,8; 199,2; 94,6; 76,6; 130,7 và 155,5 pg/mL, trong khi biểu hiện tổng lượng phenolic tương ứng là 167,3; 56,9; 88,0; 133,4; 47,3 và 50,2 pgGAE/mg (GAE là đương lượng acid gallic chuẩn) Hơn thế nữa, dịch chiết từ các loài 7 azoricum, J officinale, J multiflorum, J humile và J sambac có tống hàm lượng flavonoid tương ứng là 46,3; 34,7; 44,4; 38,3;

39,2 và 40,5 pgQE/mg (QE là đương lượng quercetin chuẩn) [28]

1.1.5.3 Tác dụng chông viêm, giảm đau

Thân và rễ của J lanceolarium được sử dụng đế điều trị bệnh thấp khớp và hạ sốt, lá

có tác dụng giảm đau Ở liều 400 mg/kg, dịch chiết ethanol của lá Jasminum

lanceolarium có tác dụng kháng viêm cao hơn indomethacin và tác dụng giảm đau tốt hơn

so với aspirin Mười một hợp chất phân lập trong đó có sáu lignanoid và năm iridoid có hoạt tính chống viêm với các giá trị IC50 lần lượt là 1,76 - 5,22 mg/mL [86]

1.1.5.4 Tác dụng chống ung thư

Dịch chiết ethanol của J sambac chống ung thư hạch bạch huyết trên chuột do làm giảm sự tồn thuong DNA [40]

Dịch chiết ethanol từ hoa của J grandiflorum có tác dụng ức chế sự phát triển của

các tế bào ung thư vú gây ra bởi 7,12-dimethylbenzanthracen (DMBA) khi dùng liều 300 mg/kg thể trọng chuột trong 14 tuần [43]

I 1.6 Công dụng

Ớ Việt Nam, hiện nay nhiều loài thuộc chi Jasminum L được biết đến với giá trị làm thuôc như J lanceolaria, J subtriplinerve, J nobile, J laurifolium, J duclouxii, J lang, J scandens, J multiflorum, J coarctatum, J elongatum, J sambac, J arborescens,

lá chữa sung vú, cho phụ nữ mới đẻ uống, còn dùng chừa rắn cắn, rễ mài với giấm thanh

để làm hết mủ những ung nhọt đà nung mủ [5] Ngoài ra, Chè vằng còn làm thuốc nhuận gan, chừa vàng da [11]

1.2 Tồng quan về cây Chè vằng

1.2.1 Đặc điểm thực vật và phân bố

Cây Chè vằng có tên khoa học là Jasminum subtrỉplinerve Blume, thuộc họ Nhài

(Oleaceae), còn được gọi là chè cước man, dây cẩm văn, cây dâm trắng, dây vắng, mổ sẻ Cây Chè vằng là một cây nhở, mọc thành bụi ở bờ rào hay bụi tre hoặc bám vào các cây lớn Thân cây cứng, chia thành từng đốt, đường kính 5-6 mm, chia thành nhiều cành, có thề vươn cao 1 - 1,5 m và vươn dài tới 15 - 20 m, thân và cành đều nhẵn Lá mọc đối, hình mũi mác, phía cuống tù hay hơi tròn, đầu lá nhọn, dài 4 - 7,5 cm, rộng 2 - 4,5 cm, nhừng lá phía trên nhỏ hơn lá phía dưới, mép nguyên, trên có 3 gân rõ rệt Cuống lá nhẵn, dài 3 - 12 mm Hoa mọc thành xim nhiều hoa (chừng 7-9 hoa), cánh hoa màu trắng Quả hình cầu, đường kính 7-8 mm (bằng hạt ngô) Khi chín có màu vàng, trong quả có một hạt rắn chắc Mùa quả chín tháng 7 - 10 [5]

Chè vằng phân bố phổ biến và khá tập trung ở khu vực các nước Đông Nam Á và Nam Á Ngoài ra, cây cũng còn gặp ở các tỉnh phía nam Trung Quốc và đảo Hải Nam.

Ở Việt Nam, Chè vằng có rải rác ở hầu hết các tỉnh thuộc vùng núi thấp, trung du và

cả đồng bằng, không thấy cây mọc ở vùng núi cao trên 1500 m Cây gặp nhiều từ Lào Cai, Hòa Bình, Vĩnh Phúc, Quảng Ninh, Hà Nội, Ninh Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, qua Thừa Thiên Huế, Quảng Nam, Đà Nằng tới Khánh Hòa [4], [13]

1.2.2 Thành phần hóa học

Cho đến nay, trên thế giới đã có một số nghiên cứu về thành phần hóa học của cây Chè vằng Trong đó, có các nhóm chất chính như terpen glycosid, flavonoid glycosid, phenylethanoid glycosid, phenylpropanoid glycosid, steroid, triterpenoid, acid

phenolic, (Bảng 1.5) cấu trúc hóa học của các họp chất phân lập từ cây Chè vằng

6-Epi-chevangin B (68)

Chevangin c (69) Chevangin D (70)

Poliumosid (81)

CA-linalool oxid (94)

Nhóm khác

a-L-rhamnopyranosyl-( 1 —>3)-ớ-(a-L- rhamnopyranosyl( 1 ->6)-1 -ớ-E-caffeoyl-

Jaspolyanthosid (96)

