Nghiên cứu bào chế nano lipid retinyl palmitat ứng dụng vào mỹ phẩm

BỘ YTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRÀN THỊ MỸ DUYÊN NGHIÊN CỨU BÀO CHÉ NANO LIPID RETINYL PALMITAT ỨNG DỤNG TRONG MỸ PHẤM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ HÀ NỘI 2022 BỘ YTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦ[.]

LỜI CẢM ON

Đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng biết on sâu sắc đến PGS TS Trần Thị Hải Yến, người thầy đã luôn động viên, hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập làm khóa luận này

Tôi xin cảm ơn Công Ty cổ Phần Hóa Chất Đại Dương Xanh (BOCC) đã

hỗ trợ nguyên vật liệu cho đề tài của tôi trong suốt quá trình nghiên cứu

Tôi xin được gửi lời cảm ơn đến toàn thể các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên, các anh chị và các bạn sinh viên tham gia nghiên cứu khoa học tại bộ môn Bào chế -

Trường Đại học Dưọ’ c Hà Nội đã hết lòng quan tâm, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất

để tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Tôi xin cảm ơn các thầy cô và các bạn sinh viên tham gia nghiên cứu khoa học tại Viện Công nghệ Dược phẩm và bộ môn Vật lí Hóa lí - Trường đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện và giúp đỡ để tôi có thể sử dụng thiết bị của bộ môn trong quá trình thực hiện khóa luận

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, các thầy cô giáo Trường Đại học Dược Hà Nội đã tâm huyết truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt 5 năm học tập tại trường

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, cảm ơn những người anh, chị, em, người bạn đà luôn ở bên ủng hộ, quan tâm, động viên, giúp đờ tôi trong cuộc sống và học tập, giúp tôi có thêm động lực để học tập, rèn luyện và nghiên cứu tại Trường Đại học Dược Hà Nội

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 27 tháng 06 năm 2022

Sinh viên

Trần Thị Mỹ Duyên

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẤT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÃC HÌNH VỄ, ĐÒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỐNG QUAN 2

1.1. Tổng quan về retinyl palmitat 2

1.1.1 Công thức hóa học, tên gọi 2

1.1.2 Tính chất vật lí, hóa học 2

1.1.3 Độ ổn định 2

1.1.4 Con đường chuyển hóa 2

1.1.5 Tác dụng trên da 3

1.1.6 Hạn chế trong ứng dụng 5

1.2. Tổng quan về hệ nano lipid (NLC) 6

1.2.1 Giới thiệu 6

1.2.2 Thành phần chính 7

1.2.3 Phân loại 8

1.2.4 Ưu nhược điểm 9

1.2.5 ứng dụng hệ tiểu phân nano lipid trong mỹ phẩm 10

1.3 Phương pháp bào chế hệ nano lipid NLC 12

1.3.1 Phương pháp đảo pha (PIT) 12

1.3.2 Các phương pháp bào chế khác 14

1.4. Một số nghiên cứu về nano lipid chứa retinyl palmỉtat và nano lipid được bào chế bằng phương pháp đảo pha 14

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CÚƯ 16

2.1 Đối tượng nghiên cứu 16

2.2 Hóa chất, nguyên liệu và thiết bị thí nghiệm 16

2.2.1 Hóa chất và nguyên liệu 16

2.2.2 Thiết bị 16

2.3. Nội dung nghiên cứu 17

2.4. Phuong pháp nghiên cúu 17

2.4.1 Phương pháp bào chế 17

2.4.2 Phương pháp định lượng retinyl palmitat 20

2.4.3 Phương pháp đánh giá một số đặc tính của tiểu phân NLC-RP 20

2.4.5 Phương pháp xử lí số liệu 24

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KÉT QUẢ VÃ BÀN LUẬN 25

3.1. Thẳm tra độ tuyến tính của phương pháp định lượng retinyl palmitat bằng phương pháp đo độ hấp thụ quang UV-VIS 25

3.1.1 Xác định điểm hấp thụ cực đại 25

3.1.2 Xây dựng đường chuẩn 25

3.2 Khảo sát thông số kĩ thuật và công thức bào chế tiếu phân NLC-RP 25

3.2.1 Khảo sát tốc độ khuấy từ 25

3.2.2 Khảo sát tỉ lệ chất diện hoạt 27

3.2.3 Khảo sát tỉ lệ lipid rắn 29

3.2.4 Khảo sát tỉ lệ lipid rắn và lipid lỏng 34

3.3 Đánh giá một số đặc tính của tiểu phân NLC-RP 36

3.3.1 Đánh giá hình thái tiểu phân NLC-RP 36

3.3.2 Đánh giá mức độ tái kết tinh 36

3.3.4 Đánh giá khả năng thấm và lưu trữ trên da 37

3.2.5 Đánh giá đặc tính bít giừ của gel chứa NLC-RP 39

KẾT LUẬN VÀ ĐÈ XUẤT 40 TÃI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẲT

Tên viết tắt Tên đầy đủ

CP Cetyl palmitat

D/N Dầu trong nước

DĐVN V Dược điển Việt Nam V

DSC Phân tích nhiệt quét vi sai (Differential scanning calorimetry)

EP Dược điển Châu Âu (European Pharmacopoeia)

FESEM Kính hiển vi điện tử quét (Field Emission Scanning Electron

Microscope)

GMS Glyceryl monostearat

HLB Hệ số phân bố dầu nước (Hydrophilic-lipophilic balance)

KTTP Kích thước tiều phân

MCT Triglycerids mạch trung bình (Medium chain triglycerides)

N/D Nước trong dầu

NSX Nhà sản xuất

PDI Chỉ số đa phân tán (Polydispersity index)

PIT Nhiệt độ đảo pha (Phase inversion temperature)

RP Retinyl palmitat

SPF Chỉ số chống nắng (Sun protection factor)

TEWL Mất nước qua biểu bì (Transepiderma water loss)

TKHH Tinh khiết hóa học

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Một số tá dược dùng cho bào chế nano lipid 8

Bảng 2.1. Hóa chất và nguyên liệu thí nghiệm 16

Bảng 2.2. Thiết bị thí nghiệm 16

Bảng 2.3 Vai trò các thành phần trong công thức bào chế 17

Bảng 2.4 Vai trò và nồng độ các thành phần trong công thức bào chế gel chứa RP 19

Bảng 2.5 Các thành phần trong cồng thức bào chế gel chứa NLC-RP 19

Bảng 2.6 Công thức mẫu đối chiếu MO trong đánh giá khả năng thấm và lưu trừ 23

Bảng 3.1. Độ hấp thụ quang của retinyl palmitat theo nồng độ tại bước sóng 325 nm25 Bảng 3.2. Thành phần công thức khảo sát tốc độ khuấy từ 26

Bảng 3.3 KTTP, PDI và thế zeta của Ml, M2 và M3 (n=3, TB ± SD) 26

Bảng 3.4. Thành phần các công thức khảo sát tỉ lệ chất diện hoạt 27

Bảng 3.5 KTTP, PDI và thế zeta của M4, M5, M2 và M6 (n=3, TB ± SD) 27

Bảng 3.6. Thành phần các công thức khảo sát tỉ lệ lipid rắn (n=3, TB ± SD) 29

Bảng 3.7 Số lượng tiểu phân quan sát được bằng mắt thường của M10, Ml 1 và MI2 29

