- Phương pháp kacs xạ ánh sáng khúc xạ kế: giúp xác định độ ẩm trong mậtong cũng như các dung dịch syrup kẹo, cho kết quả nhanh, dễ sử dụng, thiết bị nhỏgọn nhưng kết quả lại bị phụ thuộ
M c tiêu bài thí nghi m ụ ệ
- N m b t phắ ắ ương pháp th c hành đ nh lự ị ượng hàm lượng tro b ngằ phương pháp tr ng lọ ượng.
- Thành th o các kỹ năng xác đ nh đ m và đ tro trong th c ph mạ ị ộ ẩ ộ ự ẩ b ng phằ ương pháp tr ng lọ ượng
- Xác đ nh đ m trong th c ph m đã ch n (b t b p, s a l ng).ị ộ ẩ ự ẩ ọ ộ ắ ử ỏ
- Xác định hàm lượng tro trong thực phẩm đã chọn.
Nguyên t c ắ
Phương pháp trọng lượng xác định độ ẩm dựa trên nguyên tắc giảm khối lượng của mẫu khi được làm nóng trong tủ sấy trong một khoảng thời gian đủ dài.
Phương pháp trọng lượng xác định độ tro dựa trên khối lượng của phần tro trắng còn lại sau khi nung mẫu trong một khoảng thời gian đủ dài.
S đ trình t ti n hành thí nghi m ơ ồ ự ế ệ
Xác đ nh đ m trong m u b t b p và s a l ng ị ộ ẩ ẫ ộ ắ ữ ỏ
- Sấy đĩa petri cùng nắp ở 105°C, 30’ và để nguội trong bình hút ẩm
- Lấy 3g bột bắp hoặc 2g sửa cho vào đĩa petri và cân cả đĩa và nắp bằng cân
Đặt 4 mẫu vào tủ sấy ở nhiệt độ 105°C trong 3 giờ mà không đậy nắp Sau đó, lấy mẫu ra khỏi tủ sấy, để nguội trong bình hút ẩm và cân mẫu bằng cân 4 số để thực hiện tính toán.
- Mẫu phải nghiền mịn để dễ bay hơi trong quá trình sấy
- Sấy đĩa petri cùng nắp trước khi tiến hành và để nguội trong bình hút ẩm để đảm bảo chén không còn ẩm, giảm sai số
- Khi cân ở cân phân tích 4 số lẻ để đảm bảo sai số là nhỏ nhất và có độ chính xác cao
- Cân mẫu: cân cả mẫu và đĩa giúp lấy chính xác mẫu và thực hiện tính toán.
- Sấy cả đĩa và mẫu để làm giảm khối lượng.
Xác đ nh hàm l ị ượ ng tro b ng ph ằ ươ ng pháp tr ng l ọ ượ ng
Tro tr ngắ Cân Đ ngu iể ộ Đ ngu iể ộ
Tro đen Tro tr ngắ
Nh vài gi t Hỏ ọ 202 ho c HNOặ 3 Đ ngu iể ộ
- Nung chén s 500-600°C đ n kh i lứ ở ế ố ượng không đ i ổ
- Cho vào chén kho ng ả 3g m u th và nung nhi t đ 550-600OCẫ ử ở ệ ộ kho ng 6-7h ả
- Trường h p còn tro đen, l y ra đ ngu i, cho thêm vài gi t H2O2 ho cợ ấ ể ộ ọ ặ HNO3 đ m đ c và nung l i đ n tro tr ng kho ng 30 phút ậ ặ ạ ế ắ ả
- Cân chính xác sau khi b vào bình hút m đ tránh sai s ỏ ẩ ể ố
- Cho vài gi t H2O2 ho c HNO3 đ m đ c và nung l i đ t o ra ph n ngọ ặ ậ ặ ạ ể ạ ả ứ oxi hóa.
K t qu ế ả
KL ẩm (g) Độ ẩm (%) Độ ẩm trung bình (%)
M uẫ Kh i lố ượng chén (g) Kh i lố ượng m u (g)ẫ Kh i lổ ượng chén và m u sau khi nung (g)ẫ
* Xác đ nh đ m b ng phị ộ ẩ ằ ương pháp trong lượng
- Qua b ng 1.1, ta có th th y đ m c a m u b t b p qua m i l n thíả ể ấ ộ ẩ ủ ẫ ộ ắ ỗ ầ nghi m có s chênh l ch nh , kho ng 12%.ệ ự ệ ỏ ả
- Xác đ nh đ m b ng phị ộ ẩ ằ ương pháp trong lượng cho k t qu có đế ả ộ chính xác tương đ i cao, giúp ta đ t đố ạ ược m c tiêu ban đ u đ ra nh ng kháụ ầ ề ư t n th i gian (trên 5h).ố ờ
* Xác đ nh hàm lị ượng tro b ng phằ ương pháp tr ng lọ ượng
- Hàm lượng tro được tính theo công th c:ứ
+ G1: trọng lượng chén và mẫu trước khi nung (g)
+ G2: trọng lượng chén và mẫu sau khi nung (g)
- Hàm lượng tro trung bình tính theo % của mẫu sửa lỏng:
Hàm lượng tro trong mẫu sữa lỏng đạt khoảng 0,724%, với sự chênh lệch không đáng kể giữa hai mẫu Kết quả này nhất quán với nghiên cứu của Frédéric Gaucheron trong tác phẩm "The minerals of milk" (2005).
Bàn lu n ậ
Nh n xét ậ
- Kết quả thu được đúng với mục tiêu ban đầu.
- Nhìn chung các thực phẩm dạng rắn (bột bắp) có độ ẩm thấp nhiều hơn các thực phẩm ở dạng lỏng (sữa).
- Độ ẩm và hàm lượng tro tính được gần giống với thực tế.
Đánh giá k t qu ế ả
Kết quả đạt được gần giống với kết quả thực tế của sản phẩm Tuy nhiên vẫn có sai số.