1.2.3 Tác dụng sinh học

1.2.3.1 Tác dụng chống oxy hóa

Khả năng chống oxy hóa in vitro là tác dụng nối bật nhất của cây Chè vằng ụ

subtriplinerve), cụ thề trong các nghiên cứu sau:

Trong nghiên cứu của Dai Hue Ngan và các cộng sự năm 2008, chiết xuất ethyl acetat, ethanol, methanol và nước của thân và lá Chè vằng ở nồng độ 200 pg/mL đều thể hiện tác dụng chống oxy hóa dựa trên thử nghiệm thu dọn gồc tự do DPPH (2,2-diphenyl- l-picrylhydrazyl) Trong đó, hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết ethyl acetat và ethanol là mạnh nhất, nhưng vẫn kém hon acid ascorbic (44 pg/mL) [34]

Năm 2012, Nguyễn Thị Thanh Mai và các cộng sự đã sử dụng phương pháp bẫy gốc

tự do DPPH và phương pháp ức chế gốc tự do NO để khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của các cao chiết từ thân và lá của cây vằng sẻ ụ. subtriplinervcỴ Các kết quả thu được

cho thấy cao chloroform, cao ethyl acetat, cao n-butanol đều thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa Trong đó, cao ethyl acetat thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa cao nhất trên cả hai phương pháp thử nghiệm, với giá trị SC50 thu được tương ứng là 8,2 pg/mL và 80,7 pg/mL Có 3 hợp chất tinh khiết gồm acid 3,4-dihidroxibenzoic, acid 3,4,5- trihidroxibenzoic và verbascosid được phân lập từ cây vằng sẻ Khảo sát khả năng ức chế gốc tự do DPPH cho thấy cả ba họ-p chất này đều có tác dụng chống oxy hóa mạnh với giá trị SC50 tương ứng lần lượt là 9,1; 4,9 và 1,8 pM, trong đó verbascosid thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa mạnh hơn cả chất chuẩn quercetin (SC50 = 4,0 pM) [10].

Ngoài ra, bằng phương pháp bẫy gốc tự do DPPH, nhiều nghiên cứu khác đã cho thấy khả năng chống oxy hóa của loài J subtrỉplinerve [17], [31]

7.2.3.2 Tác dụng kháng khuẩn

Năm 2008, Dai Hue Ngan và cộng sự đã tiến hành thử nghiệm đánh giá hoạt tính kháng khuắn của các dịch chiết ether dầu hỏa, methanol, ethanol, ethyl acetat và nước từ

loài J subtriplinerve trên các chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus, Escherichia coli,

Pseudomonas aeruginosa và Bacillus subtilis. Ket quả cho thấy chiết xuất ether dầu hỏa

có tác dụng ức chế B subtilis với nồng độ ức chế tối thiểu MIC = 100 pg/mL, các dịch chiết ethyl acetat và ethanol ức chế s. aureus với giá trị MIC = 200 pg/mL và chiết xuất

methanol ức chế E. coli với giá trị MIC = 200 pg/mL Mặt khác, dịch chiết nước không có tác dụng ức chế bất kỳ chủng vi khuẩn nào ở nồng độ bằng hoặc thấp hơn 200 pg/mL Tất

cả các dịch chiết không cho thấy bất kỳ tác dụng ức chế nào đối với các vi nấm [34]

CHƯƠNG II: ĐỔI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu

Đối tượng nghiên cứu là thân và lá cây Chè vằng (Hình 2.1) được thu hái vào tháng

02 năm 2022 tại xà Hương Sơn, huyện Mỹ Đức, TP Hà Nội

Mầu nghiên cứu được giám định tên khoa học là Jasminum subtriplỉnerve Blume thuộc họ Nhài (Oleaceae) Tiêu bản thực vật khô Chè vằng được lưu tại Phòng Tiêu bản - Trung tâm Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu (có số hiệu TB-0000856; TB-0001414;

TB-0005899; TB-0009678 và TB-0009891) (Phụ lục 5).

Mau nghiên cứu được thái nhỏ, sấy khô ở 50°C, bảo quản trong túi nilon sạch làm nguyên liệu nghiên cứu

Hình 2.1 Thân và lá Chè vằng

2.2 Hóa chất, dung môi

- Hóa chất dùng trong phản ứng định tính: Thuốc thử Mayer, Bouchardat,

Dragendorff, diazo, Fehling A, Fehling B, dung dịch H2SO4 đặc, HC1 đặc, FeCh 5%, gelatin 1%, chi acetat 10%, bột magie kim loại, đạt tiêu chuẩn Dược điền Việt Nam V

- Bản mỏng tráng sẵn pha thường silica gel F254 (Merck), pha đảo RP-18 F254S, chất

hấp phụ silica gel pha thường (cờ hạt 0,040 - 0,063 mm, Merck), silica gel pha đảo (75 pm YMC Co., Ltd, Nhật)

- Dung dịch acid sulfuric 10% trong ethanol (TT) để phát hiện các vết chất trên bản

mỏng

- Dung môi công nghiệp: n-hexan, dicloromethan (DCM), methanol (MeOH),

ethanol (EtOH), ethyl acetat (EtOAc), aceton, nước (H2O),

2.3 Máy móc, trang thiết bị nghiên cứu

- Phổ khối lượng phun mù điện tử (ESI-MS) được đo trên hệ thống sắc ký lỏng siêu

hiệu năng ghép nối với detector khối phổ tứ cực chập ba LC-MS/MS và detector DAD (Shimadzu, Nhật Bản)

