BỘ YTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGÔ GIAO THÔNG NGHIÊN CỨU XÂY DựNG VÀ ỨNG DỤNG TƯƠNG QUAN GIẢI PHÓNG IN VITRO Ở ĐIÊU KIỆN DÀI HẠN VÀ CẤP TÓC CỦA VI CẦU LEUPROLID ACETAT GIÃI PHÓNG KÉO DÀI KHÓA LUẬN[.]
Trang 1BỘ YTẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
NGÔ GIAO THÔNG
NGHIÊN CỨU XÂY DựNG VÀ ỨNG DỤNG TƯƠNG QUAN
DÀI HẠN VÀ CẤP TÓC CỦA
VI CẦU LEUPROLID ACETAT
GIÃI PHÓNG KÉO DÀI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC sĩ
HÀ NỘI - 2022
Trang 2BỘ YTẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
NGÔ GIAO THÔNG
Mã sinh viên: 1701548
NGHIÊN CỨU XÂY DựNG VÀ
ỨNG DỤNG TƯƠNG QUAN
DÀI HẠN VÀ CÁP TÔC CỦA
VI CẦU LEUPROLID ACETAT
GIẢI PHÓNG KÉO DÀI
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC sĩ• • •
Người hưởng dân:
Trang 3Em xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Trần Linh đã quan tâm chỉ dẫn và giúp
đờ em trong suốt thời gian nghiên cứu, thực hiện đề tài
Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô, anh chị kĩ thuật viên Bộ môn Bào chế, Bộ
môn Hóa phân tích, Bộ môn Công nghiệp Dược, Bộ môn Vật lý - Hóa lý đã hết lòng
quan tâm, giúp đờ và tạo điều kiện tốt nhất để em được hoàn thành khóa luận của mình
Em cũng xin chân thành cảm ơn quý thầy cô trong Ban giám hiệu nhà trường, cácphòng ban và cán bộ nhân viên Trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã tạo điều kiện cho em được học tập tiếp thu kiến thức trong suốt 5 năm qua
Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, tập thể sinh viên
đà cùng đồng hành, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận
này
Hà Nội, ngày tháng năm 2022
Sinh viên khóa 72
Ngô Giao Thông
Trang 41.4 Úng dụng tưong quan giải phóng in vitro giữa điều kiện dài hạn và điều kiện
CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CÚƯ 12
2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị sử dụng 12
2.2 Nội dung nghiên cúu 13
2.3 Phương pháp nghiên cúu 14
2.3.4 Phương pháp thử giải phóng dược chất in vitro dài hạn 16
2.3.5 Phương pháp thử giải phóng dược chất in vitro cấp tốc 18
3.1 Xây dựng tương quan giải phóng dược chất in vitro ở điều kiện dài hạn với
điều kiện cấp tốc 21
3.1.1 Mô hình hóa quá trình giải phóng dược chất từ vi cầu 21
3.1.2 Thiết lập mối tương quan về mức độ giải phóng dược chất in vitro điều
3.2 ứng dụng tương quan giải phóng dài hạn - cấp tốc trong khảo sát công thức
Trang 53.2.1, Thử giải phóng dài hạn và dự đoán kết quả thử giải phóng cấp tốc của vi
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
Trang 6DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẲT
Tên viết tắt Tên đầy đủ
DMSO Dung môi dimethyl sulfoxid
L/G Lactic acid/Glycolic acid
KTTP Kích thước tiểu phân
PLGA Poly acid lactic-co-glycolic
PLGA-LA Vi cầu PLGA chứa dược chất leuprolid acetat
kl/kl Khối lượng/khối lượng
kl/tt Khối lượng/thể tích
PVA Poly vinyl alcohol
HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao
(High-performance liquid chromatography)
DSC Phân tích nhiệt vi sai (Differential scanning calorimetry)SEM Kính hiển vi điện tử quét (Scanning Electron Microscope)
GnRH Hormon giải phóng gonadotropin
(Gonadotropin release hormon)
FSH Hormon kích thích nang trứng phát triển
(Follicle-stimulating hormone)
LH Hormon làm noãn trưởng thành
(Luteinizing hormone)
DĐVNV Dược điển Việt Nam V
TKPT Tinh khiết phân tích
TKHH Tinh khiết hóa học
PBS Đệm phosphat saline pH 7,4
PBS-T Đệm phosphat saline pH 7,4 chứa 0,02% Tween 80
PBS-TN Đệm phosphat saline pH 7,4 chứa 0,02% Tween 80 và
0,02% natri diazid
Trang 7DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1 Cơ chế giải phóng dược chất của từng pha trongcác nghiên cứu 4
Bảng 1.2 Cơ chế giải phóng dược chất từ hệ polyme theo tham số mũ 9
Bảng 2.1 Nguyên liệu sử dụng trong nghiên cứu 12
Bảng 2.2 Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 13
Bảng 2.3 Công thức bào chế vi cầu PLGA-LA 14
Bảng 3.1 Khớp mô hình toán học dựa trên dữ liệu giải phóng dài hạn 23
Bảng 3.2 Khớp mô hình toán học dựa trên dữ liệu giải phóng cấp tốc 25
Bảng 3.3 Xác định thời diêm đạt được các mức % dược chất giải phóng 26
Bảng 3.4 Tính toán một số kết quả dựa trên phương trình của mô hình giải phóng và phương trình tương quan về thời gian giải phóng dài hạn-cấp tốc 30
Bảng 3.5 Khớp mô hình và dự đoán một số kết quả giải phóng cấp tốc của 33
Bảng 3.6 Thành phần PLGA trong công thức vi cầu (1) 33
Bảng 3.7 Kết quả so sánh mẫu Ml, M2, M3 với MO 35
Bảng 3.8 Thành phần PLGA trong công thức vi cầu (2) 36
Bảng 3.9 Kết quả so sánh mẫu Ml, M4, M5 với MO 37
Bảng 3.10 Thành phần PLGA trong công thức vi cầu (3) 38
Bảng 3.11 Kết quả so sánh mẫu Ml, M6, M7, M8 với MO 39
Trang 8DANH MỤC CÁC HÌNH VỄ, so ĐÒ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1 Công thức phân tử leuprolid acetat 2
