Hoàn thiện quy trình làm bộ mẫu ký sinh trùng sốt rét theo tiêu chuẩn của tổ chức y tế thế giới sử dụng trong chương trình ngoại kiểm của trung tâm kiểm chuẩn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ---NGUYỄN THỊ LÀI HOÀN THIỆN QUY TRÌNH LÀM BỘ MẪU KÝ SINH TRÙNG SỐT RÉT THEO TIÊU CHUẨN CỦA TỔ CHỨC Y TẾ THẾ GIỚI SỬ D

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

-NGUYỄN THỊ LÀI

HOÀN THIỆN QUY TRÌNH LÀM BỘ MẪU KÝ SINH TRÙNG SỐT RÉT THEO TIÊU CHUẨN CỦA TỔ CHỨC Y TẾ THẾ GIỚI

SỬ DỤNG TRONG CHƯƠNG TRÌNH NGOẠI KIỂM CỦA

TRUNG TÂM KIỂM CHUẨN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Y HỌC

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

NGUYỄN THỊ LÀI

HOÀN THIỆN QUY TRÌNH LÀM BỘ MẪU KÝ SINH TRÙNG SỐT RÉT THEO TIÊU CHUẨN CỦA TỔ CHỨC Y TẾ THẾ GIỚI

SỬ DỤNG TRONG CHƯƠNG TRÌNH NGOẠI KIỂM CỦA

TRUNG TÂM KIỂM CHUẨN

NGÀNH: KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM Y HỌC

MÃ SỐ: 8720601

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Y HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 PGS.TS VŨ QUANG HUY

2 PGS.TS LÊ THÀNH ĐỒNG

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các tài liệu trích dẫn, các sốliệu trong luận văn là hoàn toàn trung thực và tuân theo đúng yêu cầu của mộtnghiên cứu Luận văn này là duy nhất và chưa từng được ai công bố trong bất kỳcông trình nào khác

Tác giả luận văn

NGUYỄN THỊ LÀI

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 3

Chương 1 TỔNG QUAN 4

1.1 Tình hình sốt rét hiện nay 4

1.1.1 Tình hình sốt rét trên thế giới 4

1.1.2 Tình hình sốt rét tại Việt Nam 5

1.2 Hình thái ký sinh trùng sốt rét 6

1.2.1 Hình thái Plasmodium falciparum 7

1.2.2 Hình thái Plasmodium vivax 8

1.2.3 Hình thái Plasmodium ovale 10

1.2.4 Hình thái Plasmodium malariae 11

1.3 Chu trình phát triển của ký sinh trùng sốt rét 13

1.3.1 Giai đoạn phát triển vô tính trong cơ thể người 13

1.3.2 Giai đoạn phát triển hữu tính trong cơ thể muỗi 14

1.4 Phương pháp test nhanh chẩn đoán ký sinh trùng sốt rét 15

1.5 Ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm 17

1.5.1 Khái niệm ngoại kiểm 17

1.5.2 Mẫu ngoại kiểm 17

1.5.3 Tiêu chuẩn sản xuất mẫu ngoại kiểm 17

1.5.3.1 Tính đồng nhất của mẫu ngoại kiểm 18

1.5.3.2 Độ ổn định của mẫu ngoại kiểm 18

1.5.4 Tình hình ngoại kiểm hiện nay 19

1.5.4.1 Tình hình ngoại kiểm trên thế giới 19

1.5.4.2 Tình hình ngoại kiểm trong nước 20

1.5.4.3 Các chương trình ngoại kiểm ký sinh trùng sốt rét 22

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 Đối tượng nghiên cứu 24

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 24

2.1.2 Tiêu chuẩn chọn mẫu 24

2.1.3 Tiêu chuẩn loại trừ 24

2.1.4 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 24

2.2 Phương pháp nghiên cứu 24

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 24

2.2.2 Cỡ mẫu 25

2.2.3 Phương pháp chọn mẫu 25

2.2.4 Thu thập số liệu 25

2.2.5 Xử lý số liệu 25

2.3 Quy trình sản xuất tiêu bản KSTSR 27

2.3.1 Làm tiêu bản giọt dày và giọt mỏng 27

2.3.2 Cố định giọt máu mỏng 28

2.3.3 Quy trình nhuộm tiêu bản với dung dịch giêm sa 28

2.3.4 Kỹ thuật dán lamen, cách bảo quản 29

2.3.5 Đánh giá chất lượng tiêu bản nhuộm 29

2.4 Đếm mật độ ký sinh trùng 31

2.5 Đánh giá tính đồng nhất của mẫu ngoại kiểm 32

2.6 Đánh giá độ ổn định của mẫu ngoại kiểm 32

2.7 Bảo quản mẫu, lưu trữ mẫu 32

2.8 Đóng gói, vận chuyển mẫu đến đơn vị tham gia ngọai kiểm 33

2.9 Đánh giá kết quả ngoại kiểm 35

2.10 Vấn đề y đức và tính ứng dụng 36

Chương 3 KẾT QUẢ 37

3.1 Thực hiện bộ mẫu ký sinh trùng sốt rét để dùng trong ngoại kiểm .37

3.1.1 Thu thập mẫu máu làm tiêu bản 37

3.1.2 Thực hiện bộ mẫu ký sinh trùng sốt rét để dùng trong ngoại kiểm 37

3.2 Đánh giá tính đồng nhất và độ ổn định của bộ mẫu ngoại kiểm 38

3.2.1 Đánh giá tính đồng nhất 38

3.2.2 Đánh giá độ ổn định 50

3.3 Ngoại kiểm ký sinh trùng sốt rét 69

Chương 4 BÀN LUẬN 74

4.1 Thu thập mẫu và thực hiện bộ mẫu ngoại kiểm 74

4.2 Đánh giá tính đồng nhất 77

4.2 Đánh giá độ ổn định 79

4.3 Đánh giá ngoại kiểm 80

KẾT LUẬN 85

KIẾN NGHỊ 87 TÀI LIỆU THAM KHẢO

Phụ lục 1

Phụ lục 2

EDTA Ethylene diamin tetraacetic acid

EQA External Quality Assessment

GMS Greater Mekong Subregion

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hình thể P falciparum 8

Hình 1.2 Hình thể P vivax 9

Hình 1.3 Hình thể P ovale 11

Hình 1.4 Hình thể P malariae 12

Hình 1.5 Chu kỳ phát triển của ký sinh trùng sốt rét 15

Hình 2.1 Số ngẫu nhiên trong Sách “Căn bản xác suất và thống kê y học” 26

Hình 2.2 Tiêu bản máu giọt dày và giọt mỏng 28

Hình 2.3 Nhuộm tiêu bản KSTSR 29

Hình 2.4 Tiêu bản KSTSR trên giọt mỏng 30

Hình 2.5 Tiêu bản KSTSR trên giọt dày 31

Hình 2.6 Bảo quản bộ mẫu KSTSR trong hộp 33

Hình 2.7 Đóng gói mẫu KSTSR 33

Hình 3.1 Chứng nhận cấp độ 1 do Tổ chức Y tế Thế giới cấp 37

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Kết quả định loại và mật độ KST/µl của các bộ mẫu… 38

