Đánh giá sự phối hợp tác nhân vi khuẩn, virus trên bệnh nhân viêm phổi mắc phải cộng đồng nhập viện

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ---LÊ THỊ HUỆ ĐÁNH GIÁ SỰ PHỐI HỢP TÁC NHÂN VI KHUẨN, VIRUS TRÊN BỆNH NHÂN VIÊM PHỔI MẮC PHẢI CỘNG ĐỒNG NHẬP VIỆN Chuyên ngành: KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM Y

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

-LÊ THỊ HUỆ

ĐÁNH GIÁ SỰ PHỐI HỢP TÁC NHÂN

VI KHUẨN, VIRUS TRÊN BỆNH NHÂN VIÊM PHỔI

MẮC PHẢI CỘNG ĐỒNG NHẬP VIỆN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Y HỌC

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

-LÊ THỊ HUỆ

ĐÁNH GIÁ SỰ PHỐI HỢP TÁC NHÂN

VI KHUẨN, VIRUS TRÊN BỆNH NHÂN VIÊM PHỔI

MẮC PHẢI CỘNG ĐỒNG NHẬP VIỆN

Chuyên ngành: KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM Y HỌC

Mã số: 8720601

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Y HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS TS LÝ VĂN XUÂN

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của chúng tôi chưa từngđược ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác Các tài liệu trích dẫn, các sốliệu trong nghiên cứu là hoàn toàn trung thực và theo đúng yêu cầu của mộtluận văn Thạc sĩ

Tác giả

Lê Thị Huệ

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT i

DANH MỤC BẢNG ii

DANH MỤC BIỂU ĐỒ iii

DANH MỤC HÌNH ẢNH iv

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 4

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 Đại cương về viêm phổi mắc phải cộng đồng 5

1.2 Dịch tễ học và căn nguyên gây viêm phổi mắc phải cộng đồng 7

1.3 Các kỹ thuật xác định căn nguyên gây viêm phổi mắc phải cộng đồng 13

1.4 Các công trình nghiên cứu có liên quan 17

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Đối tượng nghiên cứu 23

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 23

2.3 Phương pháp nghiên cứu 24

2.4 Các biến số và định nghĩa biến số 32

2.5 Xử lý số liệu 32

2.6 Kiểm soát sai lệch 33

2.7 Vấn đề y đức 33

Chương 3: KẾT QUẢ 34

3.1 Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu 34

3.2 Tác nhân vi khuẩn, virus gây bệnh viêm phổi mắc phải cộng đồng 36

3.3 Mối liên quan giữa nhóm tuổi và giới tính với tác nhân phối hợp gây viêm phổi mắc phải cộng đồng 42

Chương 4: BÀN LUẬN 46

4.1 Đặc điểm chung của nhóm nghiên cứu 46

4.2 Tỷ lệ phối hợp các tác nhân vi khuẩn với vi khuẩn, vi khuẩn với virus và virus với virus trong bệnh viêm phổi mắc phải cộng đồng phát hiện bằng

bằng kỹ thuật multiplex real-time PCR 48

4.3 Mối liên quan giữa nhóm tuổi và giới với sự phối hợp của tác nhân vi khuẩn, virus gây viêm phổi mắc phải cộng đồng 60

4.4 Hạn chế của nghiên cứu và tính ứng dụng của đề tài 61

KẾT LUẬN 62

KIẾN NGHỊ 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

AFB Acid Fast Bacillus Trực khuẩn kháng acid

COPD Chronic Obstructive

Pulmonary Disease Bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính

Staphylococcus aureus Tụ cầu vàng kháng Methicillin

MRSCN

Methicillin-Resistant Staphylococci Coagulase-

S epidermidis kháng Methicillin

PCR Polymerase chain reaction Phản ứng khuếch đại chuỗi

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Phân bố bệnh nhân theo giới tính 34Bảng 3.2 Tỷ lệ tác nhân được phát hiện bằng kỹ thuật

multiplex real-time PCR 36Bảng 3.3 Tỷ lệ phân bố đơn tác nhân và tỷ lệ phối hợp vi khuẩn, virus

ở bệnh nhân VPMPCĐ 39Bảng 3.4 Tỷ lệ phối hợp tác nhân vi khuẩn, virus phân lập được

ở các bệnh nhân VPMPCĐ 40Bảng 3.5 Mối liên quan giữa nhóm tuổi với tác nhân phối hợp

vi khuẩn – vi khuẩn gây VPMPCĐ 42Bảng 3.6 Mối liên quan giữa nhóm tuổi với tác nhân phối hợp

vi khuẩn – virus gây VPMPCĐ 42Bảng 3.7 Mối liên quan giữa nhóm tuổi với tác nhân phối hợp

virus – virus gây VPMPCĐ 43Bảng 3.8 Mối liên quan giữa giới tính với tác nhân phối hợp

vi khuẩn – vi khuẩn gây VPMPCĐ 44Bảng 3.9 Mối liên quan giữa giới tính với tác nhân phối hợp

vi khuẩn – virus gây VPMPCĐ 44Bảng 3.10 Mối liên quan giữa giới tính với tác nhân phối hợp

virus – virus gây VPMPCĐ 45

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1 Phân bố bệnh nhân theo nhóm tuổi 34Biểu đồ 3.2 Phân bố bệnh nhân theo tuổi và giới tính 35Biểu đồ 3.3 Phân bố tác nhân vi khuẩn và virus trong tổng số

tác nhân vi sinh phân lập được 38

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình nghiên cứu tổng quát 24

Hình 2.2 Quy trình xét nghiệm real-time PCR đàm 25

Hình 2.3 Bệnh phẩm đàm 26

Hình 2.4 Đánh giá độ tin cậy của bệnh phẩm đàm 27

Hình 2.5 Đánh giá tác nhân vi khuẩn trên tiêu bản nhuộm Gram 28

Hình 2.6 Quy trình multiplex real-time PCR phát hiện tác nhân vi sinh gây VPMPCĐ 29

Hình 2.7 Biểu đồ khuếch đại ghi nhận cường độ huỳnh quang 31

Hình 2.8 Các tác nhân được phát hiện bằng kỹ thuật multiplex real-time PCR 32

Hình 3.1 Sự phân bố tác nhân vi khuẩn, virus gây VPMPCĐ 37

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong những năm gần đây, viêm phổi mắc phải cộng đồng là bệnh thườnggặp và là một trong những căn nguyên chính gây tử vong trên thế giới Cho đếnnay, mặc dù đã có nhiều tiến bộ trong chẩn đoán và điều trị nhưng viêm phổimắc phải cộng đồng vẫn được xếp hàng thứ tư trong số 10 căn nguyên hàngđầu gây tử vong trên toàn cầu vào năm 2010 [48] Viêm phổi mắc phải cộngđồng là tình trạng viêm phổi xảy ra ở ngoài bệnh viện hoặc trong 48 giờ đầusau khi nhập viện [18], là một bệnh lý rất thường gặp và phổ biến ở mọi lứatuổi Tỷ lệ mắc viêm phổi mắc phải cộng đồng ở các nước đang phát triển caohơn gấp 5 lần so với các nước phát triển Ở Việt Nam, viêm phổi mắc phải cộngđồng là một bệnh lý nhiễm khuẩn thường gặp nhất trong các bệnh nhiễm khuẩntrên thực hành lâm sàng, chiếm 12% các bệnh phổi [4] Năm 2018, tỷ lệ mắcviêm phổi ở nước ta là 698,7/100.000 người dân, đứng hàng thứ hai sau tănghuyết áp, tỷ lệ tử vong do viêm phổi là 1,15/100.000 người dân, đứng hàng thứhai trong các nguyên nhân gây tử vong sau đái tháo đường [1]

Các căn nguyên gây viêm phổi thường gặp là Streptoccocus pneumoniae, Haemophilius influenzae, Moraxella catarrhalis, Mycoplasma pneumoniae,

pneumoniae và các loại virus như Rhinovirus, Parainfluenzavirus 1-3, Influenzavirus A, Respiratory syncital virus …[11], [19], [22] Các căn nguyên

gây bệnh viêm phổi mắc phải cộng đồng phân bố khác nhau tuỳ thuộc từngnước và từng khu vực địa lý Từ khi dịch SARS xuất hiện vào năm 2003, sau