- Máy đo phổ cộng hưởng hạt nhân (NMR) của Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa

học Việt Nam: Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer (Billerica, Massachusetts, Hoa Kỳ)

- Bế siêu âm VEVOR Ultrasonic Cleaner 10L (Ruianshisuikangxieyeshanghang)

- Máy cất quay Rotavapor R-124, Rotavapor R-210 (Buchi, Swichzerland, Thụy

Sỹ)

- Máy cất quay chân không Rotavapor R-220 Pro 20L (Buchi, Thụy Sỹ)

- Bếp cách thủy Memmert WNB14 (Đức)

- Tủ sấy Binder FD 115 (Đức), Memmert UF110 (Đức)

- Cân kĩ thuật Ohaus PA2102 (Mỹ), cân phân tích Precisa XT 220A (Precisa, Thụy

Sỹ)

- Đèn tứ ngoại VL-6.LC hai bước sóng 254 nm và 366 nm (Vilber, Pháp)

- Các dụng cụ thủy tinh dùng trong phòng thí nghiệm như: Cột sắc ký, bình gạn,

bình nón, cốc có mỏ, phễu lọc, ống nghiệm, ống đong, pipet, đũa thủy tinh, mao quản,

2.4 Nội dung nghiên cứu

- Định tính các nhóm chất thường gặp bằng phản ứng hóa học của thân và lá Chè

vằng

- Chiết xuất cao tổng EtOH 80% và các cao phân đoạn của thân và lá Chè vằng

- Phân lập và xác định cấu trúc hóa học các hợp chất từ phân đoạn EtOAc của thân

và lá Chè vằng

2.5 ỉ Phương pháp định tỉnh các nhóm chất thường gặp trong mẫu dược liệu

Định tính sơ bộ các nhóm chất thường gặp trong mẫu dược liệu bằng các phản ứng hóa học đặc trưng cho từng nhóm chất theo các tài liệu [1J, [2]

Chuẩn bị các dịch chiết:

Dịch chiết n-hexan: Cân khoảng 10 g bột dược liệu cho vào bình soxhlet Chiết bằng /1-hexan đến khi dung môi trong bình không màu Dịch chiết đem cất thu hồi bớt dung môi Dịch chiết đậm đặc thu được dùng đế làm các phản ứng định tính chất béo, phytosterol và carotenoid

Dịch chiết ethanol 90%: Cho 5 g bột dược liệu vào bình nón 250 mL, thêm 100 IĨ1L EtOH 90%, đun cách thủy 10 phút, lọc nóng Dùng dịch lọc đế làm các phản ứng định tính flavonoid, coumarin, acid hữu cơ và acid amin.

Dịch chiết nước: Cho 10 g bột dược liệu vào bình nón dung tích 50 mL, thêm 30 mL nước cất, đun sôi trực tiếp 5 phút Lọc lấy dịch lọc làm các phản ứng định tính tanin và đường khử

2.5.1.1 Định tính chất béo

Nhỏ vài giọt dịch chiết n-hexan trên giấy lọc, sấy nhẹ cho bay hơi hết dung môi Phản ứng dương tính khi xuất hiện vết mờ trên giấy lọc

2.5.1.2 Định tính carotenoid

Cô 5 mL dịch chiết n-hexan tới cắn Thêm 1-2 giọt acid sulfuric đặc Phản ứng

dương tính khi thấy xuất hiện màu xanh ve

2.5.1.3 Định tính phytosterol

Cho vào ống nghiệm 1 mL dịch chiết n-hexan Bốc hơi dung môi đến cắn Cho vào ống nghiệm 1 mL anhydrid acetic, lắc kỹ, thêm 1 mL dung dịch H2SO4 đặc theo thành ống nghiệm Phản ứng dương tính nếu kết quả cho thấy giữa hai lớp chất lỏng xuất hiện một vòng màu tím đỏ, lắc nhẹ, lớp chất lỏng trên có màu xanh

2.5.1.4 Định tính saponin

- Phản ứng tạo bọt

Cho 0,5 g bột dược liệu và ống nghiệm có dung tích 20 mL, thêm vào đó 5 mL nước cất, đun sôi nhẹ, lọc nóng qua bông vào ống nghiệm có dung tích 20 mL, thêm 5 mL nước cất Bịt ống nghiệm bằng ngón tay cái, lắc mạnh ống nghiệm theo chiều dọc 5 phút, để yên và quan sát Phản ứng dương tính khi bọt bền sau 10 phút

- Phản ứng Salkowski

Cho vào bình nón 2 g dược liệu, thêm 20 mL EtOH 90%, đun sôi cách thủy Lọc, thu dịch lọc cho vào 1 ống nghiệm, bốc hơi dịch lọc đến cắn Hòa tan một ít cắn trong 1

mL anhydrid acetic Thêm vào dung dịch 0,5 mL chloroform Dùng pipet nhỏ từ từ 1 - 2

mL acid sulfuric đặc vào thành ống nghiệm Phản ứng dương tính khi xuất hiện vòng tím

hiện tượng sau thì dương tính Ong 1 dung dịch có tủa vàng hoặc tủa đục có màu vàng, ống 2 trong.