Bảng 3.2 Đánh giá tính đồng nhất về mật độ KSTSR của bộ mẫu PM01… 38

Bảng 3.3 Đánh giá tính đồng nhất về hình thể KSTSR bộ mẫu PM01 ……… 39

Bảng 3.4 Đánh giá tính đồng nhất của bộ mẫu PM02 ………… … 40

Bảng 3.5 Đánh giá tính đồng nhất của bộ mẫu PM03 … … … 41

Bảng 3.6 Đánh giá tính đồng nhất của bộ mẫu PM04 … … 41

Bảng 3.7 Đánh giá tính đồng nhất của bộ mẫu PM05 ……… 42

Bảng 3.8 Đánh giá tính đồng nhất của bộ mẫu PM06 ……… 43

Bảng 3.9 Đánh giá tính đồng nhất của bộ mẫu PM07 ………… 44

Bảng 3.10 Đánh giá tính đồng nhất của bộ mẫu PM08 ………… 45

Bảng 3.11 Đánh giá tính đồng nhất của bộ mẫu PM09 ………… 45

Bảng 3.12 Đánh giá tính đồng nhất của bộ mẫu PM10 ………… 46

Bảng 3.13 Đánh giá tính đồng nhất của bộ mẫu PM11 ………… 47

Bảng 3.14 Đánh giá tính đồng nhất của bộ mẫu PM12 ………… 48

Bảng 3.15 Đánh giá tính đồng nhất của bộ mẫu PM13 ………… 48

Bảng 3.16 Đánh giá tính đồng nhất của bộ mẫu PM14 ………… 49

Bảng 3.17 Đánh giá độ ổn định của bộ mẫu PM01… ………… … 51

Bảng 3.18 Đánh giá độ ổn định của bộ mẫu PM02… ………… … 52

Bảng 3.19 Đánh giá độ ổn định của bộ mẫu PM03… ………… … 53

Bảng 3.20 Đánh giá độ ổn định của bộ mẫu PM04… ………… … 55

Bảng 3.21 Đánh giá độ ổn định của bộ mẫu PM05… ………… … 56

Bảng 3.22 Đánh giá độ ổn định của bộ mẫu PM06… ………… … 57

Bảng 3.23 Đánh giá độ ổn định của bộ mẫu PM07… ………… … 59

Bảng 3.24 Đánh giá độ ổn định của bộ mẫu PM08… ………… … 60

Bảng 3.25 Đánh giá độ ổn định của bộ mẫu PM09… ………… … 61

Bảng 3.26 Đánh giá độ ổn định của bộ mẫu PM10… ………… … 62

Bảng 3.27 Đánh giá độ ổn định của bộ mẫu PM11… ………… … 64

Bảng 3.28 Đánh giá độ ổn định của bộ mẫu PM12… ………… … 65

Bảng 3.29 Đánh giá độ ổn định của bộ mẫu PM13… ………… … 66

Bảng 3.30 Đánh giá độ ổn định của bộ mẫu PM14… ………… … 68

Bảng 3.31 Kết quả cho mẫu 1(P.vivax, mật độ KST 33.360 KST /μl) … … 70

Bảng 3.32 Kết quả cho mẫu 3 (P.falciparum, mật độ KST 49.714 KST/μl) … …70

Bảng 3.33 Kết quả cho mẫu 4 (P.vivax, mật độ KST 6.006 KST/μl ………… 71

Bảng 3.34 Kết quả cho mẫu 2 và 5 (tìm không thấy KSTSR) ………71

Bảng 3.35 Kết quả ngoại kiểm KSTSR của các đơn vị tham gia ……….72

DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1 Quy trình làm tiêu bản mẫu KSTSR … …… … 34

vi phải được duy trì thường xuyên và liên tục.

Thông tư 01/2013/TT-BYT ngày 11 tháng 01 năm 2013 của Bộ Y tế về việcHướng dẫn thực hiện quản lý chất lượng xét nghiệm tại cơ sở khám bệnh, chữabệnh đã quy định các phòng xét nghiệm cần tiến hành nội kiểm tra và ngoại kiểmtra để đảm bảo chất lượng kết quả xét nghiệm [14] Đây cũng là tiêu chí bắt buộcđối với các xét nghiệm được phép liên thông kết quả xét nghiệm ban hành theoquyết định 2429/QĐ-BYT ngày 12 tháng 6 năm 2017 của bộ trưởng Bộ Y tế[5].Ngày 02/03/2016, Bộ Y tế ban hành Quyết định số 741/QĐ-BYT về việc hướng dẫngiám sát và phòng chống bệnh sốt rét Đối với các địa phương đang trong giai đoạnloại trừ sốt rét việc chẩn đoán xác định bệnh nhân nhiễm KST sốt rét được thực hiệnbằng phương pháp giêmsa, soi kính hiển vi[4] Kỹ thuật nhuộm giêmsa tìm ký sinhtrùng sốt rét là một kỹ thuật xét nghiệm theo phương pháp thủ công Tuy đã cónhiều phương pháp chẩn đoán khác hiện đại hơn nhưng phương pháp nhuộmgiêmsa vẫn được Tổ chức Y tế Thế giới đánh giá là “tiêu chuẩn vàng” trong chẩnđoán xác định KST sốt rét[43],[44] Tuy nhiên do là phương pháp thủ công nên dễsai sót khi thao tác hay nhầm lẫn là một nguy cơ hoàn toàn có thể xảy ra Vì vậyđảm bảo chất lượng là vấn đề đáng quan tâm nhất, mỗi phòng xét nghiệm cần tiếnhành nội kiểm tra và ngoại kiểm tra chất lượng bởi một phòng tham chiếu của Tổchức Y tế Thế giới công nhận

Trên thế giới các chương trình ngoại kiểm tra KSTSR đã được triển khai tạinhiều quốc gia và khu vực, trong đó có Việt Nam Ở Việt Nam, Tổ chức Y tế Thế

giới gửi lam ngoại kiểm sốt rét 1 năm 2 đợt vào tháng 6 và tháng 10 hằng năm đểngoại kiểm phòng xét nghiệm của 3 Viện: Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùngTrung Ương, Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Tp Hồ Chí Minh và ViệnSốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Quy Nhơn Trong đó mẫu ngoại kiểm có cả 5loài KSTSR và lam âm tính Việc xây dựng các ngân hàng lam mẫu để ngoại kiểmtra chất lượng cũng được Tổ chức Y tế Thế giới quan tâm.

Tuy nhiên, để có mẫu ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm chúng ta cầnmột mẫu xét nghiệm đạt tiêu chuẩn của WHO Các mẫu ngoại kiểm hiện nay đa số

ở trung tâm kiểm chuẩn là do nhân viên thu thập được mẫu máu và làm lam ngoạikiểm KSTSR theo quy trình mà không được kiểm chúng bởi 1 phòng xét nghiệmtham chiếu đạt chất lượng của WHO Vì vậy, lam ngoại kiểm KSTSR cần đượckiểm tra và đối chiếu bởi các xét nghiệm viên đạt cấp độ 1 và cấp độ 2 do WHOcấp

Việc sản xuất ra một mẫu ngoại kiểm đảm bảo tính đồng nhất và ổn địnhtheo thời gian để có thể ngoại kiểm tra chất lượng phòng xét nghiệm là điều cần

thiết Ở nước ta có hai loài KSTSR phổ biến nhất là P.falciparum và P.vivax Nên

cần tập trung vào sản xuất mẫu ngoại kiểm của 2 loài này Bên cạnh đó, chúng tacũng nên sản xuất thêm mẫu ngoại kiểm các loài khác và mẫu âm tính để có tínhkhách quan hơn khi gửi mẫu kiểm tra các phòng xét nghiệm khác

Bên cạnh đó, tình hình sốt rét kháng thuốc đang gia tăng trong một số tỉnh ởnước ta nên WHO khuyến cáo sử dụng đếm mật độ KST dựa trên số lượng KST/µlmáu thay vì đếm mật độ dấu cộng như hiện nay

Hiện nay, Trung tâm kiểm chuẩn chất lượng xét nghiệm y học – Đại học YDược Thành phố Hồ Chí Minh hiện đang sử dụng lam mẫu ngoại kiểm KSTSR với

đề tài: “Quy trình sản xuất mẫu phết máu xét nghiệm P.falciparum và P vivax dùng

cho ngoại kiểm” của Nguyễn Ngọc Hiền- năm 2019 [9]

Từ tình hình thực tế trên, tiến hành nghiên cứu đề tài “Hoàn thiện quy trìnhlàm bộ mẫu ký sinh trùng sốt rét theo tiêu chuẩn của Tổ chức Y tế Thế giới sử dụngtrong chương trình ngoại kiểm của Trung tâm kiểm chuẩn” nhằm sản xuất ra được

mẫu ngoại kiểm đảm bảo tính đồng nhất, ổn định, không lây nhiễm và ít bị tác độngbởi điều kiện môi trường trong quá trình vận chuyển mẫu Kết quả nghiên cứukhông những giúp cho các phòng xét nghiệm trong nước có thể tiến hành thực hiệnchương trình ngoại kiểm với giá hợp lý mà còn nhằm nâng cao chất lượng của cácphòng xét nghiệm đảm bảo tính chính xác tin cậy trong quá trình xét nghiệm, tiếntới liên thông kết quả xét nghiệm đem lại lợi ích cho cả bệnh nhân, cơ sở y tế vàcộng đồng.