đó là dịch cúm gia cầm A/H5N1 (2005), đại dịch cúm A/H1N1 (2009), đến nay

là đại dịch SARS Cov 2 (2019), các virus mới và các biến thể liên tục xuất hiệncũng được coi là tác nhân gây bệnh quan trọng trong viêm phổi mắc phải cộngđồng Chúng thường gây diễn biến nặng, rất nhanh dẫn đến tử vong

Rất nhiều nghiên cứu cho biết, phát hiện hai hoặc nhiều tác nhân gây bệnh

là tình huống thường gặp trong viêm phổi mắc phải cộng đồng, khác biệt so vớinhững lý thuyết cổ điển trước đây, viêm phổi thường chỉ do một tác nhân gâybệnh duy nhất [25], [47], [49] Tuy nhiên, ở Việt Nam, vai trò của căn nguyêngây viêm phổi cộng đồng còn chưa được biết đầy đủ do chưa có nhiều cácnghiên cứu lâm sàng và các phương tiện chẩn đoán còn hạn chế Hầu hết cácnghiên cứu chỉ tập trung vào các căn nguyên vi khuẩn gây viêm phổi nói chung,chưa đi sâu tìm hiểu vai trò của các loại vi khuẩn không điển hình, virus hay sựphối hợp tác nhân vi sinh trong viêm phổi cộng đồng [21]

Mặt khác, bệnh phẩm chủ yếu để phát hiện các tác nhân vi sinh gây bệnhviêm phổi mắc phải cộng đồng chính là các mẫu đàm hay các bệnh phẩm cóchứa đàm lấy được từ bệnh nhân Với phương pháp xét nghiệm đàm bằng kỹthuật nuôi cấy rất khó phát hiện vi khuẩn không điển hình và không phát hiệnđược các tác nhân virus [18]

Hiện nay kỹ thuật multiplex real-time PCR đã được nhiều công trìnhnghiên cứu nước ngoài cũng như trong nước sử dụng để phát hiện tác nhân vikhuẩn, virus gây viêm phổi mắc phải cộng đồng Đây là một kỹ thuật hiện đại,

có độ nhạy rất cao và độ đặc hiệu không khác gì kỹ thuật nuôi cấy phân lập vikhuẩn [17], [19], [20], [45] Hơn thế nữa, kỹ thuật multiplex real-time PCR cóthể phát hiện được các tác nhân vi khuẩn không điển hình và virus mà kỹ thuậtnuôi cấy không thể phân lập được, từ đó sẽ cung cấp cho các nhà lâm sàng phổ

vi sinh vật đầy đủ và xác thực để sử dụng trong xây dựng phác đồ điều trị, tránhlạm dụng các kháng sinh phổ rộng ngay từ đầu, hạn chế tình trạng đề khángkháng sinh của tác nhân gây bệnh

Ở nước ta cho đến nay chưa có công trình nghiên cứu nào chính thức công

bố đầy đủ sự phối hợp với nhau của các tác nhân vi sinh gây viêm phổi mắcphải cộng đồng Để góp phần cung cấp thông tin về các tác nhân vi khuẩn và

virus thật sự gây viêm phổi mắc phải cộng đồng ở người lớn nhập viện điều trị,cũng như sự phối hợp các tác nhân trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:

“Đánh giá sự phối hợp tác nhân vi khuẩn, virus trên bệnh nhân viêm phổi

mắc phải cộng đồng nhập viện” qua phát hiện tác nhân vi sinh gây bệnh bằng

kỹ thuật multiplex real-time PCR

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

1 Xác định tỷ lệ vi khuẩn, virus trên bệnh nhân viêm phổi mắc phải cộngđồng ở người lớn nhập viện bằng kỹ thuật multiplex real-time PCR

2 Xác định tỷ lệ phối hợp các tác nhân vi khuẩn, virus của bệnh nhân viêmphổi mắc phải cộng đồng nhập viện

3 Xác định mối liên quan giữa phối hợp tác nhân vi khuẩn, virus trên bệnhnhân viêm phổi mắc phải cộng đồng với nhóm tuổi và với giới tính

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đại cương về viêm phổi mắc phải cộng đồng

1.1.1 Viêm phổi

Viêm phổi hay viêm hô hấp dưới là tình trạng viêm nhiễm xảy ra ở toàn

bộ cấu trúc gồm phế nang, ống và túi phế nang, tiểu phế quản tận cùng và tổchức mô kẽ của phổi Tác nhân gây viêm phổi có thể là vi khuẩn, virus, ký sinhtrùng, nấm nhưng không phải là trực khuẩn lao [4]

Viêm phổi được chia làm 4 loại:

- Viêm phổi mắc phải cộng đồng (community-acquired pneumonia, CAP);

- Viêm phổi mắc phải bệnh viện (hospital-acquired pneumonia, HAP);

- Viêm phổi liên quan đến thở máy (ventilator-associated pneumonia,VAP);

- Viêm phổi liên quan đến chăm sóc y tế (health care-associatedpneumonia, HCAP)

Viêm phổi là bệnh lý rất thường gặp Theo các số liệu tổng kết của HộiBệnh nhiễm trùng của Mỹ và Hội Lồng ngực Mỹ năm 2007, trung bình, mỗinăm có khoảng 5,6 triệu ca mắc viêm phổi cộng đồng, trong số đó có khoảng1,1 triệu ca cần phải nhập viện điều trị; tỷ lệ tử vong trong số các bệnh nhânviêm phổi cộng đồng không điều trị tại bệnh viện là 1 – 5% Bệnh viêm phổicũng chiếm 12% các bệnh viêm hô hấp nói chung ở Việt Nam [11]

1.1.2 Viêm phổi mắc phải cộng đồng

Viêm phổi mắc phải cộng đồng (VPMPCĐ) là tình trạng viêm phổi mắcphải xảy ra ở cộng đồng dân cư ngoài bệnh viện, khác với viêm phổi bệnh viện

là viêm phổi xảy ra do nhiễm các tác nhân vi khuẩn trong bệnh viện (nhiễmkhuẩn bệnh viện) Viêm phổi mắc phải cộng đồng cũng xảy ra khá phổ biếnnhưng không dễ dàng phát hiện chính xác tác nhân vi khuẩn gây bệnh; phần

lớn các thông tin về tần suất mắc bệnh đều dựa trên những báo cáo thống kê sốliệu của các bệnh viện.

Theo thống kê của Bộ y tế năm 2018, tỷ lệ mắc viêm phổi ở nước ta là698,7/100.000 người dân, đứng hàng thứ hai sau tăng huyết áp, tỷ lệ tử vong

do viêm phổi là 1,15/100.000 người dân, đứng hàng thứ hai trong các nguyênnhân gây tử vong sau đái tháo đường [1]

1.1.3 Các yếu tố nguy cơ của viêm phổi mắc phải cộng đồng

Các yếu tố nguy cơ chính của viêm phổi gồm: hút thuốc lá, nghiện rượu,chỉ số khối cơ thể thấp Tiếp xúc thường xuyên với trẻ em cũng được coi như

yếu tố nguy cơ vì trẻ em là nguồn mang vi khuẩn S pneumoniae lớn, có thể lây

truyền sang người lớn và gây viêm phổi Các bệnh lý phối hợp cũng là yếu tốnguy cơ gây viêm phổi Bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính (Chronic ObstructivePulmonary Disease – COPD) là một trong những yếu tố nguy cơ lớn nhất gâyviêm phổi, cao gấp 2 – 4 lần so với người khỏe mạnh, tiếp đến là bệnh timmạch, suy tim, đái tháo đường, bệnh lý gan và ung thư Khoảng 10 – 20% bệnhnhân VPMPCĐ bị viêm phổi do hít phải và thường do các rối loạn về nuốt hoặccác rối loạn ý thức Các rối loạn ý thức này có liên quan với các tình trạng bệnh

lý như động kinh, bệnh Parkinson, xơ cứng bì lan tỏa, hoặc đột quỵ

Một số thuốc cũng là yếu tố nguy cơ của VPMPCĐ như thuốc ức chế miễndịch, thuốc ức chế tiết axid dạ dày, đặc biệt là các thuốc ức chế bơm protoncũng là yếu tố làm tăng nguy cơ viêm phổi [57] Gần đây, các nghiên cứu còn