Thêm vào cả 2 ống nghiệm, mỗi ống 2 mL nước cất Lắc đều Quan sát, phản ứng dương tính nếu thấy ồng 1 trong suốt, ống 2 có tủa đục

Acid hóa ống 1 bằng vài giọt acid hydrocloric đặc, ống 1 sẽ trở lại tủa đục giống như ống 2

- Phản ứng diazo hóa

Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 mL dịch chiết, thêm vào đó 2 mL dung dịch NaOH 10% Đun cách thủy sôi 5 phút rồi để nguội Thêm vài giọt thuốc thử diazo (mới pha) Phản ứng dương tính khi xuất hiện màu dở gạch

2.5.1.6 Định tính flavonoid

- Phản ứng cyanidỉn

Cho 2 mL dịch chiết vào ống nghiệm, thêm một ít bột magie kim loại, nhỏ từ từ 4 -

5 giọt acid hydrocloric đặc Đun nóng cách thủy sau vài phút Phản ứng dương tính nếu thấy xuất hiện màu tím đỏ

2.5.1.7 Định tính acid hữu cơ

Cho vào bát thủy tinh ImL dịch chiết cồn và đem cô tới cắn Hòa cắn trong 1 mL nước và thêm vài tinh thể natri carbonat Phản ứng dương tính khi thấy có bọt khí nồi lên

2.5.1.8 Định tính acid amỉn

Lấy 3 mL dịch chiết cồn cho vào ống nghiệm Thêm 1-3 mảnh ninhydrin, đun sôi trong 2 phút, phản ứng dương tính khi thấy dung dịch chuyển màu tím

2.5.1.9 Định tỉnh tanin

Tiến hành trong các ống nghiệm:

- Ông 1: 2 mL dịch lọc, thêm 2 giọt FeCỈ3 5% Phản ứng dương tính khi xuất hiện

màu xanh đen hoặc xanh nâu nhạt

- ông 2: 2 mL dịch lọc, thêm 2 giọt chì acetat 10% Phản ứng dương tính khi xuất

hiện tủa bông

- Ông 3: 2 mL dịch lọc, thêm 5 giọt dung dịch gelatin 1% Phản ứng dương tính khi

xuất hiện tủa bông trắng

2.5.1.10 Định tính đường khử tự do

Lấy 2 mL dịch chiết nước cho vào ống nghiệm Thêm vào đó 0,5 mL thuốc thử Fehling A và 0,5 mL thuốc thử Fehling B Đun sôi cách thủy vài phút Phản ứng dương tính khi thấy xuất hiện tủa đỏ gạch

2.5.1.11 Định tính alcaloỉd

Lấy 10 g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 50 mL, thêm 15 mL dung dịch H2SO4 2%, đun sôi vài phút Để nguội, lọc dịch chiết vào bình gạn, kiềm hóa dịch lọc bằng dung dịch NH4OH 6N đến pH kiềm Chiết alcaloid bằng chloroform 3 lần, mỗi lần 5

mL Dịch chiết CHCI3 được gộp lại và lắc với H2SO4 2% Gạn lấy lớp nước acid, cho vào

3 ống nghiệm, mồi ống khoảng 1 mL đế làm các phản ứng sau:

- Với thuốc thử Mayer: Phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa trắng hay vàng nhạt

- Với thuốc thử Bouchardat: Phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa nâu

- Với thuốc thử Dragendorff: Phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa vàng cam hoặc

đỏ

2.5.1.12 Định tính anthranoid (phản ứng Borntraeger)

Cho vào ống nghiệm 5 g bột dược liệu, thêm dung dịch H2SO4 25% tới ngập dược liệu rồi đun sôi trong vài phút Lọc dịch chiết vào bình gạn, để nguội rồi lắc với 5 mL ether Lấy 1 mL dịch ether cho vào ống nghiệm, thêm 1 mL KOH 10%, quan sát màu của lớp dung dịch KOH (đỏ)

Dược liệu được thái nhỏ, sấy khô và tiến hành chiết xuất với các điều kiện sau:

- Phương pháp chiết: Ngâm lạnh

- Dung môi: EtOH 80%

- Số lần chiết: 3 lần

- Thời gian chiết: 3 ngày/lần

- Thỉnh thoảng có khuấy trộn trong quá trình chiết

Lọc loại bỏ bã dược liệu, dịch chiết EtOH được gộp lại, cất thu hồi dung môi dưới

áp suất giảm thu được cao tổng

Cao tổng được phân tán trong một lượng nước nóng tối thiểu, chiết lỏng - lỏng lằn lượt với các dung mồi có độ phân cực tăng dần: rỉ-hexan, dicloromethan và ethyl acetat Dịch chiết các phân đoạn được cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm, dịch chiết nước

còn lại đem cô cách thủy ở nhiệt độ 80°C, thu được các cao phân đoạn tương ứng: cao n- hexan, cao DCM, cao ethyl acetat và cắn nước.