Câu hỏi nghiên cứu

Bộ mẫu ký sinh trùng sốt rét sử dụng trong ngoại kiểm có đạt tiêu chuẩn của

Tổ chức Y tế Thế giới hay không?

Mục tiêu nghiên cứu

1 Mục tiêu tổng quát:

Hoàn thiện quy trình làm bộ mẫu ký sinh trùng sốt rét theo tiêu chuẩn của

Tổ chức Y tế Thế giới sử dụng trong chương trình ngoại kiểm

2 Mục tiêu cụ thể:

- Thực hiện bộ mẫu ký sinh trùng sốt rét theo tiêu chuẩn của Tổ chức Y tếThế giới

- Đánh giá tính đồng nhất và độ ổn định trên tiêu bản mẫu đã sản xuất

- Đánh giá ngoại kiểm các phòng xét nghiệm

Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Tình hình sốt rét hiện nay

là muỗi Anopheles Có khoảng 120 loài Plasmodium, trong số này chỉ có năm loài

ký sinh gây bệnh cho người: P falciparum, P vivax, P ovale và P malariae và P knowlesi Nhưng chủ yếu có hai loại P falciparum và P vivax trong đó P falciparum chiếm 75-80% KSTSR P knowlesi được mô tả chi tiết ở khỉ năm 1932 đến năm 1965 lần đầu tiên phát hiện KSTSR P knowlesi này lây bệnh sang người Theo số liệu thống kê của WHO, năm 2018, P falciparum là ký sinh trùng sốt rét

phổ biến nhất ở khu vực châu Phi chiếm 99,7% ca sốt rét, ở khu vực Đông Nam Áchiếm 50%, khu vực Đông Địa Trung Hải chiếm 71% và khu vực Tây Thái Bình

Dương chiếm 65% Trên thế giới, P vivax là ký sinh trùng phổ biến ở Khu vực

Châu Mỹ chiếm 75% các trường hợp sốt rét

Kể từ năm 2000 cho đến nay, chương trình phòng chống sốt rét trên toàn thếgiới đã mang lại những bước tiến bộ vượt bậc, tỉ lệ mắc sốt rét đã giảm 37% và tỉ lệ

tử vong do sốt rét giảm 60% trên toàn thế giới vào năm 2015 Tuy nhiên, tình trạngkháng hóa chất diệt côn trùng dùng trong dự phòng, kháng artemisinin là thuốc điềutrị sốt rét, thậm chí kháng các thuốc dùng trong phương pháp điều trị kết hợp vớiartemisinin đã và đang gia tăng, đe dọa đẩy lùi những thành quả đạt được trong việckiểm soát và loại trừ sốt rét Hiện tượng kháng thuốc không chỉ xuất hiện tại ViệtNam, KSTSR kháng thuốc artemisinin đã được phát hiện tại 3 quốc gia khác trongkhu vực Tiểu vùng sông Mê Kông: Campuchia, Myanmar và Thái Lan Các nghiêncứu khẳng định rằng hiện tượng kháng với artermisinin xuất hiện một cách độc lập

ở nhiều nơi thuộc khu vực này Phần lớn bệnh nhân vẫn được điều trị thành côngbằng phương pháp điều trị kết hợp với artermisinin nếu không bị kháng với thuốcphối hợp Tuy nhiên một số nơi tại Campuchia và Thái Lan đã xuất hiện chủng

P.falciparum kháng với cả artermisinin và các thuốc phối hợp (đa kháng thuốc) Sốt rét P.falciparum ở Campuchia và Thái Lan đang ngày càng khó điều trị hơn.

Không những thế, tình trạng đa kháng thuốc còn có nguy cơ lan rộng đến nhiềuquốc gia và khu vự khác, gây hậu quả nghiêm trọng [1]

1.1.2 Tình hình sốt rét tại Việt Nam

Năm 2019, tại Việt Nam, số bệnh nhân sốt rét toàn quốc có 5.887 trườnghợp, giảm 14,31% so với bệnh nhân sốt rét năm 2018, không có tử vong do sốt rét.Riêng khu vực Nam Bộ - Lâm Đồng, năm 2019, tổng số bệnh nhân có KSTST là

563 trường hợp, có 02 trường hợp sốt rét ác tính và không có trường hợp nào tửvong do sốt rét[23] Theo số liệu báo cáo hàng năm của Chương trình phòng chốngsốt rét Quốc gia nhiều tỉnh có mức độ lưu hành sốt rét cao chủ yếu thuộc khu vựcmiền Trung – Tây Nguyên và Khu vực Đông Nam Bộ, hầu hết các tỉnh có các xã,huyện có đường biên giới với Lào và Campuchia đều có tỷ lệ bệnh nhân mắc sốt rétcao hơn so với các địa phương khác trên toàn quốc Bệnh sốt rét tuy đã giảm nhưng

có nguy cơ quay trở lại lớn; đối tượng dễ mắc bệnh là những người sống ở vùngsâu, vùng xa, người đi rừng ngủ rẫy và khu vực biên giới Việt Nam với Lào vàCampuchia Tại các vùng này nguy cơ lan truyền sốt rét tiếp diễn và phức tạp, việcnhiễm bệnh sốt rét chủ yếu thông qua giao lưu tự do nên rất khó khăn trong việcgiám sát, phát hiện, điều trị bệnh sốt rét [1],[8]

Ký sinh trùng sốt rét kháng thuốc luôn là một vấn đề nan giải trong phòngchống và điều trị ở nước ta Nhiều nghiên cứu tước đây ở một số vùng dịch tễ trong

cả nước đặc biệt là các tỉnh Miền Trung - Tây Nguyên và Đông Nam Bộ (Bình

Phước) đã ghi nhận sự kháng thuốc của P falciparum với các thuốc chloroquine,

fansidar, amodiaquine và cả mefloquine, có những nơi háng thuốc chloroquine vàfansidaer đến hơn 90% Tại Việt Nam việc nghiên cứu, theo dõi đánh giá tình hìnhsốt rét kháng thuốc được Viện Sốt rét- Ký sinh trùng – Côn trùng Trung Ương, ViệnSốt rét - Ký sinh trùng – Côn trùng Tp Hồ Chí Minh, Viện Sốt rét - Ký sinh trùng –Côn trùng Quy Nhơn tiến hành thường xuyên tại các vùng sốt rét nặng là khu vựccác tỉnh Miền Trung – Tây Nguyên và tỉnh Bình Phước nhằm phát hiện sớmKSTSR kháng thuốc, đặc biệt với artermisinin và dẫn chất (artersunate, dihydroartermisinin ) là thuốc sốt rét có hiệu lực trong điều trị hiện nay[1],[21]

Quan sát giọt mỏng để xác định loài KSTSR và đếm mật độ ký sinhtrùng trên đơn vị microlit máu dựa trên số hồng cầu bị nhiễm [43],[44].KSTSR luôn biến đổi hình dạng trong quá trình phát triển ở người cũng như ởmuỗi Ở người, các giai đoạn phát triển của KSTSR qua 3 giai đoạn: thể tưdưỡng, thể phân liệt, thể giao bào

Quan sát trên một phết máu nhuộm giêmsa, thành phần một ký sinhtrùng gồm có:

- Nhân, bắt màu đỏ

- Nguyên sinh chất, bắt màu xanh lơ

- Sắc tố sốt rét, có màu nâu đen

- Hạt đặc hiệu

- Không bào không bắt màu [11],[43]