Bảng 3.8 KTTP, PDI và thế zeta của các mẫu M8, M9, M2, MIO, Ml 1 và M12 (n=3, TB + SD) 30

Bảng 3.9. Thành phần các công thức khảo sát tỉ lệ lipid ran: lipid lỏng 34

Bảng 3.10 KTTP, PDI, thế zeta, độ dẫn điện của môi trường và hiệu suất nạp trong các công thức M13, M14, M15 (n=3, TB ± SD) 34

Bảng 3.11. Các thông số đo DSC của M13, M14 và M15 37

Bảng 3.12 Lượng dược chất thấm và lưu trữ trên da của các mẫu M13,M14vàM15 (n=3, TB + SD) 38

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1. Cấu trúc phân tử của retinyl palmitat 2

Hình 1.2 Con đường chuyển hóa của retinoids trên da 3

Hình 1.3 (A) Tác động trên các lóp và tế bào da (B) Tác động cấp độ phân tử 5

Hình 1.4. Phân loại của NLC 9

Hình 1.5 Sự khác biệt về cấu trúc của SLN và NLC 10

Hình 1.6 Hiện tượng hoạt chất di chuyển từ bên trong tiểu phân ra môi trường nước 10 Hình 2.1 Sơ đồ tóm tắt các giai đoạn bào chế NLC-RP 18

Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn độ hấp thụ quang theo nồng độ 25

Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn KTTP, PDI và thế zeta của M l, M2 và M3 (n=3, TB ± SD) .26

Hình 3.3. Đồ thị biểu diễn KTTP, PDI và thế zeta của các mẫu M4, M5, M2 và M6 (n=3, TB + SD) 28

Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn KTTP, PDI và thế zeta của M8, M9, M2, Ml0, Ml 1 và MI2 (n=3, TB ± SD) 30

Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn hiệu suất nạp (EE) và khả năng nạp hoạt chất (LC) của các công thức M8, M9, M2, MIO, Mil vàM12 (n=3, TB ± SD) 31

Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn sự thay đổi KTTP, PDI và thế zeta của các công thức theo thời gian (n=3, TB ± SD) 32

Hình 3.7. Đồ thị biểu diễn sự thay đổi độ dẫn điện của môi trường trong các mẫu theo thời gian (n=3, TB ± SD) 33

Hình 3.8. Đồ thị biểu diễn KTTP, PDI, thế zeta, độ dẫn điện của môi trường và hiệu suất nạp của các mẫu M13, M14 và M15 (n=3, TB ± SD) 35

Hình 3.9. Ảnh chụp FESEM của tiểu phân NLC-RP 36

Hình 3.10 Phổ phân tích nhiệt quét vi sai của M13, M14 và M15 37

Hình 3.11. Đồ thị biểu diễn lượng dược chất thấm và lưu trữ trên da của M13, M14 và M15 (n=3, TB ± SD) 38

Hình 3.12. Đồ thị biểu diễn sự mất nước qua da của các mẫu M13,M14vàM15 (n=3, TB ± SD) 39

ĐẶT VẤN ĐỀ

Lão hóa da biểu hiện bằng sự suy yếu chức năng của da, làm mỏng lớp biếu bì

và hạ bì, làm giảm lượng collagen và elastin, khiến da mất đi độ săn chắc và đàn hồi cũng như bắt đầu xuất hiện các nếp nhăn [37], [41] Lão hóa là quy luật tự nhiên vậy nên con người chỉ có thể làm chậm lại chứ không thế ngăn chặn được quá trình này Chính vì thế, các sản phấm chống lão hóa da luôn nhặn được sự quan tâm đặc biệt và nằm ở phân khúc cao cấp trong thị trường mỹ phẩm

Retinyl palmitat là dẫn xuất este của vitamin A, nằm trong nhóm hoạt chất retinoids được đánh giá là có hiệu quả cao nhất trong các nhóm chất chống lão hóa da Retinyl palmitat làm giảm sự thoái hóa của collagen thông qua việc ức chế enzym collagenase (một loại enzym phá hủy collagen), tăng sinh biểu bì, trung hòa các gốc oxy hóa tự do trong da, giúp da mau lành thương tổn, bảo vệ da trước tia UVB, [69] Mặc dù hiệu quả chậm hơn so với các dẫn xuất khác như tretinoin, retinal hay retinol nhưng retinyl palmitat lại được ưa chuộng nhờ sự bền vừng và khả năng gây kích ứng thấp hơn các dẫn xuất khác [9], [42] Tuy nhiên, retinyl palmitat vẫn tồn tại những hạn chế trong việc ứng dụng vào mỹ phẩm Retinyl palmitat có trọng lượng phân tử lớn (524,9 Da) và đặc tính rất thân dầu (log p=13,8) nên khó thấm vào da [8] Chỉ có khoảng 18% retinyl palmitat trong aceton thấm được vào da sau 30 giờ [10] cấu trúc mặc dù đã được este hóa nhưng vẫn có thế bị oxy hóa, đồng phân hóa, phân hủy và gây kích ứng cho da Vì vậy các nghiên cứu để bọc retinyl palmitat trong một hệ phân phối thuốc đã được thực hiện và phát triển

Hệ tiểu phân nano lipid từ lâu đã chứng minh được ưu điểm trong việc ứng dụng vào ngành công nghiệp mỹ phẩm nhờ sử dụng các thành phần tương thích sinh học và phân hủy sinh học Hệ tiếu phân nano lipid có sự ổn định vật lí tốt và giúp cải thiện sự on định hóa học của dược chất Chúng bám dính và hình thành một lớp màng trên da, ngăn ngừa da mất độ ầm, tăng hydrat hóa da và từ đó giúp hoạt chất có thể thấm sâu hơn vào da [11], [44], [66]

Đẻ bước đầu góp phần ứng dụng hệ tiểu phân nano lipid cho dược chất thân dầu, chúng tôi thực hiện đề tài “ Nghiên cứu bào chế nano lipid retinyl palmỉtat ứng dụng vào mỹ phấm” với các mục tiêu:

1 Bào chế được hệ nano lipid chứa retinyl palmitat

2 Đánh giá được một số đặc tính của tiểu phân nano lipid chứa retinyl palmitat

CHƯONG 1 TÔNG QUAN

1.1. Tổng quan về retinyl palmỉtat

1.1.1 Công thức hóa học, tên gọi

All-trans-retinyl palmitat là dẫn xuất este của vitamin A, thuộc nhóm chất retinoids, thu được bằng cách ngưng tụ nhóm cacboxy của acid palmitic với nhóm hydroxy của all-trans-retinol (Hình 1.1)

Hình 1.1 Cấu trúc phân tử của re tiny 1 palmitat

- Tên gọi theo IUPAC: [(2E,4E,6E,8E)-3,7-dimethyl-9-(2,6,6-trimethyl

cyclohexen- l-yl)nona-2,4,6,8-tetraenyl] hexadecanoate

- Tên gọi khác: vitamin A palmi tat, retinol palmi tat

1.1.2 Tính chất vật lí, hóa học

- Dạng vật lí: màu vàng, tồn tại ở trạng thái lỏng [3J

- Tính tan: tan trong hầu hết các dung môi hữu cơ (ethanol, isopropanol,

cloroform, aceton), chất béo và dầu Không tan trong nước và glycerol [55]

