Luận Văn Báo Cáo Tổng Kết Đề Tài Độc Lập Cấp Nhà Nước Nghiên Cứu Quy Trình Chiết Tách Ent-Kauran Ditecpenoit Có Tác Dụng Chống Ung Thư Và Chống Viêm Từ Cây Khổ Sâm Bắc Bộ.pdf

Microsoft Word bia mau doc ®¹i häc quèc gia hµ néi tr−êng ®¹i häc khoa häc tù nhiªn B¸o c¸o tæng kÕt ®Ò tµi ®éc lËp cÊp nhµ n−íc Nghiªn cøu quy tr×nh chiÕt t¸ch ent kauran ditecpenoit cã t¸c dông chèn[.]

đại học quốc gia hà nội trường đại học khoa học tự nhiên

Báo cáo tổng kết đề tài độc lập cấp nhà nước

Nghiên cứu quy trình chiết tách ent-kauran ditecpenoit có tác dụng chống ung thư

Lời mở đầu

Cây khổ sâm Bắc Bộ (Croton tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae) mọc

hoang và được trồng khắp nơi ở các tỉnh phía Bắc nước ta Cây dễ trồng và sau một thời gian ngắn đã có thể thu hái lấy nguyên liệu Cây khổ sâm Bắc Bộ

được dùng phổ biến trong y học dân gian của Việt Nam Lá cây khổ sâm Bắc

Bộ dùng chữa ung nhọt, lở loét, viêm mũi, đau bụng, tiêu hóa kém, lỵ, và viêm loét dạ dày - tá tràng

Kết quả của các công trình nghiên cứu gần đây đã phát hiện sự có mặt

của nhiều ent-kauran ditecpenoit trong cây khổ sâm Bắc Bộ, trong số đó có

nhiều hợp chất mới và có những hoạt tính sinh học rất đáng quan tâm, như hoạt tính độc hại tế bào ung thư, tác dụng ức chế sự hoạt hóa nhân tố phiên mã

NF-кB, tác dụng ức chế enzym nitric oxide synthase (iNOS) Hoạt chất kauran ditecpenoit chủ yếu của lá cây khổ sâm Bắc Bộ là ent-7β-hydroxy-15-

ent-oxokaur-16-en-18-yl axetat (1)

Đề tài nghiên cứu Khoa học và Phát triển Công nghệ độc lập cấp Nhà

nước “Nghiên cứu quy trình chiết tách ent-kauran ditecpenoit có tác dụng chống ung thư và chống viêm từ cây khổ sâm Bắc Bộ (Croton tonkinensis

Gagnep., Euphorbiaceae)”, Mã số: ĐTĐL-2005/05, có các mục tiêu:

- Xây dựng quy trình chiết tách ent-kauran ditecpenoit có tác dụng

chống ung thư và chống viêm từ cây khổ sâm Bắc Bộ;

- Thử độ an toàn của hoạt chất chiết tách được;

- Chứng minh tác dụng chống ung thư và chống viêm thực nghiệm của hoạt chất chiết tách được

Các nội dung nghiên cứu được xác định cho Đề tài ĐTĐL-2005/05 là:

1 Xây dựng quy trình ổn định chiết tách ent-kauran ditecpenoit có tác

dụng chống ung thư và chống viêm ở quy mô Phòng thí nghiệm;

2 Phân lập hoạt chất 1 và Chế phẩm CT-2005 giàu hoạt chất 1 có tác

dụng diệt tế bào ung thư dùng làm chuẩn đối chứng trong kiểm nghiệm;

3 Thử độ an toàn của Chế phẩm CT-2005;

4 Khảo sát hoạt tính kháng u trực tiếp của Chế phẩm CT-2005 trên một

số dòng tế bào ung thư người nuôi cấy in vitro;

5 Nghiên cứu tác dụng của Chế phẩm CT-2005 đến hạn chế sự phát triển

ung thư sarcoma 180 trên động vật thực nghiệm;

6 Nghiên cứu tác dụng chống viêm của Chế phẩm CT-2005 ở súc vật

thực nghiệm

Chương 1

TổNG QUAN

1.1 Các hợp chất thiên nhiên từ thực vật trong liệu pháp chống bệnh ung thư và chống viêm

Theo thống kê, bệnh ung thư hiện là nguyên nhân chính thứ hai gây tử

vong ở các nước phát triển ở Mỹ mỗi năm có khoảng 500.000 người chết do ung thư [1] ở các nước đang phát triển bệnh ung thư cũng đang trở thành phổ biến Theo đánh giá của Diễn đàn Y tế châu á được tổ chức tại Singapore trung tuần tháng 4 năm 2007 thì ở châu lục này căn bệnh ung thư tăng vọt trong ít năm gần đây; riêng năm 2002, 3,5 triệu ca ung thư đã được phát hiện tại các nước châu á [2] Theo ước tính của Cơ quan nghiên cứu ung thư quốc

tế thì ở Việt Nam năm 1990 có 52.700 ca ung thư mới và 37.000 người chết

do căn bệnh này [3]

Đã có nhiều tiến bộ trong việc chẩn đoán sớm và điều trị ung thư Vào

đầu thế kỷ hai mươi, ít bệnh nhân ung thư sống sót được Vào những năm

1930 dưới một trong năm bệnh nhân ung thư còn sống năm năm sau khi chẩn

đoán ra bệnh Vào những năm 1940, con số này đã đạt một trong bốn, vào những năm 1960 một trong ba, và vào khoảng 1990 là gần 50% [1]

Mặc dầu đã có nhiều liệu pháp mới được phát triển, phẫu thuật, bức xạ liệu pháp (xạ trị) và hóa liệu pháp được dùng riêng biệt hoặc trong sự phối hợp vẫn là các phương pháp điều trị ung thư có hiệu quả [1]

Các bệnh viêm và tự miễn, bao gồm cả viêm khớp dạng thấp, các bệnh

viêm ruột, đa xơ cứng, bệnh vảy nến và suyễn, đang đặt ra cho các nhà nghiên cứu phát triển thuốc chữa bệnh những thách thức to lớn Những bệnh này hiện

được điều trị bằng các thuốc chống viêm non-steroid (NSAIDs), các corticosteroit và methotrexat, các thuốc này có tác dụng hạn chế và/hoặc không

đủ an toàn [4] Một cuộc chạy đua đang diễn ra nhằm tạo ra các thế hệ mới các

đường cho sự phát hiện và phát triển các dược phẩm mới Thực vật bậc cao luôn là một trọng tâm đặc biệt quan trọng trong nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học do sự đa dạng sinh học - và vì thế sự đa dạng hoá học - của chúng

Cũng như trong lĩnh vực thuốc chống HIV, nhiều thuốc chống bệnh ung thư hiện đang được sử dụng trong liệu pháp hóa học hoặc được thu nhận một

cách trực tiếp từ các sản phẩm thiên nhiên hoặc là các chất được tổng hợp dựa trên các mẫu hợp chất thiên nhiên [1, 7, 8, 12-19] Các tác nhân chống ung thư bắt nguồn từ thiên nhiên (thực vật, vi sinh vật, sinh vật biển) cũng đang cho ta

cơ hội to lớn để đánh giá không những các lớp hợp chất hóa học chống ung thư hoàn toàn mới, mà lại còn các cơ chế tác dụng mới