1.2.1 Hình thái Plasmodium falciparum

1.2.1.1 Thể tư dưỡng (trophozoit)

- Thể tư dưỡng non: có hình dạng nhẫn, thể song nhân, kích thướcnhỏ và thanh mảnh, chiếm khoảng 1/4 đường kính hồng cầu, thường nằm

ở rìa hồng cầu với nhiều dạng như hình nhẫn, hình chấm phẩy, hình cánh énhay hình nhẫn với nhân là hai hạt chromatin Một hồng cầu có thể bị nhiễmnhiều tư dưỡng, nhưng kích thước hồng cầu không thay đổi [11]

- Thể tư dưỡng già: thường không thấy trong máu ngoại biên.Nguyên sinh chất dày hơn, nhân to hơn, trên màng hồng cầu xuất hiệnnhững vết Maurer màu nâu, số lượng ít (khi nhuộm với pH hơi kiềm), có thểxuất hiện sắc tố sốt rét

1.2.1.2 Thể phân liệt( schizont)

Thể phân liệt hiếm gặp ở máu ngoại biên, có khoảng 16-32 mảnh trùng, sắc

tố sốt rét hình que màu nâu đen nằm rải rác hoặc tập trung thành cụm [11]

1.2.1.3 Thể giao bào(gametocyte)

Thể giao bào P falciparum có hình liềm hay hình trái chuối, xuất

hiện trễ (sau 10 ngày) và tồn tại lâu trong máu (hàng tháng) Sắc tố sốt réthình que màu nâu đen nằm rải rác hoặc tập trung trong nguyên sinhchất[11]

Hình 1.1 Hình thể P.falciparum

1.2.2 Hình thái Plasmodium vivax

1.2.2.1 Thể tư dưỡng (trophozoit)

Thể tư dưỡng non P vivax có đường kính 2-3 µm bằng 1/3 đườngkính hồng cầu Nguyên sinh chất dày, không đều

Thể tư dưỡng già có nguyên sinh chất với hình dạng bất kỳ (dạng

amip) Kích thước hồng cầu trương to méo mó, với rất nhiều hạt Schuffner

đỏ và mịn trên màng hồng cầu Hồng cầu bị ký sinh có kích thước lớn hơnhồng cầu bình thường [11]

1.2.2.2 Thể phân liệt( schizont)

Thể phân liệt P vivax có hình tròn, nguyên sinh chất chiếm toàn bộ hồng cầu.

Sắc tố hình chấm, màu nâu sẫm nằm rải rác, thường gặp với 16-24 mảnh trùng

1.2.2.3 Thể giao bào (gametocyte)

Thể giao bào hình tròn hay bầu dục, nhân là một khối lớn, có nhiều sắc tố sốt rét,xuất hiện trong máu sớm (sau 2-3 ngày) và không tồn tại lâu (khoảng 1 tuần) [11]

Hình 1.2 Hình thể P.vivax

1.2.3 Hình thái Plasmodium ovale

1.2.3.1 Thể tư dưỡng (trophozoit)

Thể tư dưỡng non P ovale: giống như P vivax, tư dưỡng hình nhẫn

to khoảng 1/3 đường kính hồng cầu

Thể tư dưỡng già: hồng cầu cũng trương to, có dạng amíp, hình bầudục (hình oval) có răng cưa Có hạt Schuffner trên màng hồng cầu

1.2.3.2 Thể phân liệt( schizont)

Thể phân liệt có khoảng 4-16 mảnh trùng, các hạt sắc tố to tậptrung ở giữa nguyên sinh chất

1.2.3.3 Thể giao bào (gametocyte)

Thể giao bào P ovale hình tròn hay bầu dục, hạt sắc tố thô rải rác trong

nguyên sinh chất[11]

Hình 1.3 Hình thể P.ovale

1.2.4 Hình thái Plasmodium malariae

1.2.4.1 Thể tư dưỡng (trophozoit)

Thể tư dưỡng non P malariae có hình nhẫn giống P vivax, tư

dưỡng có hình dạng giống mắt cú mèo (nhân ở giữa nguyên sinh chất)

Thể tư dưỡng già hình trứng hoặc dài, có bờ dài, có dạng dải băng

bắt ngang qua hồng cầu theo đường kính Có hạt đạc hiệu Ziemann Sắc tố

nâu đậm xuất hiện sớm, nằm giữa nguyên sinh chất Hồng cầu bị ký sinh

có kích thước nhỏ hơn hồng cầu bình thường

1.2.4.2 Thể phân liệt( schizont)

Thể phân liệt P malariae có khoảng 6-12 mảnh trùng, xếp thành

hình hoa cúc, các hạt sắc tố tập trung ở giữa nguyên sinh chất

1.2.4.3 Thể giao bào(gametocyte)

Thể giao bào P malariae có hình tròn, chiếm toàn bộ hồng cầu Sắc tố có

màu đen, rải rác trong nguyên sinh chất [11]

Hình1.4 Hình thể P.malariae

1.3 Chu trình phát triển của ký sinh trùng sốt rét

1.3.1 Giai đoạn phát triển vô tính trong cơ thể người

1.3.1.1 Giai đoạn ở gan

Nếu muỗi mang mầm bệnh, ký sinh trùng sốt rét sẽ nằm trong tuyến nướcbọt của muỗi dưới dạng thoa trùng (sporozoit) là những sợi mảnh hình thoi Khiđốt người, thoa trùng sẽ theo nước bọt của muỗi, mà xâm nhập vào hệ tuần hoàn.Sau 30 phút lưu thông trong máu, thoa trùng sẽ đến gan, xâm nhập vào tế bàogan và phát triển trong đó Trong tế bào gan, các mảnh trùng sẽ phát triển lênthành thể phân liệt (còn gọi là schizont gan) với kích thước thay đổi từ 30 đến 70

µm, trong có chứa hàng ngàn mảnh trùng hay còn gọi là thể phân cách (P falciparum: 30.000; P vivax: 10.000; P malariae và P ovale: 15.000) Sau cùng

các phân liệt gan này sẽ vỡ ra, phóng thích các mảnh trùng vào máu Giai đoạn

phát triển trong gan dài hay ngắn tùy theo ký sinh trùng, đối với P falciparum là 5,5- 7 ngày, P vivax 6 - 8 ngày, P ovale 9 ngày và P malariae là 14 - 16 ngày.

Đối với P vivax và P ovale, ngoài sự phát triển tức thì của thoa trùng

trong gan như đã nói ở trên, còn có sự tồn tại của các thể ngủ (hypnozoit) tronggan: thoa trùng xâm nhập tế bào gan nhưng không tiếp tục phát triển ngay để cho

ra phân liệt, mà nằm yên trong tế bào gan Vài tháng hay thậm chí cả năm sau

đó, vì một lý do chưa rõ, các thể ngủ mới phát triển tiếp để cho ra phân liệt, và rồiphân liệt vỡ ra, tung các mảnh trùng vào máu gây ra các cơn tái phát sốt rét

Riêng P falciparum và P malariae không có thể ngủ trong gan.

1.3.1.2 Giai đoạn ở hồng cầu

Các mảnh trùng được phóng thích từ gan ra sẽ xâm nhập hồng cầu đểphát triển thành thể tư dưỡng (trophozoit) Từ tư dưỡng sẽ phát triển thành thểphân liệt có chứa nhiều mảnh trùng (schizont) trong máu Số lượng mảnh trùngtrong một phân liệt thay đổi tùy theo chủng loại ký sinh trùng sốt rét Phân liệttrong máu sẽ vỡ ra để các mảnh trùng với kích thước 1,5 µm xâm nhập các hồngcầu khác và tiếp tục chu kỳ trong hồng cầu (cho ra tư dưỡng rồi phân liệt…)

Chu kỳ phát triển trong hồng cầu kéo dài 48 giờ đối với P vivax và P.

falciparum, 72 giờ đối với P malariae và 50 giờđối với P ovale Sau nhiều chu

kỳ như trên, một số mảnh trùng phát triển thành các thể hữu tính là giao bào(gametocyte) đực và cái Các thể này không phát triển thêm mà chỉ nằm trong

hồng cầu chờ được muỗi cái Anopheles spp hút vào dạ dày để phát triển tiếp.