đi sâu tìm hiểu các yếu tố nguy cơ của nhiễm vi khuẩn kháng thuốc trongVPMPCĐ và đã xác định được một số yếu tố nguy cơ này Shindo và cộng sự(2013) thực hiện nghiên cứu tiến cứu ở 10 bệnh viện thuộc Trung tâm Nghiêncứu Các bệnh lý phổi Nhật Bản cho thấy, có 6 yếu tố nguy cơ liên quan đến đềkháng các kháng sinh thường dùng như ceftriaxone, ampicillin-sulbactam,macrolides, fluoroquinolones ở các bệnh nhân VPMPCĐ, bao gồm: tiền sử

nhập viện trong vòng 90 ngày trước đó, đang bị suy giảm miễn dịch do bẩmsinh hoặc mắc phải, tiền sử dùng kháng sinh trước đó, đang dùng thuốc ức chếtiết axid dạ dày, nuôi dưỡng qua sonde, bệnh nhân nằm liệt giường hoặc phải

di chuyển bằng xe đẩy Tăng số lượng yếu tố nguy cơ sẽ làm tăng nguy cơnhiễm các vi khuẩn đa kháng thuốc [59]

1.2 Dịch tễ học và căn nguyên gây viêm phổi mắc phải cộng đồng

1.2.1 Dịch tễ học của viêm phổi mắc phải cộng đồng

Cho đến nay, mặc dù đã có nhiều tiến bộ trong chẩn đoán và điều trị nhưngVPMPCĐ vẫn được xếp hàng thứ tư trong số 10 căn nguyên hàng đầu gây tửvong trên toàn cầu vào năm 2010 [48] Ở Mỹ, tỷ lệ bệnh nhân viêm phổi nhậpviện điều trị cũng tăng dần từ 1525 ca/100000 dân năm 1998 lên 1667/100000dân vào năm 2005 Trong đó 10 – 20% số bệnh nhân phải điều trị tại Khoa Điềutrị tích cực Tỷ lệ tử vong ở ngày thứ 30 lên đến 23% [57] Ở châu Âu, mặc dùchưa có nhiều nghiên cứu về VPMPCĐ nhưng kết quả nghiên cứu cũng chothấy, tỷ lệ VPMPCĐ là 1,6 – 2,6/1000 dân/năm ở Tây Ban Nha, 4,7/1000dân/năm ở Phần Lan và 9/1000 dân/năm ở Anh Đối tượng có tỷ lệ viêm phổicao nhất là trẻ em và người già Nghiên cứu ở Phần Lan cho thấy, tỷ lệ trẻ dưới

5 tuổi mắc viêm phổi là 36/1000 dân, sau đó giảm xuống còn 4,4/1000 dân ở

độ tuổi 15 – 29, và lại tăng lên 34,2/1000 dân ở độ tuổi trên 74 [61]

Ở nước ta hàng năm có khoảng 4/5 triệu trường hợp VPMPCĐ, phần lớnđược theo dõi điều trị ngoại trú nhưng có khoảng 20% phải nhập viện điều trịvới phân nửa số điều trị nội trú có biểu hiện nặng, đặc biệt tỷ lệ nhiễm khuẩn

và tình trạng bệnh nặng ngày càng tăng cao ở người già và trẻ nhỏ [6] Tỷ lệbệnh nhân viêm phổi điều trị tại khoa Hô Hấp, Bệnh viện Bạch Mai giai đoạn

1996 – 2000 là 9,57%, đứng hàng thứ tư trong số các bệnh hô hấp điều trị tạikhoa [4]

1.2.2 Căn nguyên gây viêm phổi mắc phải cộng đồng

1.2.2.1 Căn nguyên vi khuẩn

Ở người lớn, căn nguyên vi khuẩn gây VPMPCĐ rất đa dạng, nhưng

thường gặp nhất là phế cầu (Streptococcus pneumoniae), Hemophilus influenzae và Moraxella catarrhalis Các căn nguyên vi khuẩn không điển hình như Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci, Legionella pneumophila ngày càng được phát hiện nhiều hơn trong VPMPCĐ

[22], [24], [26], [27] Tỷ lệ xác định các căn nguyên vi khuẩn gây VPMPCĐkhác nhau theo từng khu vực địa lý và tùy thuộc nơi điều trị: ngoại trú, nội trú,điều trị tích cực và tùy theo kỹ thuật phát hiện vi khuẩn [9], [18]

❖ Các vi khuẩn thường gặp:

- Streptococcus pneumoniae (S pneumoniae): hay còn gọi là phế cầu, là

căn nguyên hàng đầu gây VPMPCĐ [26], đặc biệt là ở trẻ em, người già, người

có bệnh mạn tính Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), ước chừng mỗi năm cókhoảng 1,1 triệu trường hợp trẻ dưới 5 tuổi tử vong vì viêm phổi do phế cầu

Tỷ lệ viêm phổi do S pneumoniae ở khu vực châu Á nhìn chung thấp hơn so

với ở châu Âu, 13,3% so với 25,9% [56] Đặc biệt, phế cầu cũng là căn nguyênthường gặp nhất gây biến chứng viêm phổi bội nhiễm ở các bệnh nhân sau

nhiễm virus đường hô hấp Ngoài ra, S pneumoniae có thể gây viêm họng,

viêm tai giữa, viêm xoang, viêm màng não, viêm màng tim, viêm thận trong đóviêm màng não thường hay gặp trẻ em

- Hemophilus influenzae (H influenzae): là căn nguyên đứng hàng thứ hai

gây VPMPCĐ Vi khuẩn này có thể gây viêm phổi nặng ở cả trẻ em và người

lớn Viêm phổi do H influenzae liên quan đến một số yếu tố nguy cơ như tuổi

cao, nghiện rượu, suy giảm miễn dịch, các bệnh phổi mạn tính Tại khu vực

châu Á, tỷ lệ nhiễm H influenzae cao nhất ở Philippin (19%), tiếp theo là Nhật

Bản (10%), và Trung Quốc (9%) Tỷ lệ thấp nhất ở Hàn Quốc (1%) [56]

- Moraxella catarrhalis (M catarrhalis): là căn nguyên thường gây nhiễm

khuẩn ở trẻ em, nhất là trẻ em suy dinh dưỡng với các bệnh như viêm xoang,

viêm tai giữa, viêm phế quản, viêm phổi, viêm màng não [26] Ở người lớn, M catarrhalis gây nhiễm khuẩn hô hấp dưới, đặc biệt là trong đợt cấp của COPD,

viêm phế quản phổi ở người già và người suy giảm miễn dịch Hầu hết người

già bị viêm phổi do M cattarrhalis đều có các bệnh lý nền có sẵn như COPD,

suy tim, đái tháo đường Tuy nhiên, loại vi khuẩn này ít gây ra bệnh cảnh viêmphổi nặng [23]

❖ Các vi khuẩn không điển hình:

C pneumoniae, M pneumoniae, L pneumophila và C psittaci là các vi

khuẩn không điển hình Chúng có đặc điểm chung là cấu trúc vách không hoànchỉnh, khó nuôi cấy và không phân lập được theo các quy trình vi sinh thôngthường Tỷ lệ VPMPCĐ do vi khuẩn không điển hình dao động từ 18 – 41% ở

Mỹ, 22 – 29% ở châu Âu và 26% ở châu Á [57] C pneumoniae và M pneumoniae thường gây viêm phổi nhẹ ở người trẻ tuổi, tuy nhiên có thể gây

viêm phổi nặng ở người già trên 70 tuổi [55] Một nghiên cứu được thực hiện

tại 12 cơ sở y tế của châu Á cho thấy có đến 16,7% bệnh nhân nhiễm C pneumoniae và 3,6% nhiễm M pneumoniae phải điều trị tại Khoa Điều trị tích

cực Tỷ lệ bệnh nhân nhiễm các loại vi khuẩn không điển hình cũng khác nhaugiữa khu điều trị nội trú, điều trị tích cực và điều trị ngoại trú [55], [56]

❖ Các vi khuẩn khác:

- Klebsiella pneumoniae (K pneumoniae) thường gây viêm phổi ở các

bệnh nhân nghiện rượu, đái tháo đường hoặc viêm phế quản mạn tính Ở Đài

Loan, các nghiên cứu gần đây đều cho thấy, K pneumoniae là tác nhân chính

gây viêm phổi mắc phải tại cộng đồng có kèm theo nhiễm khuẩn huyết, chiếm

33,1% [46] Tỷ lệ viêm phổi do K pneumoniae ở Malaysia và Singapore là

23%, ở Thái Lan là 13-18%, ở các nước châu Á khác là 15% Trong khi đó, tỷ

lệ này ở các nước châu Âu chỉ chiếm 0,5% và ở Úc là 1% [57]