Nhiều hợp chất có nguồn gốc thực vật hiện đang được sử dụng có hiệu quả trong điều trị ung thư Một trong các thí dụ đáng kể nhất là nhóm các

Vinca ancaloit được phân lập từ cây dừa cạn (Catharanthus roseus) Trong số

bốn ancaloit của cây dừa cạn thể hiện hoạt tính chống bệnh bạch cầu trên chuột chỉ có vincristin và vinblastin được sử dụng để điều trị ung thư trên người Các hợp chất này đã chứng tỏ có hiệu quả trong điều trị các bệnh bạch cầu, các u bạch huyết, và một số carcinoma Các Vinca ancaloit phá vỡ cân bằng tubulin/microtubule, do liên kết với các Vinca ancaloit mà các dime tubulin không thể tập hợp để tạo thành các microtubule

N

N

N OH

H

H3COOC H

Vincristin: R = CHO Vinblastin: R = CH 3

Một thí dụ khác về một tác nhân có hoạt tính cao có nguồn gốc thực vật

là etoposide (VP-16), chất này đã đ−a lại tỷ lệ chữa khỏi cao trong điều trị ung th− tinh hoàn khi dùng phối hợp với bleomycin (cũng là một sản phẩm thiên nhiên) và cisplatin; etoposide cũng có hoạt tính đáng kể chống lại carcinoma phổi tế bào nhỏ Etoposide là một dẫn xuất bán tổng hợp của podophyllotoxin, một chất ức chế gián phân do liên kết thuận nghịch với tubulin và ức chế việc

lắp ráp microtubule Podophyllotoxin là một thành phần của cây Podophyllum

pelatum, P emodi, và P pleianthum Etoposide ức chế enzym hết sức quan

trọng DNA topoisomerase II và, sau đó, làm tăng sự phân cắt DNA

Podophyllotoxin Etoposide (VP-16)

Chất ancaloit tự nhiên camptothecin đ−ợc phân lập từ cây Camptotheca

acuminata của Trung Quốc là một hợp chất khác đã đ−ợc liên tục biến cải cấu

trúc nhằm phát triển các tác nhân hữu ích hơn cho liệu pháp hóa học

O O

O

H3CO

OCH 3 OCH3 O

OH

O O

O

H3CO

OH OCH3 O

O O HO

HO

O O H

H3C

và bàng quang, tuy nhiên nó khó kiếm được từ thiên nhiên và kém tan trong nước Các chất thiên nhiên camptothecin và 10-hydroxy-camptothecin cũng như các dẫn xuất tổng hợp của camptothecin (9-aminocamptothecin, topotecan, và irinotecan (CPT-11)) là các tác nhân chống khối u mạnh và ức chế DNA topoisomerase I Các hợp chất topotecan và irinotecan đều là các muối amin-hydroclorua; topotecan tan trong nước nhiều gấp 100 lần so với camptothecin và được dùng để chữa ung thư buồng trứng tái phát; và irinotecan chuyển hóa thành chất phenolic có tác dụng ức chế topoisomerase I

in vivo mạnh hơn, thậm chí gấp 200-1.000 lần Irinotecan cũng thể hiện hoạt

tính chống khối u mạnh đối với ung thư buồng trứng Cả topotecan lẫn irinotecan đều có tác dụng mạnh chống ung thư ruột kết-thẳng

Topotecan Irinotecan

Các taxoit taxolđ (paclitaxel), lúc đầu được phân lập từ vỏ cây thông đỏ

Tây Thái bình dương (Taxus brevifolia), và taxoteređ (docetaxel), một chất tương tự được bán tổng hợp từ 10-deacetyl-baccatin III nhận được từ lá cây

Taxus baccata thể hiện hoạt tính mạnh trên lâm sàng đối với ung thư vú và

ung thư buồng trứng Paclitaxel có một phương thức tác dụng độc đáo, nó ức chế gián phân bằng cách đẩy mạnh sự lắp ráp các microtubule

Như vậy các Vinca ancaloit và các taxoit có thể được coi như là các thuốc tác dụng trên cùng một đích, tức là bộ máy gián phân, nhưng có các cơ chế tác dụng khác nhau và bổ sung nhau: các Vinca ancaloit ức chế sự polyme hóa tubulin thành các microtubule, trong khi các taxoit ức chế phản ứng ngược lại,

đó là sự depolyme hóa các microtubule thành tubulin hòa tan Hai họ thuốc chống gián phân này có các tính chất lâm sàng rất có giá trị và khác nhau

lá và thân cây Amoora rohituka và sau này từ cây Dysoxylum binectariferum

Cơ chế tác dụng của flavopiridol bao hàm việc cản trở sự photphoryl hóa các kinase phụ thuộc cyclin, ngăn trở sự hoạt hóa chúng và ngăn cản sự tiến triển của chu trình tế bào ở giai đoạn khối u 1 (G1) hoặc 2 (G2) Các cuộc thử lâm sàng giai đoạn I đã đạt đ−ợc các tỷ lệ đáp ứng đáng khích lệ đối với nhiều loại

u ác tính rắn và u huyết ác tính Các kết quả đó đã dẫn đến sự bắt đầu các cuộc thử lâm sàng giai đoạn II với các bệnh nhân mắc các bệnh carcinoma ruột kết-

H HO

H

H O

O

R 2

R 1 O

thẳng, tuyến tiền liệt, tế bào thận và phổi tế bào không nhỏ, cũng như u lymphô không Hodgkin và bệnh bạch cầu lymphô mạn tính

Một số tác nhân có nguồn gốc thực vật khác hiện cũng đang được nghiên

cứu Thí dụ, homoharringtonine, một ancaloit được phân lập từ cây Cephalotaxus

harringtonia của Trung Quốc, thể hiện tính hiệu quả chống nhiều bệnh bạch cầu

khác nhau Cơ chế tác dụng chủ yếu của homoharringtonine là ức chế sự tổng hợp protein, ngăn cản sự tiến triển của chu trình tế bào 4-Ipomeanol là một

dẫn xuất furan độc đối với phổi được phân lập từ củ khoai lang (Ipomoeca

batatas) bị nấm Fusarium solani hoặc Ceratocystis fimbriata làm hư hại và

đang được đánh giá trên lâm sàng về tác dụng chống ung thư đặc hiệu đối với bệnh ung thư phổi Hợp chất này chuyển hóa thành các sản phẩm chuyển hóa liên kết với DNA nhờ sự hoạt hóa chuyển hóa bởi các enzym cytochrome P450 có mặt trong các tế bào phổi β-Lapachone ((từ gỗ lõi của cây tếch,