1.3.2 Giai đoạn phát triển hữu tính trong cơ thể muỗi

Khi muỗi cái Anopheles spp đốt người có bệnh sốt rét, các thể khác nhau

của ký sinh trùng trong máu sẽ được hút vào dạ dày muỗi, nhưng chỉ có các thểgiao bào là tiếp tục phát triển được Vài phút sau khi vào dạ dày muỗi, có hiệntượng thoát roi ở giao bào đực để cho ra 4 đến 8 tiểu giao tử, trong khi giao bàocái trở thành đại giao tử Quá trình phát triển từ giao bào cho ra tiểu giao tử và đạigiao tử hoàn thành trong vòng 20 phút trong dạ dày muỗi Một tiểu giao tử sẽxâm nhập vào một đại giao tử và một hợp tử (zygote) được hình thành (trứng thụtinh) Trong vòng 18-24 giờ trứng này sẽ di động, đi xuyên qua vách dạ dày muỗiphát triển thành trứng nang có kích thước 40-55 µm ở mặt ngoài dạ dày, dướilớp màng bao Trứng nang phát triển thành nang thoa trùng, chứa hàng ngànthoa trùng (sporozoit) trong đó Nang thoa trùng sẽ vỡ ra, các thoa trùng sẽhướng về tuyến nước bọt của muỗi và nằm trong tuyến nước bọt Khi muỗi đốtngười, thoa trùng sẽ theo nước bọt mà xâm nhập vào cơ thể người để tiếp tụcchu kỳ phát triển trong người Người ta ước tính là mỗi lần muỗi đốt cókhoảng gần 100 thoa trùng xâm nhập vào người

Thời gian ký sinh trùng phát triển trong muỗi kéo dài khoảng một đếnhai tuần, tùy thuộc vào nhiệt độ của môi trường bên ngoài Nhiệt độ môi trườngbên ngoài càng cao thì thời gian ký sinh trùng phát triển trong muỗi càng ngắn.Nếu nhiệt độ bên ngoài thấp hơn 16 0C thì P vivax sẽ không phát triển được trong

muỗi (18 0C đối với P falciparum), cũng như nếu nhiệt độ cao quá 45 0C thì kýsinh trùng cũng sẽ ngưng phát triển

Hình 1.5 Chu kỳ phát triển của ký sinh trùng sốt rét

1.4 Phương pháp test nhanh chẩn đoán ký sinh trùng sốt rét

1.4.1 Nguyên tắc:

Test chẩn đoán nhanh loại sắc ký miễn dịch (ICTs) dựa trên nguyên lý là bắtcặp kháng nguyên của ký sinh trùng sốt rét (KSTSR) từ mẫu máu bệnh nhân sửdụng các kháng thể đơn dòng hoặc đa dòng chống lại các kháng nguyên đích củaKSTSR Hiện tại, các test ICTs có thể nhắm đích đến loại kháng nguyên HRP2

(histidine-rich protein 2) của loài P falciparum, một loại enzyme Plasmodium aldolase phủ các loài KSTSR loại Plasmodium spp hoặc loại kháng nguyên đặc hiệu

cho ký sinh trùng (pLDH (parasite specific lactate dehydrogenase) [27]

1.4.2 Cách thực hiện:

Bước 1: Ghi thông đối tượng xét nghiệm vào phiếu xét nghiệm và ghi mã số

đối tượng vào test

Bước 2: Dùng bông cồn 700 sát khuẩn đầu ngón tay áp út, trẻ nhỏ đầu ngónchân cái hoặc gót chân theo vòng tròn từ trong ra ngoài và để khô tự nhiên

Bước 3: Dùng kim chích máu vô khuẩn đâm vào đầu ngón tay, chích nhanh,

mạnh, sâu khoảng 2mm Vuốt nhẹ từ gốc ngón tay ra để có giọt máu thứ nhất, dùngbông khô lau bỏ giọt máu đầu

Bước4: Dùng pipet mao dẫn 5 µl đã có sẵn trong bộ test, hút máu đến vạch

đen của pipet rồi nhỏ máu vào giếng mẫu thử hình tròn (giếng 1)

Bước 5: Nhỏ 4 giọt dung môi pha mẫu vào giếng dung môi hình vuông

(giếng 2), đọc kết quả sau 15 phút

Bước 6: Đọc kết quả

- Âm tính: Chỉ có 1 vạch màu đỏ tại vị trí C của phần đọc kết quả

- Không có kết quả: Không xuất hiện vạch màu đỏ nào trên test hoặc không cóvạch màu đỏ ở vị trí C (phải làm lại test khác)

- Dương tính với P falciparum: Xuất hiện 2 vạch màu đỏ tại các vị trí C và tại

vị trí P.f.

- Dương tính với P.vivax xuất hiện 2 vạch màu đỏ tại vịtrí C và vị trí P.v.

- Dương tính với P.falciparum và P.vivax (nhiễm phối hợp): Xuất hiện 3 vạch màu đỏ tại các vị trí C, vị trí P.f và vị trí P.v.

1.4.3 Diễn giải và báo cáo kết quả:

Đọc kết quả sau 15 phút Không đọc hết quả sau 30 phút, đọc kết quả sau 30 phút cóthể cho kết quả sai

- Âm tính: không có kháng nguyên KSTSR, chỉ có 1 vạch màu đỏ tại vị trí Ccủa phần đọc kết quả

- Dương tính khi có bất kì vạch thử nào xuất hiện dù mờ nhạt

 Dương tính với P falciparum: Xuất hiện 2 vạch màu đỏ tại các vị trí

- Không có giá trị: Không xuất hiện vạch màu đỏ nào trên test hoặc không có

vạch màu đỏ ở vị trí C Quy trình xét nghiệm có thể được thực hiện chưađúng hoặc test đã hết hạn sử dụng Nên tiến hành xét nghiệm lại bằng 1 bộxét nghiệm mới

1.5 Ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm

1.5.1 Khái niệm ngoại kiểm

Thuật ngữ ngoại kiểm được dùng để mô tả một phương pháp mà cho phép sosánh việc thực hiện xét nghiệm của phòng xét nghiệm này với phòng xét nghiệmbên ngoài Sự so sánh này có thể được thực hiện từ một nhóm các phòng hoặcphòng xét nghiệm tham chiếu Thuật ngữ ngoại kiểm EQA đôi khi được dùng mộtcách linh hoạt như đánh giá độ thành thạo, tuy nhiên EQA có thể được thực hiệnbằng các phương pháp khác Trong tài liệu này EQA được định nghĩa là một hệthống để kiểm tra một cách khách quan việc thực hiện của phòng xét nghiệm từ một

tổ chức hoặc cơ quan bên ngoài Khi kết quả ngoại kiểm bị sai hoặc nằm trong giátrị cần xem xét, phòng xét nghiệm sẽ phân tích nguyên nhân để khắc phục và cảitiến lại nhằm nâng cao chất lượng [42]

1.5.2 Mẫu ngoại kiểm

Mẫu ngoại kiểm là mẫu được sử dụng trong các chương trình ngoại kiểm trachất lượng xét nghiệm, thường là mẫu mù với giá trị ấn định được xác định dựa vào

sự đồng thuận của các phòng xét nghiệm tham gia [13], [14]

Có 2 loại mẫu là mẫu chuẩn RM (Referrence material) và mẫu chuẩn đượcchứng nhận CRM (Certified referrence material):

+ Mẫu chuẩn là vật liệu đủ tính đồng nhất và độ ổn định về một hoặc nhiềutính chất quy định, được thiết lập phù hợp với việc sử dụng đã định trong một quátrình đo [14]

+ Mẫu chuẩn được chứng nhận là mẫu chuẩn được đặc trưng với một giấychứng nhận cung cấp giá trị của tính chất quy định, độ không đảm bảo kèm theo vàcông bố về liên kết chuẩn đo lường [14]

1.5.3 Tiêu chuẩn sản xuất mẫu ngoại kiểm

Mỗi chương trình ngoại kiểm khi triển khai việc gửi mẫu cùng lúc đến cácphòng xét nghiệm thành viên và thu thập lại kết quả, sau đó so sánh lại kết quả, nêncần đảm bảo tính đồng nhất Nhà sản xuất mẫu chuẩn phải tiến hành đánh giá tínhđồng nhất của mọi mẫu chuẩn trong quá trình thực hiện và sau khi đã được đóng gói

ở dạng cuối cùng Việc thực hiện bao gồm lấy mẫu ngẫu nhiên và thực hiện cácphép phân tích và chứng minh vật liệu là đủ đồng nhất Nếu mẫu chuẩn được sảnxuất trong các lô khác nhau thì cần kiểm ra tính tương đương của từng lô.