2.5.3.1 Phân lập băng săc kỷ cột

Trước khi tiến hành phân lập chất, khảo sát cao phân đoạn bằng sắc ký lóp mong với các hệ dung môi khác nhau để lựa chọn pha động tối ưu nhất Các bước tiến hành sắc ký cột:

- Lựa chọn chất nhồi cột (pha tĩnh):

+ Với sắc ký cột silica gel pha thường: Silica gel cờ hạt 0,040 - 0,063 mm

(Merck)

+ Với sắc ký cột silica gel pha đảo: Silica gel pha đảo 75 |im YMC Co., Ltd,

Nhặt

- Lựa chọn dung môi rửa giải (pha động): Hồn họp được pha từ các dung môi

thường dùng: ỉĩ-hexan, dicloromethan, ethyl acetat, methanol, nước với tỷ lệ thích hợp đã được khảo sát bằng TLC

- Xác định khối lượng mẫu cần lên cột

- Chuẩn bị mẫu:

+ Với sắc ký cột silica gel pha thường: Mầu được hòa tan hoàn toàn trong một

thể tích dung môi tối thiều Sau đó, trộn đều với một lượng silica gel vừa đủ, bay hơi hết dung môi đến khi thu được bột khô tơi Nếu có các hạt vón cục,

có thể nghiền mịn lại bằng chày cối sứ

+ Với sắc ký cột silica gel pha đảo: Hòa tan lượng cao cần lên cột với một

lượng methanol tối thiểu, thu được dung dịch mẫu Nếu xuất hiện kết tủa, có thế lựa chọn dung môi khác có khả năng hòa tan mẫu tốt hơn, hoặc lọc và

xử lý riêng phần tủa

- Chuấn bị cột thủy tinh có khóa, đường kính và chiều dài phù hợp với lượng mẫu

đưa lên cột, rửa sạch, tráng bằng aceton rồi để khô, lắp thẳng đứng trên giá cố định Lót một lượng bông vừa phải ở phần thân cột ngay phía trên vòi thoát (tránh lót quá nhiều bông gây tắc cột)

- Nhồi cột:

+ Với sắc ký cột silica gel pha thường: Cân một lượng silica gel phù hợp với

lượng mẫu cần lên cột Hòa lượng silica gel trên với lượng dung môi rửa giải thích hợp trong cốc có mỏ thu được hỗn dịch dung môi - silica gel tương đối loãng Vừa khuấy đều vừa rót hỗn dịch này vào cột đã chuẩn bị,

mở khóa cột (cố gắng đưa toàn bộ khối hỗn dịch này vào cột bằng một lằn rót duy nhất) Hứng dung môi đồng thời liên tục bố sung dung môi vào cột trong khoảng thời gian thích họp để ồn định lớp silica gel trong cột.

+ Với sắc ký cột silica gel pha đảo: Cân một lượng silica gel pha đảo phù họp

với lượng mẫu đưa lên cột Hòa lượng silica gel trên với methanol trong cốc

có mỏ, khuấy đều, thu được hồn dịch MeOH - silica gel tương đối loãng Vừa khuấy đều vừa rót hỗn dịch này vào cột đã chuẩn bị, mở khóa cột (cố gắng đưa toàn bộ khối hồn dịch này vào cột bằng một lần rót duy nhất) Hứng dung môi đồng thời liên tục bố sung dung môi vào cột trong khoảng thời gian thích hợp đề ổn định lớp silica gel trong cột

- Nạp mẫu:

+ Với sắc ký cột silica gel pha thường: Phương pháp nạp mẫu dạng bột khô

Rắc đều mẫu lên lóp dung môi vừa đù ở đỉnh cột Đảm bảo lớp dung môi ở đỉnh cột trước khi cho mẫu vào phải hơi dư so với khả năng hút dung môi của bột mẫu đế tránh cột bị nứt đỉnh Cho một lớp bông vừa phải lên mặt thoáng của dung môi để bảo vệ bề mặt cột, hạn chế việc mẫu bị xáo trộn khi nạp thêm dung môi

+ Với sắc ký cột silica gel pha đảo: Phương pháp nạp mẫu dạng dung dịch

Dùng pipet đủ dài đưa nhẹ nhàng dung dịch mẫu vào lớp dung môi chừa trên đỉnh cột (1-2 cm) để toàn bộ dịch mẫu thấm đều vào chất hấp phụ

- Rửa giải: Cho dung môi rửa giải thích họp vào cột đã được nạp mẫu Bố sung dung

môi thường xuyên, đảm bảo mức dung môi luôn cao hơn mẫu trong cột

- Hứng dịch rửa giải vào các ống nghiệm hoặc bình nón có dung tích phù hợp

- Theo dõi sắc ký đồ của các ống hứng bằng TLC để gộp phân đoạn

2.5.3.2 Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)

Nguyên tắc: Dựa trên cơ chế hấp phụ Chất phân tích được chấm lên bản mỏng sè di chuyển trên một lớp chất hấp phụ mịn, theo một chiều nhất định Tùy thuộc vào hệ dung môi pha động và khả năng hấp phụ của các thành phần trong chất phân tích sẽ tạo ra các vết sắc ký ở các vị trí khác nhau

Trong khóa luận, sắc ký lớp mởng được sử dụng để lựa chọn hệ dung môi pha động trước khi lên cột và theo dõi quá trình rửa giải trong quá trình chạy cột

- Bản mỏng: Thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silica gel pha thường (TLC-Silica

gel 60 F254, Merck) và pha đảo RP-18 F254S (Merck), được hoạt hóa bằng cách sấy

ở 110°C trong 30 phút

- Dung môi pha động: Sử dụng hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với

nhau theo một tý lệ thích hợp

- Phát hiện các hợp chất bằng cách quan sát sắc ký đồ dưới ánh sáng tử ngoại ở hai

bước sóng 254 nm và 366 nm hoặc nhúng bản mỏng trong dung dịch acid sulfuric 10% trong ethanol (TT), sấy khô rồi hơ nóng đến khi hiện vết màu.