Tectona grandis) là một chất ức chế DNA topoisomerase I gây ra sự chậm trễ

của chu trình tế bào ở giai đoạn G1 hoặc S (tổng hợp) trước khi gây ra sự chết của tế bào do chương trình hóa hoặc do hoại tử trong nhiều loại tế bào carcinoma ở người, bao gồm buồng trứng, ruột kết, phổi, tuyến tiền liệt và vú Một tác nhân mới nữa cũng đang được thử lâm sàng là combretastatin A4 phosphate (CA4-P) Combretastatin A4 là một hợp chất thiên nhiên được phân

O

O

O CH 3

N H

O

O C

lập từ cây Combretum caffrum của Nam Phi Chất này là một dẫn xuất

cis-stilben liên kết được vào cùng một vị trí liên kết của tubulin như colchicine, colchicine là một chất ức chế sự trùng hợp tubulin đã được biết đến Các nghiên cứu rộng rãi trên các khối u được cấy dưới da và ở đúng vị trí ở chuột còn cho thấy combretastatin A4 có thể ngắt sự cung cấp máu cho các khối u, làm “chết đói” khối u đang phát triển, mà vẫn duy trì dòng máu chảy bình thường ở các mô bình thường ở bên cạnh

O

O

O P ONa

O ONa

Ipomeanol Combretastatin A4-phosphate (CA4-P) β-Lapachone

Đang được thử lâm sàng còn có một số hoạt chất khác được phân lập từ các loài cây mọc ở Trung Quốc, như lycobetaine, một phenanthridinium ancaloit bậc bốn được phân lập từ một số loài cây thuộc họ Amaryllidaceae,

thí dụ từ Lycoris radiata, được xem là có tác dụng điều trị ung thư cổ, buồng

trứng và dạ dày; và indirubin là một thành phần phụ có cấu trúc bisindol với

một liên kết 3,2′ trong cây Indigo naturalis, idirubin thể hiện hiệu quả điều trị

cao trên lâm sàng ở các bệnh nhân bị bệnh bạch cầu tủy bào mạn tính

O OH

OH OH

OH OH H

OH H

CH3

H3C

O

Liên quan đến tác dụng chống và dự phòng ung thư cũng như tác dụng

chống viêm, gần đây người ta quan tâm nhiều đến nhóm các ent-kauran

ditecpenoit (thuộc phân lớp ditecpen, C20; với cấu trúc lập thể ent so với cấu trúc gốc kauran) [20-33, và 15] Các ent-kauran ditecpenoit được tìm thấy ở

nhiều loài cây thuốc được dùng điều trị chống viêm và khối u trong y học dân

gian của nhiều nước châu á, như từ chi Isodon (còn gọi là Rabdosia) Nhiều

ent-kauran ditecpenoit thể hiện hoạt tính độc hại tế bào đối với nhiều dòng tế

bào ung thư người [21-27], ức chế sự tạo mạch [28], ức chế sự hoạt hóa nhân

tố phiên mã NF-кB [29]; và nhiều hoạt tính khác như kháng vi sinh vật, chống sốt rét, chống sự kết tụ tiểu cầu, chống co thắt [30-33]

Đặc biệt từ cây Rabdosia rubescens (Hemsl.) Hara của Trung Quốc người ta đã phân lập được các ent-kauran ditecpenoit oridinin và ponicidin,

các ditecpenoit này đã được phát hiện là các hoạt chất độc hại tế bào chủ yếu

của các loài Rabdosia [15]; chúng cũng thể hiện hoạt tính chống tạo mạch

mạnh [28] Oridonin thể hiện tác dụng độc hại tế bào đối với carcinoma cổ trướng Ehrlich và bệnh bạch cầu L1210 ở chuột sau khi tiêm trong màng bụng

(i.p.) Các tỷ lệ gây chết tế bào của oridonin (15 mg/kg i.p.) ở ngày 5 và ngày 8

trong số 31 bệnh nhân (32,3%) được điều trị bằng liệu pháp hóa học đơn thuần đã đáp ứng sự điều trị, gồm 2 đáp ứng bộ phận (sự thoái triển của khối u lớn hơn 50%) và 8 đáp ứng tối thiểu ở nhóm B, 59 trong số 84 bệnh nhân (70,2%) đã đáp ứng sự điều trị, gồm 10 đáp ứng hoàn toàn (khối u thoái triển 100%), 16 đáp ứng bộ phận và 33 đáp ứng tối thiểu Tỷ lệ sống sót một năm của nhóm A là 13,6%, của nhóm B là 41,3%

Trong một cuộc thử lâm sàng khác, 650 bệnh nhân mắc bệnh carcinoma thực quản ở mức vừa và mức nặng đã được điều trị bằng sự phối hợp liệu pháp

hóa học và R rubescens hoặc R rubescens cộng các thuốc cổ truyền khác

nhau của Trung Quốc đã được cấp bằng sáng chế Bốn mươi bệnh nhân đã sống sót trên 5 năm (tỷ lệ sống sót trên 5 năm là 6,15%); 32 trên 6 năm; 23 trên 10 năm, và 5 trên 15 năm Cũng đã có thông báo là oridonin và ponicidin

đã được thử lâm sàng với bệnh nhân ung thư thực quản [15]

Thuốc chống viêm và giảm đau có nguồn gốc thực vật được biết đến

nhiều và sử dụng rộng rãi nhất là aspirin [13], chất này được coi là nguyên mẫu của các tác nhân giảm đau và chống viêm nhẹ Các thuốc chống viêm non-steroid vẫn được đánh giá so sánh với aspirin Những cố gắng nhằm biến cải hóa học phân tử aspirin đã dẫn đến sự tổng hợp và đánh giá hoạt tính chống viêm của hàng trăm chất mới Mặt khác việc tìm kiếm các thuốc chống viêm mới từ thực vật vẫn đang được tiếp tục Trong một bài tổng quan mới

đây, S Darshan và Doreswamy [34] đã nêu các bằng sáng chế được bảo vệ của các thuốc chống viêm thảo mộc có nguồn gốc từ 38 loài cây Các tác giả này đã nêu bật vai trò của các thành phần trong cây, như polysaccarit, tecpenoit, curcuminoit, ancaloit,…, đối với tác dụng làm giảm các bệnh viêm bao gồm viêm khớp, bệnh thấp, viêm nang bã,… Một vấn đề đang thu hút sự quan tâm đặc biệt của các nhà nghiên cứu phát triển thuốc là tìm kiếm các chất thiên nhiên có tác dụng ức chế nhân tố phiên mã NF-кB để phát triển làm thuốc chống viêm

1.2 Nhân tố phiên mã NF-кB và bệnh ung thư và viêm

1.2.1 Vài nét về nhân tố phiên mã NF-кB và bệnh ở người

Khởi đầu với sự phát hiện ra nó bởi Sen và Baltimore vào năm 1986 và liên tục cho đến ngày nay nhân tố phiên mã NF-кB đã thu hút sự quan tâm rộng rãi căn cứ vào sự điều chỉnh khác thường của nó, sự đa dạng của các tác nhân kích thích làm cho nó hoạt động, các gen và đáp ứng sinh học khác nhau mà

nó điều chỉnh, và sự dính líu hiển nhiên của nó tới nhiều thứ bệnh khác nhau ở người [35-37]