Tất cả các mẫu sử dụng làm vật liệu ngoại kiểm phải đảm bảo độ ổn địnhtrong từng lô sản xuất Khi đánh giá độ ổn định của mẫu chuẩn, nhà sản xuất phảitiến hành thử nghiệm, hiệu chuẩn, đo lường, lấy mẫu hoặc các hoạt động để đánhgiá độ ổn định Trong quá trình đánh giá độ ổn định phải đánh giá cả trong điều kiệnvận chuyển và chọn thời điểm dánh giá phù hợp để xác nhận tất cả các mẫu đủ ổnđịnh từ khi sản xuất đến khi triển khai hoàn toàn chương trình ngoại kiểm [13],[15], [16]

1.5.3.1 Tính đồng nhất của mẫu ngoại kiểm

Khái niệm tính đồng nhất

Về mặt lý thuyết, một vật liệu được xem là hoàn toàn đồng nhất với đặc trưng đãcho nên không có sự khác biệt nào giữa những giá trị trong từng cá thể với nhau.Tuy nhiên trong thực tế một vật liệu được chấp nhận là đồng nhất khi những giátrị giữa những cá thể có sự khác biệt không đáng kể khi so sánh với các mẫu thửcùng sản xuất [14]

Thiết kế thực nghiệm

Đối với việc nghiên cứu tính đồng nhất, TCVN9596:2013 quy định khiđánh giá tính đồng nhất phải chọn 10 mẫu tối thiểu hoặc 10% số lượng mẫu đượcchọn ngẫu nhiên từ các lô Tất cả các mẫu đã lựa chọn tiến hành thử nghiệm 2 lầnlặp lại cho từng xét nghiệm [16]

1.5.3.2 Độ ổn định của mẫu ngoại kiểm

+ Độ ổn định dài hạn của vật liệu tại nơi lưu trữ của nhà sản xuất, thường

là thời hạn sử dụng của vật liệu

+ Độ ổn định ngắn hạn kèm theo mọi tác động đặc biệt do vận chuyển mẫu(có thể là điều kiện vận chuyển giả định)

Thiết kế thực nghiệm: Có 2 phương pháp cơ bản trong nghiên cứu độ ổnđịnh

+ Nghiên cứu độ ổn định cổ điển tức các mẫu riêng biệt được chuẩn bị cùngmột điều kiện giống nhau và được đo theo thời gian

+ Nghiên cứu độ ổn định đẳng thời đánh giá các mẫu chuẩn đồng thời trongnhững điều kiện lặp lại

Khi nghiên cứu độ ổn định, TCVN 9596: 2013 quy định phải chọn tối thiểu 3mẫu ngẫu nhiên trong từng lô được sản xuất theo từng thời điểm và tiến hành thửnghiệm 2 lần lặp lại đối với từng tính chất, kết quả thu được sẽ so sánh với tính chấttrước khi được bảo quản [16]

1.5.4 Tình hình ngoại kiểm hiện nay

1.5.4.1 Tình hình ngoại kiểm trên thế giới

Ngoại kiểm tra chất lượng (EQA) lần đầu tiên được triển khai vào nhữngnăm 1950 và 1960 trong bối cảnh xét nghiệm được xem như là một trong các công

cụ quan trọng của chẩn đoán, theo dõi và điều trị bệnh Các nhà quản lý y tế cũng đãquan tâm hơn đến sự thay đổi của kết quả khi tiến hành nghiên cứu, so sánh kết quảgiữa các phòng xét nghiệm khác nhau Các chương trình ngoại kiểm được triển khaitiếp theo vào các năm sau đó và đến tận ngày nay trên khắp thế giới Các chươngtrình được xây dựng thực hiện trên hầu hết các lĩnh vực sinh hóa, huyết học, vi sinh,

ký sinh trùng Có thể kể đến chương trình ngoại kiểm vi sinh lâm sàng triển khaiđầu tiên tại Na Uy năm 1982 với sự tham gia của 15 phòng xét nghiệm với hơn 24chủng vi khuẩn được gửi đến các phòng xét nghiệm Năm 1996, chương trình ngoạikiểm sinh hóa của Ricos và cộng sự triển khai với sự tham gia của 21 quốc gia tạiChâu Âu[38] Sau đó năm 2008, chương trình ngoại kiểm do Marjan Van Blerk vàcộng sự triển khai với 262 kết quả nồng độ huyết sắc tố (Hemoglobin) và số lượng

bạch cầu được triển khai tại Châu Âu và tiểu ban NewYork với sự tham gia của 11quốc gia Năm 2013, Trung tâm xét nghiệm lâm sàng quốc gia Trung Quốc tổng kết

10 năm thực hiện ngoại kiểm huyết thanh HBV cho thấy hiệu quả rõ rệt của cácchương trình ngoại kiểm khi tỷ lệ trả kết quả đúng tăng từ 95,15% năm 2003 lên97,99% năm 2012, tỷ lệ đơn vị tham gia có kết quả định lượng được chấp nhậncũng tăng lên 87, 99% vào năm 2012 so với 27,53% năm 2003 [40]

Các trung tâm, tổ chức triển khai chương trình ngoại kiểm cũng được xâydựng và hoạt động trên khắp thế giới Tổ chức Ngoại kiểm chất lượng y học Châu

Âu (EQALM) được thành lập năm 1996 và hiện có các thành viên từ 29 quốc giaChâu Âu và 6 quốc gia từ Châu Lục khác Royal College of Pathologists ofAustralasia( RCPA) một công ty thành lập năm 1988 chuyên cung cấp các chươngtrình ngoại kiểm tại Úc đã triển khai chương trình ngoại kiểm trên hầu hết cácchuyên ngành như huyết học, sinh hóa, vi sinh, và đang liên kết mở rộng với sựliên kết giữa công ty với các hiệp hội y khoa tại Úc và trên thế giới Tổ chức Y tếthế giới cũng đã triển khai nhiều chương trình ngoại kiểm cũng như công bố và banhành nhiều tài liệu hướng dẫn tổ chức, xây dựng, thực hiện các chương trình ngoạikiểm trên toàn thế giới Năm 2016, Tổ chức Y tế Thế giới đã cập nhật và ban hànhhướng dẫn thành lập và hoạt động của chương trình ngoại kiểm, cung cấp hướngdẫn toàn diện về các chiến lược và trách nhiệm đối với các hoạt động của EQA vàtiêu chuẩn quốc tế ISO17043: 2010 đánh giá sự phù hợp – yêu cầu chung đối vớithử nghiệm thành thạo và ISO13528: 2015 Phương pháp thống kê để sử dụng trongthử nghiệm thành thạo bằng cách so sánh liên phòng thí nghiệm cung cấp chi tiết vềcác tiêu chuẩn chất lượng áp dụng trực tiếp cho các nhà cung cấp chương trìnhngoại kiểm

1.5.4.2 Tình hình ngoại kiểm trong nước

Năm 2004, trước tình hình thực tế cần phải chuẩn hóa chất lượng xétnghiệm, hội hóa sinh y học Việt Nam do giáo sư Đỗ Đình Hồ chủ trì đã tổ chứcnhững hoạt động kiểm tra chất lượng xét nghiệm hóa sinh cho một số phòng xét

nghiệm tham gia hội Đây là bước đầu có ý nghĩa to lớn cho việc thành lập cáctrung tâm kiểm chuẩn xét nghiệm y học trong nước.