M t s nguyên nhân nh h ộ ố ả ưở ng đ n k t qu ế ế ả
- Thao tác tiến hành sai.
- Để mẫu và dụng cụ quá lâu ngoài không khí.
- Do dụng cụ cân đo không chính xác.
- Sấy chưa đủ lâu để có thể bốc hơi hết lượng nước có trong mẫu thực phẩm, làm sai lệch kết quả đo so với thực tế.
- Khi làm thí nghiệm bị rơi hoặc bay mất một lượng nhỏ mẫu.
- Bình hút ẩm đậy không chặt.
M t s ph ộ ố ươ ng pháp gi m thi u sai s ả ể ố
- Thao tác đúng kỹ thuật thí nghiệm
- Sấy đúng nhiệt độ, đúng thời gian với mẫu thực phẩm
M r ng v n đ ở ộ ấ ề
Có nhiều phương pháp để đo độ ẩm, bao gồm phương pháp khúc xạ ánh sáng, phương pháp Karl Fischer, và sử dụng máy đo độ ẩm hạt, đặc biệt là cho ngũ cốc và một số loại hạt.
Phương pháp khúc xạ ánh sáng (khúc xạ kế) là công cụ hiệu quả để xác định độ ẩm trong mật ong và các dung dịch syrup kẹo Phương pháp này mang lại kết quả nhanh chóng và dễ sử dụng, với thiết bị nhỏ gọn Tuy nhiên, độ chính xác của kết quả có thể bị ảnh hưởng bởi nguồn sáng, và giá thành của thiết bị tương đối cao.
Phương pháp Karl Fischer sử dụng dung dịch pha loãng gồm metanol và n-butanol theo tỷ lệ 1:3:8 v/v/v Dung dịch này được đưa vào máy đo và trộn lẫn với mẫu thử Sau đó, nếu có nước trong mẫu thử, dung dịch chỉ thị màu sẽ được thêm vào để đo sự chuyển màu và kết quả sẽ được ghi lại trên biểu đồ Kết quả này sẽ được so sánh với biểu đồ mẫu chứa các nồng độ 0%, 25%, 50%, 75%, và 100% nước.
Máy đo độ ẩm hạt có hai loại chính: máy đo cầm tay với đầu đo bên ngoài và máy đo có đầu đo bên trong buồng phân tích mẫu Máy đo cầm tay cho kết quả nhanh, thao tác đơn giản, dễ sử dụng và không phá hủy mẫu Tuy nhiên, độ chính xác của máy cầm tay thường thấp hơn khi đo các hạt có kích thước lớn, trong khi máy đo có buồng chứa có kích thước lớn hơn nhưng không linh hoạt.
TÀI LI U THAM KH OỆ Ả
1 Diana M Smith 1954 Maximum moisture content method for determining specific gravity of small wood samples United states department of
2 Frédéric Gaucheron 2005 The minerals of milk INRA, EDP Sciences 45. 473-483.
3 Samir Trabelsi 1998 A Microwave Method for On-line Determination of
Bulk Density and Moisture Content of Particulate Materials IEEE Vol47 No 1.
Đ NH L Ị ƯỢ NG NIT T NG B NG PH Ơ Ổ Ằ ƯƠ NG PHÁP KJELDAHL
S đ ơ ồ
Vô cơ hóa mẫu Phương pháp Kjeldahl
Tính toán Định phân Cất đạm
Gi i thích quy trình ả
Giai đoạn vô cơ hóa mẫu nhằm chuyển đổi tất cả các hợp chất vô cơ và hữu cơ trong mẫu thành các sản phẩm như CO2, H2O, NH3, H2S Phương pháp Kjeldahl, được phát triển bởi Kjeldahl vào năm 1883, là một quá trình oxy hóa ướt sử dụng axit sulfuric đậm đặc, theo nghiên cứu của R.B Bradstreet vào năm 1954.
Lấy 2ml nước nắm bằng micropipet cho vào bình cầu để vô cơ hóa mẫu, sau đó thêm 15ml H2SO4 đậm đặc (tỉ trọng 1.84) Đun nóng hỗn hợp cho đến khi trở nên trong suốt hoàn toàn, đảm bảo tất cả các hợp chất được vô cơ hóa, đồng thời lắc nhẹ để các vết đen trên thành bình trôi xuống.
Quá trình oxy hóa trong các điều kiện hiện tại thường tốn nhiều thời gian, đặc biệt với các mẫu lớn Để cải thiện điều này, kali sulfat đã được bổ sung vào phương pháp oxy hóa, giúp rút ngắn thời gian nhờ vào điểm sôi cao hơn Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng H2O2 35% với khoảng 10 ml.
Pha loãng hỗn hợp về nồng độ của (NH4)2SO4 vừa đủ để chuẩn độ.
Chuyển toàn bộ dung dịch mẫu đã vô cơ hóa vào bình Erlen 100ml và thêm nước cho đủ 100ml Do H2SO4 đậm đặc rất háo nước và tỏa nhiệt mạnh, nên cần để nguội trước khi định mức lại cho đủ 100ml.
Giải phóng hoàn toàn NH3 từ mẫu và hấp thụ ngay lập tức vào dung dịch H2SO4 0.1N có sẵn trong erlen, với thể tích H2SO4 0.1N được thêm vào là 10 ml.
- Lắp sơ đồ thí nghiệm như hình
Chú ý: Không được lắp lệch, vì khí sẽ bị rò rỉ làm sai lệch kết quả
- Lấy 10ml dung dịch thí nghiệm đã chuẩn bị ở trên cho vào bình cầu, cho tiếp 10 ml NaOH 40% vào bình cầu và tiến hành cất đạm khoảng 15-30 phút.
Sử dụng dung dịch NaOH 0.1N để chuẩn độ dung dịch H2SO4 hấp thụ NH3 ở trên còn dư, tứ đó sẽ tính toán và biết hàm lượng nitơ.
Lấy erlen ra khỏi bộ Kjeldahl, đem đi chuẩn độ với NaOH 0.1N trên buret.