Hình 1.2 Các quá trình hóa lý xảy ra bên trong vi cầu dẫn đến sự giải phóng dược chất 4
Hình 2.1 Sơ đồ bào chế vi cầu PLGA-LA đông khô 15
Hình 3.1 Đồ thị giải phóng điều kiện dài hạn mẫu MI và M2 (n=3, TB+SD) 21
Hình 3.2 Pha giải phóng ổn định (điều kiện dài hạn) của mẫu MI và M2 22
Hình 3.3 Đồ thị giải phóng điều kiện cấp tốc mẫu MI và M2 (n=3, TB+SD) 24
Hình 3.4 Phương trình hóa học thủy phân PLGA 25
Hình 3.5 Phương trình tương quan về thời gian giải phóng dài hạn - cấp tốc 28
Hình 3.6 Mối liên hệ giữa dữ liệu giải phóng dài hạn và cấp tốc 29
Hình 3.7 Phương trình tương quan về % dược chất giải phóng điều kiện dài hạn - cấp tốc 31
Hình 3.8 Đồ thị giải phóng dài hạn và dự đoán giải phóng cấp tốc 32
Hình 3.9 Ảnh hưởng của sự phối hợp các loại PLGA đến khả năng giải phóng (n=3, TB±SD) 34
Hình 3.10 Ánh hưởng của tỉ lệ các loại PLGA đến khả năng giải phóng 37
Hình 3.11 Ảnh hưởng của chất tạo lỗ xốp đến khả năng giải phóng (n=3, TB±SD) 39
Hình 3.12 Đường giải phóng cấp tốc của mẫu MO, M7, M8 vẽ trên cùng đồ thị 40
Trang 9ĐẶT VẤN ĐỀ
Leuprolid acetat (LA) là một nonapeptid tống hợp, có cấu trúc tương tự với hormon giải phóng gonadotropin nội sinh (GnRH), được dùng đế điều trị các bệnh liên
quan đến hormon như dậy thì sớm phụ thuộc gonadotropin, ung thư tuyến tiền liệt giai
đoạn muộn, ung thư vú, u cơ trơn tử cung [29], [36], [38] LA có thời gian bán thải
tương đối ngắn, nếu bào chế dạng thuốc tiêm giải phóng ngay thì sè phải dùng hàng
ngày Trong khi đó, thời gian điều trị các bệnh liên quan đến hormon thường kéo dài từ
vài tháng đến vài năm Vì vậy, để đảm bảo tuân thủ điều trị của bệnh nhân, việc bào chế thuốc tiêm giải phóng kéo dài là vô cùng cần thiết Trên thế giới, một số công ty đã
thành công trong việc sản xuất thuốc tiêm giải phóng kéo dài chứa LA nạp trong vi cầu
poly acid lactic-co-glycolic (PLGA) nhưng số lượng sản phẩm nhập khấu vào Việt Namcòn rất hạn chế
Với việc tăng cường sử dụng vi cầu PLGA nạp dược chất LA (PLGA-LA) đường
tiêm để kéo dài thời gian tác dụng, nhiệm vụ đánh giá giải phóng dược chất từ dạng bào
chế đã trở thành một khía cạnh quan trọng khi nghiên cứu - phát triển công thức thuốc
Tuy nhiên, quá trình đánh giá giải phóng dược chất từ vi cầu trong điều kiện in vivo và
in vitro dài hạn vừa tốn thời gian vừa tốn kém, đặc biệt là trong giai đoạn xây dựng công thức thuốc và kiểm soát chất lượng sản phẩm lun hành trên thị trường Một phương pháp đáng tin cậy để đánh giá, dự đoán quá trình giải phóng dược chất từ vi cầu trong thời gian ngắn sẽ giúp tiết kiệm chi phí Ngoài ra, phương pháp này phải đơn giản, lặp lại
trong các điều kiện nghiên cứu và có thể áp dụng cho công thức vi cầu phân hủy sinh
học Điều này đã được nêu rõ trong “Hướng dẫn thử hòa tan/giải phóng in vitro của các
dạng bào chế mới/đặc biệt” của Hiệp hội các nhà khoa học dược phẩm Hoa Kỳ/Liên
đoàn dược phẩm quốc tế (AAPS/FIP) [35]
Trước đây, tại trường Đại học Dược Hà Nội, nhóm nghiên cứu đã bào chế thành công và đánh giá được một số đặc tính của vi cầu PLGA-LA [1], [2], [3], [4], [5] Tuynhiên, việc đánh giá khả năng giải phóng dược chất in vitro từ vi cầu ở điều kiện dài hạn
và điều kiện cấp tốc chưa thực sự đầy đủ Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài “ Nghiên
cún xây dụng và úng dụng tương quan giải phóng in vitro ỏ ’ điều kiện dài hạn và
cấp tốc của vi cầu leuprolid acetat giải phóng kéo dài ” với các mục tiêu sau:
1 Mô hình hóa quá trình giải phóng leuprolid acetat in vitro từ vi cầu PLGA.
2 Thiết lập mối tương quan giữa mức độ giải phóng dưọc chat in vitro ỏ ’ điều
kiện dài hạn vói điều kiện cấp tốc.
3 Úng dụng mối tương này trong nghiên cứu xây dựng công thức bào chế vi
câu leuprolid acetat đông khô giải phóng kéo dài.
Trang 10CHƯƠNG 1 TÔNG QUAN
1.1 Tổng quan về leuprolid acetat
1.1.1 Công thức hóa học
Hình 1.1 Công thức phân tử leuprolid acetat
- Công thức phân tử: C59H84N16O12.C2H4O2
- Khối lượng phân tử: 1269,45 g/mol
- Danh pháp IUPAC:
- Cảm quan: bột kết tinh màu trắng hoặc hơi vàng, dễ hút ẩm
- Độ tan: tan tốt trong nước, acid acetic và DMSO (100 mg/ml, 25°C)
- Nhiệt độ nóng chảy: 150-155°C
> Tính chất hóa học [30]
Trong môi trường nước, leuprolid acetat bị phân hủy theo các con đường:
- Thủy phân: phân cắt đầu N - đuôi c của pGlu1, His2, Trp3, Ser4, Tyr5, Leu6, Leu7;
khử hóa-p Ser4; acetyl hóa Ser4, Tyr5, Leu6; đóng vòng His2 và Trp3
- D, L-Isomer hóa His2, Trp3, Ser4, Tyr5, Leu6, Leu7
- Oxy hóa Trp3
1.1.3 Độ ổn định
Năm 2016, Mehdi Rahimi và các cộng sự đã nghiên cứu độ ổn định cùa LA trong
môi trường nước ở các điều kiện khác nhau [30] Kết quả thu được như sau:
- Ảnh hưởng của pH: khi nghiên cứu độ ổn định của LA ở nhiệt độ 37°C trong môi
Trang 11nồng độ LA ở các pH 2, 3, 4 và dược chất LA có độ ổn định cao nhất ở pH 7,4.