Nguyễn Văn Thắng, Vũ Quang Huy và cộng sự, năm 2014 đã đánh giá 86phòng xét nghiệm tham gia chương trình ngoại kiểm Hóa sinh- miễn dịch hợp tácvới Australia tại Trung tâm kiểm chuẩn chất lượng y học – Đại học Y Dược Thànhphố Hồ Chí Minh Kết quả đạt chiếm tỉ lệ từ 45,0 – 70,3%, không đạt từ 19,6 –57,1%, kết quả đạt tăng từ 40,4% năm 2012 lên 53,3% năm 2013 và 78,6% trongnăm 2014, kết quả sai lệch giảm từ 37,0% năm 2012 xuống 22,7 % năm 2013 vàcòn 9,0% năm 2014 [17] Trong một nghiên cứu được công bố năm 2016, VũQuang Huy và cộng sự đã khảo sát nhu cầu tham gia ngoại kiểm và đánh giá kếtquả thực hiện với 19 chương trình ngoại kiểm khác nhau Tỉ lệ tham gia cao nhất làsinh hóa (95,7%), tiếp đến là huyết học (73,9%), đông máu (34,8%) và một sốchương trình khác với tỉ lệ thấp hơn[10] Từ kết quả cho thấy nhu cầu tham giangoại kiểm chất lượng xét nghiệm trong nước là rất lớn và các chương trình ngoạikiểm bước đầu đã mang lại hiệu quả rõ rệt trong việc cải thiện chất lượng xétnghiệm

Năm 2016, Thủ tướng chính phủ phê duyệt đề án tăng cường năng lực hệthống quản lý chất lượng xét nghiệm y học giai đoạn 2016 -2025, trong đó nhấnmạnh mục tiêu nâng cao năng lực hệ thống kiểm chuẩn chất lượng xét nghiệm y học

để đảm bảo thực hiện tốt các hoạt động kiểm chuẩn chất lượng xét nghiệm của cácphòng xét nghiệm Tạo cơ chế chính sách, hỗ trợ đầu tư để đến năm 2020 các trungtâm kiểm chuẩn sản xuất được tối thiểu 05 loại mẫu xét nghiệm sử dụng cho việcngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm và đến năm 2025 sản xuất được tối thiểu 10loại mẫu Đến năm 2020, mạng lưới phòng xét nghiệm tham chiếu có đủ năng lựcthực hiện hoạt động tham chiếu cho 90% các xét nghiệm thông thường, tiến tới liênthông kết quả xét nghiệm trên toàn quốc vào năm 2025 [18]

Riêng Trung tâm kiểm chuẩn chất lượng xét nghiệm y học – Đại học Y DượcThành phố Hồ Chí Minh từ khi thành lập từ năm 2010 đến nay đã thực hiện nhiệm

vụ triển khai trên 20 chương trình ngoại kiểm các lĩnh vực huyết học, sinh hóa, visinh, ký sinh trùng,

1.5.4.3 Các chương trình ngoại kiểm ký sinh trùng sốt rét

Trên thế giới các chương trình ngoại kiểm KSTSR đã được triển khai trênnhiều khu vực và quốc gia Năm 2011, chương trình ngoại kiểm KSTSR được triển

khai tại Công-gô gồm 5 mẫu: mẫu 1: P falciparum có mật độ 177.000/µl, mẫu 2: P falciparum có mật độ 2.500/µl, mẫu 3: âm tính, 1 mẫu thể Howell-Jolly để đối

chứng và 1 mẫu lam máu chưa nhuộm để đánh giá kỹ thuật nhuộm tại các phòng xétnghiệm Mỗi loại mẫu đều gồm 1 lam giọt dày và giọt mỏng gửi cho các đơn vịtham gia[37]

Năm 2018, tại Senegal, Diallo và Mamadou Alpha xây dựng bộ mẫu ngoại

kiểm gồm 8 mẫu: 3 mẫu dương tính với P falciparum có mật độ ký sinh trùng khác

nhau từ cao (28.000/µl) xuống thấp (192µl), mẫu có 2 thể tư dưỡng và giao bào của

P falciparum và 5 mẫu lam máu âm tính [32].

Năm 2012, WHO triển khai một chương trình tại khu vực Châu Á – TháiBình Dương xây dựng ngân hàng lam máu với hơn 100 người tự nguyện đang mắc

bệnh sốt rét, chủ yếu là 2 loài P falciparum và P vivax, một số khác là P malariae

và P knowlesi và cùng hỗn hợp nhiều loài Chương trình với sự tham gia của hơn

14 quốc gia trong khu vực nhằm kiểm tra, đánh giá năng lực và nâng cao chất lượngchẩn đoán KSTSR

Từ năm 2012 đến nay, WHO triển khai chương trình ngoại kiểm trong khuvực châu Á – Thái Bình Dương với 12 phòng xét nghiệm được đánh giá, trong đó

có Việt Nam với 3 phòng xét nghiệm của 3 Viện: Viện Sốt rét- Ký sinh trùng – Côntrùng Trung Ương, Viện Sốt rét- Ký sinh trùng – Côn trùng Tp Hồ Chí Minh, ViệnSốt rét- Ký sinh trùng – Côn trùng Quy Nhơn Mỗi năm, WHO gửi 2 đợt vào tháng

6 và tháng 10 hằng năm Mỗi đợt 15 lam mù gồm có P falciparum, P vivax, P ovale, P malariae, P knowlesi, nhiễm phối hợp và lam âm tính Kèm tờ hướng dẫn,

hạn cuối gửi kết quả và phiếu trả lời kết quả (1 phiếu trả lời kết quả của phòng xét

nghiệm và 1 phiếu trả lời kết quả cho các cá nhân tham gia) Lam ngoại kiểm yêucầu định loại và đếm mật độ KSTSR của tất cả các lam.

Hiện nay, Trung tâm kiểm chuẩn chất lượng y học – Đại học Y Dược Thànhphố Hồ Chí Minh hiện đang sử dụng lam mẫu ngoại kiểm KSTSR với đề tài: “Quy

trình sản xuất mẫu phết máu xét nghiệm P.falciparum và P vivax dùng cho ngoại

kiểm” của tác giả Nguyễn Ngọc Hiền- năm 2019[9]

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Mẫu ngoại kiểm

- Chương trình ngoại kiểm

- Các đơn vị tham gia ngoại kiểm

2.1.2 Tiêu chuẩn chọn mẫu

- Mẫu máu lấy từ bệnh nhân chưa điều trị thuốc sốt rét

- Mẫu máu toàn phần có chống đông EDTA, không bị đông, vón cục

- Có kết quả xét nghiệm ký sinh trùng sốt rét dương tính

- Máu không bị nhiễm HIV, viêm gan B và viêm gan C

2.1.3 Tiêu chuẩn loại trừ

- Mẫu máu lấy từ bệnh nhân đã và đang dùng thuốc điều trị sốt rét

- Mẫu máu sử dụng các chất chống đông khác EDTA, máu bị đông, vón cục

- Mẫu máu bị nhiễm HIV, viêm gan B và viêm gan C

2.1.4 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện trong thời gian từ tháng 9/2020 đến tháng5/2021

Lấy mẫu tại Xã Bù Gia Mập và xã Đăk Ơ, huyện Bù Gia Mập, tỉnh Bình PhướcLàm tiêu bản mẫu tại Viện Sốt rét - Ký sinh trùng – Côn trùng Tp Hồ Chí Minh vàTrung tâm kiểm chuẩn chất lượng xét nghiệm y học – Đại học Y Dược Thành phố

Hồ Chí Minh

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu

Phương pháp nghiên cứu phòng thí nghiệm

Thực hiện nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất làm mẫu ký sinh trùng sốt réttheo tiêu chuẩn Tổ chức Y tế Thế giới sử dụng trong ngoại kiểm Đánh giá tínhđồng nhất và độ ổn định của mẫu đã sản xuất