Nhân tố phiên mã NF-кB điều chỉnh nhiều quá trình sinh lý quan trọng, bao gồm các quá trình phát triển, các đáp ứng viêm và miễn dịch, sự tăng trưởng của tế bào, ung thư, sự chết được chương trình hóa của tế bào (apoptosis), và sự biểu hiện của một vài gen virút Bởi vậy NF-кB cũng là đích của nhiều thuốc chống ung thư và chống viêm

Các nhân tố phiên mã NF-кB là một trong các nhóm protein điều chỉnh gen thuộc nhân chuẩn được nghiên cứu nhiều nhất ở các động vật có xương sống, NF-кB đang hoạt động có thể là bất cứ dime nào trong số nhiều homo-

và heterodime được tạo thành bởi các tiểu đơn vị p50, p52, RelA (p65), RelB

và c-Rel Trong các điều kiện cơ bản, NF-кB được giữ ở trong chất tế bào, trong một trạng thái không hoạt động, bởi một protein để kiềm chế có liên quan được gọi là chất ức chế (I)кB (Inhibitor of кB; quan trọng nhất trong số các Inhibitor of кB có thể là các protein IкBα, IкBβ, và IкBε) IкB chắn cản các chuỗi di chuyển vào nhân của NF-кB và giữ NF-кB ở trong chất tế bào Một trong những cơ chế phổ biến nhất dẫn đến sự hoạt hóa NF-кB đòi hỏi

sự photphoryl hóa nhanh IкB (cụ thể là ở serine-32 và -36 của IкBα) để đáp lại các tác nhân kích thích khác nhau, thí dụ các tác nhân kích thích gây viêm (xem Mục 1.2.3) IкB được photphoryl hóa lan tỏa rộng nhanh chóng, và rồi

Sự thoái biến IкB gỡ bỏ sự chắn cản các chuỗi di chuyển vào nhân của

NF-кB, vì vậy để cho NF-кB đi vào nhân để điều khiển sự phiên mã các gen mục tiêu

Các cơ chế làm mất hoạt tính của NF-кB sau khi có đã được hoạt hóa bởi một sự kích thích gây viêm chẳng hạn, như vậy phục vụ như các “cái hãm” phân tử đối với sự hoạt hóa NF-кB đang tiến triển, đã được mô tả tương đối rõ Một trong các cơ chế làm mất hoạt tính của NF-кB được biết rõ nhất có sự tham gia của IкBα Vùng khởi đầu của gen IкBα bao gồm ba vị trí liên kết NF-кB Vì thế khi NF-кB được hoạt hóa thì nó không chỉ kích thích sự biểu

hiện của các gen gây viêm, mà còn kích thích mới sự biểu hiện của chất ức

chế chính nó, IкBα Rồi thì IкBα được tổng hợp mới lại có thể làm suy giảm

sự hoạt hóa NF-кB đang tiến triển bằng cách lại chắn cản các chuỗi di chuyển vào nhân của NF-кB Thêm vào đó IкBα được tổng hợp mới đi vào nhân để liên kết NF-кB được hoạt hóa và rồi có thể đưa NF-кB trở lại chất tế bào dể chấm dứt sự phiên mã phụ thuộc vào NF-кB

Mặc dù IкBα đóng vai trò trung tâm trong sự hoạt hóa và làm mất hoạt tính của NF-кB, bước hạn chế tốc độ trong sự hoạt hóa NF-кB xem ra nằm ở hoạt tính của IкB kinase (IKK) được định rõ đặc điểm cách đây không lâu IKK gồm bởi ba tiểu đơn vị; các tiểu đơn vị có tác dụng xúc tác IKKα và IKKβ và một tiểu đơn vị để điều chỉnh IKKγ Hiện nay IKK được thừa nhận là kinase quan trọng nhất, sự hoạt hóa IKK khởi đầu sự photphoryl hóa IкB một cách đặc hiệu ở các gốc serine có đầu cuối NH2, dẫn đến sự thoái biến IкB và tiếp đó là sự hoạt hóa NF-кB

Nói tóm lại, sự hoạt hóa NF-кB được điều chỉnh một cách tinh vi ở nhiều mức độ (Hình 1.1)

Hình 1.1: Các cơ chế phân tử của sự hoạt hóa NF-кB

1.2.2 Nhân tố phiên mã NF-кB và bệnh ung th−

Các protein NF-кB là một đích đầy triển vọng cho các liệu pháp chống ung th− mới [38-50] Ung th− là một sự rối loạn tăng sinh cao (hyperproliferative disorder), trong đó sự xâm nhập (invasion) và sự tạo mạch (angiogenesis) dẫn đến sự di căn khối u (tumor metastasis) Nhiều gen dàn xếp sự tạo u và di căn đ−ợc điều chỉnh bởi nhân tố phiên mã NF-кB

• NF-кB đ−ợc hoạt hóa bởi các chất gây ung th− và các chất xúc tiến khối u Nhiều công trình nghiên cứu gần đây cho thấy NF-кB đ−ợc hoạt hóa bởi các chất gây ung th− và các chất xúc tiến khối u khác nhau, thí dụ

được chứng minh là gây ra các phản ứng sạm nắng (sưng tấy, sự thâm nhiễm bạch cầu, sự tăng sản biểu bì, và sự tích tụ các cytokin gây viêm) dẫn đến ung thư da, và sự ức chế NF-кB hạn chế sự hư hại gây ra bởi sự sạm nắng

• NF-кB là cần thiết cho sự sống sót của tế bào và sự tăng sinh của tế bào Các công trình nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự hoạt hóa NF-кB xúc tiến sự sống sót của tế bào và sự điều chỉnh xuống của NF-кB làm cho tế bào mẫn cảm với sự chết được chương trình hóa (apoptosis) được gây ra bởi các cytokin

và các tác nhân điều trị hóa học Các công trình nghiên cứu cũng cho thấy sự biểu hiện của NF-кB được hoạt hóa xúc tiến sự tăng sinh của tế bào và sự ức chế NF-кB dẫn đến thủ tiêu sự tăng sinh

• NF-кB điều chỉnh các gen tham gia vào sự xâm nhập và sự tạo mạch của tế bào khối u

Sự xâm nhập và sự tạo mạch là các sự kiện quyết định đối với sự di căn Các công trình nghiên cứu đã chứng minh là nhiều gen khác nhau tham gia vào sự xâm nhập và sự tạo mạch được điều chỉnh bởi NF-кB Chúng bao gồm các phân tử dính bám tế bào (ICAM-1, VCAM-1, ELAM-1), COX-2,

iNOS, uPA, MMP-9, MMP-2, VEGF, các chemokin, và các cytokin viêm Vì

vậy sự ngăn chặn hoạt hóa NF-кB sẽ có thể triệt tiêu sự biểu hiện của các gen này, do đó, ngăn cản sự di căn khối u