- Ánh hưởng của nhiệt độ: hòa tan leuprolid acetat trong dung dịch đệm phosphat
pH 7,4, sau đó bảo quản ở các nhiệt độ khác nhau (-10°C, 4°c, 25°c, 37°C) trong thời gian 35 ngày Kết quả cho thấy dung dịch LA bảo quản ở 4°c có độ ốn định cao nhất
- Anh hưởng của oxy trong dung dịch: hòa tan LA trong dung dịch đệm phosphatcó/không loại oxy, sau đó bảo quản trong 35 ngày Kết quả: ở 4°c, việc dùng nước loạioxy giúp làm tăng ổn định của dung dịch LA
1.1.4 ủng dụng điều trị
Leuprolid là một nonapeptid tống họp, tương tự hormon giải phóng gonadotropin
nội sinh (GnRH) Tuy nhiên, leuprolid có hoạt tính chủ vận mạnh hơn GnRH do có ái
lực cao hơn với thụ thể của GnRH Nhờ có 1 acid amin D trong cấu trúc hóa học (Hình
1.1) mà độ ổn định sinh học của leuprolid đã tăng lên đáng kể [36], dẫn đến thời gian
bán hủy của leuprolid dài hơn GnRH (thời gian bán hủy của leuprolid khoảng 3 giờ,
trong khi thời gian bán hủy của GnRH nội sinh là 3 - 4 phút) [38] Leuprolid chủ yếu được sử dụng ở dạng muối acetat Sinh khả dụng của leuprolid acetat qua đường tiêm tĩnh mạch và đường tiêm dưới da là tương đương nhau [36]
về cơ chế tác dụng, leuprolid acetat thúc đẩy sự bài tiết tuyến yên, làm tăng mạnh
nồng độ LH và FSH trong huyết thanh, dẫn đến làm tăng nồng độ hormon sinh dục trongvòng 3 ngày kể từ ngày đầu tiên sử dụng leuprolid acetat Tuy nhiên, việc kích thích liêntục vào tuyến yên bằng cách sử dụng leuprolid acetat ở liều điều trị sẽ dẫn đến quá trình
điều hòa ngược âm tính, làm ức chế hoạt động của tuyến yên, ức chế bài tiết LH và FSH,
làm giảm nồng độ hormon sinh dục trong máu trong vòng 2-4 tuần Đây chính là cơ sởcho các ứng dụng lâm sàng của leuprolid acetat trong sản phụ khoa và ung thư học [38]
Chỉ định của leuprolid acetat: dậy thì sớm phụ thuộc gonadotropin, ung thư tuyến tiền liệt giai đoạn muộn, ung thư vú giai đoạn muộn của phụ nữ đang và sau mãn kinh, bệnh lạc nội mạc tử cung, u cơ trơn tử cung [29], [36]
1.2 Tổng quan về quá trình giải phóng dược chất ra khỏi cốt PLGA
Các cơ chế chính giúp giải phóng dược chất từ vi cầu PLGA bao gồm [17]:
a) Khuếch tán qua hệ thống lỗ xốp: đây là cơ chế giải phóng dược chất chủ yếu.Quá trình này phụ thuộc vào độ xốp vi cầu và tốc độ hình thành hoặc đóng lỗ xốp
b) Khuếch tán qua mạng lưới polyme: cơ chế này thường gặp ở các dược chất kỵ
nước Tốc độ quá trình này phụ thuộc vào tính linh động của chuỗi polyme Khả năng khuếch tán dược chất sẽ tăng lên khi polyme chuyển từ trạng thái thủy tinh sang trạng thái lỏng nhớt
c) Bơm thẩm thấu: cơ chế này xuất hiện khi vi cầu tiếp xúc với môi trường giải
phóng, hấp thu nước làm tăng áp suất thẩm thấu và thúc đẩy sự vận chuyển dược chất
từ trong lòng vi cầu ra ngoài môi trường
Trang 12d) Ăn mòn: cơ chế ăn mòn bề mặt/ăn mòn toàn bộ polyme thường gặp ở các công thức chứa PLGA khối lượng phân tử thấp Cơ chế này giúp dược chất dược giải phóng
mà không cần phải vận chuyến từ trong lòng vi cầu ra ngoài môi trường
Mỗi cơ chế giải phóng dược chất là kết quả của một loạt các quá trình hóa lý
phức tạp xảy ra bên trong vi cầu và được thể hiện trên hình 1.2 [17]
Co' chê giải phóng
Kết tinh
Thay dồi pH
Hòa tan PLGA oligome
An mòn
u’
3 Thủy phân
Thay đồi tỳ trọng của
1 chuồi polyme 2— ► Hòa tan thuôc
Bơm
thâm thâu
Tương tác thuốc - thuốc
Khuếch tản qua
Với các pha giải phóng khác nhau, cơ chế giải phóng dược chất từ vi cầu cũng
khác nhau và được thể hiện như trên bảng 1.1
Bảng 1.1 Cơ chế giải phóng dược chất của tùng pha trong các nghiên cún
Phai Pha II Pha III Nghiên cứu
Pha ăn mòn, tại đó quá
trình thoái hóa vi cầu
xảy ra
Xu vàCzernuszka
Thời gian khởi phát pha
này phụ thuộc vào tốc
độ hydrat hóa vi cầu
D’Souza và
cộng sự [13]
Trang 13dược chất với polyme.