2.2.2 Cỡ mẫu

Để đảm bảo mẫu sản xuất đủ điều kiện của mẫu ngoại kiểm, các lô mẫu cầnđánh giá tính đồng nhất và độ ổn định theo tiêu chuẩn ISO13528: 2003

n =[1,96 x 1,5/√0,05 ] =14

d : độ chính xác mong muốn (sai số ước lượng)

Zα/2: tri ̣ số phân phối chuẩn ( Z

0,975= 1,96)

n : cỡ mẫu

σ: độ lệch chuẩn quần thể (σ = 1,5)

(Dựa theo nghiên cứu của PGS.TS Trần Thiện Trung (2019)ta có độ nhạy ước tính

là 89,72%, tỉ lệ hiện mắc trong dân số là 53,2%, d = 0,05)

Như vậy tổng cộng số mẫu nghiên cứu tối thiểu là 14 mẫu

2.2.3 Phương pháp chọn mẫu

Nghiên cứu dùng phương pháp ngẫu nhiên Người nghiên cứu có mặt tại địađiểm thu thập mẫu, chọn mẫu thỏa tiêu chí chọn mẫu để thu thập về làm vật liệunghiên cứu Mẫu máu được lấy từ tĩnh mạch cho vào ống EDTA [43],[47], sau đóvận chuyển lạnh từ 2-8o C từ thực địa về Thành phố Hồ Chí Minh

Số liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2019 và Stata 11.2

2.2.5.1 Chọn mẫu ngẫu nhiên

Từ Bảng A6 bảng số ngẫu nhiên trong “Căn bản xác suất và thống kê y học” củatác giả Đỗ Văn Dũng, chọn một số ngẫu nhiên 26606- chọn 2 số đầu- Sau đó đi

từ trên xuống, phải sang trái -chọn 10 số có giá trị từ 1 – 40: 26, 31, 30, 05, 25,

18, 36, 19, 03, 23

Làm tương tự cho các bộ mẫu khác

Hình 2.1 Số ngẫu nhiên trong Sách “Căn bản xác suất và thống kê y học” của

Đánh giá tính đồng nhất bằng phép kiểm định tham số T -test trong stata 11.2

Với giả thuyết H₀: bộ mẫu đạt đồng nhất

Với giả thuyết H₁: bộ mẫu không đồng nhất

Nếu giá trị p ≥ 0,05 chấp nhận H₀ bộ mẫu đạt đồng nhất

Nếu giá trị p < 0,05 bác bỏ H₀, bộ mẫu không đồng nhất

Kết luận bộ mẫu đạt tính đồng nhất

2.2.5.3 Đánh giá độ ổn định

Đánh giá độ ổn định bằng phép kiểm định về phương sai, dùng phép kiểm địnhSdtest trong stata 11.2: nếu p ≥ 0,05 thì không có sự khác biệt phương sai 2 nhóm

Chuyển sang kiểm định tham số T-test, nếu p < 0,05 thì phương sai 2 nhóm khácnhau, sử dụng kiểm định phi tham số

Đánh giá độ ổn định bằng phép kiểm định tham số T -test trong stata 11.2

Với giả thuyết H₀: bộ mẫu đạt độ ổn định

Với giả thuyết H₁: bộ mẫu không ổn định

Nếu giá trị p ≥ 0,05 chấp nhận H₀ bộ mẫu đạt độ ổn định

Nếu giá trị p < 0,05 bác bỏ H₀, bộ mẫu không ổn định

Kết luận bộ mẫu đạt độ ổn định

2.3 Quy trình sản xuất tiêu bản KSTSR

2.3.1 Làm tiêu bản giọt dày và giọt mỏng

Trong chẩn đoán sốt rét nên làm giọt máu dày và giọt mỏng trên cùng mộtlam nhằm mục đích hỗ trợ trong phát hiện chủng loại [41], [43], [47]

Bước 1: Chuẩn bị dụng cụ: lam kính, lam kéo, micropipette, đầu côn, giá lam, găng

tay,

Bước 2: Lấy máu tĩnh mạch cho vào ống EDTA, trộn đều ống máu EDTA bằng

cách lắc nhẹ nhàng ống máu

Bước 3: Trên một lam kính sạch đã dãn nhãn, ta chia đôi lam kính ra, dùng

micropipette hút 2 µl máu cho vào chính giữa lam để làm giọt mỏng và chia đôi nửacòn lại dùng micropipette hút 6 µl máu để làm giọt đặc

Bước 4: Làm tiêu bản giọt mỏng: Từ giọt máu, ta dùng 1 lam kéo cho tiếp xúc với

giọt máu để máu lan ra dọc theo bờ lam kéo Cạnh lam kéo và lam tiêu bản hợpthành một góc 45o Sau đó ta đẩy nhanh đều và nhẹ tay máu về phía trước, ta đượcmột hình tiêu bản máu hình Parabol, tiêu bản máu mỏng dần về phía đuôi

Bước 5: Làm tiêu bản giọt đặc: Dùng 1 góc của lam kéo đặt vào trung tâm của giọt

máu đánh xoáy ốc từ trung tâm đánh ra ngoài khoảng 5 – 6 vòng để được giọt máuđặc có đường kính khoảng 1 – 1,2 cm, xoay góc lam kéo di ngược vào trong rồinhấc lam kéo lên

Bước 6: Để lam máu khô tự nhiên, tránh bụi bẩn, tránh ánh sáng và nhiệt độ cao.

Hình 2.2 Tiêu bản máu giọt dày và giọt mỏng

2.3.2 Cố định giọt máu mỏng

Giọt máu mỏng sau khi để khô trong ít nhất 2 phút được cố định với methanolbằng cách nhúng giọt máu mỏng vào cốc chứa methanol trong 3-5 giây Để khô tựnhiên, không cố định giọt máu dày

2.3.3 Quy trình nhuộm tiêu bản với dung dịch giêm sa

Bước 1: Cố định giọt máu mỏng bằng methanol, không để giọt dày tiếp xúc với

methanol Để khô tự nhiên[43]

Bước 2: Xếp tiêu bản lên giá nhuộm, pha dung dịch giêm sa 3%, nhỏ dung dịch

giêm sa phủ kín lên tiêu bản Để 45 phút, rửa bằng nước sạch, tránh làm đổ dung

dịch nhuộm trước[43].

Hình 2.3 Nhuộm tiêu bản KSTSR

Bước 3: Xếp tiêu bản lên giá, để khô tự nhiên.

2.3.4 Kỹ thuật dán lamen, cách bảo quản

Bước 1: Khi tiêu bản khô hoàn toàn, dùng bông gòn thấm cồn 70 0 lau sạch mặtdưới

Bước 2: Nhỏ keo Entellan lên trên bề mặt tiêu bản.

Bước 3: Để nhẹ lamen lên bề mặt keo, tránh tạo bọt khí.

Bước4: Để tiêu bản trên bề mặt phẳng qua 24 giờ để keo khô hoàn toàn.

Bước 5: Dán nhãn ghi rõ mã số trên tiêu bản.

Bước 6: Bảo quản trong hộp nhựa có túi hút ẩm.

2.3.5 Đánh giá chất lượng tiêu bản nhuộm

* Giọt máu mỏng đạt yêu cầu

- Tiêu bản máu dàn đều màu hồng nhạt, không sóng, không xước, không loanglổ

- Giọt máu mỏng ở 1/3 đuôi: Soi trên kính hiển vi thấy một lớp hồng cầu dànđều, không chồng lên nhau và không cách xa nhau, 1 vi trường có khoảng 3 - 5 bạchcầu

- Nền lam máu sạch, không có cặn thuốc nhuộm, màu hồng cầu là màu xanhhồng nhạt, Bạch cầu trung tính có màu tím đỏ và có hạt đặc hiệu rõ ràng Nhân củaKSTSR có màu đỏ và nguyên sinh chất bắt màu xanh da trời, sắc tố bắt màu nâuđen hoặc nâu ánh vàng.

Hình 2.4 Tiêu bản KSTSR trên giọt mỏng(100X)

* Giọt máu dày đạt yêu cầu