• NF-кB được biểu hiện một cách cơ định trong các tế bào khối u

Trong khi từ những điều miêu tả ở trên có thể thấy rõ NF-кB là cần thiết cho sự tăng sinh, sự xâm nhập và sự tạo mạch của tế bào ung thư thì người ta

đã phát hiện được là nhiều loại tế bào ung thư khác nhau, bao gồm các dòng tế bào bệnh bạch cầu, u lympho, u tủy, u mêlanin, các loại ung thư tuyến tiền liệt, ruột kết, vú, tuyến tụy, carcinoma có vảy ở đầu và cổ , đã biểu hiện dạng hoạt động của NF-кB một cách cơ định Một số công trình nghiên cứu còn đã chứng minh được rằng các mẫu nhận được từ các bệnh nhân ung thư cũng biểu

lộ NF-кB cơ định Người ta cũng đã chứng minh được rằng sự biểu hiện cơ

định của TNF và IL-1 là nguyên nhân dẫn đến sự biểu hiện của dạng hoạt

động của NF-кB ở u lympho da tế bào T (do TNF) và bệnh bạch huyết cấp tính ở tủy xương (do IL-1) Sự kìm hãm việc sản xuất TNF và IL-1 đã được chứng minh là có tác dụng điều chỉnh xuống sự biểu hiện của NF-кB hoạt

động, và việc này có tương quan với sự sự ức chế tăng sinh của các tế bào ung thư này

• Sự hoạt hóa NF-кB bị ức chế bởi các tác nhân dự phòng hóa học

Nhiều thí nghiệm đã được phát triển nhằm xác định khả năng dự phòng hóa học (chemopreventive) của một tác nhân Đa số tác nhân có tác dụng dự phòng hóa học ức chế sự hoạt hóa NF-кB Các tác nhân này là curcumin (từ

củ nghệ, Curcuma longa ), resveratrol (từ quả nho, có trong rượu vang đỏ), emodin (có trong loài lô hội Aloe barbadensis; và trong cốt khí củ,

Polygonum cuspidatum), các polyphenol của chè xanh (từ lá chè, Camellia sinensis), silymarin (từ quả cây cúc gai, Silybum marianum), β-lapachone (từ

gỗ lõi của cây tếch, Tectona grandis),… Vì NF-кB điều chỉnh sự biểu hiện

của rất nhiều gen tham gia vào sự gây ung thư nên sự ức chế biểu hiện của các gen này thông qua việc ức chế sự hoạt hóa NF-кB có thể là một trong các cơ chế mà các tác nhân dự phòng hóa học (chemopreventive agents) phát huy tác dụng của chúng

• NF-кB được hoạt hóa bởi các tác nhân điều trị hóa học đã dẫn đến sự đề kháng hóa chất

Người ta đã phát hiện ra rằng hầu hết các tác nhân điều trị hóa học (chemotherapeutic agents) hoạt hóa NF-кB Các tác nhân này là taxol, doxorubicin, daunorubicin, etoposide, vincristin, vinblastin, ara-C, cisplatin, phenobarbital, tamoxifen, camptothecin,….Ngay cả sự bức xạ gamma, thuờng dùng điều trị bệnh nhân ung thư, cũng được thấy hoạt hóa NF-кB Sự

hoạt hóa NF-кB có thể dẫn đến sự chống lại sự chết được chương trình hóa của các tế bào (apoptosis) thường được gây ra bởi sự trị liệu hóa học hoặc bởi

sự bức xạ Như thế trong khi hoạt hóa apoptosis, cũng tác nhân ấy lại có thể hoạt hóa NF-кB, và điều này có thể dẫn đến antiapoptosis

• Sự ức chế NF-кB làm cho các tế bào ung thư mẫn cảm với các tác nhân

điều trị hóa học và sự bức xạ ion hóa

Hầu hết các tác nhân điều trị hóa học và sự bức xạ ion hóa gây ra apoptosis thông qua nhiều con đường khác nhau Chúng cũng hoạt hóa antiapoptosis thông qua sự hoạt hóa NF-кB, điều này rút cục dẫn đến sự đề kháng của các tế bào khối u đối với sự điều trị Vì như đã biết hầu hết các tác nhân dự phòng hóa học ức chế sự hoạt hóa NF-кB, nên các tác nhân điều trị hóa học và sự bức xạ gamma nên được sử dụng trong sự phối hợp với các tác nhân dự phòng hóa học trong việc điều trị ung thư Ngoài việc ngăn cản sự hoạt hóa NF-кB, các tác nhân dự phòng hóa học như curcumin và resveratrol cũng được biết là

có tác dụng gây ra apoptosis Như vậy không giống như các tác nhân điều trị

hóa học, các tác nhân dự phòng hóa học gây ra apoptosis mà không hoạt hóa con đường antiapoptosis Vì hầu hết các tác nhân dự phòng hóa học là các

sản phẩm có nguồn gốc thiên nhiên từ thực vật, nên độc tính của chúng thường rất thấp Điều này cung cấp thêm một lý do căn bản cho việc điều trị phối hợp

Các bằng chứng được giới thiệu ở trên cho thấy sự hoạt hóa NF-кB có thể dẫn đến sự tăng sinh của tế bào khối u, sự xâm nhập, sự tạo mạch, và sự di căn Như vậy sự ức chế NF-кB trong các tế bào ung thư có thể cung cấp thêm một đích cho việc ngăn ngừa, dự phòng ung thư Các chất ức chế NF-кB , trong số đó có nhiều sản phẩm có nguồn gốc thiên nhiên từ thực vật, cũng có thể được xem xét để sử dụng cho điều trị ung thư, có thể là trong sự phối hợp với các tác nhân điều trị hóa học hay sự bức xạ gamma Việc sử dụng phối

hợp các tác nhân điều trị hóa học (chemotherapeutic agents) với các tác nhân

dự phòng hóa học (chemopreventive agents) có thể là một phương thức hợp lý trong điều trị bệnh ung thư

1.2.3 Nhân tố NF-кB và viêm

ý kiến cho rằng có mối liên kết gần gũi giữa viêm và sự gây ung thư đã có

từ lâu Chẳng hạn, các tác nhân có tính chất chống viêm, như các thuốc chống viêm non-steroid, bao gồm aspirin, piroxicam và indomethacin có thể có tác dụng dự phòng hóa học chống ung thư Một số công trình nghiên cứu trên người đã cho thấy việc sử dụng đều đặn aspirin làm giảm nguy cơ ung thư ruột

kết-thẳng tới khoảng 50% Cả hai mô hình in vitro và in vivo đều gợi ra rằng

các thuốc chống viêm non-steroid ức chế các khối u ruột kết thông qua sự cảm ứng apoptosis, tức sự chết được chương trình hóa của các tế bào [46]