Khuếch tán nhanh hơn
do hệ bị ăn mòn Khối lượng phân tử polyme giảm, lỗ trống trongmạng lưới polyme tăng
Khuếch tán qua lỗ xốp Lao và cộng
sự [23]
Quá trình giải phóng dược chất từ vi cầu PLGA tuân theo mô hình hai pha [27]
hoặc ba pha [24], [37], [43], [45], trong đó hay gặp mô hình ba pha Mô hình ba pha
gồm: Pha giải phóng ồ ạt ban đầu (pha burst), pha giải phóng chậm (pha lag) và pha giải
phóng nhanh (pha erosion)
Pha giải phóng ồ ạt là đặc điếm thường gặp ở các hệ mang thuốc polyme, chủ
yếu là do sự giải phóng nhanh dược chất liên kết lỏng lẻo trên bề mặt vi cầu Ớ giai đoạn này, một lượng lớn dược chất (khoảng 10-80% lượng dược chất được nạp vào vi cầu)
sẽ được giải phóng trong thời gian ngắn ngay sau khi tiêm [37] Năm 1999, Ravivarapu
và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu đế tối ưu hóa pha giải phóng ồ ạt, từ đó giúp tối ưu
hóa thời gian tác dụng của thuốc [31] Nghiên cứu chỉ ra rằng khi hiệu suất nạp dược
chất tăng lên, lượng dược chất có sẵn trên bề mặt vi cầu cũng tăng lên, do đó làm tăng
lượng dược chất được giải phóng trong pha giải phóng ồ ạt Ngoài ra, khi thêm calciclorid vào trong công thức, độ xốp và diện tích bề mặt của vi cầu tăng lên đáng kế, mặc
dù hiệu suất nạp dược chất giảm đi nhưng tỉ lệ dược chất giải phóng trong pha giải phóng
ồ ạt lại tăng lên [31]
Pha giải phóng chậm là một giai đoạn ốn định, trong đó dược chất giải phóng từ
vi cầu rất chậm, thậm chí không giải phóng [32], [34], [40] Thông thường, pha giải
phóng chậm xuất hiện là do tính lưu động của lóp polyme cao, khả năng hấp thụ nước thấp và sự suy thoái của PLGA ở trạng thái thủy tinh, dẫn đến bề mặt vi cầu ít lỗ xốp hơn và dược chất khó khuếch tán qua mạng lưới polyme hơn [22] Rút ngắn pha giải phóng chậm là nhiệm vụ cấp thiết để quá trình giải phóng kéo dài được liên tục Một số nghiên cứu đà đưa ra phương pháp để vượt qua pha giải phóng chậm:
1) Kết họp PLGA khối lượng phân tử thấp với PLGA khối lượng phân tử cao
Trong môi trường nước, các liên kết este của chuỗi polyme PLGA khối lượng phân tử
Trang 14thấp bị thủy phân, tạo ra các oligome có tính acid, làm giảm pH môi trường, làm tăng
tốc quá trình thoái hóa PLGA khối lượng phân tử cao và do đó rút ngắn pha lag [19]
2) Thêm một số base ít tan, chẳng hạn như kèm carbonat, magnesi hydroxyd,magnesi carbonat Kèm carbonat phản ứng với môi trường có pH acid, tạo thành muốitan và carbon dioxid, gây ra áp suất thẩm thấu và thúc đẩy sự hình thành lỗ xốp trong
quá trình thoái hóa vi cầu, tạo điều kiện thuận lợi cho việc giải phóng liên tục dược chất[20]
3) Thêm các tá dược tan trong nước có tác dụng làm tăng áp lực thấm thấu, giúphình thành lỗ xốp, tạo điều kiện thuận lợi cho việc giải phóng liên tục dược chất Một
số tá dược hay dùng như natri clorid, calci clorid, cyclodextrin [27]
Trong pha ăn mòn, mạng lưới polyme bị ăn mòn toàn bộ, các chuỗi PLGA đạtđến khối lượng phân tử tới hạn (khoảng 20 kDa) và không đủ để cản trở sự trương nởcủa vi cầu, vì vậy đã làm giải phóng toàn bộ lượng dược chất còn lại
1.3 Mô hình hóa quá trình giải phóng dược chất in vitro tù ’ dạng bào chế
Để so sánh các quá trình hòa tan/giải phóng, các nhà nghiên cứu đã đưa ra haiphương pháp tiếp cận khác nhau: “không phụ thuộc mô hình” dựa trên việc đánh giá cácchỉ số khác biệt và tương đồng, “phụ thuộc mô hình” dựa trên việc xác định phươngtrình toán học tối ưu cho mô tả bộ dữ liệu giải phóng [8]
1.3.1 Phương pháp không phụ thuộc mô hình
Phương pháp này được thiết lập dựa trên hai chỉ số là /1 (chỉ số khác biệt) và fl
(chỉ số tương đồng) Bằng cách sử dụng hai chỉ số này, sự giống hoặc khác nhau giữa quá trình giải phóng dược chất của mẫu thử và mẫu đối chiếu có thể được thiết lập
Chỉ số khác biệt (/1) là sai số tương đối giữa hai đường cong, vì /1 được tính toán
dựa phần trăm chênh lệch tại từng thời điểm trên các đường cong /1 được tính theo
phương trình [11]:
Á = ~ rJ • 100
Trong đó:
n là số thời điểm lấy mẫu
Ri và Ti lần lượt là % dược chất giải phóng của mẫu đối chiếu và mẫu thử tại thời điểm i
f\ càng nhỏ, đường cong giải phóng của mẫu thử và mẫu đối chiếu càng giống
nhau Thông thường yêu cầu /1 < 15
Chỉ số tương đồng (/2) là một dạng biến đổi logarit của tổng sai số bình phương
Chỉ số /2 phản ánh sự giống nhau về phần trăm giải phóng giừa hai đường cong /2 được
tính theo phương trình [11]:
Trang 15fl càng cao, hai đồ thị giải phóng càng giống nhau Khi hai đồ thị giải phóng giống
hệt nhau, fl = 100 Theo hướng dẫn của Cục quản lý Thực phấm và Dược phấm Hoa
Kỳ (FDA), % giải phóng dược chất tại mỗi thời điểm của mẫu thử và mẫu đối chiếu
được phép chênh lệch 10%, dẫn đến fl > 50. Do đó, khi thử giải phóng dược chất, mẫu
thử và mẫu đối chiếu được coi là tương đương về mặt bào chế nếu fl nằm trong khoảng 50-100 và/1 thấp hơn 15 [8]
Phương pháp không phụ thuộc mô hình tương đối đơn giản, do đó ngày càng được
sừ dụng phổ biến để đánh giá sự tương đồng/khác biệt giữa hai đồ thị giải phóng Tuy
nhiên, nó cũng có một số nhược điểm [8]:
- Không xác định được nguyên nhân cúa sự khác biệt
- Không cân nhắc đến khả năng đồ thị giải phóng của mẫu thử nằm trên hay nằm
dưới đồ thị giải phóng của mẫu đối chiếu
- Không nhạy với sự thay đổi hình dạng của đồ thị giải phóng
- fi là một tham số thống kê nhưng lại không sử dụng giả thiết thống kê để đánh
giá sự giống nhau giữa 2 đồ thị nên không thề xác định được tỉ lệ âm tính giả và dươngtính giả trong kết luận cuối cùng
1.3.2 Phương pháp phụ thuộc mô hình
Phương pháp này dựa trên việc lựa chọn một hàm toán học thích hợp cùng với việc
xác định các chỉ số của nó để mô tả động học giải phóng của một dạng bào chế Có nhiều
“mô hình phụ thuộc” khác nhau như mô hình động học bậc 0, mô hình động học bậc 1,
mô hình Weibull, mô hình Higuchi, mô hình Hixson - Crowell, mô hình Korsmeyer - Peppas, mồ hình Baker - Lonsdale, mô hình Hopfenberg [11]
Qt là tổng lượng dược chất đã giải phóng được cho tới thời điểm t
Qo là lượng dược chất giải phóng tại thời điếm ban đầu
Ko là hằng số giải phóng bậc 0
1.3.2.2 Mô hình động học bậc 1
Phương trình động học bậc 1 có dạng [11]:
Qt=Qox(l-e’Kxt)Trong đó:
Trang 16Qt là tống lượng dược chất đà giải phóng được cho tới thời điểm t.