2.5.4 Phương pháp xác định cấu trúc của các họp chất

Xác định cấu trúc các họp chất phân lập được dựa vào các tính chất lý hóa (trạng thái, màu sắc) và dữ liệu phổ khối (ESI-MS), phố cộng hưởng từ hạt nhân (]H-NMR, 13C-

NMR, DEPT, HMBC), kết họp so sánh các dừ liệu thu được từ thực nghiệm với các tài

r

1 • /V -4- 1

liệu đã công bô

CHƯƠNG III: THỤC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ thường gặp có trong dược liệu

Ket quả định tính các nhóm chất có trong thân và lá Chè vằng bằng phản ứng hóa học được trình bày trong Bảng 3.1 và Phụ lục 2.

Bảng 3.1 Kết quả định tính các nhóm chất thường gặp trong Chè vằng

Chú thích’ (-): Phản ứng âm tính, (+): Phản ứng dương tính, (++): Phản ứng dương tính rõ

chất béo, carotenoid, phytosterol, saponin, flavonoid, đường khử tự do và acid amin

3.2 Kết quả chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc của các hợp chất

3.2.1 Kết quả chiết xuất và phân lập

Thân và lá cây Chè vằng đã được thái nhỏ, sấy khô (7,5 kg, độ ầm 11,55%), đem ngâm chiết với ethanol 80% ở nhiệt độ phòng với tỷ lệ DL/DM =1:8 (kg/1) X 3 lần, mồi lần chiết kéo dài trong vòng 3 ngày Kết thúc 3 lần chiết, lọc loại bỏ bã dược liệu, dịch

chiết được gộp lại, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm rồi làm khô trong tủ hút thu được cao tổng (1,2 kg, độ ẩm 22,76%).

Cao tổng được phân tán trong một lượng nước nóng tối thiểu, sau đó tiến hành chiết lỏng - lỏng lần lượt với dung môi n-hexan, DCM và EtOAc trong bình gạn thủy tinh (3 lần, tỷ lệ dung môi 1:1, v/v), thu được dịch chiết các phân đoạn n-hexan, DCM và EtOAc

Thu hồi dung môi bằng máy cô quay chân không thu được cao n-hexan (63,0 g), DCM (100,0 g), cao EtOAc (35,0 g) và cắn nước (882,0 g) Quy trình chiết xuất được thể hiện qua Hình 3.1

Thân, lá Chè văng (7,5 kg)

Hình 3.1 Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn từ thân và lá Chè vằng

Cao EtOAc (35,0 g) sau khi lưu mẫu (1,6 g) được phân tách bằng sắc ký cột silica gel, rửa giải bằng dung môi 100% DCM, DCM - MeOH (9:1, 7:1, 5:1, 3:1, 1:1, v/v) và 100% MeOH thu được 7 phân đoạn ký hiệu là El - E7

Tiêp tục phân lập phân đoạn E3 (4,3 g) băng săc ký cột silica gel, rửa giải băng hệdung môi gradient EtOAc - MeOH - H2O (90:9:1 70:25:5, v/v/v) và 100% MeOH thuđược 5 phân đoạn ký hiệu là E3.1, E3.2, E3.3, E3.4, E3.5.

Tinh chế phân đoạn E3.2 (88,0 mg) bằng sắc ký cột silica gel pha đảo RP-C18 với hệ dung môi rửa giải aceton - nước (1:2, 1:1, v/v), thu được họp chat JS1 (12,0 mg)

Tinh chế phân đoạn E3.3 (100,0 mg) bằng sắc ký cột silica gel pha đảo RP-C18, rửa

giải bằng hệ dung môi MeOH - H2O (1:1, v/v), thu được hợp chất JS2 (10,0 mg).

Sắc ký đồ của các họp chất phân lập so với cao tống, cao EtOAc, phân đoạn E3 được thể hiện qua Hình 3.2

Hình 3.2 Sắc kỷ đồ của các hợp chắt phân lập

A: Săc kỳ đô pha đảo với hệ dung môi methanol — nước (1:2, v/v) dưới ánh sáng tử ngoại

ở bước sóng 254 nm.

B: Sắc kỳ đồ pha đảo với hệ dung môi methanol - nước (1:2, v/v) sau khi nhúng dung

dịch acid sulfuric 10% trong ethanol (TT) roi hơ nóng, quan sát dưới ảnh sáng thường

JST: Cao tổng ethanol 80%.

JSE: Cao EtOAc.

E3: Phân đoạn E3.

JS1, JS2: Các hợp chất phân lập được.

Quy trình phân lập hai họp chất JS1 và JS2 được thể hiện tóm tắt qua Hình 3.3

Cao EtOAc

(33,4 g)

Hình 3.3 Sơ’ đô quy trình phân lập hai họp chải JSI và JS2

3.2.2 Xác định cấu trúc của các họp chất phân lập

và 123,9), cũng cho thấy sự xuất hiện của hệ ABX trong cấu trúc của JS1 Phố khối ESI-

MS (Phụ lục 3.3) của JS1 cho pic ion giả phân tử tại m/z 153,10 [M-H]’, phù họp với công thức phân tử C7H6O4 Từ những phân tích trên kết họp so sánh với tài liệu tham khảo [62], có thế xác định JS1 là acid protocatechuic (Hình 3.4)