- Sử dụng V ml NaOH 0.1N để tính toán ra hàm lượng nitơ.
Hàm lượng Nitơ được tính bằng g/ml, trong đó a là số mL dung dịch chuẩn H2SO4 dùng để hấp thụ NH3, b là số mL dung dịch NaOH 0.1N được sử dụng trong quá trình chuẩn độ, và m là thể tích mẫu được vô cơ hóa (ml).
V: tổng thể tích định mức dung dịch vô cơ hóa (100 mL) v: thể tích dung dịch vô cơ hóa dùng chưng cất (10 mL)
0.0014: lượng Nitơ (g) ứng với 1 mL H2SO4 0.1N
K: hệ số hiệu chỉnh nồng độ NaOH 0.1N (hệ số chuẩn độ được xem là bằng
1 nếu chúng ta sử dụng ống chuẩn).
K được tính bằng tỉ số giữa nồng độ thực tế (Ct) và nồng độ cần pha (Cp) của NaOH Để thực hiện, lấy 10 mL H2SO4 0.1N (chuẩn) vào bình Erlen và tiến hành định phân.
V (mL) NaOH 0.1N (Cp) đã pha sẵn Thêm 3 giọt phenolphtalein Từ thể tích định phân (V) suy ra được Ct và K.
- Thể tích NaOH 0.1N dùng để chuẩn độ là 6.7 ml
- Như vậy theo công thức:
Hàm lượng nitơ tổng trong mẫu nước châm Nam Ngư đệ nhị được phân tích theo phương pháp Kjeldahl là 0.0231 g/ml, tương đương với 2.31 g nitơ có trong 100 ml nước.
- Dựa theo thành phần ghi trên nhãn chai là 2.4 g trong 100 ml sản phẩm. Như vậy, kết quả phân tích có sự sai lệch nhỏ so với sự công bố.
Theo tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5107:2003, hàm lượng nitơ toàn phần trong nước mắm loại 2 phải đạt tối thiểu 10 g/l Do đó, nước chấm Nam Ngư đệ nhị không được phân loại là sản phẩm nước mắm So với công bố của Hội nước mắm Phú Quốc, độ đạm của nước mắm nhỉ thường dao động từ 25-28, cho thấy độ đạm của sản phẩm Nam Ngư đệ nhị cao hơn nhiều.
5.2 Nguyên nhân gậy ra sự sai sót
- Khi đun để vô cơ hóa mẫu dung dịch sôi và bám trên thành bình vì vậy không được vô cơ hóa mẫu hoàn toàn.
- Trong quá trình cất đạm khí bị bay ra ngoài do lắp đặp thiết bị bị lệch.
- Lượng H2SO4 đem đi hấp thu dư không đủ lớn nên không hấp thu triệt để lượng NH3 bay ra.
- Các phương pháp giảm thiểu sai số.
- Khi đun lắc nhẹ để cho các vết đen trôi xuống dung dịch.
- Lắp thiết bị chắc chắn, không bị nghiêng để khí không thoát ra ngoài.
- Lượng H2SO4 đem hấp thụ phải đủ dư.
M r ng v n đ ở ộ ấ ề
Tất cả các phương pháp Kjeldahl hiện nay đều sử dụng K2S04 hoặc Na2S04 để nâng cao nhiệt độ tiêu hóa, cùng với các chất xúc tác như selen, thủy ngân hoặc đồng nhằm thúc đẩy quá trình oxy hóa chất hữu cơ (theo J M Bremner, 1965).
- Phương pháp Kjeldahl có thể bỏ qua ni tơ trong các hợp chất có vòng chứa liên kết N-N, N-O (theo J M Bremner, 1965).
TÀI LI U THAM KH OỆ Ả
3 R.B Bradstreet, 1954, Kjeldahl Method for Organic Nitrogen, Analytical Chemistry, vol 26, No.1.
5.Thầy Trịnh Khánh Sơn, Tài liệu hướng dẫn thí nghiệm phân tích thực phẩm năm học 2017-2018.
Bài báo cáo thí nghiệm số 3: Đ NH LỊ ƯỢNG PROTEIN HÒA TAN B NG PHẰ ƯƠNG PHÁP BIURET
1 M c tiêu bài thí nghi mụ ệ
- Biết được nguyên tắc, phương pháp, cách tiến hành của phương pháp định lượng protein hòa tan bằng phương pháp Kjeldahl.
- Biết cách tính toán tổng hàm lượng protein hòa tan thông qua độ hấp thu.
- Hiểu được phạm vi áp dụng trong các loại thực phẩm của phương pháp Biuret.
- Tiến hành đúng các bước của một bài thực hành phân tích định lượng bằng phương pháp Biuret.
- Biết được các sai số có thể có trong quá trình thức hiện.
Trong môi trường kiềm, mạch peptit kết hợp với Cu2+ tạo thành phức có màu đặc trưng, với độ màu tăng theo hàm lượng protein Cường độ hấp thu của phức được đo ở bước sóng 540nm, tỷ lệ thuận với nồng độ protein trong mẫu Hàm lượng protein trong mẫu được xác định dựa vào phương trình đường chuẩn.
3 S đ trình t ti n hành thí nghi mơ ồ ự ế ệ
Hàm lượng Ni tơ Tính toán
Xác định độ hấp thu Chuyển vào cuvet
Pha loãng mẫu Dựa đường chuẩn huyết thanh bò
Đ NH L Ị ƯỢ NG PROTEIN HÒA TAN B NG PH Ằ ƯƠ NG PHÁP BIURET 17 1 M c tiêu bài thí nghi mụệ
Gi i thích quy trình thí nghi m ả ệ
Dựng đường chuẩn bằng huyết thanh bò
- Dựa vào độ hấp thu của huyết thanh bò để dựng đường chuẩn làm co sở cho việc xác định hàm lượng protein hòa tan trong mẫu thí nghiệm.