Qo là lượng dược chất giải phóng tại thời điểm ban đầu
K là hằng số giải phóng bậc 1
ỉ 3.2.3 Mô hình Weibull
Phưong trình Weibull là một phương trình mang tính thực nghiệm, được đưa ralần đầu tiên vào năm 1951 Sau đó đến năm 1972, Langenbucher đã sử dụng phươngtrình này để mô tả quá trình hòa tan/ giải phóng dược chất từ dạng bào chế [11]
X là % dược chất giải phóng tại thời điếm t
Xinf là % dược chất được giải phóng hoàn toàn (Xinf = 100%)
a là tham số tỷ lệ, xác định thang chia thời gian của quá trình giải phóng
p là tham số hình dạng, đặc trưng cho hình dạng cùa đồ thị giải phóng, p = 1, đồ
thị giải phóng có dạng hàm mũ p > 1, đồ thị giải phóng có dạng hình chữ s p < 1, đồ
thị giải phóng có dạng parabol với độ dốc ban đầu lớn
Một số nghiên cứu trên thế giới đã sử dụng phương trình Weibull để mô hình hóa quá trình giải phóng dược chất từ vi cầu PLGA, từ đó giúp quá trình khảo sát, đánh giátrở nên đơn giản và trực quan hơn [12], [13], [18]
Bởi vì phương trình Weibull là một mô hình thực nghiệm, không dựa trên bât kì
nguyên tắc dược động học cơ bản nào nên nó có những hạn chế nhất định như:
- Không mô tả đầy đủ động học giải phóng dược chất từ dạng bào chế
- Không chứa tham số nào mô tả trực tiếp tốc độ giải phóng dược chất
- Khó sử dụng để thiết lập tương quan in vivo - in vitro [11]
Năm 1983, Korsmeyer và cộng sự đã xây dựng một mô hình bán kinh nghiệm để
mô tả quá trình giải phóng dược chất từ dạng bào chế theo thời gian [11]:
Trong đó:
a: hằng số phụ thuộc cấu trúc và đặc tính hình học của dạng bào chế
n: tham số mũ, phản ánh co chế giải phóng dược chất
Mt: lượng dược chất đã giải phóng tại thời điểm t
Moo: lượng dược chất ban đầu có trong dạng bào chế
f t : tỉ lệ dược chất đã được giải phóng tại thời điểm t
Trang 17Năm 1985, Peppas đã sử dụng tham số mũ n để mồ tả các cơ chế giải phóng dược
chất khác nhau (Bảng 1.1) Mô hình Korsmeyer - Peppas được sử dụng để phân tích sự
giải phóng dược chất từ các cốt polyme khi cơ chế giải phóng chưa được biết rõ hoặc có
nhiều cơ chế giải phóng cùng thể hiện đồng thời
Bảng 1.2 Co ’ chê giải phóng dược chât tù ’ hệ polyme theo tham sô mũ
Tham số mũ (n) Cơ chế giải phóng dược chất Tốc độ giải phóng dược chất
là một hàm theo thòi gian
0.5 Khuếch tán theo định luật Fick t -°-5
> 1.0 Vận chuyển siêu loại II
(Super Case-II transport)
t n-l
Một số nghiên cứu trên thế giới đã sử dụng phương trình Korsmeyer - Peppas
để mô hình hóa quá trình giải phóng dược chất từ vi cầu PLGA và cho kết quả tương
đối khả quan [25], [42]
1.3.2.5 Mô hình giải phóng của Dưvvuri
Năm 2005, trong khi nghiên cứu hệ gel PLGA-PEG-PLGA chứa vi cầu PLGA- ganciclovir, Duvvuri và cộng sự đã đưa ra một phương trình toán học để mô tả quá trìnhgiải phóng 3 pha từ vi cầu Phương trình này được cải tiến dựa trên phương trình sigmoid
cơ bản Cồng thức của mô hình [15]:
F = A X (1
-Trong đó:
F là lượng dược chất đã giải phóng cho tới thời điểm t
A là tổng lượng chất đã giải phóng trong pha I
ki là tốc độ giải phóng dược chất trong pha I nhờ quá trình khuếch tán
B là tổng lượng chất đã giải phóng trong pha III
k2 là tốc độ giải phóng dược chất trong pha III nhờ quá trình thoái hóa polyme
t50 là thời gian cần thiết để vi cầu giải phóng được 50% tổng lượng dược chất
1.3.2.6 Tiêu chí đảnh giá độ phù họp của mô hình
Để lựa chọn được mô hình phù hợp nhất cho bộ dừ liệu thử giải phóng, một số chỉtiêu đã được đưa ra Chỉ tiêu hay sử dụng nhất là hệ số xác định R2 (coefficient of
determination)
Công thức tính R2 [10]:
Trang 18R2 = 1
-zr=1ơí - Yd 2
Trong đó:
Xi là giá tính ước tính tại điểm i
Yi là giá trị thực tại điểm i
Y là giá trị trung bình của các Yi
Giá trị tốt nhất của R2 = +1, giá trị xấu nhất của R2 = - 00
Với một bộ dữ liệu có sẵn, khi ước tính giá trị tham số của mô hình, R2 sè cho biết
với tập hợp tham số nào thì mô hình thu được là phù hợp nhất với bộ dừ liệu Tuy nhiên,nhược điểm của R2 là hệ số này có xu hướng lớn lên khi thêm các tham số vào mô hìnhbất chấp việc mô hình đó có phù hợp hay không Do đó, R2 chỉ phù hợp để so sánh các
Nếu R2 có xu hướng tăng lên hoặc ít nhất là không đổi khi thêm các tham số vào
mô hình thì Radjusted lại có xu hướng giảm đi Điều này đã đưa gợi ý rằng liệu tham số
đã thêm vào mô hình có thực sự cần thiết để làm tăng tính phù hợp của mô hình hay không Nói cách khác, mô hình phù hợp nhât là mô hình có hệ sô Radjusted cao nhất [11]
Ngoài hệ số R2 Radjusted
7
thì tiêu chuân thông tin Akaike (the Akaike information
criterion, AIC) cũng là một chỉ số hay được sử dụng A1C được xem như một công cụchuẩn đế đánh giá tính phù hợp của mô hình Mô hình cho giá trị AIC nhỏ nhất được
n là số điểm dữ liệu giải phóng
p là số tham số của mô hình
WSSR (weighted sum of square) là tổng bình phương phần dư có trọng số
yi là phần trăm giải phóng thực tế tại thời điểm thứ i
ỹị là phần trăm giải phóng dự đoán theo mô hình tại thời điểm thứ i
Trang 191.4 ứng dụng tương quan giải phóng in vitro giữa điều kiện dài hạn và điều kiện cấp tốc.