Vai trò then chốt của NF-кB trong viêm đã được chứng minh thông qua nhiều nghiên cứu thực nghiệm [44, 51-58] Các kết quả nghiên cứu này đã cho thấy NF-кB được hoạt hóa bởi một số tín hiệu và điều chỉnh nhiều gen liên quan tới phản ứng viêm Thật vậy, như đã nói đến ở Mục 1.2.1, một số các tác nhân kích thích gây viêm (các cytokin như TNF-α hoặc IL-1, stress oxi hóa, các tác nhân truyền nhiễm, các endotoxin) có thể hoạt hóa NF-кB trong một

số các loại tế bào khác nhau (xem Hình 1.2) NF-кB ở dạng hoạt động có thể lần lượt hoạt hóa sự biểu hiện của nhiều trung gian viêm: các cytokin (TNF-

α, IL-1, ΙL-6), các chemokin (RANTES, IL-8), các enzym gây viêm (iNOS, COX-2, các lipoxygenase) và các phân tử dính bám (ICAM-1,…) Mặt khác các cytokin được tổng hợp này lại có thể trực tiếp hoạt hóa NF-кB, và như vậy thiết lập một vòng tự điều chỉnh theo chiều dương có thể khuếch đại sự đáp ứng viêm và kéo dài khoảng thời gian viêm mạn tính

Gần đây hơn, sự hoạt hóa NF-кB đã được quan sát thấy ở các mô hình

động vật cũng như ở các bệnh viêm ở người Chẳng hạn sự hoạt hóa liên tục

NF-кB đã được chứng minh trong vi tế bào thần kinh đệm của chuột bị mắc viêm não tủy thực nghiệm, trong các tổn thương vữa xơ động mạch, trong mô hoạt dịch từ các động vật hoặc bệnh nhân bị viêm đa khớp dạng thấp và trong hen Các thông tin đã thu thập được này đã thiết lập sự liên quan về mặt lâm sàng của sự hoạt hóa NF-кB trong các tổn thương viêm

Nhiều thuốc chống viêm khác nhau, bao gồm các chất chống oxi hóa, các glucocorticoit, các thuốc chống viêm non-steroid (NSAIDs), các chất ức chế

miễn dịch và các hợp chất thực vật là các chất ức chế con đường NF-кB, gợi

ra rằng sự ức chế NF-кB là một phần quan trọng của hoạt tính chống viêm của chúng Liệu pháp chống NF-кB cung cấp các biện pháp ức chế đồng thời sự biểu hiện nhiều chất trung gian viêm, bao gồm TNF-α và IL-1, có thể là một bước phát triển mới trong điều trị các bệnh viêm

Hình 1.2: Vai trò trung tâm của NF-кB trong viêm

1.3 Nghiên cứu cây khổ sâm Bắc Bộ (Croton tonkinensis Gagnep.,

Euphorbiaceae)

Cây khổ sâm Bắc Bộ mà chúng tôi dùng để chiết tách các hoạt chất

ent-kauran ditecpenoit mọc hoang và được trồng khắp nơi ở các tỉnh phía Bắc nước ta Cây dễ trồng và sau một thời gian ngắn đã có thể thu hái lấy nguyên liệu Một ưu điểm nữa là cây khổ sâm Bắc Bộ đã được dùng phổ biến trong y học dân gian của Việt Nam và theo kinh nghiệm dân gian thì không độc [59-

61]

Ta dùng lá khô của cây khổ sâm Bắc Bộ Theo GS Đỗ Tất Lợi [50], cây này được chú ý do lá của nó được dùng trong đơn thuốc đau dạ dày Lá khổ sâm Bắc Bộ còn dùng chữa ung nhọt, lở loét, viêm mũi, viêm loét dạ dày - tá tràng, lỵ, đau bụng, tiêu hóa kém Theo TS Võ Văn Chi [61], lá khổ sâm Bắc

Bộ thường dùng sắc với dây ngấy hương uống thay trà để chữa đau bụng lâm râm hay sau khi ăn đau bụng khó tiêu

Cho đến nay, nghiên cứu cây khổ sâm Bắc Bộ chỉ được tiến hành bởi các

nhà khoa học Việt Nam

GS Vũ Thị Phan, Viện Sốt rét, Ký sinh trùng và Côn trùng, đã sưu tầm

được một bài thuốc dân gian chữa sốt rét ở Thanh Hóa gồm hai vị: lá khổ

sâm Bắc Bộ (200 g), vỏ bưởi đào (200 g), nước (600 ml), sắc còn 200 ml,

chia làm hai lần uống trong ngày Vũ Thị Phan, Đào Bội Hoàn, Vũ Thu Tuyết, Trương Văn Như, xuất phát từ bài thuốc này đã sử dụng lá khổ sâm Bắc Bộ dưới dạng thuốc sắc hoặc siro để điều trị 55 bệnh nhân sốt rét gây

ra bởi Plasmodium falciparum và Plasmodium vivax Thuốc thể hiện rõ rệt

tác dụng ức chế ký sinh trùng sốt rét và hạ sốt và không thấy những biểu hiện độc tính, tuy nhiên so với các thuốc tổng hợp thì tác dụng còn thấp và

lượng thuốc dùng còn nhiều [62] Theo TS Trương Văn Như và cộng sự [63, 64], hoạt chất của lá khổ sâm Bắc Bộ chủ yếu thuộc các lớp flavonoit

và ancaloit, trong số đó ancaloit toàn phần có tác dụng trên ký sinh trùng

sốt rét, còn nhóm flavonoit có tác dụng kháng khuẩn

Trong khuôn khổ một kế hoạch nghiên cứu dài hạn, chúng tôi (Phan Tống Sơn và cộng sự) đã đi sâu nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học

của cây khổ sâm Bắc Bộ theo cách định hướng bởi các xét nghiệm hoạt tính sinh học (bioactivity-guided) [65-81], với sự quan tâm trước hết đến các thành

phần tecpenoit của cây này Cho đến các công trình nghiên cứu của chúng tôi

đã không có một công bố nào về các hợp chất tecpenoit của cây khổ sâm Bắc

Bộ Năm 1999 chúng tôi đã công bố kết quả lần đầu tiên phân lập được một

hợp chất ent-kauran ditecpenoit mới từ lá cây khổ sâm Bắc Bộ và xác định

được cấu trúc hóa học của nó là ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl

axetat (1) [65, 66], chất 1 này là hợp chất ent-kauran ditecpenoit chủ yếu có

hàm lượng cao nhất và hoạt tính sinh học mạnh nhất của cây Kết quả xác

định cấu trúc của hợp chất gốc 1 của chúng tôi là rất có ý nghĩa đối với việc

giải cấu trúc các ent-kauran có cấu trúc tương tự khác của cây này

sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum in vitro rõ rệt đối với cả chủng nhạy

lẫn chủng kháng chloroquine [65, 68, 69] (nơi thử: Viện Sốt rét, Ký sinh trùng

và Côn trùng) Đặc biệt chất 1 có hoạt tính độc hại tế bào mạnh đối với các

dòng tế bào ung thư người Hep-G2 (ung thư gan, IC50 4,06 àg/ml), RD (ung thư màng tim, IC50 1,04 àg/ml), Fl (ung thư màng tử cung, IC50 2,90 àg/ml);

và khỉ VR (tiền ung thư thận khỉ, IC50 1,10 àg/ml [69] (nơi thử: Phòng Thử nghiệm hoạt tính sinh học, Viện Hoá học các Hợp chất thiên nhiên, Viện