- Bị đồng phân hóa và phân húy dưới tác động của tia uv Khi tiếp xúc với

không khí hoặc khí oxy sẽ bị oxy hóa thành chất không có hoạt tính [55]

1.1.3 Độ ổn định

Tính ổn định của retinoids phụ thuộc vào giá trị pH, các chất chống oxy hóa và điều kiện môi trường bảo quản Retinyl palmitat (RP) được ưa thích trong các công thức mỹ phẩm do tính ổn định cao hơn các dẫn xuất khác trong nhóm retinoids [42] Tính ổn định của retinyl palmitat được cải thiện đáng kể nhờ vitamin c và E, butylated hydroxytoluen, và chất chống nắng [20]

1.1.4 Con đưòug chuyển hóa

Hiện nay, các retinoids có trong mỹ phẩm bao gồm retinyl este, retinol, retinaldehyd, acid retinoic, isotretinoin, adapalen và tazaroten Tuy nhiên, các dẫn xuất cần phải chuyển hóa thành acid retinoic để có tác dụng sinh học [69]

Retinyl este đi vào trong da, dưới sự hoạt động của enzym retinyl este hydrolase (REH) sẽ được thủy phân thành retinol [51] Mặt khác, retinol cũng có thể este hóa thành các dẫn xuất retinyl este dưới sự xúc tác của enzyme lecithimretinol acyltransferase (LRAT) [22] Quá trình chuyển đổi retinol thành retinaldehyd được xúc tác bởi hai họ enzym, cytosolic alcohol dehydrogenases (ADHs) và chủ yếu là

retinoic nhờ ba retinaldehyde dehydrogenase (RALDH1, RALDH2 và RALDH3) [50] Quá trình chuyển đổi retinol thành retinal có thể được đảo ngược nhờ enzym DHRS3, một retinal reductase (RALR) nhưng quá trình chuyển đối retinal sang acid retinoic là một chiều [69] (Hình 1.2).

O

Retinvl Ester *

Hình 1.2 Con đường chuyển hóa của retinoids trên daTương ứng với con đường chuyển hóa, thứ tự xếp hạng hiệu quả sau khi bôi retinoids tại chỗ như sau: acid retinoio retinaldehyd> retinol> retinyl este Nói cách khác, càng gần retinoic acid, chúng càng có hoạt tính retinoid cao hơn [64]

1.1.5 Tác dụng trên da

a Tăng sinh và biệt hóa tế bào

Nhóm chất retinoids ảnh hưởng mạnh mẽ đến sự biệt hóa và tăng sinh của tế bào biếu mô Tế bào sừng được nuôi cấy ỉn vitro trong môi trường thiếu acid retinoic

bị giảm tính di động và tăng độ kết dính Việc sản xuất keratins được điều hòa bởi nồng độ retinoids, bổ sung retinoids trong tế bào sừng biểu bì của con người được nuôi cấy dẫn đến tăng biểu hiện của keratin 7, keratin 13, keratin 15 và keratin 19, giảm biểu hiện của keratin 1, keratin 5, keratin 6, keratin 10 và keratin 14 [69], [72]

b Chong lão hóa

Sau khi các dẫn xuất chuyển hóa thành acid retinoic thì acid retinoic sè liên kết với thụ thể acid retinoic (RAR) và thụ thể retinoid X (RXR) để tạo ra những tác động lên gen mục tiêu [30] Cả RAR và RXR đều có trong da người, nhưng RXR-a và RAR-y heterodimers là các thụ thể retinoid có vai trò quan trọng hơn Tín hiệu của chúng giúp tăng sản xuất procollagen, làm tăng sự hình thành collagen loại I và III, ức chế matrix metalloproteinase (có khả năng phân hủy collagen, ức chế sự tổng hợp hình thành collagen mới) [16], [17]

Kong và cộng sự vào năm 2016 đã chỉ ra rằng sử dụng acid retinoic và retinol giúp điều hòa biểu hiện của các gen mã hóa cho collagen loại 1 (COL1A1) và collagen

loại 3 (C0L3A1), từ đó làm tăng sinh protein procollagen I và procollagen III Cả hai họp chất đều làm tăng độ dày biểu bì và giúp giảm nếp nhăn trên khuôn mặt sau 12 tuần điều trị, góp phần chống lão hóa da [32].

c Bảo vệ da trước tia ƯVB

Vào năm 2017, Li và cộng sự đã cho thấy rằng acid retinoic hạn chế tác hại do tia UVB gây ra đối với các sợi collagen, và tăng hàm lượng collagen trong da bị ảnh hưởng [36] Tác dụng của vitamin A như một loại kem chống nắng cũng đã được chứng minh Antille và cộng sự đã báo cáo rằng, sử dụng 2% retinyl palmitat bôi trên

da một lần mỗi ngày trong 2 ngày có khả năng bảo vệ da khỏi ban đỏ do tia ƯVB gây

ra tương đương với một sản phẩm kem chống nắng có chỉ số SPF là 20 [5J Ngoài ra, retinyl palmitat còn được ứng dụng để bảo vệ chống lại sự phá hủy ADN do ánh sáng UVB gây ra [65]

d Làm lành vết thương

Sự thiếu hụt vitamin A làm chậm quá trình tế bào biểu mô di chuyển lên trên để đóng miệng vết thương, giảm tốc độ tổng hợp collagen và hình thành liên kết chéo của collagen mới Các nghiên cứu lâm sàng đã chứng minh rằng việc bôi vitamin A tại chồ hoặc bổ sung bằng đường uống đều giúp kích thích tái tạo biểu bì, tăng tốc độ quá trình đóng miệng vết thương và phục hồi cấu trúc biểu mô, tăng cường sản xuất các thành phần chất nền ngoại bào như collagen loại I và fibronectin, tăng sinh tế bào sừng

và nguyên bào sợi, đồng thời giảm thoái hóa chất nền metalloproteinase

Ờ những người sử dụng glucocorticoid, sau khi bị thương, nồng độ corticosteroid cao sẽ làm chậm sự xuất hiện của các tế bào viêm, nguyên bào sợi; sự lắng đọng của chất nền, collagen và quá trình tái tạo mao mạch Vitamin A đã được chứng minh là làm giảm sự ảnh hưởng của glucocorticoid lên quá trình làm lành vết thương, từ đó giúp tăng tốc độ làm lành vết thương [54]

Một số tác dụng khác của retinoids trên da và trên cấp độ phân tử được trình bày trong hình 1.3 [69]

B I liệu ứng phân tử của AIR A

A

sy biệt hoá nguyên bào sợi

l.àm phăng diêm nôi

(la- biêu bì

Tái tạo mạch máu ị

RARp RARY

Claudin 4 ị

Kalllkreln 6 t Kallikrein 10 ì Hyaluronan '