Trước đây đã có một số nghiên cứu về phương pháp thử giải phóng cấp tốc vi cầu PLGA Bằng cách tối ưu hóa các điều kiện thử giải phóng như nhiệt độ, pH, nồng độ đệm và chất diện hoạt, Shameem và cộng sự [33] cũng như D'Souza và cộng sự [13] đã
xây dựng thành công phương pháp thử giải phóng vi cầu PLGA-LA để cho mối tương quan tốt giữa dữ liệu giải phóng ở điều kiện dài hạn và dữ liệu giải phóng ở điều kiện cấp tốc Cũng tiến hành thay đổi các điều kiện như trên (ngoại trừ pH thấp), Du và cộng
sự [14] đã thiết lập được phương pháp thử ngắn hạn để đánh giá quá trình giải phóng in vitro dược chất cấu trúc decapeptid (các chất tương tự hormon LHRH, LXT-101) từ vi
cầu Các nghiên cứu kể trên đã chứng minh rằng việc thay đổi các yếu tố ảnh hưởng đến
quá trình giải phóng cấp tốc sẽ giúp làm gia tăng mối tương quan giữa giải phóng vi cầu
điều kiện dài hạn và điều kiện cấp tốc
Cơ chế giải phóng dược chất từ vi cầu có thể thay đổi theo các điều kiện khác nhau
của quá trình thử giải phóng cấp tốc, nhưng một phương pháp thử ngắn hạn cho mối
tương quan tốt giữa giải phóng điều kiện dài hạn và điều kiện cấp tốc có thể được sử
dụng để kiểm soát chất lượng sản phẩm [26], [44], [45]
Trang 20CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cưu 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị sử dụng
2.1.1 Nguyên vật liệu
Bảng 2.1 Nguyên liệu sủ ’ dụng trong nghiên cúu STT Tên nguyên liệu Xuất xứ Tiêu chuẩn
3 PLGA (50:50), 7-17 kDa Sigma - Đức NSX
4 PLGA (75:25), 4-15 kDa Sigma - Đức NSX
6 Alcol polyvinyl (PVA-124) Trung Quốc NSX
8 D-Manitol Trung Quốc TKHH
9 Amoni bicarbonat Trung Quốc TKHH
11 Dimethyl sufoxid Merck - Đức NSX
13 Methanol Merck - Đức TKPT
18 Natri diazid Merck - Đức TKHH
22
Lucrin® PDS Depot 3,75 mg(1 tháng) Số lô sản xuất:
1129842 NSX: 05/12/2019
HSD: 4/12/2022
Takeda - Nhật Bản NSX
Trang 212,1,2 Thiết bi
Bảng 2.2 Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
STT Thiết bị Xuất xứ
3 Máy đo pH Eutech Instruments pH 510 Nhật Bản
4 Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Shimadzu 20A,
cột InertSustain C18 5 pm - 4,6 mm X 250 mm Nhật Bản
5 Máy đo kích thước tiểu phân MasterSizer 3000E Anh
6 Máy đồng nhất hóa Unidrive XI000 Homogenizer Drive Đức
7 Máy khuấy từ gia nhiệt IKA - WERKE Hàn Quốc
8 Máy ly tâm lạnh tốc độ cao Hand Supra R2 Hàn Quốc
9 Máy ly tâm Hermle Z200A Mỹ
12 Máy huỳnh quang Cary Eclipse Fluorescence
14 Kính hiến vi điện tử quét Regulus8100-HITACHI Nhật
2.2 Nội dung nghiên cửu
- Thử giải phóng dược chat in vitro ở điều kiện dài hạn với điều kiện cấp tốc
- Mô hình hóa quá trình giải phóng leuprolid acetat in vitro từ vi cầu PLGA
- Thiết lập mối tương quan giữa giải phóng dược chat ỉ’n vitro ở điều kiện dài hạn
với điều kiện cấp tốc
- ứng dụng mối tương này trong nghiên cứu xây dựng công thức bào chế vi cầu leuprolid acetat đông khô giải phóng kéo dài
Trang 222.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp bào chế vi cầu PLGA-LA
Vi cầu PLGA-LA được bào chế bằng phương pháp nhũ hóa kép kết họp bốc hơidung môi với công thức bào chế được trình bày ở bảng 2.3
Bảng 2.3 Công thức bào chế vi cầu PLGA-LA
PLGA (75:25) 4-15 kDa Khảo sát
Pha nước ngoại Dung dịch PVA 1,5% - natri
Mô tả chi tiết quy trình bào chế vi cầu PLGA-LA giải phóng kéo dài:
> Giai đoạn 1: chuẩn bị pha nưó’ c và pha dầu
- Pha nước: trong cốc thủy tinh 10 ml, hòa tan 60 mg LA trong 0,6 ml đệm phosphat
pH 7,4 Sau đó, thêm 6,6 mg gelatin, làm ấm cốc qua nước nóng cho đến khi gelatin tan
hoàn toàn
- Pha dầu: trong cốc thủy tinh 5 ml, hòa tan 360 mg PLGA (tỉ lệ từng loại PLGA
Trang 23Pha nước nội: dung dịch gelatin và LA
trong đệm phosphat 7,4
Hình 2.1 So ’ đồ bào chế vi cầu PLGA-LA đông khô
> Giai đoạn 2: bào chế vi cầu
*Nhũ hóa lần 1:
- Ngâm cốc thủy tinh chứa pha nước vào nước đá Phối pha dầu vào pha nước, tiến
hành đồng nhất hóa ở tốc độ 12000 vòng/phút trong 5 phút, thu được nhũ tưong N/D
*Nhũ hóa lần 2:
- Chuyển nhũ tương N/D sang cốc 25 ml Thêm 10 ml dung dịch PVA 1,5% - NaCl1,5% Ngâm cổc trong nước đá Tiến hành đồng nhất hóa ở tốc độ 4000 vòng/phút trong
thời gian 40 giây, thu được nhũ tương kép N/D/N
> Giai đoạn 3: pha loãng và tinh chế vi cầu
- Chuyển nhũ tương kép sang cốc có mỏ 100 ml, thêm 20 ml dung dịch PVA 1,5%
- natri clorid 1,5% Ngâm cốc vào nước đá Sau đó sục khí nitrogen (N2) với tốc độ 20
ml/phút trong 30 phút đế rắn hóa vi cầu
- Sau khi rắn hóa, chuyển toàn bộ hỗn dịch vi cầu vào ống ly tâm, đem ly tâm lạnh với tốc độ 5000 vòng/ phút, thời gian 5 phút, nhiệt độ 5°c Sau đó gạn bỏ nước, thu vi
cầu Rửa vi cầu bằng nước cất 2 lần, rồi tiếp tục đem ly tâm lạnh lần 2 với tốc độ 5000 vòng/ phút, thời gian 5 phút, nhiệt độ 5°C Gạn bỏ nước, thu được bột nhão vi cầu
Trang 24> Giai đoạn 4: đông khô vi cầu