Khoa học và Công nghệ Việt Nam) Thêm vào đó chất 1 còn có hoạt tính

kháng khuẩn, kháng nấm in vitro rõ rệt đối với Bacillus subtilis, Aspergillus

niger, Fusarium oxysporum và Candida albicans [69] (nơi thử: Phòng thử

nghiệm hoạt tính sinh học, Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam)

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng đã cho thấy các thành phần của

cây khổ sâm Bắc Bộ có thể phân thành hai lớp chủ yếu: các ent-kauran

ditecpenoit và các flavonoit glucozit (vitexin, isovitexin và tiliroside); ngoài ra còn có một số hợp chất steroit (β-sitosterol, stigmasterol) và ankyl ancol mạch

dài (n-nonacosan-2-ol, n-triacontan-1-ol), các chất này cũng nằm trong phân

đoạn lipoit cùng với các ditecpenoit Thành phần các ent-kauran ditecpenoit

của cây khổ sâm Bắc Bộ khá phong phú Tổng cộng chúng tôi đã phân lập và

xác định được cấu trúc hóa học 18 ent-kauran ditecpenoit từ cây này, trong số

đó có 13 hợp chất mới [65, 66, 70, 71, 77, 79, 80] Chỉ tính riêng các hợp chất

ent-kaur-16-en-15-one là các chất mang cấu trúc α-metylenxiclopentanon có

thể dẫn đến hoạt tính thì cho đến nay chúng tôi đã công bố kết quả lần đầu tiên phân lập và xác định được cấu trúc 13 hợp chất từ cây khổ sâm Bắc Bộ,

trong số đó có 9 hợp chất mới ở trang 23 có nêu công thức của 7 hợp chất

ent-kaur-16-en-15-one có hàm lượng tương đối cao trong lá cây khổ sâm Bắc

Bộ, trong số đó có 6 hợp chất mới là các chất 1 (hoạt chất chủ yếu), 2, 3, 5,

6 và 7 Các khảo sát nhờ phương pháp Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

được thực hiện với phần chiết metanol của lá khổ sâm Bắc Bộ và các chất phân lập được đã khẳng định nguồn gốc tự nhiên của các chất này

Đặc biệt các ent-kauran ditecpenoit mới mà chúng tôi phân lập được từ

cây khổ sâm Bắc Bộ có cấu trúc hóa học tương tự oridonin và ponicidin là các chất đã thể hiện tác dụng chống khối u mạnh (xem Phần tổng quan ở trên)

Các kết quả thử hoạt tính ức chế sự phát triển của tế bào ung thư với

ent-kauran ditecpenoit từ cây khổ sâm Bắc Bộ như nêu ở trên đã là một đóng góp tích cực vào việc sàng lọc hoạt chất của cây này Tuy nhiên nhằm tạo lập cơ sở

khoa học cho việc xác định triển vọng ứng dụng các ent-kauran ditecpenoit

phân lập được từ cây khổ sâm Bắc Bộ vào điều trị viêm và ung thư, chúng tôi

đã tiến hành thử hoạt tính của chúng bằng hai phương pháp đáng tin cậy và hiện đại: xác định tác dụng ức chế nhân tố phiên mã NF-κB và tác dụng ức

chế enzym nitric oxide synthase (iNOS) [71]; kết quả được nêu ở Bảng 2.1

dưới đây

Bảng 1.1: Các giá trị IC50 (àM) của các ent-kauran ditecpenoit 1-4

trong các thử nghiệm hoạt hóa NF-κB và sản sinh NO

Như vậy các ent-kauran ditecpenoit của cây khổ sâm có tác dụng ức chế

sự hoạt hóa NF-κB mạnh hơn rất nhiều so với chất đối chứng Parthenolide,

mà không có ảnh hưởng tới khả năng sống được của tế bào ở nồng độ tác dụng trong các thử nghiệm MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-

diphenyltetrazolium bromide] trên cơ sở của phép so màu [71] Các kauran ditecpenoit của cây khổ sâm cũng ức chế iNOS mạnh hơn hàng chục

ent-lần so với aminoguanidine làm đối chứng

Xuất phát từ những kết quả nghiên cứu được nêu tóm tắt ở trên, năm

2003 chúng tôi đã đề xuất Đề tài Nghiên cứu cấp Nhà nước này, và năm 2004 chúng tôi đã đề xuất lại Trong cả hai lần đề xuất của chúng tôi đều được chấp nhận, dẫn đến việc Bộ Khoa học và Công nghệ đã xét duyệt cho thực hiện Đề tài Nghiên cứu Khoa học và Công nghệ độc lập cấp Nhà nước này

Sau chúng tôi, Phạm Hoàng Ngọc và Phạm Thị Hồng Minh cũng đã

nghiên cứu cây khổ sâm Bắc Bộ và đã chiết tách được một vài dẫn xuất

ent-kauran có hoạt tính [82, và các tài liệu dẫn ở đó], tuy nhiên những chất này

nằm trong số các ent-kauran ditecpenoit có hoạt tính sinh học mà chúng tôi đã

phân lập được từ cây này và đã xác định được cấu trúc cũng như khảo sát hoạt

tính của chúng và đã công bố trước đó (xin xem các bài báo 65, 66, 69, 70,

71, 77, 79, 80] của chúng tôi trong Phần Tài liệu tham khảo)

Tài liệu tham khảo

1 Pratt, W B.; Ruddon, R W ; Ensminger, W D.; Maybaum, J., The anticancer drugs, Second Edition, Oxford University Press, New York – Oxford (1994)

2 Ngọc Nhân, Toàn cảnh đại dịch ung thư toàn cầu, Thế giới mới, 2007, Số

733, tr 36-40

3 Pham Thi Hoang Anh and Nguyen Ba Duc, The Situation with Cancer

Control in Vietnam, Jpn J Clin Oncol, 2002, 32 (Supplement 1), 92-97

4 Lewis, A J and Manning, A M., New targets for anti-inflammatory

drugs, Current Opinion in Chemical Biology, 1999, 3, 489-494

5 Hamburger, M and Hostettmann K., Bioactivity in Plants: The Link

between Phytochemistry and Medicine, Phytochemistry, 1991, 30(12),

3864-3874

6 Clark, A M., Natural Products as a Resource for New Drugs,

Pharmaceutical Research, 1996, 13(8), 1133-1141

7 Newman, D J.; Cragg, G M.; and Snader, K M., Natural Products as

Sources of New Drugs over the Period 1981-2002, J Nat Prod., 2003, 66,

1022-1037

8 Lee, K.-H., Current Developments in the Discovery and Design of New

Drug Candidates from Plant Natural Products Leads, J Nat Prod., 2004,

Spices and Other Natural Products, 2000, 18-23 November, Dhaka,

Bangladesh

10 Grabley, S and Sattler, I., Natural products for lead identification: Nature

is a valuable resource for providing tools, in Modern Methods of Drug Discovery (ed by Hillisch, A and Hilgenfeld, R.), 87-107, Birkhäuser Verlag, Switzerland (2003)

