Nghiên cứu sản xuất và bảo quản mẫu huyền phù tế bào bạch cầu và tiểu cầu tại trung tâm kiểm chuẩn chất lượng xét nghiệm đại học y dược thành phố hồ chí minh

Một trong những phương pháp thường được sửdụng là đánh giá chất lượng bên ngoài hay còn được gọi là ngoại kiểm tra chất lượng Vật liệu ngoại kiểm tra chất lượng phải đạt những yêu cầu: c

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tượng

Khối bạch cầu hạt và khối tiểu cầu gạn tách của người hiến máu tình nguyện được cung cấp bởi Trung tâm Truyền máu Bệnh viện Chợ Rẫy.

Khối bạch cầu hạt và khối tiểu cầu gạn tách có thể đạt từ 250 đến 300 mL, cùng nhóm máu và âm tính với HIV, HBV, HCV, giang mai, và sốt rét Kết quả Coombs trực tiếp và gián tiếp cũng cho thấy âm tính.

Thời gian tối đa từ ngày sản xuất đến khi nhận túi máu là 72 giờ cho khối tiểu cầu và 24 giờ cho khối bạch cầu hạt.

− Chế phẩm máu khi quan sát bằng mắt thường có hiện tượng tiêu huyết, có hiện tượng ngưng kết hay có xuất hiện cục đông.

− Hình thái tế bào dưới kính hiển vi: bạch cầu bị thoái hóa nhiều, mất màng tế bào,tiểu cầu ngưng kết nhiều cụm trên lame.

Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu thực nghiệm.

2.2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 09/2019 đến 05/2020 tại Trung tâm Kiểm chuẩn Chất lượng Xét nghiệm Y học thuộc Bộ Y tế, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Trung tâm đã đạt tiêu chuẩn ISO 9001 AJA của Anh quốc vào tháng 02/2017 và được công nhận đạt ISO 17043:2010 vào ngày 18/09/2019 bởi Sở Dịch vụ Khoa học, Bộ Khoa học Công nghệ Thái Lan.

2.2.3 Cỡ mẫu Để đảm bảo bộ mẫu bạch cầu và tiểu cầu sản xuất ra đạt chuẩn có thể ứng dụng vào mẫu máu toàn phần dùng trong chương trình ngoại kiểm công thức máu thì mẫu phải được đánh giá độ đồng nhất và độ ổn định theo quy định và hướng dẫn của ISO/IEC

Theo tiêu chuẩn 17043:2010 và ISO 13528:2015, cỡ mẫu trong nghiên cứu và đánh giá cần phải đủ Cần sản xuất một bộ mẫu bạch cầu và một bộ mẫu tiểu cầu, mỗi bộ gồm ba lô tương ứng với ba mức nồng độ: thấp, bình thường và cao Cụ thể, bộ mẫu bạch cầu được ký hiệu là B1 (nồng độ thấp), B2 (nồng độ bình thường), B3 (nồng độ cao), và bộ mẫu tiểu cầu được ký hiệu là T1 (nồng độ thấp), T2 (nồng độ bình thường), T3 (nồng độ cao).

Số lượng mẫu cần cho quá trình đánh giá

− Đánh giá độ đồng nhất 10 mẫu/lô x 6 (lô) = 60 mẫu (1)

− Đánh giá độ ổn định 03 mẫu/lô/thời điểm (đánh giá 14 thời điểm: tuần 1, tuần 2, tuần 3…tuần 14): 3 x 6 (lô) x 14 (thời điểm) = 252 mẫu (2)

− Độ ổn định vận chuyển 01 mẫu/lô/thời điểm (đánh giá tại 3 thời điểm: sau 1 ngày,

2 ngày, 3 ngày): 1 x 6 (lô) x 3 (thời điểm) = 18 mẫu (3)

− Đánh giá độ vô trùng 03 mẫu/lô/thời điểm (đánh giá tại 4 thời điểm: ngày 0, 1 tháng, 2 tháng, 3 tháng): 3 x 6 (lô) x 4 (thời điểm) = 72 mẫu (4)

− Đánh giá pH: 05 mẫu/lô/thời điểm (đánh giá tại 4 thời điểm: ngày 0, 1 tháng, 2 tháng, 3 tháng): 5 x 6 (lô) x 4 (thời điểm) = 120 mẫu (5)

− Cỡ mẫu tối thiểu cho cả quá trình nghiên cứu: (1) + (2) + (3) + (4) + (5) = 522 mẫu

− Xác suất thất lạc mẫu 10%: 522 + (522 x 10%) = 574 mẫu cho 6 lô ≈ 96 mẫu/lô

− Để thuận tiện trong nghiên cứu và tránh thất lạc, chúng tôi tiến hành sản xuất 100 mẫu/lô

2.2.4 Phương pháp chọn mẫu, thu thập và xử lý số liệu

Nghiên cứu này sử dụng phương pháp chọn mẫu ngẫu nhiên thông qua phần mềm Excel 2016, với câu lệnh “=RANDBETWEEN(1,100” để đánh giá các yếu tố như độ đồng nhất, độ ổn định, độ pH và độ vô trùng.

2.2.4.2 Thu thập và xử lý số liệu

Nghiên cứu đã được thực hiện với sự chấp thuận của Hội đồng xét duyệt đề cương và Hội đồng y đức của Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Dữ liệu được thu thập từ kết quả xét nghiệm các biến số nghiên cứu được trình bày trong mục.

2.2.4.3 trong quá trình theo dõi độ đồng nhất, độ ổn định, độ pH của mẫu và được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2016 và Stata 13.0.

Đánh giá độ đồng nhất và độ ổn định của mẫu bạch cầu và tiểu cầu là rất quan trọng trong xét nghiệm huyết học Các thông số WBC, PLT và MPV trên hệ thống máy huyết học tự động giúp xác định chất lượng mẫu Việc phân tích các chỉ số này đảm bảo độ chính xác và tin cậy trong kết quả xét nghiệm.

− Đánh giá các yếu tố ảnh hưởng độ ổn định mẫu bao gồm: độ pH, độ vô trùng.

Các thông số huyết học được xác định bằng hệ thống máy Sysmex XE - 5000, trong đó sử dụng phương pháp đo điện trở kháng cho PLT và phương pháp đo quang học cho WBC.

Trung tâm Kiểm chuẩn chất lượng xét nghiệm Y học Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh thực hiện nghiên cứu với trang thiết bị và máy móc được hiệu chuẩn định kỳ Các thiết bị này đều trải qua nội kiểm và ngoại kiểm để đảm bảo đạt chất lượng theo quy định.

Bảng 2.1 Thiết bị - Dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu

STT Thiết bị - dụng cụ Mã thiết bị Xuất xứ

1 Tủ an toàn sinh học cấp 2 2012 - 73893 Esco – Singapore

2 Cân phân tích 27709155 Sartorius – Đức

6 Bể điều nhiệt 01013012100078 Biosan - Latvia

7 Bộ dụng cụ dispenser 01013012100094 Mỹ

STT Thiết bị - dụng cụ Mã thiết bị Xuất xứ

8 Máy ly tâm lạnh Eppendorf

9 Máy lắc tự động 01013012100062 Đức

13 Tủ lạnh Sanyo TL-01 Việt Nam

14 Máy huyết học tự động Sysmex

Hóa chất, thuốc thử được sử dụng và bảo quản theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Bảng 2.2 Hóa chất - sinh phẩm sử dụng trong nghiên cứu

STT Tên hóa chất – sinh phẩm Xuất xứ

1 Nước cất hai lần Việt Nam

4 Polyethylen glycol PEG 20,000 Merck – Đức

7 Đệm phosphate - PBS Merck – Đức

14 30% Bovine Serum albumin Merck – Đức

16 Control Serum level 1: 4,5mL Streck – Mỹ

17 Control Serum level 2: 4,5mL Streck – Mỹ

18 Control Serum level 3: 4,5mL Streck – Mỹ

19 Môi trường nuôi cấy vi sinh Nam Khoa Biotek – Việt Nam

❖ Các loại dung dịch cần sử dụng trong nghiên cứu

Bảng 2.3 Dung dịch rửa tế bào đệm phosphate đẳng trương (PBS) [47]

STT Tên hóa chất – sinh phẩm Hàm lượng g/L

1 Phosphate buffered saline (PBS), pH = 7,4 9,9

Bảng 2.4 Dung dịch cố định bạch cầu các mức nồng độ chất Formaldehyde 37% ([8],

Bảng 2.5 Dung dịch cố định tiểu cầu các mức nồng độ chất Formaldehyde 37% [26],

STT Tên hóa chất Thể tích (mL) Nồng độ

STT Tên hóa chất Thể tích (mL) Nồng độ

Bảng 2 6 Dung dịch treo tế bào CSS (Cell Suspension Solution), pH = 7,35 - 7,45, Osmol xấp xỉ = 310 - 315 mOsm/kg [21], [27].