- Phân tán toàn bộ bột nhão vi cầu trong 10 ml manitol 1,25% (kl/tt) rồi rây qua
rây 125 pm thu được hỗn dịch vi cầu
- Đặt hỗn dịch vi cầu lên máy khuấy từ Hút 2 ml hỗn dịch vi cầu cho vào lọ thủytinh 10 ml Đậy lọ bằng nút cao su có xẻ rãnh
- Đem đông lạnh ở -70°C trong 7 giờ, sau đó chuyển vào thiết bị đông khô để thăng
hoa dung môi ở nhiệt độ -50°C, áp suất 0,04 mbar trong 24 giờ
2.3.2 Đo kích thước vi cầu
- Thiết bị', thiết bị đo KTTP MasterSizer 3000E
- Tiến hành', cho khoảng 400 ml nước tinh khiết vào cốc có mỏ 500 ml Đặt cốc
vào máy đo MasterSizer 3000E Nhở hỗn dịch vi cầu bào chế được vào cốc có mỏ chođến khi độ đục đạt khoảng 1 - 6% Đo và đọc kết quả
- Ỷ nghĩa các chỉ số:
D [4,3] (pm): KTTP trung bình theo thể tích
Dv (90) (pm): phân vị 90% vi cầu có kích thước dưới Dv (90)
Span: độ phân tán KTTP, span càng nhỏ thì khoảng phân bố càng hẹp, span nhỏ hơn 5 là giá trị có thể chấp nhận được
2.3.3 Chụp hình thái bề mặt vi cầu
- Thiết bị: kính hiển vi điện tử quét Regulus8100 - HITACHI
- Cách tiến hành: cho lên đế carbon một lượng vừa đủ mẫu vi cầu đông khô (được
bào chế theo mô tả ở mục 2.3.1) Sau đó, phủ lên mẫu một lớp platin mong trong 35
giây để tăng độ dẫn điện, rồi đưa vào buồng chứa mẫu Điện thế đo ở mức 1 hoặc 1,5
kV, độ phóng đại từ 1000 đến 10.000 lần
2.3.4 Phương pháp thử giải phóng dược chất in vitro dài hạn
2.3.4.1 Định lượng dược chât trong lọ đông khô
Áp dụng phương pháp định lượng dược chất bằng HPLC đã được thẩm định theo
nghiên cứu [4] trước đây của nhóm
- Thiết bị: hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Shimadzu 20A
- Điều kiện sắc ký: cột InertSustain C18 5 pm - 4,6 X 250 mm; nhiệt độ cột: 25°C;pha động: đệm amoni dihydrophosphat 0,03M pH 4,0: ACN = 75:25 (tt/tt); tốc độ dòng
0,8 ml/phút; thể tích tiêm mẫu: 50 pl; detector ƯV, bước sóng phát hiện 280 nm
- Mau chuẩn: cân chính xác khoảng 5,0 mg chất chuẩn LA, hòa tan hoàn toàn trongdung dịch đệm amoni dihydrophosphat pH 4,0, định mức vừa đủ 10,0 ml thu được dung
dịch chuẩn gốc Hút chính xác 2,0 ml dung dịch chuẩn gốc trên pha loãng với dung dịch đệm amoni dihydrophosphat pH 4,0 vừa đủ 25,0 ml, lắc đều thu được dung dịch chuẩn.Lọc dung dịch chuẩn qua màng lọc nylon 0,45 pm vào lọ đựng mẫu
Trang 25- Mâu thử: lây 1 lọ vi câu đông khô Chuyên toàn bộ lượng bột trong lọ sang bìnhđịnh mức 5,0 ml, sau đó thêm nước cất 2 lần vừa đủ định mức, lắc đều Hút chính xác
1,0 ml hỗn dịch vi cầu cho vào bình định mức 25,0 ml Thêm khoảng 10 ml DMSO vào
bình định mức rồi đem siêu âm 15 phút để vi cầu tan hoàn toàn Sau đó, thêm dung dịch đệm amoni dihydrophosphat pH 4,0, định mức vừa đủ 25,0 ml Lọc dung dịch thử qua
màng lọc nylon 0,45 pm vào lọ đựng mẫu
- Tiến hành tiêm mẫu chuẩn, mẫu thử trên hệ thống sắc ký HPLC với điều kiện sắc
ký như trên Ghi lại giá trị diện tích pic tương ứng của các mẫu
- Khối lượng LA thực tế có trong 1 lọ vi cầu đông khô được tính theo công thức:
mLA =
Trong đó:
mLA: khối lượng LA có trong 1 lọ vi cầu đông khô (mg)
mc: khối lượng LA đã cân để làm mẫu chuẩn (mg)
fc : độ tinh khiết của LA
Ac: diện tích pic mẫu chuẩn (mAU.s)
At: diện tích pic mẫu thử (mAƯ.s)
Dc: hệ số pha loãng của mẫu chuẩn
Dt: hệ số pha loãng của mẫu thử
2.3.4.2 Thử giải phóng dược chất in vitro dài hạn từ vỉ cầu PLGA-LA
- Phương pháp thử giải phóng dược chất in vitro điều kiện thực được xây dựng dựa trên phương pháp lấy mẫu và phân tách (sample and separate) Môi trường thử giải
phóng là dung dịch đệm phosphat saline (PBS) pH 7,4 chứa 0,02% Tween 80 và 0,02%
natri diazid- gọi tắt là môi trường PBS-TN (1 lít dung dịch đệm PBS chứa 137 mMnatri clorid, 2,7 mM kali clorid, 10 mM dinatri hydrophosphat, 2 ĨÌ1M kali
dihydrophosphat, chỉnh pH bằng acid hydrocloric M và natri hydroxyd M) Nhiệt độ thửgiải phóng là 37°c
- Tiến hành:
+ 4 ml hồn dịch vi cầu còn lại trong bình định mức 5,0 ml (mục 2.3.4.1) sẽ tiếp tục
được sử dụng để thử giải phóng dài hạn theo phương pháp lấy mẫu và phân tách Thêmdung dịch đệm PBS pH 7,4 (chứa 0,1% Tween 80 và 0,1% natri diazid) vào bình định
mức 5,0 ml trên, vừa đủ đến vạch, lắc đều, thu được 5 ml hỗn dịch vi cầu trong đệm
PBS chứa 0,02% Tween 80 và 0,02% natri diazid
+ Hút chính xác 1,0 ml hỗn dịch vi cầu cho vào ống Eppendorf 2 ml (tiến hành làm
3 ống) Đặt mẫu thử vào máy lắc ngang, lắc với tốc độ 125 vòng/phút ở nhiệt độ 37°c
Tại các thời điểm nhất định (ngày 1,4,7, 14, 21, 28, 35,42,49, 56) ly tâm ống Eppendorf
ở tốc độ 3000 vòng/ 5 phút Hút chính xác 0,8 ml dịch trong để định lượng phần dược
Trang 26chất đã giải phóng và bố sung bằng thể tích môi trường tương ứng (Lưu ý: không được hút cắn vi cầu, nếu hút phải cẳn vi cầu thì trả toàn bộ dịch về ống Eppendorf, đem ống Eppendorf đi ly tâm rồi hút lại).