COL1A1 I COL3A1

Tác dụng phụ khác là nhạy cảm với ánh nắng, thường xảy ra khi bắt đầu điều trị Việc tiếp xúc với ánh nắng có thể tạo ra độc tính cấp tính và mãn tính thông qua việc hình thành các sản phẩm gây độc Retinoids hấp thụ ánh sáng trong phạm vi tia UVA (315-400 nm) nên khi bị tia ƯVA chiếu vào có thể tạo ra các gốc oxy hóa tồn tại trong thời gian ngắn, đà được chứng minh là làm hỏng ADN, protein và dẫn đến hình thành khối u [71] Bệnh nhân đang điều trị bang retinoids nên tránh tiếp xúc với ánh nắng mặt trời và thực hiện các biện pháp tránh nắng như sử dụng kem chống nắng Tuy nhiên, sau vài tháng điều trị, phản ứng của da với bức xạ uv trớ lại bình thường [43]

Phụ nữ trong độ tuổi sinh đẻ và đang cho con bú được khuyên cần thận trọng hoặc ngừng sử dụng retinoids tại chỗ Mặc dù, trong hơn 25 năm sử dụng tretinoin đường bôi cho điều trị mụn trứng cá, không có trường hợp nào gây quái thai và nghiên cứu của Jick cùng cộng sự cũng chỉ ra sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê về khả năng gây quái thai của retinoids [24], [31]

Tuy nhiên, retinyl palmitat lại là một loại retinoid tương đối mới đã được báo cáo là có tác dụng điều trị với khả năng gây kích ứng thấp Retinyl palmitat tạo ra đáp

ứng thấp hơn nên khả năng gây kích ứng cũng thấp hơn so với các dẫn xuất retinoids khác, phần lớn là do khả năng thấm vào da kém Hơn nữa, tính thân dầu cao khiến nó

có nhiều khả năng tồn tại trong lớp phospholipid kép của tế bào sừng [9]

Năm 1987, Ban chuyên gia đánh giá thành phần mỹ phấm đã tiến hành đánh giá

độ an toàn của retinyl palmitat và nhận thấy việc sử dụng retinyl palmitat là an toàn ở mức nồng độ hiện tại trong các sản phẩm đang lưu hành Nồng độ retinyl palmitat từ 0,1% đến 1% trong mỹ phẩm ít gây kích ứng nhất và không gây mẫn cảm cho da Một đánh giá sau đó vào năm 2006 đã đồng tình với công bố đó và đưa giới hạn lên đến 5% cho retinyl palmitat [49]

1.2 Tổng quan về hệ nano lipid (NLC)

1.2.1 Giới thiệu

Đầu những năm 1990, người ta đã kết hợp ưu điểm của hệ tiểu phân rắn, nhũ tương và liposome để tạo ra hệ tiểu phân nano lipid rắn (SLN hoặc lipospheres hoặc nanospheres) [46], [62] SLN được sản xuất bằng cách thay the lipid lỏng/dầu của nhũ tương D/N bằng lipid rắn hoặc hỗn hợp lipid rắn, làm cho các tiểu phân tồn tại ở trạng thái rắn ở cả nhiệt độ phòng và nhiệt độ cơ thể SLN bao gồm từ 0,1% (kl/kl) đến 30% (kl/kl) lipid rắn phân tán trong môi trường nước và được ốn định bằng chất hoạt động

bề mặt, nồng độ tối ưu là 0,5% (kl/kl) đến 5% (kl/kl) [52]

Hệ tiểu phân nano lipid rắn SLN có nhiều ưu điếm như:

- Sử dụng các tá dược tương thích sinh học và phân hủy sinh học, được cho là an

toàn cho cả đường uống và đường dùng tại chồ [57]

- Hạn chế sử dụng dung môi hữu cơ [11]

- Có thể sản xuất quy mô lớn bằng phương pháp đồng nhất áp suất cao, thậm chí

sử dụng dây chuyền sản xuất nhũ tương đế giảm chi phí [45]

- Kiểm soát giải phóng thuốc và đưa thuốc đến vị trí mục tiêu [40]

- Tăng độ ổn định của thuốc [40]

Tuy nhiên cũng gặp phải hạn chế bao gồm: khả năng tải thuốc bị hạn chế bởi độ tan của thuốc trong lipid rắn thấp, hiện tượng tống xuất thuốc ra khỏi hạt nano theo thời gian làm giảm độ ổn định của hệ [45], [62]

Các hạn chế này đã dẫn đến việc nghiên cứu và phát triển hệ nano lipid mới NLC để khắc phục những nhược điểm này Để đạt được khả năng nạp thuốc tối ưu và

độ ổn định theo thời gian, thay vì sử dụng một lipid rắn như với SLN, NLC đã sử dụng hỗn họp lipid rắn và lipid lỏng/dầu rất khác nhau về độ dài mạch carbon, acid béo bão hòa và không bão hòa, để tạo ra nhiều vị trí trống từ sự sắp xếp lộn xộn trong cấu trúc tinh thể, dẫn đến việc hiệu suất nạp thuốc cao hơn [45]

1.2.2 Thành phần chính

a Lipid

Lipid là thành phần chính của các hạt nano lipid, có ảnh hưởng đến khả năng tải thuốc, tính ốn định của chúng và sự giải phóng thuốc Các loại lipid được sử dụng rất

đa dạng, bao gồm acid béo, glycerid và sáp

Khi lựa chọn lipid cần chú ý đến những yếu tố sau [27]:

Độ tan của thuốc trong lipid và sự phân chia thuốc giữa pha lipid/dầu và pha nước: nếu thuốc tan tốt trong lipid sẽ làm tăng hiệu quả nạp thuốc và khả năng nạp thuốc

Tính đa hình của lipid: lipid rắn có nhiều dạng cấu trúc tinh thể sè tạo ra nhiều

vị trí trống trong cấu trúc tiểu phân để nạp thuốc Tuy nhiên, một mạng tinh thể hoàn hảo thì ổn định về mặt nhiệt động học hơn so với những mạng tinh thể khác Các dạng kém bền về mặt nhiệt động học có xu hướng chuyển đổi sang dạng ổn định hơn, làm mất đi các vị trí trống trong cấu trúc và dẫn đến việc tống xuất thuốc theo thời gian

Xu hướng hình thành cấu trúc mạng tinh thế hoàn hảo: các lipid rắn có xu hướng kết tinh theo thời gian đề tạo thành cấu trúc mạng tinh thể hoàn hảo Sự kết tinh của lipid có chuỗi acid béo dài thì chậm hơn so với lipid có chuỗi acid béo ngắn Các hạt nano lipid sử dụng chất mang là sáp được chứng minh ốn định hon về mặt vật lý, tuy nhiên lại tống xuất thuốc đáng kể do có cấu trúc tinh thế có trật tự cao

Do vậy, việc lựa chọn loại và nồng độ các lipi ran, lipid lỏng/dầu rất quan trọng trong việc giảm nhiệt độ nóng chảy nhưng vẫn duy trì trạng thái rắn của hệ tiều phân,

và tạo ra các vị trí trống trong cấu trúc để nạp thuốc và hạn chế sự ảnh hưởng của việc kết tinh các lipid rắn theo thời gian

b Chắt diện hoạt

Chất diện hoạt (còn được gọi là chất hoạt động bề mặt) ở nồng độ thấp sè hấp thụ lên bề mặt phân cách, làm giảm năng lượng tự do bề mặt và do đó làm giảm sức căng bề mặt giữa hai pha

Chúng đóng hai vai trò khá rõ ràng và quan trọng:

- Nhũ hóa lipid nóng chảy trong pha nước

- On định các hạt nano lipid sau khi làm lạnh

Lựa chọn chất hoạt động bề mặt phụ thuộc vào một số yếu tố, bao gồm:

- Đường dùng dự kiến

- Giá trị HLB của chất hoạt động bề mặt

- Tác động đến sự biến đổi lipid và kích thước hạt

- Vai trò trong quá trình phân hủy lipid in-vi vo

Một số nguyên liệu thường sử dụng trong bào chế hệ tiểu phân nao lipid rắn được trình bày trong bảng 1.1

Bảng 1.1. Một sô tá dược dùng cho bào chê nano lipid

Thành phần Nguyên liệu

Lipid rắn

Tristearin, stearic acid, cetyl palmitat, Precirol® ATO 5, Compritol®

888 ATO, Dynasan® 116, Dynasan® 118, Softisan® 154, Cutina®

CP, Imwitor® 900 p, Geleol®, Gelot® 64, Emulcire® 61

Lỉpid lỏng

Tryglycerid mạch trung bình (MCT), dầu paraffin, 2-octyl dodecanol, oleic acid, squalene, isopropyl myristate,vitamin E, Miglyol® 812, Transcutol® HP, Labrafil Lipofile® WL 1349, Labrafac® PG,

polyglycerol methyl glucose distearate

- NLC loại I hay loại "tinh thể không hoàn hảo"

- NLC loại II hay loại “vô định hình”

- NLC loại III hay loại “nhũ tưong kép”

a Loại I

NLC loại I có chất nền lipid rắn với mạng lưới tinh thể không hoàn hảo Sự không hoàn hảo trong cấu trúc tinh thể đến từ sự sắp xếp lộn xộn của các lipid rắn khác nhau đã tạo ra các vị trí trống để tăng nạp dược chất Các vị trí trống được tăng lên bằng cách sử dụng các glycerid chứa các acid béo khác nhau hoặc sử dụng các lipid khác nhau về mặt không gian (ví dụ như sáp, acid béo)

b Loại II

Để đạt được trạng thái ổn định hơn về mặt nhiệt động học, các tiểu phân nano lipid thường kết tinh lại và dẫn đến hiện tượng tống xuất thuốc Để giảm thiểu điều này, NLC được bào chế bằng cách trộn lipid rắn với lipid lỏng Các hạt nano lipid tồn tại ở trạng thái rắn nhưng không kết tinh, lõi lipid đông tụ ớ trạng thái vô định hình Loại NLC này giảm thiểu sự bài xuất thuốc bằng cách duy trì tính đa hình của cấu trúc lipid

c Loại III

NLC loại III là loại dầu trong lipid trong nước Độ hòa tan của thuốc thân dầu trong lipid lỏng/dầu cao hơn trong lipid rắn Trong loại này, một lượng dầu lớn hơn được trộn với lipid rắn Ở nồng độ thấp, các phân tử dầu dễ dàng phân tán vào chất nền lipid Việc bố sung dầu vượt quá khả năng hòa tan của nó dẫn đến sự phân tách pha, tạo ra các ngăn nano dầu nhỏ được bao quanh bởi chất nền lipid rắn Các mô hình như vậy cho phép giải phóng thuốc được kiếm soát và ngăn ngừa rò rỉ thuốc

Loại tinh thể không hoàn hão (I) (imperfect type) thuốc

- Độ tan của dược chất thân dầu trong lipid lỏng/dầu cao hơn trong lipid rắn [73]

- Hỗn hợp các lipid khác nhau tạo ra nhiều vị trí trống từ sự sắp xếp lộn xộn

trong cấu trúc tinh thể [45]

- Thay thế một phần lipid ran bang lipid long giúp làm giảm sự kết tinh bên trong

tiểu phân và từ đó giảm sự tống xuất thuốc ra ngoài [27]

Các đặc điểm trên làm tăng hiệu suất nạp thuốc, khả năng tải thuốc, hàm lượng thuốc trong chế phẩm cuối cùng và độ ổn định vật lí cho thuốc

Ngoài ra, hệ nano lipid NLC cũng tồn tại một số nhược điểm như:

- Hiệu quả trong ứng dụng phân phối thuốc chứa peptid, protein hay gen vẫn cần

được nghiên cứu thêm [11]

- Khi các tiếu phân lipid kết tinh một phần trong quá trình bảo quản, tinh thế từ

tiểu phân này có thể thâm nhập vào pha dầu lỏng của tiểu phân khác thông qua

quá trình tiếp xúc hoặc va chạm, làm cho các hạt dính lại với nhau Hiện tượng này được gọi là sự kết tụ một phần và làm giảm sự ổn định của hệ.

Cấu trúc bao gôm

I loại lipid rắn

Thế hệ 1

SLN

solid lipid nanoparticles

Cung cấp nhiều vị trí cho phân tủ' thuốc

Thế hệ 2

Cẩu trúc lipid

NLC

nanostructured lipid carriers

cắu trúc hao gồm hồn hụp lipid rắn

và lipid lóng

lipid rán lipid lóng (dầu)

Có It hiền vị trí

đê nạp thuốc

(welsh natural stone wall)

(symetrie brick wall)

SLN

vị trí trống "jL l; i

kha năng nạp thuốc tháp do kha năng kết tinh r I

cao I

Bien dổi cấu trúc lipid theo thời gian

khá năng nạp (liiiiíc cao

Không hiến dổi cấu trúc lipid

rống xuất thuốc

On dinh vật lí

Hình 1.5 Sự khác biệt về cấu trúc của SLN và NLC

1.2.5 ứng dụng hệ tiếu phân nano lipid trong mỹ phẩm

a Cải thiện độ ổn định hóa học cho hoạt chất

Một trong những đặc điếm quan trọng nhất của hạt nano lipid là khả năng làm chậm quá trình phân hủy hóa học của các hoạt chất bằng các con đường quang hóa,thủy phân và oxy hóa [11]

Nhũ tưoĩig Liposome l ieu phân nano lipid rắn

Hình 1.6. Hiện tượng hoạt chất di chuyển từ bên trong tiểu phân ra môi trường nước

Với nhũ tương D/N, hoạt chất thân dầu di chuyển nhanh từ giọt dầu ra môi

chất Tương tự với liposome, các hoạt chất thân dầu trong lớp màng kép và các hoạt chất thân nước trong lõi nước cũng xảy ra hiện tượng rò rỉ dược chất.