STT Tên hóa chất – sinh phẩm Hàm lượng (g/L)

Bảng 2.7 Dung dịch ly giải hồng cầu

Nội dung nghiên cứu

Nghiên cứu gồm 2 nội dung: sản xuất và đánh giá

2.3.1 Phương pháp sản xuất: Gồm 2 phần

2.3.1.1 Phần 1: Sản xuất thử nghiệm huyền phù tế bào bạch cầu và huyền phù tế bào tiểu cầu bằng phương pháp cố định với dung dịch Formaldehyde nhiều nồng độ

Chuẩn bị nguyên liệu thô và hóa chất bao gồm chế phẩm khối bạch cầu hạt và khối tiểu cầu gạn tách, cùng nhóm máu đáp ứng tiêu chí chọn mẫu theo mục 2.1.2 Tiến hành pha dung dịch rửa tế bào.

STT Tên hóa chất – sinh phẩm Hàm lượng (g/L)

4 Saponin 0,05 bào, dung dịch treo tế bào, dung dịch ly giải và dung dịch cố định thử nghiệm trình bày ở mục 2.2.7.

Bạch cầu và tiểu cầu từ chế phẩm máu được xử lý bằng dung dịch Formaldehyde với nồng độ và thời gian khác nhau để ngừng hoạt động trao đổi chất của enzyme, bảo tồn hình dạng và cấu trúc tế bào Sau đó, chúng được treo trong dung dịch vô trùng tương tự huyết tương, giúp duy trì hình dạng và cấu trúc tế bào trong ít nhất 30 ngày cho các thông số WBC, PLT và MPV Dung dịch bảo quản không chỉ giữ vai trò là dịch treo tế bào mà còn giảm tác động của lực bên ngoài trong quá trình xử lý và vận chuyển mẫu Quá trình thử nghiệm huyền phù bạch cầu và tiểu cầu bao gồm các giai đoạn trước cố định, cố định và sau cố định.

Chế phẩm khối bạch cầu hạt tại ngân hàng máu được điều chế bằng hai phương pháp: gạn tách trực tiếp từ người hiến máu và từ các túi máu toàn phần Mặc dù đây là chế phẩm đậm đặc bạch cầu, nhưng vẫn còn tiểu cầu và hồng cầu Do đó, để thu được riêng thành phần bạch cầu, cần loại bỏ huyết tương giàu tiểu cầu và ly giải hồng cầu trước khi cố định Ngược lại, chế phẩm khối tiểu cầu không cần giai đoạn xử lý trước khi cố định.

Trong giai đoạn cố định, tế bào bạch cầu được thực hiện cố định theo tỷ lệ, nồng độ và thời gian đã được thiết lập trong Hình 2.1 Tiểu cầu cũng được cố định tương tự như mô tả trong Hình 2.2.

Sau khi cố định, rửa tế bào 3 lần bằng dung dịch PBS đẳng trương để loại bỏ hoàn toàn dung dịch cố định Tiếp theo, tái huyền phù từng loại tế bào vào dung dịch treo Cuối cùng, phân phối thành 2 bộ mẫu, mỗi bộ gồm 3 lô tương ứng với 3 thử nghiệm.

B2F, B4F và B10F là các lô bạch cầu được cố định với nồng độ Formaldehyde lần lượt là 2%, 4% và 10% T1F, T5F và T16F là các lô tiểu cầu được cố định với nồng độ Formaldehyde là 1%, 0,5% và 0,16% Việc theo dõi và đánh giá độ đồng nhất cũng như độ ổn định dài hạn của các mẫu này là rất quan trọng.

2 bộ mẫu trong 5 tuần theo hướng dẫn của ISO 13528:2015.

Hình 2.1 Sơ đồ thử nghiệm cố định bạch cầu

*Chú thích: BC: CĐ với tỷ lệ 1 thể tích bạch cầu lắng và 10 thể tích dung dịch cố định

Hình 2.2 Sơ đồ thử nghiệm cố định tiểu cầu

*Chú thích: TC: CĐ với tỷ lệ 1 thể tích bạch cầu lắng và 1 thể tích dung dịch cố định

2.3.1.2 Phần 2: Sản xuất mẫu huyền phù tế bào bằng phương pháp cố định với dung dịch Formaldehyde ở nồng độ được lựa chọn sau khi thử nghiệm

Thời gian 40 phút (nhiệt độ phòng)

Thời gian 50 phút (nhiệt độ phòng)

Thời gian 60 phút (nhiệt độ phòng)

Thời gian 10 phút (nhiệt độ phòng)

Thời gian 15 phút (nhiệt độ phòng)

Thời gian 05 phút(nhiệt độ phòng)

Khối TC gạn tách Đánh giá chất lượng Đánh giá chất lượng

Xử lý cố định TC Đạt

Dung dịch cố định 10% Formaldehyde

Dung dịch cố định 0,16% Formaldehyde

Ly tâm 2500 rpm trong 05 phút

Ly tâm 1500 rpm trong 30 phút

Tái huyền phù BC vào dung dịch treo

Tái huyền phù TC vào dung dịch treo

Xử lý cố định BC

BC lắng Đo WBC Đo PLT, MPV Điều chỉnh nồng độ Điều chỉnh nồng độ

Thấp: < 50 - 90 G/L BT: 200 - 350 G/L Cao: 450 - ≥ 650 G/L Không đạt Đánh giá chất lượng Đánh giá chất lượng Đạt

Không đạt Đạt Đồng nhất, ổn định

20 phút, 50 - 60⁰C 15 phút, nhiệt độ phòng

❖ Diễn giải quy trình tạo huyền phù tế bào bạch cầu (Hình 2.3).

Giai đoạn 1: Chuẩn bị nguyên liệu, dung dịch hóa chất cần cho huyền phù tế bào bạch cầu bao gồm:

− Dung dịch rửa tế bào đệm PBS (pH = 7,4): sau khi hoà tan các thành phần theo Bảng 2.3, điều chỉnh pH và hấp tiệt trùng (Autoclave) 121⁰C trong 15 phút.

Dung dịch treo tế bào (CSS) có pH từ 7,35 đến 7,45 và Osmol từ 310 đến 315 mOsm/kg Sau khi hòa tan các thành phần theo Bảng 2.6 (trừ bovine serum albumin), cần đo và điều chỉnh pH Tiếp theo, hấp tiệt trùng ở 121⁰C trong 15 phút, sau đó để nguội hoàn toàn và hòa tan các thành phần còn lại.

− Dung dịch cố định bạch cầu 10% Formaldehyde (Bảng 2.4)

− Dung dịch ly giải hồng cầu (Bảng 2.7)

− Kiểm tra thông tin túi chế phẩm khối bạch cầu hạt thỏa tiêu chuẩn chọn mẫu, ghi vào nhật ký sản xuất mẫu.

Giai đoạn 2: Xử lý cố định tế bào

− Phân phối chế phẩm khối bạch cầu ra ống falcon vô trùng.

Để tách lớp huyết tương giàu tiểu cầu, cần pha loãng máu với dung dịch PBS theo tỷ lệ 1:1, sau đó ly tâm ở tốc độ 120g (tương đương 780 vòng/phút với máy ly tâm Eppendorf 5810R) trong 10 phút.

Tách lớp buffy coat vào ống falcon vô trùng và lặp lại quy trình 2 - 3 lần bằng cách thêm dung dịch đệm PBS sau mỗi lần hút lớp buffy coat Thực hiện ly tâm ở tốc độ 2000 vòng/phút trong 10 phút.

Để ly giải hồng cầu, cho dung dịch ly giải vào phần buffy coat với tỷ lệ 1 thể tích buffy coat và 5 thể tích dung dịch ly giải, sau đó để hỗn hợp ở nhiệt độ phòng trong 10 phút.

Rửa bạch cầu bằng PBS ba lần và ly tâm ở tốc độ 2000 vòng/phút trong 10 phút Sau mỗi lần ly tâm, sử dụng thiết bị vortex để tái huyền phù tế bào.

− Đặt bình dung dịch cố định 10% Formaldehyde đã pha vào bể điều nhiệt khoảng 50⁰C - 60⁰C ủ 15 phút trước khi cố định.

Cho bạch cầu lắng vào bình dung dịch cố định theo tỷ lệ 1 thể tích bạch cầu lắng với 10 thể tích dung dịch cố định Thực hiện quá trình này trong 20 phút ở nhiệt độ từ 50⁰C đến 60⁰C trong bể điều nhiệt, lắc nhẹ nhàng Sau khi hoàn tất, để mẫu trở về nhiệt độ phòng.