+ Mầu thử: 0,8 ml dịch trong hút ra được pha loãng trong bình định mức 5,0 ml bằng môi trường thử giải phóng
+ Mầu chuẩn:
• Dung dịch chuẩn gốc: cân chính xác khoảng 5,0 mg LA chuẩn, cho vào bình định
mức 50,0 ml, bổ sung dung dịch môi trường thử giải phóng vừa đủ thể tích, lắc đều, thu được dung dịch chuẩn gốc
• Từ dung dịch chuẩn gốc pha thành các dung dịch chuẩn có nồng độ 1 pg/ml, 4
pg/ml, 8 pg/ml, 12 pg/ml, 16 pg/ml, 20 pg/ml bằng dung dịch môi trường thửgiải phóng
+ Mầu trắng: dung dịch môi trường thử giải phóng
+ Đem mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thử đi đo huỳnh quang ở bước sóng kích thích 280 nm, phát xạ 356 nm Phương pháp định lượng dược chất bằng đo huỳnh quang
đà được thẩm định theo nghiên cứu f 11 trước đây của nhóm
> Lượng dược chất giải phóng từ vi cầu theo thời gian được tính toán như sau:
+ Phương trình tuyến tính giữa nồng độ dược chất và cường độ huỳnh quang:
F = a X c + b (R > 0,995)+ Nồng độ dược chất trong mẫu thử giải phóng tại thời điểm thứ i:
Cì: nồng độ dược chất trong mẫu thử giải phóng tại thời điểm thứ i (mg/ml)
Fì: cường độ huỳnh quang của mẫu thử giải phóng tại thời điểm thứ i (A.Ư)
Dì: độ pha loãng của mẫu thử giải phóng tại thời điểm thứ i
vm: thể tích môi trường thử giải phóng (ml)
Vh: thể tích dịch trong hút ra tại thời điểm thứ i (ml)
iula: khối lượng LA trong lọ vi cầu đông khô đã dùng để định lượng (mg)
2.3.5 Phương pháp thử giải phóng dược chắt in vitro cấp tốc
2.3.5.1 Định lượng dược chât trong lọ vỉ câu đông khô
- Thiết bị, điều kiện sắc ký, mẫu chuẩn, mẫu thử, mẫu trắng, công thức tính toán:
như đã nêu trong mục 2.3.4.1
Trang 272.3.5.2 Phương pháp thử giải phóng cắp tốc
4 ml hỗn dịch vi cầu còn lại trong bình định mức 5,0 ml (mục 2.3.5.1) sẽ tiếp tục
được sử dụng đế thử giải phóng cấp tốc theo phưong pháp lấy mẫu và phân tách Thêmdung dịch Tween 80 0,1% vào bình định mức 5,0 ml trên, vừa đủ đến vạch, lắc đều, thu
được 5 ml hỗn dịch vi cầu trong Tween 80 0,02% để thử giải phóng
- Tiến hành:
+ Môi trường thử giải phóng: Lựa chọn 1 trong 2 môi trường sau:
• Dung dịch Tween 80 0,02%.
• Dung dịch đệm phosphat saline (PBS) pH 7,4 chứa 0,02% Tween 80 - gọi tắt là
môi trường PBS-T (1 lít dung dịch đệm PBS chứa 137 mM natri clorid, 2,7 mM
kali clorid, 10 mM dinatri hydrophosphat, 2 mM kali dihydrophosphat, chỉnh pH
bằng acid hydrocloric M và natri hydroxyd M)
+ Mầu thử: Hút chính xác 1,0 ml hỗn dịch vi cầu từ bình định mức 5,0 ml đưa vào
lọ thủy tinh 120 ml (thủy tinh loại I hoặc loại II) có chứa sẵn 79 ml môi trường thử giải
phóng (đà được gia nhiệt đến nhiệt độ 50 ± 0,5°C) (làm đồng thời 3 mẫu) Đậy nút cao
su, siết nắp nhôm Lắc đều để phân tán vi cầu Đặt lọ thủy tinh này vào máy lắc ngang
với tốc độ 125 vòng/phút, duy trì nhiệt độ 50 ± o,5°c Tại các thời điểm 1,4, 7, 24, 30,
48 giờ, dùng kim tiêm 25G (0,5 X 88 mm) tiến hành hút 3 ml dịch môi trường Lọc
dịch môi trường vừa lấy qua màng lọc nylon 0,45 Ịim, thu được mẫu thử
+ Mầu chuẩn: chuẩn bị như mục 2.3.4.2
+ Mầu trắng: dung dịch môi trường thử giải phóng
+ Mầu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thử được đem đi đo cường độ huỳnh quang với
Cì: nồng độ dược chất trong mẫu thử giải phóng tại thời điếm thứ i (mg/ml)
Fì: cường độ huỳnh quang của mẫu thử giải phóng tại thời điểm thứ i (A.U)
Vmi thế tích môi trường thử giải phóng (ml) tại thời điếm i
ỉtila: khối lượng LA trong lọ vi cầu đông khô đã dùng để định lượng (mg)
2.3.6 Phương pháp xử lý số liệu
- Mỗi thí nghiệm làm 3 lần, số liệu trình bày dưới dạng TB ± SD Các số liệu được
xử lý bằng phần mem Microsoft Office Excel 365
Trang 28- Bộ dừ liệu thử giải phóng vi cầu ở điều kiện dài hạn được đem khớp vào các mô
hình sau, trong đó F là tổng lượng dược chất đà giải phóng được cho tới thời điểm t:
Mô hình Phương trình toán học Thông số
F = 100 X (1 - e-fcixt) ki là hằng số giải phóng bậc 1.
Weibull F = 100 X (1 - e-“xt/?) a là tham số tỷ lệ, xác định thang
chia thời gian của quá trình giảiphóng
p là tham số hình dạng, đặc trưngcho hình dạng của đồ thị giải phóng
ki là tốc độ giải phóng dược chấttrong pha I nhờ quá trình khuếch tán
B là tống lượng chất đà giải phóngtrong pha III
k2 là tốc độ giải phóng dược chấttrong pha III nhờ quá trình thoái hóa polyme
tso là thời gian cần thiết để vi cầu giải
phóng được 50% tổng lượng dược
chất
*Lưuý : Chỉ áp dụng khi vi cầu giải
phóng theo 3 pha.
+ 1 4- g-fc2(t-t5o)
Đê khớp mô hình cho bộ dữ liệu, sử dụng add-ins DDSolver trong Microsoft Office
Excel 365 Độ phù họp mô hình được đánh giá dựa trên chỉ số AIC (tiêu chuấn thông
tin Akaike)
- Đe so sánh 2 đồ thị giải phóng, tiến hành đánh giá thông qua chỉ số/1 (chỉ số khác
biệt) và/2 (chỉ số tương đồng)./i và/2 được tính nhờ add-ins DDSolver trong Microsoft