- Pha thuốc thử biuret: Hòa tan 0,375 g CuSO4.5H2O và 1,51 g natri kali tartrate
Hòa tan NaKC4H4O6 vào 100mL nước và khuấy đều cho đến khi tất cả các thành phần trong hỗn hợp tan hoàn toàn Tiếp theo, bổ sung 100mL dung dịch NaOH 10% và định mức lên 250mL.
Sự hấp thụ của phức hợp protein-đồng không phụ thuộc vào nồng độ natri hydroxit trong khoảng từ 6% đến 20% Tuy nhiên, khi nồng độ dưới 6%, sẽ xảy ra hiện tượng kết tủa hydroxit đồng Do đó, nồng độ 10% đã được lựa chọn để sử dụng (Theo Ruth F Itzhaki và D.M Gill, 1964).
Để sử dụng đường chuẩn định lượng hàm lượng protein, cần pha loãng mẫu đến nồng độ đủ nhỏ, trong khoảng 2-10 mg protein hòa tan.
Hòa tan mẫu cùng với nước để giảm nồng độ, 2ml mẫu cho vào bình định mức lên 100ml.
Lấy 1ml dung dịch đã pha loãng cho vào ống nghiệm, sau đó thêm 5ml thuốc thử biuret và lắc đều trong 15 phút để hỗn hợp phân tán, giúp protein tạo phức với ion Cu2+.
Chuyển vào cuvet chuẩn bị đem đi do. Đem cuvet có sẵn mẫu đi đo độ hấp thu.
Tính toán giá trị hàm lượng protein hòa tan trong mẫu dựa vào đường chuẩn và độ hấp thu đo được.
Giá trị độ hấp thu đo được
Pha loãng 10 lần Pha loãng 5 lần
- Hàm lượng protein hòa tan trong mẫu pha loãng 5 lần: 0.116 mg/ml.
- Vậy hàm lượng protein hòa tan trong mẫu ban đầu là: 0.116*5*20.6mg.
Hàm lượng protein hòa tan trong mẫu nước chấm Nam Ngư Đệ Nhị là 58 mg trên tổng số 2.4 g protein trong 100 ml, cho thấy tỷ lệ protein hòa tan rất nhỏ Do đó, giá trị dinh dưỡng của sản phẩm này không đáng kể.
*Các nguyên nhân dẫn đến sai sót trong quá trình thực hiện thí nghiệm
- Dung dịch đem đi do không được trong suốt, có cặn.
- Bề mặt cuvet có dấu vân tay.
- Lấy hóa chất không chính xác.
Cách kh c ph c sai sót ắ ụ
- Sử dụng micropipet để lấy chình xác lượng dung dịch, cân chính xác khối lượng.
M r ng ở ộ
Ngoài phương pháp Biuret để định lượng protein, phương pháp Lowry, một cải tiến của Biuret, cũng được sử dụng Mặc dù phương pháp Biuret có mối tương quan tuyến tính tốt hơn giữa nồng độ protein và độ hấp thụ, nhưng độ nhạy của nó không cao Do đó, phương pháp Lowry, với độ nhạy tốt hơn, thường được ưa chuộng hơn trong các nghiên cứu (S.Tsuyoshi Ohnishi và James K.Barr, 1977).
Một phương pháp biuret đã được cải tiến để tăng độ nhạy và giảm sự can thiệp, cho phép sử dụng với cả vi khuẩn toàn phần và protein tinh khiết Độ hấp thụ của phức hợp đồng peptide được đo để đánh giá kết quả.
Tại bước sóng 330 nm, các axit nucleic không có khả năng hấp thụ, đồng thời có sự hiện diện của các ion amoni và base Ngoài ra, không có sự ảnh hưởng từ một lượng nhỏ axit, base, đệm hoặc ion amoni (Arthur L Koch và Susan L Putnam, 1971).
1 Arthur L.Koch và Susan L.Putnam, 1971, Sensitive Biuret Method for
Determination of Protein in an Impure System Such as Whole Bacteria,
2 Mary Ann K Markwell, Suzanne M Haas, L L Bieber và N E. Tolbert, 1978, A Modification of the Lowry Procedure to Simplify Protein
Determination in Membrane and Lipoprotein Sample, ANALYTICAL
3 Ruth F.Itzhaki và D.M Gill, 1964, A Micro-Biuret Method for
4 S.Tsuyoshi Ohnishi và James K.Barr, 1977, A Simplified Method of
Quantitating Protein Using the Biuret and Phenol Reagents, ANALYTICAL
Đ NH L Ị ƯỢ NG LIPID T NG TRONG M U R N B NG PH Ổ Ẫ Ắ Ằ ƯƠ NG PHÁP SOXLET
M c đích bài thí nghi m ụ ệ
Xác định lipid trong nguyên liệu hoặc sản phẩm thực phẩm dạng rắn bằng phương pháp trích ly với dung môi hữu cơ.
Sử dụng dung môi kỵ nước để trích ly hoàn toàn lipid từ nguyên liệu nghiền nhỏ, các hợp chất màu, vitamin tan trong chất béo và các chất mùi cũng được trích ly, nhưng hàm lượng của chúng tương đối thấp, không ảnh hưởng đáng kể đến kết quả Phần trích ly này chứa tạp chất và được gọi là lipid tổng hay dầu thô.
Hàm lượng lipid tổng có thể được xác định bằng cách cân trực tiếp lượng dầu sau khi chưng cất và loại bỏ dung môi, hoặc thông qua việc tính toán gián tiếp dựa trên khối lượng bã còn lại sau khi đã trích ly hoàn toàn lipid bằng dung môi.
Bàn lu n ậ
Hàm lượng protein hòa tan trong mẫu nước chấm Nam Ngư Đệ Nhị là 58 mg trên tổng số 2.4 g protein trong 100 ml, cho thấy tỷ lệ protein hòa tan rất nhỏ Do đó, giá trị dinh dưỡng của sản phẩm không đáng kể.