Giai đoạn 3: Rửa tế bào và tái huyền phù (treo) tế bào vào dung dịch treo

− Phân phối bạch cầu đã cố định ra ống falcon vô trùng.

Quay ly tâm bạch cầu với lực ly tâm 2500 vòng/phút trong 5 phút ở nhiệt độ 20 - 25⁰C để tách bỏ dịch cố định Sau đó, rửa bạch cầu 3 lần bằng dung dịch rửa tế bào PBS với cùng lực ly tâm.

− Tái huyền phù (treo) tế bào vào dung dịch treo, điều chỉnh theo ngưỡng nồng độ mong muốn và phân phối.

❖ Diễn giải quy trình tạo huyền phù tế bào tiểu cầu (Hình 2.3).

Giai đoạn 1: Chuẩn bị nguyên liệu, dung dịch hóa chất cần cho huyền phù tế bào tiểu cầu bao gồm:

− Dung dịch rửa tế bào đệm PBS (pH = 7,4)

− Dung dịch treo tế bào (CSS) pH = 7,35 - 7,45, Osmol = 310 - 315 mOsm/kg

− Dung dịch cố định tiểu cầu 0,16% Formaldehyde (Bảng 2.5)

− Kiểm tra thông tin túi chế phẩm khối tiểu cầu thỏa tiêu chuẩn chọn mẫu, ghi vào nhật ký sản xuất mẫu.

Giai đoạn 2: Xử lý cố định tế bào

− Phân phối tiểu cầu ra ống falcon vô trùng

Cho dung dịch vào cố định tiểu cầu với tỷ lệ 1 thể tích tiểu cầu: 1 thể tích dung dịch cố định 0,16% Lắc trộn nhẹ nhàng trên máy lắc trong 15 phút ở nhiệt độ phòng.

Giai đoạn 3: Rửa tế bào và tái huyền phù (treo) tế bào vào dung dịch treo

− Sau khi cố định, quay ly tâm với tốc độ 1500 vòng/phút trong 40 phút, hút bỏ dịch nổi Rửa tiểu cầu với dung dịch PBS đẳng trương 3 lần.

− Tái huyền phù (treo) tiểu cầu vào dung dịch treo, điều chỉnh theo ngưỡng nồng độ mong muốn và phân phối.

2.3.1.3 Điều chỉnh các mức nồng độ tế bào và phân phối mẫu (Giai đoạn 4 và 5)

Kiểm soát chất lượng trong quá trình nghiên cứu

2.4.1 Trong giai đoạn sản xuất

− Các nguyên liệu đầu vào (chế phẩm máu) được kiểm soát theo tiêu chuẩn chọn mẫu và tiêu chuẩn loại trừ ở mục 2.1.2 và 2.1.3.

Các dung dịch rửa và bảo quản tế bào sau khi pha chế được hấp tiệt trùng ở nhiệt độ 121ºC trong 15 phút để đảm bảo vô trùng Sau đó, chúng được dán nhãn, ghi hạn sử dụng và bảo quản trong chai có nắp kín ở nhiệt độ từ 2 đến 6ºC.

Các thao tác với hóa chất cần tuân thủ nghiêm ngặt các quy định về an toàn sinh học Toàn bộ quy trình sản xuất phải được thực hiện trong tủ an toàn sinh học, và các dụng cụ xử lý mẫu phải được hấp tiệt trùng ở nhiệt độ 121ºC trong 15 phút Điều này nhằm hạn chế nhiễm khuẩn vào mẫu nghiên cứu trong các giai đoạn thực hiện trong hệ thống hở, đồng thời ngăn chặn sự phát tán của các hóa chất độc hại ra môi trường.

Các chất thải sinh học trong quá trình sản xuất, bao gồm mẫu nghiên cứu hết hạn và các vật liệu theo dõi, được xử lý theo quy trình an toàn sinh học Tất cả máy móc và trang thiết bị dùng để xử lý mẫu cũng như định lượng hóa chất đều được hiệu chuẩn theo các quy định hiện hành.

Mẫu phân phối theo lô cần được dán nhãn đầy đủ thông tin, bao gồm ngày sản xuất và số mã code theo lô sản xuất Việc này sẽ giúp thuận lợi trong quá trình thu thập, nhập liệu và xử lý số liệu.

Ghi chép nhật ký sản xuất hàng ngày giúp theo dõi các công việc đã thực hiện và kết quả đạt được, đảm bảo tính liên tục trong nghiên cứu Điều này không chỉ giúp tổng hợp quá trình mà còn cho phép khắc phục kịp thời các sai sót và thực hiện cải tiến quy trình sản xuất, từ đó đạt được các mục tiêu đề ra.

2.4.2 Trong quá trình đánh giá

Hệ thống máy huyết học tự động được kiểm tra nội bộ hàng ngày và kiểm tra bên ngoài hàng tháng để đảm bảo chất lượng xét nghiệm Các thiết bị và máy móc được bảo trì và bảo dưỡng theo quy định.

− Theo dõi nhiệt độ lưu trữ: Nhiệt độ lưu trữ mẫu trong nghiên cứu này là 2 - 6⁰C

Mẫu được lưu trữ trong tủ lạnh và nhiệt độ được kiểm tra hàng ngày vào buổi sáng lúc 09 giờ và buổi chiều lúc 16 giờ bằng nhiệt kế đặt trong tủ Quá trình theo dõi này được ghi lại và điều chỉnh kịp thời nếu nhiệt độ không đạt yêu cầu.

Y đức và tính ứng dụng trong nghiên cứu

2.5.1 Vấn đề y đức Đề cương nghiên cứu đã được thông qua tại Hội đồng xét duyệt đề cương cho học viên cao học năm 2018 của Bộ môn Xét nghiệm, Khoa Điều Dưỡng - Kỹ thuật y học, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh Nghiên cứu đã được sự chấp thuận của Hội đồng Đạo đức trong nghiên cứu y sinh học Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh (Giấy chấp thuận của Hội đồng đạo đức trong nghiên cứu y sinh học Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh số 646/ĐHYD-HĐĐĐ ngày 15 tháng 11 năm 2019) Nghiên cứu thực nghiệm trên các chế phẩm máu, không can thiệp và không có bất kỳ tác động có hại nào lên con người cũng như động vật Việc tham gia vào nghiên cứu không gây ra bất kỳ tổn thất hay nguy cơ bất lợi nào cho người tham gia nghiên cứu Các chế phẩm máu được cung cấp từ ngân hàng máu đã được sàng lọc các tác nhân lây nhiễm: âm tính với HIV, HBV, HCV, giang mai, sốt rét Người tham gia nghiên cứu không phải lấy thêm máu hay tốn thêm khoảng chi phí nào khác.

2.5.2 Tính ứng dụng của nghiên cứu Đây là một trong những nghiên cứu đầu tiên có hệ thống trong lĩnh vực sản xuất vật liệu kiểm soát chất lượng huyết học tại Việt Nam, mang tính cấp thiết và ứng dụng cao trong lĩnh vực đảm bảo chất lượng xét nghiệm giúp kiểm soát chất lượng, đảm bảo chất lượng xét nghiệm Huyết học Kết quả nghiên cứu của chúng tôi sẽ góp phần tìm ra giải pháp hiệu quả cho việc sản xuất vật liệu ngoại kiểm có độ ổn định với nguồn nguyên liệu dễ tìm, phù hợp các quy định về y đức và luật pháp hiện hành, có thể chuẩn bị với số lượng lớn cho chương trình ngoại kiểm công thức máu Hơn thế nữa, không chỉ giải quyết được vấn đề chi phí tham gia ngoại kiểm phù hợp với các phòng xét nghiệm tại Việt Nam mà còn giúp cho các nhà ngoại kiểm chủ động được trong việc cung cấp với nguồn mẫu ổn định mà không cần nhập khẩu từ nước ngoài Từ đó, tạo điều kiện cho tất cả các phòng xét nghiệm tham gia góp phần kiểm soát chất lượng xét nghiệm đảm bảo độ tin cậy mang lại lợi ích không chỉ cho phòng xét nghiệm, bệnh viện, bệnh nhân mà còn cho cả cộng đồng.

KẾT QUẢ

Kết quả sản xuất và bảo quản thử nghiệm huyền phù tế bào bạch cầu và tiểu cầu bằng phương pháp cố định formaldehyde nhiều nồng độ

cầu bằng phương pháp cố định formaldehyde nhiều nồng độ

Hai bộ mẫu với 3 lô bạch cầu và 3 lô tiểu cầu đã được thử nghiệm ở các mức nồng độ và thời gian khác nhau, như trình bày trong mục 2.3.1.1 Đánh giá độ đồng nhất và độ ổn định dài hạn trong 5 tuần đã được thực hiện, và kết quả được thể hiện qua các bảng sau.