- Pseudomonas aeruginosa (P aeruginosa) chỉ gây bệnh trong điều kiện

có cơ hội thuận tiện như nhiễm khuẩn ngoài da, nhiễm khuẩn huyết, viêm phổi,viêm đường tiết niệu, viêm đường ruột gây tiêu chảy ở trẻ em Hậu quả nhiễm

trực khuẩn P aeruginosa ngày càng trở nên trầm trọng do vi khuẩn kháng với kháng sinh ngày càng mạnh [26] Viêm phổi do P aeruginosa ở Anh chỉ chiếm

< 1%, ở Úc là 3,5%, ở các nước khu vực châu Á cao hơn với tỷ lệ chung là 7%[57] Các yếu tố nguy cơ bao gồm: bệnh lý mạn tính ở phế quản phổi (giãn phếquản, viêm phế quản có mủ mạn tính, xơ hóa phổi, xơ hóa phế nang) và/hoặcsuy tim xung huyết, nhiễm HIV tiến triển (CD4 < 50 tế bào/mm3), tiền sử trước

đó dùng kháng sinh hoặc dùng corticoides kéo dài Viêm phổi do P aeruginosa

thường có biểu hiện lâm sàng nặng

- Acinetobacter baumannii (A baumannii) hiện diện khắp nơi, đặc biệt

những nơi ẩm ướt như đất, nước, môi trường bệnh viện và có thể tìm thấy trên

da, ở màng nhầy, chất tiết, ở ruột nhưng lại là tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnhviện với bệnh cảnh lâm sàng nặng như viêm màng não, viêm nội tâm mạc, viêm

phổi, nhiễm khuẩn huyết với khuynh hướng ngày một tăng [26] A baumannii

có thể gây viêm phổi nặng và thường liên quan đến sốc nhiễm khuẩn với tỷ lệ

tử vong cao Tỷ lệ viêm phổi do A baumannii rất thấp ở châu Âu, chỉ từ 0,2 –

1% Hầu hết các bệnh nhân đều là nam giới, nghiện rượu và có tiền sử hút thuốc

lá nặng hoặc viêm phế quản mạn tính Phơi nhiễm nghề nghiệp với silic hoặc

kim loại cũng có liên quan đến viêm phổi do A baumannii [57].

- Burkholderia pseudomallei (B pseudomallei) được phát hiện với tỷ lệ khá cao ở khu vực châu Á Ở Thái Lan, B pseudomallei chiếm 15,4% trong số

các trường hợp VPMPCĐ, được phát hiện bằng kỹ thuật nuôi cấy vi khuẩn

Nghiên cứu ở Malaysia cho thấy có 1 – 2% nhiễm B pseudomalle, chủ yếu gặp

ở các bệnh nhân vào khoa Điều trị tích cực Một nghiên cứu tiến cứu ởCampuchia trên các bệnh nhân VPMPCĐ điều trị nội trú cho thấy, tỷ lệ nhiễm

B pseudomallei là 1,6% [56].

- Tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus – S aureus) thường gây viêm phổi

ở một số đối tượng nguy cơ cao, đặc biệt là người có bệnh phổi mạn tính, bệnhnhân thở máy và gây viêm phổi thứ phát sau nhiễm virus cúm Một nghiên cứu

ở Australia cho thấy, tỷ lệ viêm phổi do tụ cầu vàng kháng methicillin chiếm1,2% trong số các bệnh nhân mắc cúm A/H1N1 nhập viện Viêm phổi do tụ cầukháng methicillin có tỷ lệ tử vong cao từ 56 đến 63% [43]

1.2.2.2 Căn nguyên virus

Trong những năm gần đây, sự ra đời của các kỹ thuật xét nghiệm sinh họcphân tử đã cải thiện đáng kể khả năng phát hiện các tác nhân virus gây viêmphổi Vì vậy, nhiễm virus đường hô hấp cũng được cho là một trong những cănnguyên thường gặp gây VPMPCĐ ở cả trẻ em và người lớn [28] Các nghiêncứu gần đây về căn nguyên gây VPMPCĐ cho thấy, khoảng 15 – 56% cáctrường hợp VPMPCĐ là do căn nguyên virus [39], [41], [53] Tuy nhiên, vaitrò thực sự của virus gây viêm phổi vẫn còn ít được đề cập Do vậy, các đặcđiểm lâm sàng của viêm phổi do từng loại virus chưa được mô tả một cách cụthể Hơn nữa, các thông tin liên quan đến tỷ lệ mắc và đặc điểm lâm sàng củaviêm phổi do căn nguyên virus còn bị giới hạn, nên các hướng dẫn chẩn đoán

và điều trị VPMPCĐ chưa đưa ra được các khuyến cáo về đánh giá và điều trịviêm phổi do virus [23]

Trong số các virus gây viêm phổi, virus cúm A (Influenzavirus A) và virus hợp bào hô hấp (Respiratory syncital virus – RSV) là căn nguyên hay gặp nhất

gây viêm phổi, tiếp theo là Adenovirus, virus á cúm (Parainfluenza virus) type

1, 2 và 3 và virus cúm B (Influenzavirus B).

- Virus cúm (Influenzavirus): Các kháng nguyên HA và NA có sự khác

nhau giữa các dòng virus Ngày nay người ta phân biệt được 15 thứ type HA(từ H1 đến H15) và 9 thứ type NA (từ N1 đến N9) Sự kết hợp giữa H và N sẽtạo ra nhiều chủng virus cúm có khả năng gây bệnh khác nhau (ví dụ H5N1).Trong số các kháng nguyên HA thì kháng nguyên H5 và H7 hiện diện ở virus

có độc tính rất cao Virus cúm A là căn nguyên gây bệnh ở người với các phântype gây bệnh chính là H1N1, H2N2, H3N2, H5N1, H7N9, H6N7 [28] Tỷ lệ

tử vong và tỷ lệ nhiễm cúm cũng rất khác nhau, đặc biệt là ở người già và người

có bệnh mạn tính phối hợp Bên cạnh việc gây viêm phổi, virus cúm còn làmsuy giảm một loạt các cơ chế bảo vệ tại chỗ của đường hô hấp do gây tổn thươngniêm mạc đường hô hấp, tạo điều kiện thuận lợi cho viêm phổi thứ phát donhiễm vi khuẩn

- Virus hợp bào hô hấp (Respiratory syncitalvirus – RSV): Các nghiên cứu

đã chứng minh được rằng, RSV là một trong số các căn nguyên gây nhiễm trùng

hô hấp ở người già Trong số người già đang được chăm sóc điều dưỡng tạinhà, có khoảng 10% số ca bị nhiễm RSV mỗi năm và trong số đó, có khoảng10% có biểu hiện viêm phổi [28] Tỷ lệ mới mắc RSV hàng năm trong mộtnghiên cứu thuần tập kéo dài 4 năm chiếm trung bình 5,5% và có độ ổn địnhtương đối trong vòng 4 năm, gần như là gấp 2 lần so với virus cúm A [50]

- Virus á cúm (Parainfluenza virus): Virus á cúm gây bệnh ở người

(Human Parainfluenza Virus, viết tắt là HPIV) hiện nay được chia làm 5 nhómhuyết thanh là HPIV-1, HPIV-2, HPIV-3, HPIV-4a và HPIV-4b Các biểu hiệncủa nhiễm HIPV gồm sốt cảm lạnh, viêm thanh khí phế quản, viêm tiểu phếquản và viêm phổi Trong đó, HPIV-3 được xếp hàng thứ hai sau virus hợp bào

hô hấp gây viêm phổi và viêm tiểu phế quản ở trẻ nhỏ và trẻ đang trong thời kỳ

bú mẹ HPIV-3 có độc lực mạnh nhất trong các nhóm huyết thanh và thườnggây tử vong cao Ở người lớn, các virus này thường gây ra nhiễm trùng tái phát

nhiều lần, gây viêm phổi ở người trẻ tuổi và viêm phế quản phổi ở người già[50].