*Các nguyên nhân dẫn đến sai sót trong quá trình thực hiện thí nghiệm
- Dung dịch đem đi do không được trong suốt, có cặn.
- Bề mặt cuvet có dấu vân tay.
- Lấy hóa chất không chính xác.
5.2 Cách kh c ph c sai sótắ ụ
- Sử dụng micropipet để lấy chình xác lượng dung dịch, cân chính xác khối lượng.
Ngoài phương pháp Biuret để định lượng protein, phương pháp Lowry, một cải tiến của Biuret, cũng được sử dụng Mặc dù phương pháp Biuret có mối tương quan tuyến tính tốt hơn giữa nồng độ protein và độ hấp thụ, nhưng độ nhạy của nó không cao Do đó, phương pháp Lowry, với độ nhạy tốt hơn, thường được ưa chuộng hơn trong các nghiên cứu (S.Tsuyoshi Ohnishi và James K.Barr, 1977).
Một phương pháp biuret đã được cải tiến để tăng cường độ nhạy và giảm thiểu sự can thiệp Phương pháp này có thể áp dụng cho cả vi khuẩn toàn phần và các protein tinh khiết Độ hấp thụ của phức hợp đồng peptide được đo lường chính xác.
Tại bước sóng 330 nm, các axit nucleic không có khả năng hấp thụ, đồng thời có sự hiện diện của các ion amoni và base Ngoài ra, không có sự ảnh hưởng từ một lượng nhỏ axit, base, đệm hoặc ion amoni (Arthur L Koch và Susan L Putnam, 1971).
1 Arthur L.Koch và Susan L.Putnam, 1971, Sensitive Biuret Method for
Determination of Protein in an Impure System Such as Whole Bacteria,
2 Mary Ann K Markwell, Suzanne M Haas, L L Bieber và N E. Tolbert, 1978, A Modification of the Lowry Procedure to Simplify Protein
Determination in Membrane and Lipoprotein Sample, ANALYTICAL
3 Ruth F.Itzhaki và D.M Gill, 1964, A Micro-Biuret Method for
4 S.Tsuyoshi Ohnishi và James K.Barr, 1977, A Simplified Method of
Quantitating Protein Using the Biuret and Phenol Reagents, ANALYTICAL
Bài báo cáo thí nghiệm số 4: Đ NH LỊ ƯỢNG LIPID T NG TRONG M U R N B NG PHỔ Ẫ Ắ Ằ ƯƠNG PHÁP
Xác định lipid trong nguyên liệu hoặc sản phẩm thực phẩm dạng rắn bằng phương pháp trích ly với dung môi hữu cơ.
Sử dụng dung môi kỵ nước để trích ly lipid từ nguyên liệu nghiền nhỏ, quá trình này cũng thu hồi một số hợp chất hòa tan trong chất béo như vitamin và hợp chất màu, nhưng hàm lượng của chúng thấp và không ảnh hưởng đáng kể đến kết quả Do sự có mặt của tạp chất, sản phẩm trích ly được gọi là lipid tổng hay dầu thô.
Hàm lượng lipid tổng có thể được xác định bằng cách cân trực tiếp lượng dầu sau khi chưng cất và loại bỏ dung môi, hoặc thông qua khối lượng bã còn lại sau khi đã trích ly hoàn toàn lipid bằng dung môi.
3.1 S đ kh i các công đo n hay quá trình th c hi n thí ơ ồ ố ạ ự ệ nghi mệ
3.2 Gi i thích m c đích các công đo n, các thông s thí nghi m.ả ụ ạ ố ệ
- Nghiền: Cân 5g nguyên liệu đã được nghiền nhỏ để tăng diện tích tiếp xúc giữa mẫu và dung môi để tăng hiệu suất và giảm thời gian trích ly.
Sấy nguyên liệu là quá trình quan trọng, trong đó mẫu được sấy khô ở nhiệt độ 105℃ cho đến khi đạt khối lượng không đổi Mục đích của việc này là loại bỏ hoàn toàn độ ẩm trong đậu phộng, từ đó tăng hiệu suất trích ly Nếu nguyên liệu có nhiều độ ẩm, nước trong nguyên liệu sẽ cản trở khả năng hòa tan của các chất cần trích ly vào dung môi.
- Gói kín mẫu bằng giấy lọc tránh nguyên liệu mẫu (đậu phộng) cùng với dung môi trích ly theo ống siphon rơi xuống bình cầu.
Dung môi petroleum ether là lựa chọn hiệu quả để trích ly các hợp chất trong chất béo Để tối ưu hóa quá trình trích ly, cần đảm bảo dung môi ngập hoàn toàn và tiếp xúc đầy đủ với đậu phộng trong túi giấy.
Bật công tắc bộ gia nhiệt và điều chỉnh nhiệt độ
Mở nguồn nước làm lạnh Đổ dung môi
Cho vào trụ chiết Để ráo Trích ly
Cân Để nguộiSấy khô Lipid Cân
Đun sôi dung môi trong bình cầu bằng bếp cách thủy giúp dung môi bay hơi được làm lạnh và ngưng tụ tại tháp trích ly Trong quá trình này, dung môi sẽ trích ly chất béo, và khi dung môi trong tháp vượt quá đầu ống siphon, nó sẽ tràn về bình cầu cùng với chất béo Dung môi tiếp tục bay hơi, trong khi chất béo với nhiệt độ sôi cao hơn sẽ ở lại trong bình cầu Quá trình tuần hoàn này cho phép trích ly toàn bộ chất béo trong mẫu sau khoảng 8-12 giờ.
- Sấy khô túi giấy và mẫu: Làm bay hơi hết lượng dung môi lẫn trong túi giấy và mẫu
Sau khi sấy, cần làm nguội mẫu bằng cách đặt vào bình hút ẩm để ngăn chặn hiện tượng hút ẩm trở lại Sau đó, tiến hành cân mẫu.