9 r Bảng 3.2 Dữ liệu phô của họp chât JS1 và acid protocatechuic

Phổ ’H-NMR cho thấy JS2 có chứa nhóm phenylethanoid với các tín hiệu đặc trưng

tại ổH 6,72 (1H, á, J = 2,0 Hz, H-2'); 6,70 (1H, d, 7 = 8,0 Hz, H-5'); 6,59 (1H, dd, J = 2,0;

8,0 Hz, H-6'); 2,82 (2H, m, H-7'); 3,75 (1H, m, H-8') và 4,07 (1H, m, H-8') Các tín hiệu tại ỔH 7,07 (1H, á,J= 2,0 Hz, H-2); 6,80 (1H, d, 7 = 8,5 Hz, H-5) và 6,98 (1H, dd, J = 2,0; 8,5 Hz, H-6) cùng với 2 tín hiệu tại ổh 7,61 (1H, br d, J = 15,5 Hz) và 6,30 (1H, br d,

J = 16,0 Hz) đặc trưng cho cấu hình acid írans-caffeic Ngoài ra, trên phổ ^-NMR của

H-l"') lằn lượt của gốc đường glucose và rhamnose Hằng số tưong tác lớn J = 8,0 Hz đặc

trưng cho cấu hình p của gốc đường glucopyranoyl cấu hình a của gốc đường rhamnopyranosyl được xác định thông qua hằng số ghép J = 1,5 Hz Phổ 13C-NMR và

DEPT của JS2 xuất hiện tín hiệu của 29 nguyên tử carbon, trong đó có 8 carbon của nhóm phenylethanoid (de 146,1; 144,7; 131,5; 121,3; 116,5; 116,3; 72,3 và 36,6), 9 carbon của gốc acid irarcs-caffeic (ífc 168,3; 149,8; 148,0; 146,8; 127,7; 123,2; 117,1; 115,3 và 114,7), 6 carbon của gốc đuờng glucopyranosyl (<5c 103,0; 81,7; 76,2; 76,1; 70,6

và 62,4) và 6 carbon của gốc đường rhamnopyranosyl (ổc 104,2; 73,8; 72,3; 72,1; 70,4 và 18,4) Phố HMBC cho thấy tương tác giữa proton H-l w Rha (<5 h 5,20) với C-3" gic (de 81,7) khăng định vị trí gắn của gốc đường rhamnopyranosyl tại C-3" gic Vị trí của gốc đường glucopyranosyl được xác định thông qua các tương tác giữa H-1" gic (dh 4,40) với C-8' (ỏc 115,3) và H-4" gic ( ã 4,94) với C-9 (db 168,3) Phố khối ESI-MS của hợp chất JS2 có pic ion giả phân tử ở m/z 623,2 [M-H]’, 647,2 [M+Na]+ phù hợp với công thức phân tử là

‘H-NMR (400 MHz)

13C-NMR (100 MHz)

Hình 3.5 Câu trúc hóa học và tương tác HMBC chính của hợp chât JS2

3.3 Bàn luận

3.3.1 về kết quả định tỉnh

Kết quả định tính các nhóm chất thường gặp bằng các phản ứng hóa học đặc trưng cho thấy thân và lá Chè vằng chứa chất béo, carotenoid, phytosterol, saponin, flavonoid, đường khử tự do và acid amin Phương pháp này đơn giản, dễ thao tác, phù hợp với nhiều mẫu nghiên cứu trong điều kiện phòng thí nghiệm

Ket quả định tính giúp phân tích sơ bộ thành phần hóa học có trong thân và lá Chè vằng, từ đó là cơ sở định hướng cho việc chiết xuất và phân lập các hợp chất hóa học từ loài cây này

3.3.2 về kết quả chiết xuất

Phương pháp dùng để chiết dược liệu là phương pháp ngâm lạnh (ngâm ở nhiệt độ phòng) với dung môi chiết là EtOH 80%, tỷ lệ DL/DM =1:8 (kg/1) X 3 lần, mồi lần chiết kéo dài trong vòng 3 ngày Việc lựa chọn phương pháp ngâm lạnh vì phương pháp này có những ưu điểm sau:

- Quy trình và dụng cụ đơn giản, ít tốn kém, phù hợp với quy mô phòng thí nghiệm

- Thích hợp với nhiều loại dược liệu và nhiều loại dung môi

- Hạn chế sự phân hủy các hoạt chất kém bền với nhiệt

Tuy nhiên, phương pháp này cũng có nhiều hạn chế như thao tác thủ công, tốn thời gian, dịch chiết loãng do chiết nhiều lần gây tốn dung môi, hiệu suất thấp hơn so với các phương pháp khác như chiết hồi lưu, ngấm kiệt, soxhlet, Do đó, quy trình chiết xuất đã thực hiện các biện pháp nhằm tăng hiệu suất chiết như: (1) Thái nhỏ, sấy khô thân và lá Chè vằng trước khi chiết, làm tăng diện tích tiếp xúc giữa dung môi và dược liệu; (2) Thi thoảng có khuấy trộn hồn hợp chiết để tăng chênh lệch nồng độ hoạt chất ở bề mặt phân cách pha; (3) Tỷ lệ DL/DM phù hợp Ngoài ra, việc lựa chọn dung môi chiết xuất cao tống là ethanol 80% là vì những nguyên nhân sau:

- Theo cuốn "Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ" (2007), tác giả Nguyễn Thị Kim

Phụng đã đê cập rằng: "Khi cần phải chiết lấy toàn bộ các hợp chất có trong bột cây, các nhà hóa học các họp chảt thiên nhiên thường hay sử dụng dung môi là alcol 80% (ethanol, methanol), vì loại dung môi này có khả nẫng thẩm thấu xuyên qua màng tế bào thực vật, cũng như có thể tạo nối hydrogen liên phân tử với các nhóm phân cực khác, nên được xem là dung môi vạn năng, có thể chiết được cả các hợp chắt có độ phân cực mạnh, vừa và yếu" [9], dẫn đến tăng hiệu suất chiết.