3.1.1 Kết quả 3 thử nghiệm nồng độ cố định bạch cầu

Bảng 3 1 Kết quả độ đồng nhất 03 lô bạch cầu thử nghiệm 03 nồng độ chất cố định

Bài viết đề cập đến các loại bạch cầu được cố định bằng formaldehyde với các tỷ lệ khác nhau: B10F (10% Formaldehyde), B4F (4% Formaldehyde) và B2F (2% Formaldehyde) Y 0 đại diện cho giá trị trung bình của 10 mẫu trong một lô tại thời điểm ngày 0, trong khi SD là độ lệch chuẩn của 10 mẫu trong lô Các ký hiệu S w và S s lần lượt chỉ độ lệch chuẩn của cùng một mẫu và giữa các mẫu khác nhau Độ lệch chuẩn cho phép, ký hiệu là 𝜎 pt, được tính theo công thức 𝜎 pt = TEa x Y 0, trong đó TEa (Total Allowable Error Goal) là tổng sai số cho phép.

Sau khi hoàn tất phân phối mẫu bạch cầu với quy cách 2 mL/ống, tất cả các lô mẫu đều được đánh giá độ đồng nhất Hệ thống 10 mẫu/lô được chọn ngẫu nhiên và phân tích lặp lại 02 lần, kết quả thể hiện ở Bảng 3.1 Cả 03 lô bạch cầu đều đạt yêu cầu về độ đồng nhất với giá trị Ss của 3 lô đều thỏa mãn điều kiện Ss < 0,3𝜎pt theo tiêu chuẩn ISO 13528:2015.

Ss < 0,3𝜎pt Đạt Đạt Đạt

Bảng 3 2 Kết quả độ ổn định 03 lô mẫu bạch cầu thử nghiệm 03 nồng độ chất cố định

Bài viết đề cập đến các loại bạch cầu được cố định bằng formaldehyde với các tỷ lệ khác nhau: B10F (10% Formaldehyde), B4F (4% Formaldehyde) và B2F (2% Formaldehyde) Ô đỏ biểu thị thời điểm không còn đạt độ ổn định Trung bình 10 mẫu/lô tại thời điểm ngày 0 được ký hiệu là Y0 Trị tuyệt đối hiệu hai trung bình tại thời điểm i và ngày 0 được biểu diễn bằng |𝑌𝑖 − 𝑌0| Độ lệch chuẩn cho phép được tính bằng công thức 𝜎pt = TEa x Y0, trong đó TEa (Total Allowable Error Goal) là tổng sai số cho phép.

Sau khi xác định các lô mẫu đạt độ đồng nhất, chúng tôi tiến hành đánh giá độ ổn định của 03 lô bạch cầu thử nghiệm tại 05 thời điểm cách nhau 01 tuần Mỗi thời điểm, chúng tôi chọn ngẫu nhiên 03 mẫu/lô và thực hiện phân tích 02 lần Kết quả cho thấy độ ổn định khác nhau tùy thuộc vào nồng độ chất cố định và thời gian cố định.

− Lô B10F: bạch cầu cố định nồng độ 10% Formaldehyde trong 40 phút cho độ ổn định thông số WBC lâu nhất trong 03 thử nghiệm, suốt thời gian theo dõi từ ngày

Ngày 0 Tuần 1 Tuần 2 Tuần 3 Tuần 4 Tuần 5

Trong giai đoạn từ 0 đến tuần thứ 4, số lượng bạch cầu không có sự thay đổi rõ rệt, với hiệu hai trung bình |Yi – Y0| dao động từ 0,02 đến 0,05, luôn nhỏ hơn 0,3𝜎 𝑃𝑇 = 0,25 Tuy nhiên, đến tuần thứ 5, số lượng tế bào đã suy giảm và không còn ổn định, với hiệu hai trung bình |Y5 – Y0| = 0,26, lớn hơn 0,3𝜎 𝑃𝑇.

Lô B4F cho thấy bạch cầu được cố định với nồng độ 4% Formaldehyde trong 50 phút, đảm bảo độ ổn định của thông số WBC đến tuần thứ 2 Tuy nhiên, từ tuần thứ 3, số lượng bạch cầu bắt đầu không ổn định với |Y3 – Y0| = 0,24, lớn hơn 0,3𝜎 𝑃𝑇 = 0,2, và tiếp tục giảm trong các tuần tiếp theo.

Lô B2F cho thấy bạch cầu được cố định với nồng độ 2% Formaldehyde trong 60 phút đạt độ ổn định ngắn nhất trong ba lô, chỉ duy trì ổn định trong tuần đầu tiên Tuy nhiên, vào tuần thứ hai, số lượng bạch cầu bắt đầu giảm đáng kể và tiếp tục xu hướng giảm trong các tuần tiếp theo, với hiệu hai trung bình không đáp ứng điều kiện |Yi – Y0| ≤ 0,3𝜎𝑝𝑡.

Hình 3 1 A) Hình ảnh Bạch cầu cố định 2% Formaldehyde trên tiêu bản nhuộm

Hình ảnh bạch cầu dưới kính hiển vi 100X cho thấy sự cố định 2% Formaldehyde đã bị thoái hoá vào tuần thứ 02 trên tiêu bản nhuộm Giemsa.

Hình ảnh bạch cầu được cố định bằng dung dịch 4% Formaldehyde cho thấy rõ sự khác biệt giữa hai thời điểm quan sát A) Ở thời điểm đầu, bạch cầu được nhuộm Giemsa và quan sát dưới kính hiển vi với độ phóng đại 100X B) Đến tuần thứ 03, bạch cầu đã bị thoái hoá, vẫn được nhuộm Giemsa và quan sát dưới kính hiển vi 100X, cho thấy sự thay đổi rõ rệt trong cấu trúc tế bào.

Hình ảnh bạch cầu được cố định bằng 10% Formaldehyde và nhuộm bằng Giemsa được quan sát dưới kính hiển vi với độ phóng đại 100X Hình A cho thấy bạch cầu ở thời điểm ban đầu, trong khi hình B thể hiện bạch cầu tại tuần thứ 05.

Nồng độ 10% Formaldehyde cho thấy sự ổn định lâu dài nhất về số lượng bạch cầu trong ba nồng độ thử nghiệm Hình ảnh vi mô cho thấy cấu trúc màng và nhân tế bào bạch cầu vẫn tương đối nguyên vẹn hơn so với hai nồng độ thấp hơn Mặc dù số lượng bạch cầu đã giảm vào tuần thứ 5, nhưng hình ảnh bạch cầu vẫn chưa có dấu hiệu thoái hóa rõ rệt Ngược lại, nồng độ 2% và 4% Formaldehyde cho thấy sự ổn định số lượng bạch cầu rất ngắn, không đạt yêu cầu tối thiểu 30 ngày, và cấu trúc tế bào bạch cầu không còn nguyên vẹn Hơn nữa, nồng độ chất cố định thấp dẫn đến hình ảnh tế bào thoái hóa nhanh chóng và nhiều hơn.

3.1.2 Kết quả 3 thử nghiệm nồng độ cố định tiểu cầu

Bảng 3 3 Kết quả độ đồng nhất 03 lô tiểu cầu 03 mức nồng độ chất cố định Formaldehyde

Chú thích các thuật ngữ trong nghiên cứu bao gồm T1F, T5F và T16F, tương ứng với tiểu cầu cố định ở các nồng độ Formaldehyde khác nhau là 1%, 0,5% và 0,16% Y 0 đại diện cho trung bình của 10 mẫu/lô tại thời điểm ngày 0, trong khi SD là độ lệch chuẩn của 10 mẫu/lô Các ký hiệu S w và S s lần lượt chỉ độ lệch chuẩn cùng một mẫu và giữa các mẫu Độ lệch chuẩn cho phép được ký hiệu là 𝜎 pt, được tính theo công thức 𝜎 pt = TEa x Y 0, trong đó TEa (Total Allowable Error Goal) là tổng sai số cho phép.

Tất cả 03 lô mẫu tiểu cầu đều được đánh giá về độ đồng nhất, và kết quả từ Bảng 3.3 cho thấy rằng tất cả các lô mẫu này đều đạt tiêu chuẩn về độ đồng nhất.