Khối lượng đậu phộng sử dung (g) 5.0064
Khối lượng đậu phộng và giấy sau thí nghiệm Soxlet (g)
Khối lượng túi giấy sau khi sấy (g) 2.6680
Hàm lượng chất béo có trong mẫu (%)
* Hàm lượng (%) chất béo được tính theo công thức sau:
: Khối lượng túi giấy và mẫu ban đầu (g)
: Khối lượng túi giấy và mẫu sau khi trích ly lipid và sấy khô (g)
: Khối lượng mẫu ban đầu (g)
Hàm lượng chất béo trong đậu phộng khá cao, do đó cần phải định lượng một cách chính xác để thu được hàm lượng chất béo cao nhất.
5.1 Nh n xét k t qu và so sánh v i s li u th c tậ ế ả ớ ố ệ ự ế
Hàm lượng chất béo trong đậu phộng dao động từ 44-56% (Cobb và Johnson, 1973), trong khi kết quả phân tích thực tế cho thấy là 53.38% Sự chênh lệch này không quá lớn và có thể do sai số trong quá trình thực hiện thí nghiệm.
5.2 Các nguyên nhân nh hả ưởng đ n k t qu thí nghi m, sai sế ế ả ệ ố
Trong quá trình tiến hành, việc cân nguyên liệu có thể không chính xác và có nguy cơ rơi rớt mẫu trong quá trình vận chuyển Ngoài ra, cũng có thể xảy ra tình trạng quên cân túi giấy trước khi thực hiện trích ly.
- Thời gian trích ly chưa chính xác.
- Thời gian sấy chưa đủ để làm bay hơi dung môi.
- Thiết bị trích ly chưa được tốt, có thể là do sai số hệ thống.
5.3 Các phương pháp gi m thi u sai sả ể ố
- Tăng thời gian trích ly và sấy mẫu.
- Hạn chế sai số do thao tác của người làm thí nghiệm.
- Cải thiện thiết bị trích ly.
Lipid trong mẫu thực phẩm được định lượng bằng cách sử dụng dung môi phù hợp để hòa tan lipid ra khỏi các thành phần khác Những dung môi này cần có khả năng bay hơi tốt và thu hồi sản phẩm hiệu quả Các phương pháp trích ly lipid khác nhau sẽ sử dụng các loại dung môi khác nhau, trong đó phương pháp Soxlet thường sử dụng dung môi hexan hoặc petroleum (A.A.C.C., 1916).
Ngoài phương pháp Soxlet, còn có các phương pháp khác như Folch, Bligh và Dyer, được sử dụng phổ biến để khai thác và định lượng chất béo (Christie WW, 2009) Phương pháp Folch sử dụng dung môi Chloroform (Folch, 1975), trong khi phương pháp Bligh và Dyer kết hợp dung môi Chloroform và ethanol (1:1) hoặc Chloroform và Methanol (1:1) (Manirakiza P, 2001).
- Các biện pháp rút ngắn thời gian trích ly, tăng hiệu suất sau trích ly:
+ Kích thước và hình dạng của hạt để tăng khả năng tiếp xúc giữa mẫu và dung môi
Giảm độ ẩm trong mẫu là rất quan trọng, vì độ ẩm cao sẽ làm chậm quá trình khuếch tán và tăng cường sự kết dính của các hạt bột trích ly Ẩm trong bột tương tác với protein và các chất ưa nước, ngăn cản sự thẩm thấu của dung môi vào bên trong hạt bột trích ly.
+ Tăng tốc độ chuyển động để tăng khả năng lôi kéo chất béo ra khỏi hỗn hợp để đi vào dung môi
Đ NH L Ị ƯỢ NG LIPID T NG TRONG M U L NG B NG PH Ổ Ẫ Ỏ Ằ ƯƠ NG PHÁP ADAM ROSE – GOTTLIEB
Gi i thích m c đích các công đo n chính, các thông s ả ụ ạ ố
- Dùng NH3 và cồn để kết tủa và loại protein ra khỏi các hạt cầu béo.
- Dùng diethyl ether và petroleum ether để trích li chất béo và các thành phần không tan trong chất béo.
Hỗn hợp sau khi thêm dung môi và khuấy đều sẽ phân tách thành hai pha: pha nhẹ ở trên chứa dung môi và chất béo, trong khi pha nặng ở dưới bao gồm nước và các chất hòa tan trong nước.
- Đun để dung môi bay hơi.
Sấy (1h) Đun nóng nhẹ đĩa ptri
Thu pha nhẹ và cho vào đĩa petri Để yên 30 phút Cho vào phễu chiết
Tráng erlen bằng petroleum ether
Thêm 25ml petroleum ether Lắc đều trong 5 phút
Hh dung môi và mẫu
1,5ml dd NH3 và 10ml cồn
K t qu ế ả
Hình 5.1 Hỗn hợp dung dịch sau khi tách ra 2 pha
Hình 5.2 Hỗn hợp pha nhẹ sau khi làm bay hơi dung môi
- Hàm lượng chất béo có trong 100ml dịch sữa được tính theo công thức sau:
TF (total fat): Hàm lượng báo trong 100ml dịch sữa (g/100ml)
M: Khối lượng đĩa petri và béo sau khi sấy (g) m: Khối lượng petri ban đầu (g) v: Thể tích sữa đem phân tích (10ml)
Vậy hàm lượng chất béo có trong 10ml dịch sữa là:
Bằng phương pháp Adam Rose-Gottlieb đã định lượng được lipid có tổng có trong 10ml sữa dừa là 9,622g/ml
Mẫu Khối lượng đĩa ban đầu(g)
Khối lượng đĩa và chất béo sau khi sấy (g) Đĩa 1 37,0674 37,5014 Đĩa 2 49,7860 50,3142
Nh n xét k t qu và so sánh v i s li u th c t ậ ế ả ớ ố ệ ự ế
Hàm lượng chất béo thực tế trong sữa dừa được phân tích là 14,1g/100ml, trong khi kết quả phân tích thu được chỉ là 9,622g/100ml Sự chênh lệch này khá lớn và có thể do một số nguyên nhân trong quá trình thực hiện thí nghiệm.