- Rhinovirus: Rhinovirus có thể gây xuất hiện đợt cấp của hen phế quản,

xơ hóa phế nang, viêm phế quản mạn tính và nhiễm trùng nặng đường hô hấpdưới ở trẻ sơ sinh, người già và người suy giảm miễn dịch [26], [50] Biểu hiện

thường gặp nhất của nhiễm Rhinovirus là cảm lạnh thông thường, diễn biến nhẹ

và thường tự khỏi Nghiên cứu của Callaghan G.O và cộng sự cho thấy, hơnmột nửa số trẻ nhập viện vì viêm phổi nặng được phát hiện ít nhất một loại

virus đường hô hấp, trong đó Rhinovirus chiếm tỷ lệ cao nhất (41%) [24].

- Các virus mới xuất hiện: Kể từ năm 2001, một số virus chưa từng được

báo cáo trước đây đã được xác định là căn nguyên gây viêm phổi mắc phải tại

cộng đồng Các virus này bao gồm Metapneumovirus (hMPV), cúm A/H5N1, A/H7N9, A/H5N6, 3 chủng coronaviruses mới gây bệnh ở người bao gồm virus gây hội chứng suy hô hấp cấp nặng (SARS), coronavirus HKU1, coronavirus NL6, và gần đây là Bocavirus gây bệnh ở người Các bệnh nhiễm trùng lây từ động vật sang người như SARS – liên quan với coronavirus và cúm gia cầm

A/H5N1 đã gây ra bệnh cảnh viêm phổi không điển hình với nguy cơ gây thành

dịch lớn khá cao [39] Gần đây, virus Hantavirus Bắc Mỹ cũng được phát hiện

là tác nhân gây ra viêm phổi nặng, gây suy hô hấp và tử vong cao [41]

1.3 Các kỹ thuật xác định căn nguyên gây viêm phổi mắc phải cộng đồng

Các kỹ thuật xét nghiệm được sử dụng để chẩn đoán căn nguyên gâyVPMPCĐ được chia thành 2 nhóm:

- Các kỹ thuật chẩn đoán trực tiếp: gồm nhuộm Gram, nuôi cấy phân lậpđịnh danh vi khuẩn từ mẫu bệnh phẩm (đàm, máu, dịch màng phổi), phát hiệnvật liệu di truyền của vi khuẩn hoặc virus bằng kỹ thuật PCR

- Các kỹ thuật chẩn đoán gián tiếp: là các kỹ thuật miễn dịch giúp pháthiện kháng nguyên và kháng thể tương ứng của vi khuẩn hoặc virus trong cácmẫu bệnh phẩm lâm sàng.

Mỗi một kỹ thuật xét nghiệm có ưu nhược điểm riêng và có vai trò nhấtđịnh trong việc khẳng định căn nguyên gây VPMPCĐ Hầu hết các hướng dẫnđiều trị VPMPCĐ đều khuyến cáo liệu pháp kháng sinh nên được bắt đầu trongvòng 4 giờ sau khi bệnh nhân nhập viện [23], [57] Do đó, các xét nghiệm chokết quả trong thời gian ngắn sẽ có giá trị định hướng cho việc lựa chọn khángsinh ban đầu Nhuộm Gram đàm, xét nghiệm tìm kháng nguyên trong nước tiểu

và real-time PCR là những xét nghiệm nhanh để xác định căn nguyên gâyVPMPCĐ [62] Các xét nghiệm cho kết quả chậm hơn như nuôi cấy, huyếtthanh chẩn đoán có thể cung cấp các thông tin hữu ích hỗ trợ cho việc tiếp tục

sử dụng kháng sinh (lựa chọn kháng sinh thích hợp hoặc thay đổi kháng sinhnếu điều trị thất bại)

1.3.1 Kỹ thuật chẩn đoán trực tiếp

❖ Nhuộm Gram và nuôi cấy phân lập xác định vi khuẩn:

Nhuộm Gram là một trong những kỹ thuật cơ bản và quan trọng nhất trongphân tích vi khuẩn ở giai đoạn đầu nhằm định hướng sơ bộ vi khuẩn có trongmẫu đàm dựa vào tính chất bắt mầu Gram và hình thể của chúng Đây là xétnghiệm đơn giản, dễ làm và có kết quả nhanh hơn các xét nghiệm chẩn đoánkhác, được sử dụng trong chẩn đoán viêm phổi để làm tăng độ chính xác củachẩn đoán và tiết kiệm chi phí [2]

Nuôi cấy, phân lập, xác định vi khuẩn và làm kháng sinh đồ để đánh giá

độ nhạy cảm của vi khuẩn với các kháng sinh là xét nghiệm quan trọng để chẩnđoán căn nguyên vi khuẩn gây VPMPTCĐ Dịch tiết đường hô hấp dưới củabệnh nhân viêm phổi là bệnh phẩm quan trọng giúp chẩn đoán căn nguyên gâybệnh Dịch tiết từ đường hô hấp dưới có thể là dịch rửa phế quản, dịch hút nội

khí quản ở bệnh nhân viêm phổi nặng hoặc đàm khạc Đàm khạc là bệnh phẩmthường được sử dụng để chẩn đoán căn nguyên gây viêm phổi ở những nơi có

tỷ lệ lưu hành bệnh lao cao và để chẩn đoán các trường hợp viêm phổi nhậpviện điều trị Để đảm bảo một mẫu đàm tốt, đạt tiêu chuẩn trong nhuộm Gram,các mẫu đàm cần được thu thập tốt (khạc trực tiếp vào lọ vô khuẩn, lấy quasonde hút hoặc bẫy đàm) Một mẫu đàm tốt khi quan sát bằng kính hiển vi sẽ

có < 10 tế bào biểu mô và > 25 bạch cầu đa nhân trung tính [2], [23], [57] Cấyđàm có độ nhạy không cao, dao động từ 20 – 79% (trung bình là 56%) tùy từngnghiên cứu [11], [18], [56] Một số biện pháp đã được gợi ý làm để tăng độnhạy và độ đặc hiệu của cấy đàm trong chẩn đoán VPMPCĐ như làm sạch mẫuđàm bằng nước muối trước khi nhuộm soi, so sánh kết quả nhuộm Gram vớinuôi cấy, sử dụng phương pháp cấy đàm định lượng [23]

❖ Cấy máu và cấy dịch màng phổi:

Kết quả cấy máu và cấy dịch màng phổi dương tính phản ánh chính xáctác nhân vi khuẩn gây VPMPCĐ Cấy máu có độ nhạy thấp nhưng lại có độđặc hiệu cao Trong số các bệnh nhân VPMPCĐ, chỉ có khoảng 5 – 16% bệnhnhân có kết quả cấy máu dương tính [23] Phần lớn các trường hợp cấy máu

dương tính ở các bệnh nhân VPMPCĐ đều là S pneumoniae Các trường hợp

cấy máu dương tính thường liên quan với tình trạng nặng của bệnh và vì vậycấy máu được chỉ định làm cho tất cả các trường hợp VPMPCĐ nhập viện đểxác định căn nguyên và định hướng sử dụng kháng sinh điều trị ban đầu [23],[57]

❖ Kỹ thuật PCR xác định vật liệu di truyền của vi khuẩn hoặc virus:

Hiện nay, kỹ thuật PCR được cho là xét nghiệm thường dùng nhất trongxác định căn nguyên gây VPMPCĐ vì cho phép phát hiện nhanh một số lượngaxit nucleic từ tất cả các tác nhân gây viêm phổi, ít bị ảnh hưởng bởi việc dùngkháng sinh trước đó và cho kết quả rất nhanh [32] Kỹ thuật PCR đặc hiệu cho

từng loại căn nguyên có độ nhạy cao so với phương pháp chẩn đoán dựa trênnuôi cấy thông thường Các tiến bộ nhanh chóng của kỹ thuật PCR và giá trịcủa nó trong chẩn đoán, đặc biệt là của real-time PCR đã cho phép xét nghiệmnày trở thành một xét nghiệm thường quy sẵn có để phát hiện các virus và một

số vi khuẩn đường hô hấp Kỹ thuật real-time PCR có nhiều ưu điểm: (1) độnhạy và độ đặc hiệu cao, (2) thời gian trả kết quả ngắn, (3) sử dụng trực tiếpcác mẫu bệnh phẩm lâm sàng, (4) có thể xác định và phát hiện được một số tácnhân kháng thuốc và (5) đo được tải lượng của vi sinh vật Tuy nhiên, cả PCRthường và real-time PCR có hạn chế là không cho biết được mức độ khángthuốc kháng sinh của vi khuẩn