Ss < 0,3𝜎pt Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt sau khi phân phối với giá trị Ss ≤ 0,3𝜎 𝑃𝑇 , đáp ứng điều kiện tiên quyết để thực hiện đánh giá tiếp theo

Bảng 3 4 Kết quả đánh giá độ ổn định thông số PLT (G/L), MPV (fL) của tiểu cầu bảo quản thử nghiệm

Chú thích các loại tiểu cầu được sử dụng trong nghiên cứu bao gồm T1F (tiểu cầu cố định 1% Formaldehyde), T5F (tiểu cầu cố định 0,5% Formaldehyde) và T16F (tiểu cầu cố định 0,16% Formaldehyde) Giá trị trung bình 10 mẫu/lô tại thời điểm ngày 0 được ký hiệu là Y0 Độ lệch tuyệt đối giữa hai giá trị trung bình tại thời điểm i và ngày 0 được biểu thị bằng |𝑌𝑖 − 𝑌0| Độ lệch chuẩn cho phép được tính bằng công thức 𝜎pt = TEa x Y0, trong đó TEa (Total Allowable Error Goal) là tổng sai số cho phép Ô màu đỏ trong biểu đồ thể hiện thời điểm giá trị không còn thỏa mãn điều kiện ổn định.

Nhận xét: Kết quả đánh giá độ ổn định 2 thông số PLT, MPV của các lô tiểu cầu thử nghiệm ở Bảng 3 4 cho thấy:

Kết quả đánh giá huyển phù tế bào bạch cầu và tiểu cầu sản xuất bằng phương pháp cố định formaldehyde ở nồng độ thích hợp

Dựa trên kết quả từ giai đoạn thử nghiệm, nhóm đã sản xuất 2 bộ mẫu bạch cầu và tiểu cầu theo quy trình đã định, sử dụng nồng độ 10% Formaldehyde cho cố định bạch cầu và 0,16% Formaldehyde cho cố định tiểu cầu Mỗi bộ mẫu bao gồm 03 lô tương ứng với 03 mức nồng độ thấp, bình thường và cao (Bộ mẫu bạch cầu: B1, B2, B3; Bộ mẫu tiểu cầu: T1, T2, T3) Tất cả các lô đều được đánh giá về độ đồng nhất và độ ổn định theo tiêu chuẩn ISO/IEC 17043:2010 và ISO 13528:2015 Kết quả được trình bày trong các bảng sau.

3.2.1 Kết quả đánh giá độ đồng nhất

Bảng 3 5 Kết quả đánh giá độ đồng nhất thông số WBC (G/L) 03 lô bạch cầu

* Chú thích: B1: Lô bạch cầu nồng độ thấp; B2: Lô bạch cầu nồng độ bình thường; B3: Lô bạch cầu nồng độ cao;

Y 0: Trung bình 10 mẫu/lô tại thời điểm ngày 0; SD: Độ lệch chuẩn 10 mẫu/lô; S w : Độ lệch chuẩn cùng một mẫu;

S s : Độ lệch chuẩn giữa các mẫu; 𝜎 pt: Độ lệch chuẩn cho phép, trong đó 𝜎 pt = TEa x Y 0 , với TEa (Total Allowable Error Goal): tổng sai số cho phép [58]

Sau khi điều chỉnh 3 mức nồng độ mong muốn, mẫu bạch cầu được phân phối thành 03 lô theo các mức nồng độ thấp, bình thường và cao Đánh giá độ đồng nhất ngay sau khi phân phối cho thấy cả 03 lô đều đạt yêu cầu, với độ lệch chuẩn giữa các nhóm Ss lần lượt là 0,01, 0,01 và 0,03, thỏa mãn điều kiện Ss < 0,3𝜎pt theo tiêu chuẩn ISO.

Ss < 0,3𝜎pt Đạt Đạt Đạt

* Chú thích: T1: Lô tiểu cầu nồng độ thấp; T2: Lô tiểu cầu nồng độ bình thường; T3: Lô tiểu cầu nồng độ cao; Y 0:

Tại thời điểm ngày 0, trung bình 10 mẫu/lô được tính toán với độ lệch chuẩn 10 mẫu/lô (SD) Độ lệch chuẩn cùng một mẫu được ký hiệu là S w, trong khi độ lệch chuẩn giữa các mẫu là S s Độ lệch chuẩn cho phép, ký hiệu là 𝜎 pt, được xác định theo công thức 𝜎 pt = TEa x Y 0, trong đó TEa (Total Allowable Error Goal) là tổng sai số cho phép.

Sau khi hoàn tất giai đoạn phân phối mẫu, quy trình đánh giá độ đồng nhất của tiểu cầu được thực hiện bằng cách chọn ngẫu nhiên 10 mẫu/lô và lặp lại phân tích 02 lần cho các thông số số lượng tiểu cầu (PLT) và thể tích trung bình tiểu cầu (MPV) Kết quả đánh giá độ đồng nhất của 03 lô tiểu cầu ở 3 mức nồng độ thấp, bình thường và cao cho thấy tất cả 03 lô đều thỏa mãn điều kiện Ss < 0,3𝜎pt ở cả 02 thông số PLT và MPV, chứng tỏ mẫu tiểu cầu đạt độ đồng nhất.

3.2.2 Kết quả đánh giá độ ổn định ngắn hạn (ổn định vận chuyển giả định) Bảng 3 7 Theo dõi nhiệt độ vận chuyển giả định của 2 bộ mẫu bạch cầu và tiểu cầu

Bộ mẫu Sau khi đóng gói 1 ngày 2 ngày 3 ngày

Thông số Thông số Thông số

PLT MPV PLT MPV PLT MPV

Ss < 0,3𝜎pt Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt Đạt

Bảng 3 6 Kết quả đánh giá độ đồng nhất thông số PLT (G/L) và MPV (fL) của 03 lô tiểu cầu

Thùng xốp kích thước R21xD31xC23 cm, chứa 10 viên đá gel 330g, có khả năng duy trì nhiệt độ từ 2 - 10ºC tối đa trong 48 giờ trong điều kiện vận chuyển giả định Sau 72 giờ, nhiệt độ trong thùng chứa mẫu sẽ đạt khoảng

Bảng 3 8 Kết quả độ ổn định ngắn hạn 03 lô trong bộ mẫu bạch cầu

Bài viết đề cập đến ba lô bạch cầu với các nồng độ khác nhau: B1 (nồng độ thấp), B2 (nồng độ bình thường) và B3 (nồng độ cao) Trung bình 10 mẫu/lô tại thời điểm ngày 0 được ký hiệu là \(Y_{v0} = Y_0\) Trị tuyệt đối hiệu hai trung bình tại thời điểm \(i\) và ngày 0 được biểu diễn bằng \(|Y_{vi} - Y_{v0}|\) Độ lệch chuẩn cho phép được tính bằng công thức \(\sigma_{pt} = TEa \times Y_0\), trong đó TEa (Total Allowable Error Goal) là tổng sai số cho phép Ô màu đỏ trong biểu đồ thể hiện thời điểm không đạt độ ổn định.

Khi điều kiện vận chuyển được duy trì ở nhiệt độ từ 2 - 10ºC, mẫu có thể đạt độ ổn định trong 48 giờ Tuy nhiên, nếu nhiệt độ vượt quá 10ºC vào ngày thứ 3, thông số WBC sẽ không còn ổn định do sự chênh lệch |𝑌 𝑣𝑖 − 𝑌 𝑣0 | > 0,3𝜎 𝑃𝑇, với xu hướng giảm dần Do đó, để đảm bảo mẫu ổn định tối đa 48 giờ, cần tuân thủ quy định về nhiệt độ và quy cách đóng gói như đã nêu trong mục 2.3.1.4.

Bảng 3 9 Kết quả độ ổn định ngắn hạn thông số PTL, MPV bộ mẫu tiểu cầu

*Chú thích: T1: Lô tiểu cầu nồng độ thấp; T2: Lô tiểu cầu nồng độ bình thường; T3: Lô tiểu cầu nồng độ cao; Y v0

Tại thời điểm ngày 0, giá trị trung bình của 10 mẫu/lô là \$Y_0\$ Hiệu số tuyệt đối giữa hai trung bình tại thời điểm \$i\$ và ngày 0 được biểu diễn bằng \$|Y_{vi} - Y_{v0}|\$ Độ lệch chuẩn cho phép được xác định bởi công thức \$\sigma_{pt} = TEa \times Y_0\$, trong đó \$TEa\$ (Tổng sai số cho phép) là tổng sai số tối đa được chấp nhận.

Kết quả đánh giá 3 lô mẫu tiểu cầu cho thấy số lượng và thể tích trung bình tiểu cầu có xu hướng giảm liên tục Mặc dù vẫn trong giới hạn ổn định, sự suy giảm nhanh chóng trong 3 ngày theo dõi cho thấy ảnh hưởng đáng kể của nhiệt độ Do đó, nhiệt độ là yếu tố quan trọng cần được đảm bảo khi vận chuyển mẫu huyền phù tế bào.