5.2 Các nguyên nhân nh hả ưởng đ n k t qu thí nghi m, sai sế ế ả ệ ố
- Thao tác tiến hành chưa chính xác, sai sót trong quá trình lấy mẫu, lác không đều dẫn đến sai số so cới thực tế.
- Sai số do thiết bị ( sai số hệ thống).
- Thời gian tách hai pha chưa đủ lâu dẫn đến quá trình trích ly mẫu chưa hết hoặc có thể bị thất thoát một phần trong quá trình chiết.
- Do không tráng kỹ erlen khi đỗ hỗn hợp dung dịch vào phiễu chiết, không tráng kỹ phễu chiết khi cho hỗn hợp pha nhẹ vào đĩa.
5.3 Các phương pháp gi m thi u sai sả ể ố
- Hạn chế sai số do thao tác người làm thí nghiệm.
- Tăng thời gian trích ly.
- Chất béo sữa là các hạt triacylglycerol tương đối tinh khiết (Timmen, H.,
Fats in liquid form exist as lipid droplets and are encapsulated and emulsified by a layer of phospholipids and proteins To enhance the extraction efficiency of fats, it is essential to break down these lipid droplets and remove the proteins, allowing the solvent mixture to dissolve the fats more easily.
- Một số phương pháp xác định hàm lượng lipid lỏng:
+ Định lượng lipid toàn phần theo Vowibun-ston (Weibull-stoldt)
TÀI LI U THAM KH OỆ Ả
1 L S Palmer and H V Wiese 1993 J Dairy Sei Vol 16 Page 41.
2 M P Thompson, J R Bronner, C M Stine and K Lindquist 1961 J. Dairy Sci., Vol 44 Page 1589.
3 S Matsushita, F Ibuki, T MoriI and T Hata 1965 Agr Biol Chem Vol 29 Page 436.
4 Timmen, H., & Patton, S (1988) Milk fat globules: Fatty acid composition, size and in vivo regulation of fat liquidity Lipids, 23(7), 685–689.
5 Waistra, P., and Jenness, R (1984) Dairy Chemistry and Physics pp 58-
91, 254-255, John Wiley and Sons, New York.
Đ NH L Ị ƯỢ NG Đ ƯỜ NG KH B NG PH Ử Ằ ƯƠ NG PHÁP QUANG PH SO Ổ MÀU V I THU C TH DNSỚỐỬ
S đ kh i trình t các b ơ ồ ố ự ướ c thí nghi m ệ
Hình 6.2 S đ các bơ ồ ước ti n hành thí nghi mế ệ
Gi i thích ả
Đun sôi cách thủy nghiệm đã đủ chuẩn bị nhằm tăng tốc độ phản ứng giữa các dung dịch có màu khác nhau, tạo ra các sản phẩm hấp thụ ánh sáng ở các bước sóng quang khác nhau.
- Làm l nh v nhi t đ phòng trạ ề ệ ộ ước khi đo vì đ h p th r t nh yộ ấ ụ ắ ạ v i nhi t.ớ ệ
Cho 2-3 mL mẫu vào cuvet, sau đó đo mật độ quang bằng thiết bị quang phổ màu ở bước sóng 540 nm Màu sắc của dung dịch sẽ khác nhau, dẫn đến kết quả đo mật độ quang khác nhau Đồng thời, mật độ quang sẽ tăng khi nồng độ dung dịch tăng.
Làm ngu i ngộ ố nghi mệ Đo m t đậ ộ quang
Cho vào dãy ngố nghi mệ Đun sôi cách th y ngủ ố nghi mệ
Dùng đường chuẩn nồng độ đậm đặc 540nm và thiết lập hệ thống tuyền tính giữa nồng độ đậm đặc 540nm: áp dụng tính năng đường chuẩn trong mẫu phân tích.
K t qu và đ th ế ả ồ ị
STT ng nghi mố ệ N ng đ glucose, mg/Lồ ộ Đ h p th Aộ ấ ụ
B ng 6.1 B ng th hi n m i tả ả ể ệ ố ương quan gi a n ng đ đữ ồ ộ ường kh và m tử ậ
B ng 6.2 B ng th hi n m t đ h p th quang ph c a m uả ả ể ệ ậ ộ ấ ụ ổ ủ ẫ
Hình 6.3 Đường chu n n ng đ đẩ ồ ộ ường kh v i m t đ quang ODử ớ ậ ộ 540nm
4.2 Tính toán k t qu và x lý th ng kêế ả ử ố
- Theo s li u và bi u đ ta có đố ệ ể ồ ược ta có phương trình ty n tínhế gi a n ng đ đữ ồ ộ ường kh v i m t đ quang OD540nm :ử ớ ậ ộ
- D a theo phự ương trình tuy n tính gi a n ng đ đế ữ ồ ộ ường kh v i m tử ớ ậ đ quang OD540nm ta tính độ ược hàm lượng đường kh có trong m u phânử ẫ tích:
- Hàm lượng đường kh trong m u khi không pha loãng: ử ẫ
M1, M2: hàm lượng đường kh trong nử ước cam Swister (g glucose)
C1, C2: hàm lượng đường kh có trong m u phân tích (mg/mL).ử ẫ
V1, V2: th tích c a chai nể ủ ước cam Swister (455mL).
V: Th tích pha loãng (mL).ể n: s l n pha loãng ố ầ
K t lu n ế ậ
- V i h s tớ ệ ố ương quan R= 0.997 th hi n m i quan h ch t chẽ gi aể ệ ố ệ ặ ữ m t đ h p th quang v i n ng đ c a glucose ậ ộ ấ ụ ớ ồ ộ ủ
- K t qu kh o sát hàm lế ả ả ượng đường kh trong m u Swister 455mLử ẫ kho ng 9,9g (glucose), v i k t qu có s sai l ch khá th p.ả ớ ế ả ự ệ ấ
Khi tăng nồng độ dung dịch glucose 0.1%, độ hấp thụ quang ở bước sóng 540nm tăng dần theo thứ tự từ thí nghiệm 1 đến 5 Điều này cho thấy mối liên hệ giữa nồng độ glucose và độ hấp thụ quang, cho phép phân tích chính xác hơn về sự thay đổi trong dung dịch.