- An toàn, ít độc, giá thành thấp

- Nhiệt độ sôi của ethanol thấp hon so với nước, thuận lợi khi cô thu hồi dung môi,

giảm sự phân hủy các hoạt chất trong dịch chiết

- Ethanol có tác dụng bảo quản, hạn chế nhiễm khuấn so với dung môi nước, do đó

có thể ngâm dược liệu trong nhiều ngày

Từ những ưu điểm trên mà khóa luận đã chọn ethanol 80% là dung môi chiết xuất thay vì dung môi nước (vốn là dung môi được người dân dùng đế sắc Chè vằng uống trong đời sống hằng ngày)

Từ cao tổng, tiến hành chiết lỏng - lỏng lằn lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần: /1-hexan, DCM và EtOAc, thu hồi dung môi thu được các cao phân đoạn tương ứng

3.3.3 về kết quả phân lập các hợp chất

Khóa luận tiến hành phân lập các hợp chất hóa học bằng phương pháp sắc ký cột cổ điến vì phương pháp này sử dụng thiết bị, dụng cụ đơn giản hơn so với các phương pháp sắc ký cột cải tiến, phù hợp quy mô phòng thí nghiệm Khảo sát các vết hợp chất bằng sắc

ký lớp mỏng với mục đích lựa chọn hệ dung môi pha động tồi ưu và theo dõi quá trình rửa giải

Khóa luận lựa chọn phân đoạn Ethyl acetat để phân lập chất vì lý do sau: Dựa vào tổng quan hóa học về cây Chè vằng cho thấy nhóm hợp chất chính có trong cây Chè vằng

là các họp chất phenylethanoid glycosid và flavonoid Hai nhóm chất này có mặt trong phân đoạn ethyl acetat

Từ phân đoạn EtOAc của dịch chiết cao tổng EtOH 80% đã phân lập được hai hợp

chất là JS1 và JS2 Dựa trên đặc điểm về tính chất lý hóa, khối phổ, phố cộng hưởng từ

hạt nhân, so sánh với các dừ liệu đã được công bố, xác định được hai họp chat JS1 và JS2 lằn lượt là acid protocatechuic và verbascosid

3.3.3.1 về họp chất JS1 (acid protocatechuic, PCA)

Acid protocatechuic (acid 3,4-dihydroxybenzoic) là một acid phenolic tự nhiên được tìm thấy trong nhiều loài thảo dược PCA có nguồn gốc từ loài Bụp giấm (Hibiscus

sabdariffa) [79] Hợp chất này đã được phân lập từ thân và lá Chè vằng trong một nghiên cứu năm 2012 [ 10J Ngoài ra, PCA còn được báo cáo có trong các loài khác thuộc chi

Jasminum như J nudiflorum, J azoricum, J humile, J muliflorum, J officinale, J sambac [47] Acid protocatechuic có nhiều tác dụng sinh học đã được chứng minh như:

vitro, acid protocatechuic cho thấy hoạt động chồng oxy hóa hiệu quả hơn nhiều so với

Trolox ở cả môi trường lipid và nước Do đó, hợp chất này có thể được sử dụng trong ngành dược hoặc công nghiệp thực phẩm như một chất chống oxy hóa tự nhiên [481 •

Một số nghiên cứu của Wen-hu Liu và cộng sự cho thấy acid protocatechuic thể hiện hoạt tính kháng khuẩn in vitro đối với các chủng vi khuẩn như Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA), Klebsiella pneumoniae, Helicobacter pylori, Pseudomonas aeruginosa [51], [79] Nhiều nghiên cứu khác cũng chứng minh rang acid protocatechuic

có tác dụng kháng khuẩn [24], [38], [45], [52], [87]

Trong một nghiên cứu năm 2006, các thử nghiệm về độc tính tế bào cho thấy acid protocatechuic ở nồng độ 100 pmol/L đã tiêu diệt hiệu quả các tế bào ung thư biểu mô tế bào gan Hep-G2 [88] Tác dụng chống ung thư của PCA cũng đã được chứng minh trong nhiều nghiên cứu khác [49], [57], [76]

Năm 2011, Amol B Lende và cộng sự đã tiến hành thử nghiệm đánh giá hoạt động chống viêm của acid protocatechuic trên chuột Kết quả là PCA gây ra sự ức chế đáng kể các tình trạng như phù chân sau, sự hình thành u hạt và chỉ số viêm khớp trong phù do

carrageenan Ngoài ra, PCA cũng tạo ra hoạt động giảm đau đáng kể ở chuột bằng

phương pháp đĩa nóng, điều này rất có lợi vì đau là một triệu chứng thường đi kèm với quá trình viêm [46]

Ngoài các tác dụng sinh học được nhắc đến ở trên, acid protocatechuic còn được biết đến với nhiều tác dụng có lợi khác như:

- Tác dụng bảo vệ tế bào gan [50], [80]

- Tác dụng chống đái tháo đường [32], [68], [69]