3.2.3 Kết quả đánh giá độ ổn định dài hạn

Bảng 3 10 Kết quả tóm tắt đánh giá độ ổn định thông số WBC (G/L) của 03 lô bạch cầu qua 14 tuần ở nhiệt độ 2 - 6⁰C

Ngày 0 Tuần 4 Tuần 8 Tuần 12 Tuần 13 Tuần 14

* Chú thích: B1: Lô bạch cầu nồng độ thấp; B2: Lô bạch cầu nồng độ bình thường; B3: Lô bạch cầu nồng độ cao;

Y 0: Trung bình 10 mẫu/lô tại thời điểm ngày 0; |𝑌 𝑖 − 𝑌 0 |: Trị tuyệt đối hiệu hai trung bình tại thời điểm i và ngày

0; 𝜎 pt: Độ lệch chuẩn cho phép, trong đó 𝜎 pt = TEa x Y 0 , với TEa (Total Allowable Error Goal): tổng sai số cho phép [58]

Kết quả đánh giá độ ổn định của WBC được trình bày trong Bảng 3.10 cho thấy cả 3 lô đều duy trì độ ổn định của thông số WBC (G/L) trong suốt thời gian theo dõi từ ngày 0 đến tuần 12, với giá trị hiệu hai trung bình tại mỗi thời điểm đánh giá.

|𝑌 𝑖 − 𝑌 0 | so với giá trị 0,3 lần độ lệch chuẩn cho phép 0,3𝜎 𝑃𝑇 đều thỏa mãn điều kiện |Yi

– Y0| ≤ 0,3𝜎𝑝𝑡 theo hướng dẫn của ISO 13528:2015

Biểu đồ Hình 3.6 cho thấy sự biến động của số lượng bạch cầu trong 3 lô từ ngày 0 đến tuần 12 là không đáng kể Tuy nhiên, từ tuần 13 trở đi, cả 3 nồng độ bạch cầu đều giảm rõ rệt, không còn đạt độ ổn định Cụ thể, số lượng bạch cầu tại tuần 13 của 3 lô thấp, bình thường và cao lần lượt là 0,26, 0,25 và 1,88, không thỏa mãn điều kiện |Yi – Y0| ≤ 0,3𝜎𝑝𝑡, và sự suy giảm này tiếp tục gia tăng trong tuần tiếp theo.

Hình 3 6 Biểu đồ thể hiện độ ổn định thông số WBC (G/L) của 3 lô mẫu bạch cầu qua

Tuần 1 Tuần 2 Tuần 3 Tuần 4 Tuần 5 Tuần 6 Tuần 7 Tuần 8 Tuần 9 Tuần

Tuần 1Tuần 2Tuần 3Tuần 4Tuần 5Tuần 6Tuần 7Tuần 8Tuần 9 Tuần

Tuần 1 Tuần 2 Tuần 3 Tuần 4 Tuần 5 Tuần 6 Tuần 7 Tuần 8 Tuần 9 Tuần

Bảng 3 11 Tóm tắt kết quả đánh giá độ ổn định thông số PLT (G/L) của 3 lô mẫu tiểu cầu qua 14 tuần ở nhiệt độ 2 - 6⁰C

Ngày 0 Tuần 4 Tuần 8 Tuần 12 Tuần 13 Tuần 14

* Chú thích: T1: Lô tiểu cầu nồng độ thấp; T2: Lô tiểu cầu nồng độ bình thường; T3: Lô tiểu cầu nồng độ cao; Y 0:

Trung bình 10 mẫu/lô tại thời điểm ngày 0; |𝑌 𝑖 − 𝑌 0 |: Trị tuyệt đối hiệu hai trung bình tại thời điểm i và ngày 0;

𝜎 pt: Độ lệch chuẩn cho phép, trong đó 𝜎 pt = TEa x Y 0 , với TEa (Total Allowable Error Goal): tổng sai số cho phép [58]

Qua 14 tuần theo dõi, kết quả độ ổn định số lượng tiểu cầu của 3 mức nồng độ cho thấy, 2 lô ở mức nồng độ thấp và bình thường đạt độ ổn định từ ngày 0 đến tuần 12 với hiệu hai trung bình thỏa điều kiện |Yi – Y0| ≤ 0,3𝜎𝑝𝑡 Tuy nhiên, từ tuần 13, số lượng tiểu cầu giảm đáng kể, dẫn đến kết quả không còn ổn định với giá trị hiệu hai trung bình tại tuần 13 lần lượt là 3,53 và 18,1 cho 2 lô thấp và bình thường Lô nồng độ cao duy trì độ ổn định lâu hơn (13 tuần), mặc dù cũng giảm so với ngày 0 Đến tuần 14, số lượng tiểu cầu không còn ổn định với hiệu hai trung bình đạt 57,22, vượt quá 0,3𝜎𝑝𝑡 = 55,32.

Biểu đồ Hình 3.7 chỉ ra sự khác biệt về thời gian ổn định số lượng tiểu cầu giữa ba mức nồng độ Mặc dù tất cả đều có xu hướng giảm dần, thời điểm không còn đạt độ ổn định bắt đầu từ tuần 13 đối với lô nồng độ thấp và bình thường.

14 với lô nồng độ cao) nhưng lô nồng độ cao ổn định số lượng tiểu cầu 13 tuần lâu hơn

2 lô còn lại 1 tuần là 12 tuần Giá trị ô đỏ cho thấy sự suy giảm đáng kể so với giá trị ban đầu của mỗi nồng độ

Hình 3 7 Biểu đồ thể hiện độ ổn định thông số PLT (G/L) của 3 lô mẫu tiểu cầu qua

14 thời điểm đánh giá ở nhiệt độ 2 - 6⁰C

Ngày 0 Tuần 1 Tuần 2 Tuần 3 Tuần 4 Tuần 5 Tuần 6 Tuần 7 Tuần 8 Tuần 9 Tuần

Tuần 1 Tuần 2 Tuần 3 Tuần 4 Tuần 5 Tuần 6 Tuần 7 Tuần 8 Tuần 9 Tuần

Tuần 1 Tuần 2 Tuần 3 Tuần 4 Tuần 5 Tuần 6 Tuần 7 Tuần 8 Tuần 9 Tuần

Bảng 3 12 Tóm tắt kết quả đánh giá độ ổn định thông MPV (fL) của 3 lô tiểu cầu qua

Ngày 0 Tuần 4 Tuần 8 Tuần 12 Tuần 13 Tuần 14

* Chú thích: T1: Lô tiểu cầu nồng độ thấp; T2: Lô tiểu cầu nồng độ bình thường; T3: Lô tiểu cầu nồng độ cao; Y 0:

Trung bình 10 mẫu/lô tại thời điểm ngày 0; |𝑌 𝑖 − 𝑌 0 |: Trị tuyệt đối hiệu hai trung bình tại thời điểm i và ngày 0;

Độ lệch chuẩn cho phép, ký hiệu là 𝜎 pt, được tính bằng công thức 𝜎 pt = TEa x Y 0, trong đó TEa (Total Allowable Error Goal) là tổng sai số cho phép Ô màu đỏ biểu thị giá trị tại thời điểm không còn đạt độ ổn định.

BÀN LUẬN

Những phương pháp sản xuất mẫu ngoại kiểm công thức máu từ các nguồn nguyên liệu khác nhau

Các chương trình EQA có thể được thiết lập theo quy mô địa phương, quốc gia hoặc quốc tế, mỗi loại đều có ưu và nhược điểm riêng Chương trình địa phương hoặc quốc gia có thể cung cấp mẫu và báo cáo nhanh chóng, nhưng thiếu tính mạnh mẽ về mặt thống kê so với chương trình quốc tế với số lượng đơn vị tham gia lớn, từ đó khó khăn trong việc đánh giá tổng quan tình trạng phòng thí nghiệm Hơn nữa, không có vật liệu "lý tưởng" nào để đánh giá chất lượng bên ngoài cho xét nghiệm công thức máu, vì mỗi loại nguyên liệu đều có những ưu nhược điểm khác nhau phù hợp với quy mô và mục tiêu của từng chương trình.

Phương pháp truyền thống để duy trì hệ thống kiểm soát chất lượng cho thiết bị đếm tế bào tự động là sử dụng mẫu máu toàn phần tươi, nhưng loại vật liệu này chỉ có giá trị sử dụng trong ngày Do đó, các vật liệu ổn định hơn đã được phát triển, tuy nhiên chưa có phương pháp chuẩn bị nào hoàn toàn phù hợp cho tất cả các quy mô chương trình và các thông số mục tiêu khác nhau Việc hoàn thiện và mở rộng các thông số ngoại kiểm công thức máu cần dựa trên việc xem xét ưu nhược điểm, phạm vi áp dụng, đối tượng khách hàng, vị trí địa lý và điều kiện vận chuyển Từ đó, nhà ngoại kiểm có thể lựa chọn phương pháp sản xuất và xác định giới hạn chấp nhận cho từng thông số huyết học.