Tuy nhiên, hiện tượng di chuyển hoạt chất từ các tiểu phân nano lipid rắn ra pha nước bên ngoài lại xảy ra rất chậm và nhờ đó giúp cải thiện sự ốn định hóa học của hoạt chất [44] (Hình 1.6)

b Cải thiện độ ồn định vật lí

Nhược điểm của các hệ phân tán keo là sự kết tụ của tiểu phân trong quá trình bảo quản Điều này có thể được cải thiện bằng cách tăng nồng độ chất ổn định hoặc kết hợp với chất diện hoạt ion hóa [46] Tuy nhiên, một số đường dùng thuốc lại yêu cầu chỉ được sử dụng một vài chất diện hoạt nhất định như thuốc tiêm, thuốc nhỏ mắt, Bên cạnh đó, các sản phẩm mỹ phẩm đang có xu hướng hạn chế sử dụng các chất diện hoạt ion hóa vì khả năng gây kích ứng cao [15]

Ưu điểm của các hạt nano lipid rắn là độ ổn định vật lí tốt hơn so với các hệ phân tán keo khác như nhũ tương hay liposome [48] Freitas cùng cộng sự đã nghiên cứu và bào chế ra hệ SLN sử dụng Compritol®888 ATO và poloxamer 188 có độ ổn định lên đến 3 năm trong điều kiện bảo quản tránh ánh sáng và ở nhiệt độ 8°c [18]

c Giữ ẩm, hydrat hóa da, tăng thấm hoạt chắt

Khi thoa các hạt lipid lên da, lực thoa sẽ dẫn đến sự hợp nhất của các hạt tạo thành một lớp màng Sự hợp nhất này được thúc đấy bởi các lực mao dẫn liên quan trong quá trình bay hơi nước So sánh một lớp hạt nano với một lớp hạt micro cho thấy, các khoảng trống ít hơn thì sự bay hơi của nước sẽ giảm [66] (Hình 1.7)

Khoáng trống bé H2o À H2() 4 H,() À H2o À H2o À H2O Tăng hydrat hoá da

Giảm kích thiróc

Q Q Q Q Q Q

Tăng nồng (lộ ticII phân

OŨOOOOOOOOO

Hình 1.8 Cách tăng cường hiệu ứng bít giữHiệu ứng bít giữ cũng giúp tăng hydrat hóa da do giảm lượng nước mất đi và từ

đó gia tăng khả năng thâm nhập vào da của các thành phần có hoạt tính [44], [66]

d Kiểm soát giải phóng hoạt chất

Quá trình giải phóng hoạt chất sẽ phụ thuộc vào phương pháp bào chế các hạt nano lipid, thành phần của công thức (thành phần và nồng độ của chất hoạt động bề mặt), đặc tính hòa tan của chất hoạt động bề mặt đối với hoạt chất, độ hòa tan (và nồng độ) của hoạt chất trong lipid (hệ số phân bố dầu/nước) Những yếu tố này ảnh hưởng đến cấu trúc bên trong của hạt và tốc độ giải phóng hoạt chất [66] Tùy thuộc vào cấu trúc tiểu phân, quá trình giải phóng có thể thay đổi từ rất nhanh, trung bình hoặc kéo dài [46]

1.3 Phương pháp bào chế hệ nano lipid NLC

1.3.1. Phương pháp đảo pha (PIT)

1.3.1.1 Nguyên tắc

Sự đảo pha từ nhũ tương D/N thành nhũ tương N/D và ngược lại được gọi là

“đảo pha”, tạo ra bằng cách thay đổi nhiệt độ và tại đó xảy ra sự đảo ngược pha được gọi là PIT (phase inversion temperature) [58] Nguyen tắc bào chế dựa trên sự thay đổi tính chất của chất hoạt động bề mặt không ion hóa ở các nhiệt độ khác nhau

Hình 1.9. Giản đồ biểu diễn sự phụ thuộc nhiệt độ của tỉ lệ kết tụ và sức căng bề mặt

Hệ số phân bố dầu nước (HLB) của chất hoạt động bề mặt được xác định ở 25°C Ớ nhiệt độ này, phần thân nước của các chất hoạt động trên bề mặt được ngậm

làm tính thân dầu của các chất hoạt động bề mặt tăng lên cùng với sự giảm giá trị HLB Tại một thời điếm nhất định, các chất hoạt động bề mặt có ái lực với pha nước

và lipid bằng nhau, nhiệt độ này được gọi là nhiệt độ đảo pha (nhiệt độ PIT) Hạt ở trạng thái hạt này có cấu trúc phức tạp và sức căng bề mặt rất thấp

Nếu nhiệt độ được tăng thêm thì ái lực của các chất hoạt động bề mặt trở nên cao hơn, đủ để hình thành và ổn định nhũ tương kiểu N/D Nếu hạ nhiệt độ, hệ phân tán sẽ chuyển sang quá trình ngược lại (Hình 1.9) Các tiếu phân rất nhỏ được hình thành một cách tự phát ngay dưới nhiệt độ đảo pha Nếu làm lạnh nhanh ngay tại điểm này sẽ thu được các tiểu phân với kích thước và độ phân tán mong muốn [19]

Cơ chế hình thành tiểu phân:

- Sự đảo ngược tự nhiên của nhũ tương N/D thành nhũ tương D/N do thay đổi

nhiệt độ bằng các chu kỳ đun nóng-làm lạnh liên tiếp

- Khi làm lạnh nhanh, các giọt nhũ tương vỡ ra và đông lại ở nhiệt độ thấp hơn

nhiệt độ nóng chảy tạo thành các tiểu phân nano lipid

1.3.1.2. Ưu nhược điểm

Phương pháp đảo pha có một số ưu điềm như: thiết bị đơn giản, dễ dàng thực hiện; kích thước tiếu phân bé và độ phân tán thấp; không sử dụng dung môi hữu cơ;

hiệu suất cao [25] Tuy nhiên cũng tồn tại hạn chế, nối bật là việc sử dụng nhiệt độ cao trong thời gian dài có thể ảnh hưởng đến độ ổn định của dược chất [12]

1.3.1.3. Các thông số kĩ thuật cần kiểm soát

a Chất điện giải

Nhiệt độ điểm mây (the cloud point) là nhiệt độ mà tại đó dung dịch chất diện hoạt không ion hóa không hòa tan và khi tăng nhiệt độ sẽ xảy ra sự tách pha do nhóm ethoxy mất nước [38] Sự đảo pha của nhũ tương sẽ xảy ra ở nhiệt độ gần nhiệt độ điếm mây của chất hoạt động bề mặt không ion hóa [61] Sharif và cộng sự đã chứng minh rằng, các chất điện giải làm tăng nhiệt độ điểm mây của dung dịch chất diện hoạt không ion hóa và nhiệt độ đảo pha của nhũ tương [60]

b Số lượng chu kì nhiệt

Đã có báo cáo rằng, kích thước tiếu phân và PDI của hệ giảm khi số lượng chu

kì nhiệt độ tăng lên Tuy nhiên, ảnh hưởng của các chu kỳ nhiệt độ liên quan trực tiếp đến lượng chất hoạt động bề mặt không ion hóa trong hệ: lượng chất hoạt động bề mặt càng thấp, số chu kỳ cần thiết để ổn định hệ nano càng cao [6J

c Tốc độ làm lạnh

Ờ tốc độ làm lạnh chậm, có sự gia tăng kích thước tiểu phân do sự phát triển của hạt khi đi qua vùng kết tụ Mặt khác, ớ tốc độ làm lạnh nhanh hơn, kích thước tiều phân nhỏ hơn do các nhũ tương dành ít thời gian hơn trong vùng kết tụ [25]

1.3.2. Các phương pháp bào chế khác

a Đồng nhất hóa nhờ lực phân cắt lớn và siêu âm

Nguyên tắc: Pha dầu đun chảy đà hòa tan dược chất được phối họp từ từ vào pha nước chứa chất diện hoạt Sau đó khuấy tốc độ cao hoặc siêu âm ở nhiệt độ cao đế hình thành nhũ tương nano Đe nguội hoặc làm lạnh trong điều kiện phù họp sẽ hình thành các tiểu phân nano lipid [1]