Đối với một số vi khuẩn không khu trú ở đường hô hấp trên, như vi khuẩn

lao hoặc Legionella, kết quả PCR dương tính với 2 loại vi khuẩn này sẽ cho

phép chẩn đoán xác định tác nhân gây bệnh [49], [56] Riêng đối với một số vi

khuẩn khu trú ở đường hô hấp trên, đặc biệt là S pneumoniae, nếu chỉ dựa vào

kết quả dương tính của PCR thì chưa cho phép khẳng định đó là căn nguyêngây viêm phổi

1.3.2 Kỹ thuật chẩn đoán gián tiếp

Xét nghiệm phát hiện kháng thể được sử dụng để chẩn đoán nhiễm virus

đường hô hấp và các vi khuẩn không điển hình [56] Các kỹ thuật được sử dụng

phát hiện các kháng thể trong chẩn đoán VPMPCĐ gồm kỹ thuật cố định bổthể (CF), miễn dịch huỳnh quang (IFA) gián tiếp, miễn dịch có gắn men(ELISA) gián tiếp Độ đặc hiệu của kỹ thuật chẩn đoán bằng huyết thanh học

rất cao nhưng độ nhạy thì ở mức trung bình Riêng đối với Legionella, xét

nghiệm huyết thanh học không được sử dụng để chẩn đoán vì kháng thể củaloại vi khuẩn này thường xuất hiện muộn sau 3 tuần, thậm chí có thể tới 10 tuần

và những người sống trong vùng dịch tễ đều có nồng độ kháng thể cao trongmáu [49]

Kỹ thuật xét nghiệm phát hiện kháng nguyên có thể được thực hiện trêncác bệnh phẩm đường hô hấp trên, đàm, nước tiểu hoặc trong huyết thanh củabệnh nhân VPMPCĐ [23] Bệnh phẩm đường hô hấp trên thường được sử dụng

để phát hiện nhanh kháng nguyên virus đường hô hấp, bệnh phẩm nước tiểu cógiá trị chẩn đoán nhanh các tác nhân vi khuẩn gây viêm phổi, mà các tác nhânnày khó chẩn đoán bằng kỹ thuật nuôi cấy So với nuôi cấy phân lập vi khuẩnthì kỹ thuật xét nghiệm phát hiện kháng nguyên có nhiều ưu điểm hơn do ít bịảnh hưởng của việc sử dụng kháng sinh trước đó và do kháng nguyên thườngtồn tại một thời gian dài sau khi bắt đầu điều trị

Trong thực hành lâm sàng, hai loại vi khuẩn gây VPMPCĐ được chẩn

đoán bằng xét nghiệm nhanh tìm kháng nguyên vi khuẩn trong nước tiểu là S pneumoniae và L pneumophila, dựa trên nguyên lý của kỹ thuật sắc ký miễn

dịch Tổng hợp kết quả của 27 nghiên cứu sử dụng xét nghiệm kháng nguyênphế cầu trong nước tiểu ở các bệnh nhân nghi ngờ mắc VPMPCĐ cho thấy, độnhạy chung của xét nghiệm là 74%, độ đặc hiệu chung là 97% Xét nghiệm nàyđược khuyến cáo sử dụng trong chẩn đoán viêm phổi do phế cầu mà không cầnxét nghiệm đàm hoặc cấy máu [57]

1.4 Các công trình nghiên cứu có liên quan

1.4.1 Tại Việt Nam

Ở Việt Nam, VPMPCĐ cũng đã được nghiên cứu từ lâu Các nghiên cứuchủ yếu tập trung vào biểu hiện lâm sàng và căn nguyên gây VPMPCĐ Tuynhiên, do các xét nghiệm sử dụng để chẩn đoán căn nguyên gây VPMPCĐ rấtphong phú, trong đó kỹ thuật real-time PCR có giá thành tương đối cao Thêmvào đó, không phải phòng thí nghiệm nào cũng thường xuyên sẵn có các thiết

bị sử dụng cho xét nghiệm này, nên phần lớn các nghiên cứu chủ yếu dựa vàokết quả nuôi cấy bệnh phẩm đàm Vì vậy, tỷ lệ phát hiện căn nguyên gây bệnhthường thấp Hơn nữa, các bằng chứng huyết thanh học chẩn đoán căn nguyên

gây viêm phổi dựa trên hiện tượng tăng nồng độ kháng thể giữa giai đoạn hồiphục so với giai đoạn cấp nên chẩn đoán bằng huyết thanh học ít khi được dùng

để chẩn đoán xác định đối với các trường hợp VPMPCĐ điều trị tại bệnh viện.Gần đây, một số nghiên cứu về VPMPCĐ ở Bệnh viện Nguyễn Tri PhươngThành phố Hồ Chí Minh chủ yếu tập trung vào việc phát hiện căn nguyên gâybệnh bao gồm đơn tác nhân và đa tác nhân cùng tính đề kháng với kháng sinhcủa các chủng vi khuẩn phân lập được Các kết quả này cũng đóng góp mộtphần vào kết quả chung của mạng lưới lâm sàng khu vực châu Á Thái BìnhDương giám sát tình trạng kháng kháng sinh của các vi khuẩn phân lập được[18], [19]

Theo tác giả Nguyễn Văn Thành có 50% VPMPCĐ thì tác nhân vi khuẩn

được phát hiện là Streptoccci spp (bao gồm nhóm S viridans) chiếm tỷ lệ cao nhất (47,7%) kế đến là S aureus (15,6%) và P aeruginosa (10%) [16] Kết quả

nghiên cứu của Đinh Ngọc Sỹ và cộng sự trên bệnh nhân VPMPCĐ điều trị ở

Bệnh viện Bạch Mai Hà Nội năm 2000 – 2004 cho thấy vi khuẩn S pneumoniae

và H influenzae chiếm tỷ lệ rất thấp với 6% và 2% [14] Sau đó năm 2005,

cũng tại Bệnh viện Bạch Mai, tác giả Ngô Quý Châu và cộng sự nghiên cứu tác

nhân gây bệnh VPMPCĐ ghi nhận kết quả vi khuẩn chiếm ưu thế là K pneumoniae với tỷ lệ 42,1%, kế đến là P aeruginosa với tỷ lệ 13,2%, H influenzae là 10,5% và S pneumoniae là 10,5% [3].

Theo kết quả nghiên cứu của Trần Văn Ngọc, Phạm Hùng Vân và cộng

sự, tác nhân vi khuẩn gây VPMPCĐ ở 146 bệnh nhân điều trị tại Bệnh việnChợ Rẫy năm 2005 – 2006 ghi nhận tỷ lệ phát hiện vi khuẩn gây bệnh là 58,9%

(86/146) trong đó vi khuẩn Gram âm chiếm tỷ lệ 33% (28/86) với đa số là H influenzae 25% (7/28), M catarrhalis, 17% (5/28), P aeruginosa và K pneumoniae chỉ chiếm cùng tỷ lệ 7% (2/28) [12] Trước đó vào năm 2004, tác

giả Trần Văn Ngọc và Phạm Hùng Vân trong nghiên cứu tác nhân vi khuẩn gây

VPMPCĐ cùng ghi nhận vi khuẩn Gram âm ngày càng có vai trò quan trọng

và tần suất gây bệnh ngày càng tăng

Tương tự theo kết quả nghiên cứu của Lê Tiến Dũng về tác nhân gâyVPMPCĐ trên bệnh nhân nhập viện điều trị tại Bệnh viện Nguyễn Tri Phươngnăm 2005, 2006 và 2008 cho thấy vi khuẩn Gram âm chiếm đa số với tỷ lệ từ

69 – 94,6% trong đó thường gặp nhất là P aeruginosa 27 – 36,5%, kế đến là Klebsiella spp (10 – 29%), H influenzae 6,7% và vi khuẩn Gram dương thường gặp nhất là S pneumoniae chiếm tỷ lệ 3,2 – 20,5% [7], [8] Cũng nghiên

cứu về tác nhân vi khuẩn trong bệnh viêm phổi mắc phải cộng đồng ở bệnhnhân điều trị tại Bệnh viện Nguyễn Tri Phương năm 2007, tác giả Võ ĐứcChiến ghi nhận vi khuẩn Gram âm chiếm tỷ lệ cao hơn vi khuẩn Gram dương