Vật liệu ngoại kiểm cần tuân thủ các yêu cầu nhất định, đảm bảo nguồn gốc đạo đức và tuân thủ các luật pháp hiện hành đối với cả nhà cung cấp EQA và đơn vị tham gia.

Nguồn nguyên liệu cho chu kỳ ngoại kiểm cần có sẵn với khối lượng đủ, không mang mầm bệnh (trừ khi là mục tiêu của kế hoạch EQA), và phải có thể xử lý phân tích tương tự như mẫu lâm sàng Ngoài ra, nguyên liệu cần được cung cấp với mức giá chấp nhận được cho các phòng thí nghiệm tham gia Vật liệu phải được chuẩn bị và sản xuất đồng nhất, ổn định trong quá trình vận chuyển và suốt thời gian diễn ra chu kỳ ngoại kiểm.

Nguồn cung cấp vật liệu ngoại kiểm có thể từ máu động vật hoặc ngân hàng máu của người hiến máu tình nguyện Vật liệu từ máu động vật có ưu điểm về độ ổn định và giá cả hợp lý, nhưng chỉ phù hợp cho kỹ thuật đếm thủ công và không áp dụng cho tất cả các thông số huyết học Cần cân nhắc về đạo đức và phúc lợi động vật, trong khi nguồn từ người hiến máu tình nguyện được kiểm tra kỹ lưỡng và có thể đáp ứng nhu cầu sản xuất mẫu lớn Nhà ngoại kiểm có thể cố định máu toàn phần hoặc bổ sung tiểu cầu để tạo ra vật liệu ổn định, nhưng cần lưu ý rằng vật liệu này có thể phản ứng khác nhau với các hệ thống đếm tự động Việc thiếu tính hoán đổi ở mẫu ngoại kiểm yêu cầu phân tích kết quả dựa trên nhóm thiết bị và phương pháp, đồng thời cần thông tin từ nhà sản xuất để đảm bảo độ chính xác.

Mục tiêu nghiên cứu của chúng tôi không phải là phát hiện vật liệu mới thay thế cho máu người, như phương pháp mà các tác giả Skitek và cộng sự đã thực hiện.

Nghiên cứu của chúng tôi nhằm phát triển phương pháp tạo huyền phù cho từng dòng tế bào bạch cầu và tiểu cầu từ chế phẩm máu người, sử dụng Formaldehyde và dung dịch chất bảo quản để đảm bảo tính ổn định cho cả ba dòng tế bào khi phối trộn lại Mục tiêu là tạo ra vật liệu có độ ổn định ít nhất 30 ngày, đáp ứng các thông số trong chương trình ngoại kiểm công thức máu, bao gồm 3 thông số WBC, PLT, MPV trong tổng số 10 thông số (RBC, Hb, Hct, MCV, MCH, MCHC, RDW, WBC, PLT, MPV) Kết quả nghiên cứu sẽ góp phần nâng cao độ ổn định cho chương trình ngoại kiểm công thức máu.

Nghiên cứu này sử dụng chế phẩm khối bạch cầu hạt và khối tiểu cầu nhóm O từ ngân hàng máu, với sự lựa chọn nhóm máu dựa trên tính tương thích trong hệ ABO Theo nghiên cứu của Jaewoo Song và cộng sự (2015), nhóm máu O có nồng độ yếu tố VIII và von Willebrand thấp nhất, trong khi nhóm B và AB có nồng độ cao hơn Yếu tố von Willebrand, một glycoprotein quan trọng trong việc kết dính tiểu cầu, được sản xuất bởi tiểu cầu và tế bào nội mô Do đó, nếu quy trình xử lý tế bào được thực hiện tốt, việc lựa chọn nhóm máu sẽ không ảnh hưởng đáng kể Tuy nhiên, nghiên cứu của chúng tôi chọn nhóm máu O để giảm thiểu nguy cơ kết cụm tiểu cầu trong quá trình xử lý.

Thành phần dung dịch cố định và dung dịch treo tế bào (css) bạch cầu, tiểu cầu 70 4.3 Thử nghiệm sản xuất huyền phù tế bào bạch cầu và tiểu cầu bằng phương pháp cố định dung dịch formaldehyde nhiều nồng độ

4.2.1 Dung dịch cố định tế bào

Cố định là bước quan trọng trong xử lý mẫu mô hay tế bào sinh thiết, giúp kiểm tra tình trạng tế bào và bảo quản lưu trữ Một chất cố định lý tưởng cần tạo độ cứng cơ học, ngăn ngừa sự phân hủy do vi khuẩn và tự phân hủy của tế bào, đồng thời dừng các phản ứng enzyme Quá trình cố định diễn ra từ từ và phức tạp, liên quan đến sự khuếch tán của chất cố định vào tế bào cùng với các hiện tượng vật lý và phản ứng hóa học Hiện tại, chưa có chất cố định lý tưởng nào bảo tồn hoàn hảo hình thái tế bào mà không làm thay đổi mức độ phản ứng của các gốc hóa học trong các phương pháp xét nghiệm sau Do đó, việc lựa chọn phương pháp hay chất cố định với nồng độ cụ thể cần được cân nhắc kỹ lưỡng, vì một khi chất cố định đã thẩm thấu vào tế bào, việc khắc phục là không thể.

Nghiên cứu của Theo Fraschini và cộng sự (1981) cho thấy Formaldehyde là chất cố định hiệu quả nhất trong việc bảo tồn cấu trúc tế bào lympho, với khả năng liên kết với protein để phản ánh chính xác các mối quan hệ phân tử trong tế bào sống Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng Formaldehyde pha loãng từ dung dịch gốc 37% cho bạch cầu và tiểu cầu, với nồng độ phù hợp cho từng loại tế bào Phương pháp cố định aldehyde với tế bào máu đã được thực hiện theo hướng dẫn của WHO Tương tự, Saxena và cộng sự (2007) cũng đã đề cập đến vấn đề này.

Aldehyde được sử dụng trong việc cố định hồng cầu của gà, ngỗng và dê để tạo ra vật liệu giả định cho ngoại kiểm công thức máu Nghiên cứu của Reardon và cộng sự (1991), Warner và cộng sự (1993), cùng với Fink và cộng sự (1998) cho thấy aldehyde có thể cố định máu toàn phần của người, tạo ra vật liệu ổn định từ vài tuần đến vài tháng Việc sử dụng aldehyde trong bảo quản tế bào máu được đồng thuận bởi nhiều tác giả Dung dịch cố định có thể là một chất duy nhất hoặc hỗn hợp, hòa tan trong dung môi như dung dịch đệm để ổn định pH, và cần đáp ứng một số yêu cầu cụ thể Các enzyme trong tế bào rất dễ bị phá hủy, do đó dung dịch cố định cần ngăn chặn quá trình trao đổi chất và làm bất hoạt enzyme mà không làm hư hỏng cấu trúc tế bào, điều này cũng được nhấn mạnh bởi Davis và cộng sự.

Liên kết giữa Formaldehyde và protein được hình thành dựa trên ái lực [48] Có

2 giai đoạn chính trong quá trình cố định là quá trình thẩm thấu và quá trình tạo liên kết

Sự thẩm thấu đề cập đến khả năng khuếch tán của dung dịch cố định vào mô hoặc tế bào, trong khi giai đoạn tạo liên kết là khả năng của Formaldehyde hoàn thành liên kết với protein Theo Thavarajah và cộng sự (2012), sự xâm nhập và tạo liên kết của Formaldehyde vào tế bào bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ, độ pH, thời gian và nồng độ dung dịch cố định Thời gian tiếp xúc lâu hơn với cùng nồng độ chất cố định sẽ tăng cường sự khuếch tán vào tế bào Đối với nồng độ chất cố định thấp, thời gian cố định cần kéo dài để đảm bảo dung dịch khuếch tán đều Nghiên cứu cho thấy tăng nhiệt độ có lợi cho sự phân ly Formaldehyde từ cấu trúc polyme, giúp hình thành liên kết nhanh chóng và giảm thời gian cố định cần thiết Thể tích dung dịch cố định lý tưởng thường là 1:25, với tỷ lệ sử dụng phổ biến là 1:10, đảm bảo lượng Formaldehyde đủ lớn để liên kết với hầu hết protein của tế bào.

Yếu tố pH đóng vai trò quan trọng trong sự phân ly các chất trong dung dịch, với liên kết giữa Formaldehyde và protein mạnh mẽ ở độ pH kiềm khoảng 7,0 - 8,0 Sự hiện diện của axit formic do oxy hoá Formaldehyde trong dung dịch cố định lâu ngày có thể làm chậm hoặc ức chế phản ứng liên kết này, điều này không xảy ra với dung dịch Formaldehyde mới Nếu độ pH của dung dịch cố định quá thấp, quá trình ngưng kết tế bào có thể xảy ra, trong khi nếu quá cao, tế bào có thể vỡ hoặc tổn thương cấu trúc Do đó, việc pha chế dung dịch cố định mới cho từng lần thực hiện là cần thiết để đảm bảo hiệu quả, và Formaldehyde nên được hoà tan trong dung dịch đệm theo quan điểm của Kiernan.