Ưu điểm của phương pháp bào chế này là đơn giản, dễ thực hiện ở quy mô phòng thí nghiệm nhưng lại tăng nguy cơ nhiễm tạp kim loại khi tăng thời gian siêu

âm và tiểu phân được bào chế có phân bố KTTP rộng [29]

b Nhũ hóa bốc hơi dung môi

Nguyên tắc: lipid (lipid rắn+lipid lỏng) và hoạt chất được hòa tan trong dung môi hữu cơ không đồng tan với nước (cloroform, cyclohexan, ) Sau đó được phân tán vào pha nước chứa chất nhũ hóa để tạo nhũ tương D/N Bốc hơi dung môi dưới áp suất giảm, lipid và hoạt chất kết tủa tạo thành nano lipid rắn [1]

Phương pháp này có ưu điểm là tránh ứng xuất nhiệt nhưng phải sử dụng dung môi hừu cơ

Các phương pháp bào chế khác:

- Đồng nhất hóa nóng/lạnh

- Phương pháp kết tủa do thay đổi dung môi

- Phương pháp sử dụng chất long siêu tới hạn

- Phương pháp phun sấy

1.4. Một số nghiên cứu về nano lipid chứa retinyl palmitat và nano lipid được bào chế bằng phương pháp đảo pha

Năm 2011, Rong Kong và cộng sự đã nghiên cứu bào chế hệ NLC chứa retinyl palmitat đế ứng dụng trong thực phẩm bằng phương pháp đồng nhất hóa áp suất cao Các đặc tính hóa lý của hạt nano lipid được đánh giá bằng cách sử dụng các thiết bị

phân tích khác nhau như chụp kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM), quang phổ tương quan photon (PCS), đo nhiễu xạ laser (LD) và máy quang phố tử ngoại Các chu kỳ và

áp suất tối ưu tương ứng là 70MPa và 5 chu kỳ KTTP là 144 ± 1,7 nm (với 2% hoạt chất), PD1 đạt 0,234 và hiệu suất nạp hoạt chất lên đến 99,8% Ngoài ra, hạt nano lipid retinyl palmitat có hình cầu, kích thước vào khoảng 60-330 nm tùy theo hàm lượng

retinyl palmitat, giá trị thế zeta đạt từ -18 đến -23 mV [33]

Vào năm 2018, Sham AlZahabi MSc và cộng sự đã nghiên cứu bào chế hệ SLN

và NLC chứa retinyl palmitat sử dụng lipid lỏng là dầu hạt xương rồng (prickly pear seed oil) và phương pháp bào chế là đồng nhất hóa áp suất cao Các thông số đánh giá bao gồm KTTP, PDI, the zeta, hiệu suất nạp hoạt chất, giải phóng hoạt chất ỉn vitro và

các thông số Các tiểu phân NLC có KTTP khoảng 215-244 nm và PDI <0,3- Ngược lại, tiểu phân SLN có đường kính lớn hơn là 365 nm, với sự phân bố kích thước không đồng nhất (PDI đạt 0,92) Thử nghiệm giải phóng hoạt chất in vitro cho thấy khả năng

giải phóng hoạt chất của NLC cao hơn SLN gần 2 lần Thử nghiệm đánh giá khả năng

thấm ex vivo của tiểu phân NLC cho thấy các công thức có thể giải phóng từ 200-400

pg và lưu giữ trên da từ 0,5-1,25 pg hoạt chất sau 24h [4]

Hệ NLC chứa quercetin đế ứng dụng trong điều trị ung thư vú đã được Ming Sun và các công sự nghiên cứu bào chế bằng phương pháp đảo pha, sử dụng pha lipid

là hỗn hợp bao gồm dược chất, glyceryl tridecanoat, glyceryl tripalmitat, vitamin E

acetat, Kolliphor HS15 và môi trường phân tán là nước khử ion chứa 1% NaCl Kích thước trung bình của Quercertin-NLC là đường 32 nm, PDI chỉ khoảng 0,05 và thế

zeta dao động khoảng -15 mV Quercetin-NLC có độ ổn định hóa học và vật lý tốt,

hiệu suất nạp thuốc lên đến 95% Quercetin là một loại flavonoid phổ biến trong chế

độ ăn uống, đã được nghiên cứu trong việc phòng ngừa ung thư, do độ tan trong nước, tính ổn định, sinh khả dụng thấp đã hạn chế ứng dụng của nó Nhưng sau khi bao bọc quercetin vào hệ NLC, các tác động chống ung thư đã được tăng cường đáng kể nhờ tăng độ tan trong nước ít nhất 1000 lần, tăng độ ổn định và hàm lượng dược chất các tế bào ung thư [68]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cưu

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Hệ nano lipid chứa retinyl palmitat

2.2 Hóa chất, nguyên liệu và thiết bị thí nghiệm

2.2.1 Hóa chất và nguyên liệu

Bảng 2.1 Hóa chât và nguyên liệu thí nghiệm

STT Tên hóa chất, nguyên liệu Nguồn gốc Tiêu chuẩn

2.2.2 Thiết bị

Bảng 2.2. Thiết bị thí nghiệm

3 Thiết bị phân tích kích thước Zetasiser nano ZS90 Malvern Anh

7 Thiết bị đánh giá giải phóng qua màng Hanson Research Đức

2.3 Nội dung nghiên cứu

- Bào chế hệ nano lipid chứa retinyl palmitat

- Đánh giá một số đặc tính của tiểu phân nano lipid chứa retinyl palmitat

9 Máy phân tích nhiệt quét vi sai Mettle Toledo AB 204S Thụy Sĩ

14 Tủ sấy, tủ lạnh, cân kỹ thuật, nhiệt kế, các dụng cụ thủy tinh

và các dụng cụ khác

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp bào chế

2.4.1.1. Phương pháp bào chế NLC-RP bằng phương pháp đảo pha

Tham khảo các tài liệu [19], [25], [68] tiến hành bào chế NLC-RP bằng phương pháp đảo pha theo thành phần (bảng 2.3) và các bước sau:

Bảng 2.3 Vai trò các thành phân trong công thức bào chê

STT Tên chất Kí hiệu Vai trò

Chất ổn định

Mô tả các bước bào chế:

- Chuân bị pha lipid: cân retinyl palmitat, glyceryl monostearat, cetyl palmi tat và

triglycerids mạch trung bình theo công thức Đun nóng hôn hợp lên 80°C, sau

đó khuấy từ nhẹ nhàng với tốc độ 600 rpm để thu được hỗn họp đồng nhất

- Chuân bị pha nước: cân Tween 20 theo công thức rồi hòa tan trong nước tinh

khiết Đun nóng pha nước lên 80°C

- Phối hợp tạo tiền nhũ tương: nhỏ từ từ từng giọt pha nước (tốc độ nhỏ giọt:

2ml/phút) vào pha dầu đang được khuấy trộn ở tốc độ 600 rpm kết họp duy trì nhiệt độ ở 80°C, sử dụng máy khuấy từ gia nhiệt