(68,6% so với 31,4%) trong đó vi khuẩn Gram âm thường gặp nhất là P aeruginosa 34,4%, Klebsiella spp 10%, M catarrhalis, A baumannii và E coli cùng có tỷ lệ 5% Còn với vi khuẩn Gram dương thì S pneumoniae chiếm

tỷ lệ 10% và S.aureus có tỷ lệ 6,2% [5] Kết quả nghiên cứu của Trần Anh Đào

năm 2011 tại Bệnh viện Nhân dân Gia Định về đặc tính lâm sàng và cận lâmsàng ở 172 bệnh nhân bị viêm phổi mắc phải cộng đồng cho thấy tỷ lệ phát hiện

vi khuẩn là 28,5% (49/172) Tuy nhiên, trong số 172 mẫu đàm thì chỉ có 101mẫu đàm đạt chuẩn tin cậy, tỷ lệ đạt chuẩn là 58,7% (101/172) Nếu chỉ tínhtrên mẫu đàm đạt chuẩn thì tỷ lệ phát hiện vi khuẩn gây bệnh (tỷ lệ dương tính)

là 48,1% (49/101) trong đó vi khuẩn Gram âm chiếm đa số 93,9% (46/49) với

P aeruginosa 30,6%, Acinetobacter spp 16,3%, Klebsiella spp 14,3% và H influenzae 6,1% Vi khuẩn Gram dương chỉ chiếm tỷ lệ 6,1% (3/49) trong đó

S pneumoniae có tỷ lệ 4,1% và S aureus 2% Ngoài ra tác giả cũng ghi nhận

vi khuẩn P aeruginosa thường gặp bệnh nhân viêm phổi mắc phải cộng đồng

có kèm theo COPD, giãn phế quản hoặc lao phổi cũ cũng như ở nhóm bệnh

nhân > 60 tuổi so với nhóm bệnh nhân < 60 tuổi (38,9% so với 14,3% với p <0,01%) [6].

Kết quả nghiên cứu của Tạ Thị Diệu Ngân (2016) trên bệnh nhânVPMPCĐ tại tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương, Bệnh viện đa khoaĐống Đa và Bệnh viện Đức Giang cho thấy tỷ lệ phát hiện được virus là 8,4%,

tỷ lệ xác định được căn nguyên vi khuẩn chung là 62% (38,7% đơn nhiễm và23,3% đồng nhiễm), tỷ lệ vi khuẩn không điển hình chiếm 33,1% số bệnh nhân;

trong đó, căn nguyên vi khuẩn thường gặp nhất gây VPMPCĐ là M pneumoniae (16,2%), K pneumoniae (14,8%), C pneumoniae (10,6%) và S pneumoniae (9,9%) [11].

Tóm lại, kết quả công trình nghiên cứu của các tác giả trong nước về tácnhân vi sinh gây viêm phổi mắc phải cộng đồng nhập viện điều trị chỉ ghi nhậntác nhân vi khuẩn gây bệnh với tỷ lệ dương tính khoảng 45 – 55% Vi khuẩnGram âm chiếm tỷ lệ cao hơn vi khuẩn Gram dương và có khuynh hướng ngày

càng tăng, trong đó chiếm đa số là P aeruginosa và A baumannii ( đặc biệt là

ở bệnh nhân COPD, dãn phế quản, bệnh trầm trọng và tuổi cao > 60 tuổi) Vi

khuẩn S pneumoniae (không kể nhóm S viridans) và H influenzae chiếm tỷ lệ

khá thấp Hầu hết các nghiên cứu trong nước không phát hiện được vi khuẩnkhông điển hình, virus và đồng nhiễm (đa tác nhân)

1.4.2 Trên thế giới

Theo kết quả nghiên cứu Ruiz M và cộng sự (1999) thì tỷ lệ tác nhân visinh trong viêm phổi mắc phải cộng đồng được phát hiện 46% trong đó có đến23% nhiễm đa tác nhân Trong số các tác nhân vi khuẩn gây viêm phổi mắc

phải cộng đồng phải nhập viện điều trị thì S pneumoniae chiếm đa số với tỷ lệ 29%, H influenzae 11%, L pneumophila 8%, C pneumoniae 7% Vi khuẩn đường ruột chỉ chiếm 6%, P aeruginosa 5% Kết quả nghiên cứu cho thấy có

một số trường hợp có nhiễm khuẩn phối hợp (đa nhiễm) Ở bệnh nhân viêm

phổi mắc phải cộng đồng trong tình trạng trầm trọng thì có nguy cơ nhiễm P aeruginosa với tỷ lệ cao Tác giả cũng ghi nhận các vi khuẩn không điển hình như M pneumoniae, C pneumoniae trước đây chưa được biết nhiều, nay ngày

không ngừng gia tăng trong nhiễm khuẩn hô hấp dưới Hơn nữa các vi khuẩn

không điển hình như C pneumoniae có thể gây nhiễm khuẩn phối hợp với các

vi khuẩn khác và làm cho tình trạng nhiễm khuẩn do S pneumoniae càng thêm

trầm trọng Kết quả nghiên cứu của tác giả Arancibia F và của tác giả LiamC.K đều ghi nhận, ngoài tác nhân chính gây viêm phổi mắc phải cộng đồng là

S pneumoniae, vi khuẩn Gram âm ngày càng có vai trò quan trọng và tần suất

gây bệnh ngày càng tăng [16], [27]

Các công trình nghiên cứu tác nhân vi khuẩn gây viêm phổi mắc phải cộngđồng của tác giả Garcia V.C [24], hay của Lauderdale Tsai-Ling và cộng sự

[26] đều ghi nhận vi khuẩn S pneumoniae chiếm đa số, kế đến là H influenzae,

M pneumoniae, C pneumoniae, sau cùng là các vi khuẩn Gram âm thuộc nhóm Enterobacteriaceae và P aeruginosa Tác giả Lauderdalee T và cộng sự cùng

ghi nhận, trong các tác nhân vi khuẩn gây bệnh viêm phổi mắc phải cộng đồng

thì S pneumoniae là tác nhân gây bệnh chính với tỷ lệ 23,8%, kế đến là M pneumoniae 14,3%, C pneumoniae 7,1%, K pneumoniae 4,8% và H influenzae 4,8% [26] Hầu hết các tác giả nước ngoài kể trên đều cho rằng nhờ

các kỹ thuật tiên tiến mà các tác nhân gây nhiễm khuẩn đường hô hấp dưới

ngày càng được phát hiện càng nhiều, tuy nhiên S pneumoniae vẫn là vi khuẩn

bệnh nhân trên 60 tuổi, đặc biệt là tác nhân P aeruginosa thường xảy ra ở bệnh

nhân viêm phổi mắc phải cộng đồng có kèm COPD, dãn phế quản, bệnh nặngtrầm trọng Đa tác nhân (phối hợp vi khuẩn) cũng được ghi nhận với tỷ lệ 23%các trường hợp Kết quả của các công trình nước ngoài cũng cho thấy tỷ lệ pháthiện vi khuẩn (tỷ lệ dương tính) bằng kỹ thuật real-time PCR cao hơn nhiều sovới phương pháp nuôi cấy phân lập vi khuẩn, đồng thời phát hiện được các vi

khuẩn không điển hình như M pneumoniae, C pneumoniae và L pneumophila

mà kỹ thuật nuôi cấy không phát hiện được

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là các mẫu đàm hoặc bệnh phẩm có chứa đàm củabệnh nhân được chẩn đoán VPMPCĐ đáp ứng được các tiêu chuẩn theo Hộinghị đồng thuận giữa Hội Lồng ngực Mỹ và Hội Bệnh nhiễm trùng Mỹ [57]:

- Một tổn thương mới xuất hiện trên phim chụp X-quang ngực, tổn thươngmột hoặc hai bên phổi

- Bệnh nhân có kèm theo một hoặc nhiều các biểu hiện cấp tính của đường

hô hấp như:

+ Ho: mới xuất hiện hoặc gia tăng, có thể ho khan hoặc có đàm

+ Khạc đàm với sự thay đổi tính chất và màu sắc đàm (đục, xanh, vàng).+ Khó thở

+ Sốt trên 38°C hoặc dưới 36°C

+ Có hội chứng đông đặc hoặc có ran ẩm hoặc ran nổ

2.1.1 Tiêu chuẩn chọn vào

- Mẫu đàm của bệnh nhân được chẩn đoán VPMPCĐ nhập viện điều trịtrong vòng 36 giờ đầu

- Mẫu đàm được đánh giá là tin cậy (bao gồm tin cậy vừa và rất đáng tincậy) theo thang điểm Barlett (Phụ lục 1)

- Mẫu đàm được chuyển đến phòng xét nghiệm trong hộp gel đá theo quyđịnh

2.1.2 Tiêu chuẩn loại ra

- Mẫu đàm của cùng bệnh nhân khi lấy ở các lần sau

- Mẫu đàm phát hiện có trực khuẩn Mycobacterium tuberculosis.