Nghiên cứu này khuyến nghị sử dụng dung môi là đệm phosphate với pH = 7,4 thay vì nước cất, vì dung dịch đệm có khả năng ngăn chặn những thay đổi nhỏ của pH Việc này giúp loại trừ các tác động không mong muốn do biến đổi pH gây ra Do đó, chúng tôi đã chọn dung dịch đệm phosphate pH = 7,4 có sẵn trên thị trường làm dung môi cho chất cố định Formaldehyde 37%.

4.2.2 Dung dịch treo tế bào (CSS)

Một dung dịch treo tế bào cho mẫu ngoại kiểm công thức máu cần bảo tồn các đặc điểm của tế bào máu trong thời gian dài Thành phần của dung dịch này có thể bao gồm các hợp chất vô cơ và hữu cơ, trong đó cần có ít nhất một hợp chất đệm để ổn định độ pH Ngoài ra, dung dịch cũng cần chứa polymer để giảm sự kết tụ của tế bào máu, protein để mô phỏng protein huyết tương, và các chất phụ gia như alcohols, chất hoạt động bề mặt, chất chống đông máu và nước Đặc biệt, dung dịch phải có ít nhất một hợp chất kháng khuẩn như chloramphenicol hoặc neomycin sulfate để đảm bảo độ vô trùng Độ pH của dung dịch treo nên dao động từ 6,0 đến 8,0.

Dung dịch treo tế bào trong nghiên cứu này bao gồm các thành phần chính như muối vô cơ, đệm hữu cơ và/hoặc vô cơ, albumin huyết thanh bò để duy trì cân bằng nội môi, EDTA chống đông máu, ít nhất một chất kháng sinh để đảm bảo độ vô khuẩn, và các chất phụ gia khác Độ pH được điều chỉnh ở mức 7,35 - 7,45 và áp suất thẩm thấu khoảng 310 - 315 mOsm/kg Thành phần đệm giúp ổn định độ pH và ngăn ngừa sự thay đổi đột ngột khi thêm ion hydroxide Chúng tôi sử dụng đệm HEPES với khoảng đệm pH từ 6,8 - 8,2, phù hợp với pH mục tiêu của mẫu nghiên cứu Hỗn hợp muối vô cơ cũng được thêm vào để hỗ trợ tác dụng đệm và tạo thành phần ion tương tự huyết tương Độ pH dịch treo trong nghiên cứu tương đồng với quan điểm của Skitek và cộng sự (2003), nhấn mạnh rằng dung dịch treo nên đạt khoảng 7,4 thay vì 7,9 như Lombarts đã thực hiện trước đó Acid hoặc bazo có thể được sử dụng để trung hòa và chuẩn độ đến độ pH mong muốn.

Hỗn hợp kháng sinh Chloramphenicol và natri azide là thành phần quan trọng trong nghiên cứu này để đảm bảo dung dịch vô trùng Theo Minassian và cộng sự (1979), việc chỉ sử dụng muối chứa ion Ca 2+ và Cl - không đủ để bảo tồn cấu trúc tế bào, như đã nêu bởi Glauert và cộng sự Nghiên cứu của Minassian chỉ ra rằng natri azide không chỉ ức chế vi khuẩn mà còn có tác dụng bất ngờ trong việc bảo tồn cấu trúc ty thể nhờ vào khả năng ức chế hoạt động hô hấp Natri azide thâm nhập nhanh chóng vào tế bào do kích thước phân tử nhỏ, nhưng nồng độ lớn hơn 0,1% không mang lại hiệu quả bảo quản tốt hơn mà còn làm tăng sự co rút màng tế bào Do đó, nghiên cứu của chúng tôi lựa chọn phối hợp Chloramphenicol và natri azide để tối ưu hóa hiệu quả bảo tồn cấu trúc tế bào và ức chế vi khuẩn.

EDTA và PEG 20,000 được bổ sung để giảm thiểu hiện tượng kết tụ của tế bào máu, giúp chúng duy trì trạng thái lơ lửng Điều này hỗ trợ trong việc phân phối mẫu, đảm bảo độ đồng nhất về mật độ tế bào trong dung dịch.

PEG 20,000 có khả năng bảo vệ tế bào khỏi tổn thương trong quá trình xử lý mẫu Để tạo môi trường tương tự huyết tương người, chúng tôi sử dụng Albumin huyết thanh bò để điều chỉnh độ nhớt và áp suất thẩm thấu Các chất phụ gia như natri hydroxide và urea được thêm vào để điều chỉnh pH và áp suất thẩm thấu, đảm bảo mọi giai đoạn pha chế dịch treo tế bào đều vô trùng Công thức dịch treo của chúng tôi dựa trên cơ sở khoa học và thử nghiệm thực tế, nhằm tạo mẫu ngoại kiểm cho các chế phẩm bạch cầu và tiểu cầu của người Dung dịch treo tế bào tổng hợp này đảm bảo độ ổn định trong 12 tuần, đáp ứng yêu cầu thời gian cho chu kỳ ngoại kiểm.

4.3 Thử nghiệm sản xuất huyền phù tế bào bạch cầu và tiểu cầu bằng phương pháp cố định dung dịch formaldehyde nhiều nồng độ

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng nồng độ formaldehyde từ 1% đến 10% được sử dụng để cố định tế bào máu và tế bào trong dịch cơ thể Để đảm bảo tính ổn định của vật liệu ngoại kiểm, nghiên cứu này tiến hành thử nghiệm với các mức nồng độ và thời gian tiếp xúc khác nhau nhằm tìm ra phương pháp phù hợp cho mẫu tế bào máu người, đảm bảo tiêu chí đồng nhất và ổn định.

Tác giả Lei Zhao và cộng sự (2007) đã thực hiện các thử nghiệm cố định máu toàn phần với nhiều tỷ lệ khác nhau nhằm đạt được độ ổn định cho các thông số RBC, WBC, PLT, MCV trong 3 ngày, đồng thời giữ được màu sắc giống với máu toàn phần tươi Trong nghiên cứu của chúng tôi, các thử nghiệm về nồng độ chất cố định và thời gian tiếp xúc đã được thiết kế để lựa chọn phương pháp phù hợp nhất với mục tiêu nghiên cứu.

Sự khác biệt trong đáp ứng giữa mẫu vật liệu ngoại kiểm và mẫu máu tươi trên lâm sàng có thể do quy trình sản xuất khác nhau, ảnh hưởng đến đặc điểm hình dạng và tính chất hóa lý của các thành phần tế bào Các yếu tố trong giai đoạn xử lý tế bào như thời gian tiếp xúc với dung dịch hóa chất, thao tác rửa, tách chiết, quay ly tâm, phân phối và bảo quản ở nhiệt độ thấp có thể tác động đến chất lượng vật liệu Việc sử dụng chất bảo quản, kháng sinh và phụ gia là cần thiết để bảo vệ tính toàn vẹn của các đặc tính cần phân tích và ngăn ngừa nhiễm khuẩn Tuy nhiên, không phải tất cả các chất bảo quản đều tương thích với mọi quy trình hay loại vật liệu, do đó cần thiết phải thực hiện giai đoạn thử nghiệm.

4.3.1 Thử nghiệm quy trình sản xuất huyền phù bạch cầu

Thử nghiệm cho thấy, mẫu bạch cầu ở nồng độ 10% Formaldehyde trong 40 phút ở nhiệt độ phòng duy trì độ ổn định WBC lâu nhất, với số lượng bạch cầu không thay đổi đáng kể từ ngày 0 đến tuần thứ 4 Ngược lại, ở nồng độ 4% và 2% Formaldehyde, dù thời gian tiếp xúc lâu hơn, số lượng bạch cầu không đạt độ ổn định mong muốn Điều này cho thấy nồng độ thấp hơn không đủ để liên kết với protein của tế bào, dẫn đến sự thoái hóa theo thời gian Mặc dù tế bào ở nồng độ 2% và 4% vẫn ổn định hơn so với mẫu máu tươi, nhưng không đạt yêu cầu tối thiểu cho chu kỳ ngoại kiểm là 30 ngày Nồng độ cao trên 10% có thể làm trầm trọng thêm tình trạng co rút kích thước tế bào, mặc dù nồng độ 10% đã cho thấy sự giảm nhẹ kích thước tế bào mà không co rút quá mức.