- Xử lí nhiệt: giảm nhiệt độ của hệ xuống 60°C sau đó lặp lại quá trình đun nóng-

làm lạnh thêm 2 lần Ớ chu kì nhiệt cuối cùng, khi nhiệt độ của hệ giảm xuống 70°C thì làm lạnh nhanh bằng cách ngâm trong nước đá

- Sau khi hỗn dịch NLC-RP đã ổn định về nhiệt độ phòng, bổ sung thêm nước

tinh khiết bù vào phần đã bị bay hoi trong quá trình bào chế

Sơ đồ tóm tắt các giai đoạn:

Hình 2.1 Sơ đồ tóm tắt các giai đoạn bào chế NLC-RP

2.4.I.2 Phương pháp bào chế gel chứa retinyl palmitat 0,1%

Tiến hành bào chế gel chứa retinyl palmitat 0,1 % theo thành phần (bảng 2.4) và các bước sau:

Bảng 2.4. Vai trò và nông độ các thành phân trong công thức bào chê gel chứa RP

STT Nguyên liệu Vai trò Khối lượng (g)

Cân các nguyên liệu theo công thức rồi phối họp theo trình tự sau:

• Hòa tan Nipagin và Nipasol vào Tween 20 và glycerin tạo thành dung dịch

chất bảo quản

• Phân tán retinyl palmitat vào dung dịch chất bảo quản tạo thành hỗn hợp

chứa dược chất

• Phân tán đều gôm xanthan vào nước, ngâm trương nở qua đêm

• Phối hợp hỗn hợp chứa dược chất và chất bảo quản vào gôm xanthan đã

trương nở, khuấy nhẹ một chiều tạo gel đồng nhất

2.4.I.3. Phương pháp bào chế gel chứa NLC-RP 1%

Tiến hành bào chế gel chứa NLC-RP 1 % theo thành phần (bảng 2.5) và các bước sau:

Bảng 2.5 Các thành phần trong công thức bào chế gel chứa NLC-RP

STT Nguyên liệu Vai trò Khối lương (g)

0,0 Ig retinyl palmitat)

Cân các nguyên liệu theo công thức rồi phối họp theo trình tự sau:

• Hòa tan Nipagin và Nipasol vào glycerin

• Phân tán đều gôm xanthan lên bề mặt hỗn dịch NLC-RP và nước, ngâm

trương nở qua đêm

• Phối hợp dung dịch chất bảo quản vào gel và khuấy nhẹ một chiều tạo gel

đồng nhất

2.4.2 Phương pháp định lượng retinyl paỉmitat

Tham khảo tài liệu [67] xây dựng phương pháp định lượng RP bằng quang phố hấp thụ ƯV-VIS

a Xác định bước sóng hấp thụ cực đại

Cân chính xác khoảng 18,18 mg hoạt chất (tương đương với khoảng 10 mg retinyl palmitat), hòa tan vào vừa đủ 100 ml ethanol 96%, thu được dung dịch chuân gốc có nồng độ 100 pg/ml Hút chính xác 1 ml dung dịch trên cho vào bình định mức

25 ml, định mức bằng ethanol 96% thu được dung dịch có nồng độ 4 pg/ml Tiến hành quét độ hấp thụ quang của dung dịch ở dải bước sóng từ 200-800 nm Từ đó xác định được bước sóng hấp thụ cực đại của retinyl palmitat dựa vào hình ảnh quang phổ

b Xây dựng đường chuẩn

- Mầu chuẩn: từ dung dịch chuẩn gốc ở trên, pha loãng bằng ethanol 96% thành

các dung dịch chuẩn có nồng độ lần lượt là 3 pg/ml, 4 pg/ml, 5 pg/ml, 7 pg/ml,

2.4.3.2 Đánh giá kích thước tiểu phân (KTTP), chỉ số đa phân tán (PDI), thế zeta

và độ dẫn điện của môi trường

a Đảnh giá KTTP và PDI

Nguyên tắc:

- KTTP được xác định bằng phương pháp tán xạ ánh sáng động (dynamic light

scattering) Khi chiếu chùm tia laser vào các hạt có kích thước khác nhau sẽ thu được mức độ tán xạ ánh sáng khác nhau Bằng cách phân tích sự dao động của cường độ ánh sáng tán xạ có thể xác định được KTTP

- Phân bố KTTP hay chỉ số đa phân tán (PDI) cho biết khoảng phân bố của

KTTP trong hệ, giới hạn trong khoảng 0 đến 1 Thông thường, giá trị PDI nhỏ hơn 0,1 là tốt nhất, nhỏ hơn 0,3 là tối ưu và nhỏ hon 0,5 là chấp nhận được [59]

Phân tán hỗn dịch thu được vào nước tinh khiết đã lọc qua màng cellulose acetat 0,2 ụm sao cho số lượng photon được phát hiện mỗi giây (count rate) đạt giá trị 200-400 (Kcps) Tiến hành đo KTTP, chỉ số đa phân tán PDI của hỗn dịch bằng thiết

bị Zetasizer Nano ZS90 và cuvet nhựa trong suốt

b Đảnh giá thế zeta và độ dẫn điện của môi trường

Phân tán hỗn dịch thu được vào nước tinh khiết đã lọc qua màng cellulose acetat 0,2 pm đến độ pha loãng thích hợp Tiến hành đo thế zeta và dộ dẫn điện của môi trường bằng thiết bị Zetasizer Nano ZS90 và cuvet đo thế zeta

2.433 Đánh giá độ ổn định vật lí của hỗn dịch NLC-RP

Mầu được đựng trong lọ thủy tinh, bọc trong giấy nhôm và bảo quản trong điều kiện khồng có ánh sáng ở nhiệt độ phòng Đánh giá KTTP, PDI, thế zeta và độ dẫn

điện của môi trường của sau 3 ngày và 7 ngày

2.43.4. Đánh giá hiệu suất nạp

a Phươngphảp định lượng hoạt chất nạp trong NLC

Để định lượng hoạt chất nạp trong NLC, tiến hành xử lí mẫu và định lượng phần hoạt chất tự do

- Mầu thử: cân chính xác khoảng 0,5 g hỗn dịch NLC vừa bào chế được vào bình

định mức 10ml, định mức bằng nước tinh khiết Đem hỗn dịch vừa pha loãng đi siêu li tâm ở tốc độ 20000 rpm trong 30 phút ở 20°C Sau đó đem đi lọc thô để loại các tiểu phân NLC chứa hoạt chất đã bị kết tụ Pha loãng phần dịch lọc bang ethanol 96% tới nồng độ thích hợp nằm trong khoảng 3-10 pg/ml

- Khả năng nạp thuốc (LC) được tính theo công thức:

T ío/\— ban đầu " mRP tự do 1 ,

LC (%)= —-7 -

2?

mRP ban đầu~*~ mlipid

2.43.5 Đánh giá hình thái tiểu phân NLC-RP

Sử dụng kính hiển vi điện tử quét trường phát xạ (FESEM)

Nguyên tắc: Trong cột chân không (p=lxio 7 Pa), các điện tử sơ cấp được tập trung lại và điều chỉnh hướng bằng các ống kính điện tử để tạo ra một chùm tia hẹp bắn phá vật liệu Tại các điểm bị bắn phá phát ra các điện tử thứ cấp Tốc độ và góc của các điện tử thứ cấp đại diện cho cấu trúc vật liệu được một dectector ghi lại và tạo