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian nghiên cứu: tháng 11/2020 đến 09/2021

- Địa điểm nghiên cứu: Bệnh viện Nguyễn Tri Phương và Khoa xétnghiệm của Công ty Nam Khoa Biotek

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu mô tả hàng loạt ca

2.3.2 Phương pháp chọn mẫu

Lấy mẫu thuận tiện trong thời gian nghiên cứu từ 01 tháng 12 năm 2020đến ngày 30 tháng 06 năm 2021

2.3.3 Quy trình nghiên cứu

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình nghiên cứu tổng quát

Thực hiện kỹ thuật xét nghiệm multiplex real-time PCR

Lấy thông tin bệnh nhân (từ hồ sơ bệnh án), lấy bệnh phẩm đàm xét

nghệm

Nhuộm Gram đánh giá mẫu bệnh phẩm đàm, chọn mẫu đàm tin cậy

Ghi nhận kết quả, lưu dữ liệu

Xử lý và phân tích số liệu Chẩn đoán bệnh nhân VPMPCĐ nhập viện

Hình 2.2 Quy trình xét nghiệm real-time PCR đàm

(Nguồn: Công ty Nam Khoa Biotek) 2.3.3.1 Thu thập bệnh phẩm

- Nhận bệnh phẩm đàm của bệnh nhân VPMPCĐ: Đàm phải được đựngtrong lọ vô khuẩn nắp vặn chặt được vận chuyển tới phòng xét nghiệm trongcác hộp gel đá trong thời gian quy định

Hình 2.3 Bệnh phẩm đàm

Đàm được xử lý hoặc giữ lạnh ngay (có tủ lạnh riêng dành cho nghiêncứu):

+ Bệnh phẩm đàm được xử lý trong vòng 2 giờ sau khi lấy

+ Nếu bệnh phẩm nhận trong thời gian từ 4 giờ chiều đến 7 giờ sáng hômsau thì được giữ lạnh ở 4°C và được xử lý sáng ngày hôm sau

2.3.3.2 Thực hiện xét nghiệm

Các xét nghiệm tìm căn nguyên vi khuẩn và virus từ các bệnh phẩm đàm,bao gồm nhuộm Gram xét nghiệm multiplex real-time PCR phát hiện các tácnhân vi sinh gây bệnh

❖ Nhuộm soi đàm:

- Mỗi bệnh phẩm đàm được nhuộm Gram (quy trình nhuộm tại Phụ lục 2),kiểm tra lam kính ở vật kính 10x và đếm số lượng tế bào biểu mô lát và cácbạch cầu đa nhân trên một vi trường Lặp lại ít nhất 10 vi trường Sau đó soilam kính ở độ phóng đại lớn hơn (100x) để xem hình ảnh vi khuẩn chiếm ưuthế

Hình 2.4 Đánh giá độ tin cậy của bệnh phẩm đàm

- Tiêu chuẩn đánh giá:

+ Bệnh phẩm đạt yêu cầu là bệnh phẩm có > 25 bạch cầu đa nhân trungtính/quang trường

+ Có < 10 tế bào biểu mô/quang trường

- Bệnh phẩm đạt yêu cầu sẽ được xét nghiệm PCR tìm AFB, và multiplexreal-time PCR tìm tác nhân vi khuẩn, virus gây bệnh

Mẫu không tin cậy:

Không thấy TB bạch cầu

Tế bào biểu mô >10

Mẫu tin cậy vừa:

Nhiều TB bạch cầu Nhiều TB biểu mô

Mẫu tin cậy:

Nhiều TB bạch cầu

Tế bào biểu mô <10

Mẫu tin cậy:

Nhiều TB bạch cầu Không có TB biểu mô

Hình 2.5 Đánh giá tác nhân vi khuẩn trên tiêu bản nhuộm Gram

Song cầu Gram [+] giống

❖ Kỹ thuật multiplex real-time PCR:

Kỹ thuật multiplex real-time PCR vừa có thể phát hiện, vừa có thể địnhlượng DNA trong mỗi mẫu xét nghiệm

Hình 2.6 Quy trình multiplex real-time PCR phát hiện tác nhân vi sinh gây

VPMPCĐ [17]

(1) Mẫu đàm (Đánh giá, xử lý)

(2) Tách chiết DNA/RNA

(3) Chạy multiplex real-time PCR

Phát hiện

Kỹ thuật multiplex real-time PCR nhằm phát hiện các tác nhân vi sinh gâybệnh trong mẫu đàm hay bệnh phẩm có chứa đàm Kỹ thuật này được tóm tắtnhư sau:

(1) Trước hết mẫu được làm thuần nhất bằng một thể tích dung dịch thuầnnhất đàm là PBS có chứa NALC (N-Acetyl L-Cysteine)

(2) Sau đó mẫu được tách chiết nucleic acid trên máy tách chiết tự độngKingFisher FLEX của hãng Thermo với bằng bộ thuốc thử NKRNADNAprep-MAGBEAD của Công ty Nam Khoa Biotek Bộ thuốc thử này đã được thẩmđịnh bằng cách so sánh với phương pháp BOOM tách chiết nucleic acid,phương pháp sử dụng Trizol-LS tách chiết RNA và phương pháp tách chiếtnucleic acid dùng hệ thống kín MagnaPure của Roche

(3) Các tách chiết nucleic acid từ các mẫu đàm được đưa vào thực hiệnreal-time PCR sử dụng các mồi và Tagman probe đặc hiệu (Phụ lục 3) để pháthiện và định lượng các tác nhân vi khuẩn bao gồm: (i) các vi khuẩn cộng đồng

là S pneumoniae, H influenzae, H influenzae type b, M catarrhalis, Streptococci nhóm A, Streptococci nhóm B, và S suis; (ii) các vi khuẩn không điển hình là M pneumoniae, C.pneumoniae và L pneumophila; (iii) các vi khuẩn bệnh viện là S aureus kháng hay nhạy methicillin, S epidermidis kháng hay nhạy methicillin, S aureus có độc tố Pantom-Valentine Leukocydine, E faecalis, E faecium, E coli, K pneumoniae, P aeruginosa, và A baumannii.

Kỹ thuật multiplex real-time PCR nêu trên đã được thẩm định qua nhiềunghiên cứu đã công bố trước đây [18], [32], [62] Kết quả phát hiện và địnhlượng các tác nhân vi khuẩn gây bệnh được trả lời qua số đơn vị phát hiện được(detection unit) thông qua biểu đồ khuếch đại (Phụ lục 3) và mỗi đơn vị pháthiện được là tương đương 5 copies tác nhân vi khuẩn dựa theo nghiên cứu

Hình 2.7 Biểu đồ khuếch đại ghi nhận cường độ huỳnh quang

Tác nhân vi sinh được xác định là tác nhân gây bệnh khi kết quả multiplexreal-time PCR cho số định lượng là ≥ 20.000 DU (tức là ≥ 100.000 copies).Riêng đối với tác nhân vi khuẩn không điển hình vì không có tiêu chuẩn nêntrong nghiên cứu này chúng tôi cho là tác nhân gây bệnh nếu số định lượng là

≥ 1.000 DU (tức là ≥ 5.000 copies) Tác nhân gây bệnh được cho là tác nhânchính gây bệnh nếu có số lượng cao nhất còn những tác nhân có số lượng thấphơn sẽ được cho là tác nhân gây bệnh phối hợp Ngoài ra , mẫu bệnh phẩm cũng

được thực hiện real-time PCR phát hiện M tuberculosis để ghi nhận theo quy

trình thường quy

Kỹ thuật multiplex real-time PCR có thể phát hiện 72 tác nhân gây bệnh