- K t qu thu đế ả ược có đ chính xác tộ ương đ i cao, các đi m trên đố ể ồ th l ch ít so v i đị ệ ớ ường chu n n ng đ đẩ ồ ộ ường kh v i m t đ quangử ớ ậ ộ
+ Thao tác đo không chính xác
+ Hóa ch t chu n b cho thí nghi m không đấ ẩ ị ệ ược chu nẩ
+ Do v n chuy n m u không đúng cáchậ ể ẫ
+ Ghi s li u không chính xácố ệ
+ Hút hóa ch t không chính xác ấ
- Phương pháp gi m thi u sai s : ả ể ố
+ Thao tác ph i đúng quy trình th tả ứ ự
+ Ki m tra d ng c trể ụ ụ ước khi ti n hành thí nghi mế ệ
Mặc dù đường chuẩn và chương trình tuyển tính có thể giúp xác định các mẫu nguyên liệu cần phân tích, nhưng việc chọn đường chuẩn glucose không phải lúc nào cũng chính xác Điều này là do sự tồn tại của nhiều loại đường khác như fructose, maltose, và các loại đường khác.
TÀI LI U THAM KH OỆ Ả
1 Alexander V Gusakov 2011 Comparison of Two Methods fos
Assaying Reducing Sugars in the Determination of Carbohydrase Activities.
International Journal of Analytical Chemistry Volume 2011 1-5.
2 R F McFeeters 1980 A manual method for reducing sugar determinations with 2,2’-bicinchoninate reagent Analytical Biochemistry.
3 Stephen Dygert 1965 Determination of reducing sugar with improved precision Analytical biochemistry Volume 11 367-374.
Đ NH L Ị ƯỢ NG T NG CARBOHYDRATE B NG PH Ổ Ằ ƯƠ NG PHÁP
Gi i thích m c đích các công đo n chính, các thông s thí nghi m ả ụ ạ ố ệ
- Pha loãng mẫu: Để nồng độ chất cần phân tích rơi trúng vào vị trí đường chuẩn, tăng tính chính xác cho phép đo. Đo độ hấp thụ
Làm nguội Để yên 10 phút
Cho vào dãy ống nghiệmKhử khí CO2
Phản ứng của H2SO4 với dung dịch nước tạo ra nhiệt, làm nóng dung dịch và sinh ra các dẫn xuất furfural Những dẫn xuất này sẽ kết hợp với phenol, tạo ra các hợp chất màu vàng có thể được đo bằng phương pháp quang phổ.
Khi đo độ hấp thụ, cần kiểm tra xem hai bề mặt mà ánh sáng đi qua có bị ướt hoặc có vết bẩn hay không Việc bề mặt bị ướt hoặc bẩn có thể cản trở ánh sáng xuyên qua dung dịch, dẫn đến sai số trong kết quả đo độ hấp thụ của mẫu.
Nồng độ glucose chuẩn (mg/L)
Tính toán k qu và x lý th ng kê ế ả ử ố
A=0.4413C+0.0292 với hệ số tương quan R=0.9862
Dựa vào phương trình đường chuẩn và mật độ quang của mẫu, chúng ta có thể tính toán nồng độ carbohydrate (g glucose/L), với giả định rằng tất cả carbohydrate khi thủy phân sẽ chuyển hóa thành glucose.
- Ước lượng calorie mà lon bia với thể tích 350ml cung cấp cho cơ thể:
Q: Năng lượng cung cấp (Cal)
V: Thể tích lon bia Sài Gòn Special (ml)
Thể tích mẫu pha loãng (ml) n: Số lần pha loãng
Với hệ số tương quan R=0.9862 thể hiện mối quan hệ chặt chẽ giữa mật độ hấp thụ quang ở bước song 490nm và nồng độ glucose chuẩn.
Nh t xét k t qu và so sánh k t qu v i s li u th c t ậ ế ả ế ả ớ ố ệ ự ế
Khi tăng thể tích dung dịch glucose vào các ống nghiệm từ 1 đến 6, mật độ quang hấp thụ ở bước sóng 490nm cũng tăng theo thứ tự từ ống nghiệm 1 đến 6.
- Kết quả thu được có độ chính xác khá cao, độ lệch đường chuẩn là
5.2 Các nguyên nhân nh hả ưởng đ n k t qu thí nghi m, sai sế ế ả ệ ố
- Thao tác của người làm thí nghiệm chưa chính xác, lấy thể tích các dung dịch chưa chính xác, lắc chưa kỹ.
- Do dụng cụ đo: máy quang phổ, micro pipet.
- Ghi số liệu không chính xác
Các ph ươ ng pháp gi m sai s ả ố
- Hạn chế sai sót do thao tác của người làm thí nghiệm.
Among various colorimetric methods for determining carbohydrates, the phenol-sulfuric acid method (M Dubois et al., 1951; M Dubois et al., 1956) stands out as the simplest and most reliable technique for measuring neutral sugars in oligosaccharides, proteoglycans, glycoproteins, and glycolipids This method is widely used due to its rapid and straightforward colorimetric analysis Other methods, such as those using anthrone (A Laurentin, C.A Edwards, 2003), orcinol (M Irwin, A.G Leaver, 1956), or resorcinol (M Monsigny, C Petit, A.C Roche, 1988), also provide quick colorimetric results but are less convenient.
Aldehyde or ketone saccharides undergo dehydration to form furfural derivatives when treated with concentrated sulfuric acid, followed by hydrolysis and condensation with phenol to create a colored complex (Dische, Z., 1955; Ashwell, G., 1957).
- Mẫu được đo ở máy quang phổ ở độ hấp thụ 490nm (Masuko, T et al,2005).