11 Cordell, G A., Plants in Drug Discovery – Creating a New Vision, in Novel Compounds from Natural Products in the New Millennium Potential and Challenges (ed by Tan, B K.-H.; Bay, B.-H.; Zhu, Y.-Z.), World Scientific Publishing, New Jersey (2004)

12 Yang, S S.; Cragg, G M.; Newman, D J.; and Bader, J P., Natural Product-Based Anti-HIV Drug Discovery and Development Facilitated by

the NCI Developmental Therapeutics Program, J Nat Prod., 2001, 64,

265-277

13 Rocha, A B.; Lopes, R M and Schwartsmann, G., Natural products in

anticancer therapy, Current Opinion in Pharmacology, 2001, 1, 364-369

14 Adams, J and Elliott, P J., New agents in cancer clinical trials, Oncogene,

2000, 19, 6687-6692

15 Tang, W.; Hemm, I.; Bertram, B., Recent Development of Antitumor Agents from Chinese Herbal Medicines; Part I Low Molecular

Compounds, Planta Med, 2003, 69, 97-108

16 Wong, R.; Sagar, C M and Sagar, S M., Integration of Chinese medicine

into supportive cancer care: A modern role for an ancient tradition, Cancer

Treatment Reviews, 2001, 27, 235-246

17 Lee, K.-H., Novel Antitumor Agents from Higher Plants, in Antitumor Agents 197, pp 569-596, John Wiley & Sons, Inc (1999)

18 Miller, M L.; Ojima, I., Chemistry and Chemical Biology of Taxane

Anticancer Agents, The Chemical Record, 2001, 1, 195-211

19 Oberlies, N H and Kroll, D J., Camptothecin and Taxol: Historic

Achievements in Natural Products Research, J Nat Prod., 2004, 67,

129-135

20 Takeda, Y.; Otsuka, H., in “Studies in Natural Products Chemistry”, Vol

15, ed by Atta-ur-Rahman, 111-185, Elsevier, Amsterdam (1995)

21 Zhang, H.; Fan, Z.; Tan, G T.; Chai, H.-B.; Pezzuto, J M.; Sun, H.; and

Fong, H H S., Pseudoirroratin A, a New Cytotoxic ent-Kaurene Diterpene

from Isodon pseudo-irrorata, J Nat Prod., 2002, 65, 215-217

22 Jiang, B.; Yang, H.; Li, M.-L.; Hou, A.-J.; Han, Q.-B.; Wang, J., Li,

S.-H., and Sun, H.-D., Diterpenoids from Isodon adenantha, J Nat Prod.,

2002, 65, 1111-1116

23 Niu, X.-M.; Li, S.-H.; Mei, S.-X.; Na, Z., Zhao, Q.-S.; Lin, Z.-W.; and Sun,

H.-D., Cytotoxic 3,20-Epoxy-ent-Kaurane Diterpenoids from Isodon

eriocalyx var laxiflora, J Nat Prod., 2002, 65, 1892-1896

24 Niu, X.-M.; Li, H.; Li, M L.; Zhao, Q.-S.; Mei, X.; Na, Z.; Wang,

S.-J.; Lin, Z.-W.; Sun, H.-D., Cytotoxic ent-Kaurane Diterpenoids from

Isodon eriocalyx var laxiflora, Planta Med, 2002, 68, 528-533

25 Jiang, B.; Hou, A.-J.; Li, M.-L.; Li, S.-H.; Han, Q.-B.; Wang, S.-J.; Lin,

Z.-W.; Sun, H.-D., Cytotoxic ent-Kaurane Diterpenoids from Isodon

sculponeata, Planta Med, 2002, 68, 921-925

26 Li, S.-H.; Niu, X.-M.; Peng, L.-Y.; Zhang, H.-J.; Yao, P.; Sun, H.-D., Kaurane Diterpenoids from the Leaves of Isodon xerophilus, Planta Med,

ent-2002, 68, 946-948

27 Han, Q.-B.; Zhao, A.-H.; Zhang, J.-X.; Lu, Y.; Zhang, L.-L.; Zheng, Q.-T.;

and Sun, H.-D., Cytotoxic Constituents of Isodon rubescens var lushiensis,

J Nat Prod., 2003, 66, 1391-1394

28 Meade-Tollin, L C.; Wijeratne, E M K.; Cooper, D.; Guild, M.; Jon, E,; Fritz, A.; Zhou, G.-X.; Whitesell, L.; Liang, J.; and Gunatilaka, A A L., Ponicidin and Oridonin Are Responsible for the Antiangiogenic Activity of

Rabdosia rubescens, a Constituent of the Herbal Supplement PC SPES, J

Nat Prod., 2004, 67, 2-4

29 Lee, J.-H.; Koo, T H.; Hwang, B Y.; and Lee, J J., Kaurane Diterpene, Kamebakaurin, Inhibits NF-кB by Directly Targeting the DNA-binding Activity of p50 and Blocks the Expression of Antiapoptotic NF-кB Target

Genes, The Journal of Biological Chemistry, 2002, 277(21), 18411-18420

30 Wilkens, M.; Alarcon, C.; Urzua, A.; Mendoza, L., Characterization of the

Bactericidal Activity of the Natural Diterpene Kaurenoic Acid, Planta

32 Yang, Y.-L.; Chang, F.-R.; Wu, C.-C.; Wang, W.-Y.; and Wu, Y.-C., New

ent-Kaurane Diterpenoids with Anti-Platelet Aggregation Activity from

Annona squamosa, J Nat Prod., 2002, 65, 1462-1467

33 Zamilpa, A.; Tortoriello, J.; Navarro, V.; Delgado, G.; Alvarez, L.,

Antispasmodic and Antimicrobial Diterpenic Acids from Viguiera

hypargyra Roots, Planta Med, 2002, 68, 281-283

34 Darshan, S and Doreswamy, R., Patented Antiinflammatory Plant Drug

Development from Traditional Medicine, Phytother Res., 2004, 18,

343-357

35 Baldwin, A S., Jr., The transcription factor NF-кB and human disease, The

Journal of Clinical Investigation, 2001, 107(1), 3-6

36 Zingarelli, B.; Sheehan, M.; Wong, H R., Nuclear factor-кB as a

therapeutic target in critical care medicine, Crit Care Med, 2003, 31(1,

Suppl.), S105-S111

37 Epinat, J.-C and Gilmore, T D., Diverse agents act at multiple levels to

inhibit the Rel/NF-кB signal transduction pathway, Oncogene, 1999, 18,

6896-6909

38 Bharti, A C.; Aggarwal, B B., Nuclear factor-kappa B and cancer: its role

in prevention and therapy, Biochemical Pharmacology, 2002, 64, 883-888

39 Schwartz, S A.; Hernandez, A.; Evers, B M., The role of NF-кB/IкB

proteins in cancer: implications for novel treatment strategies, Surgical

Oncology, 1999, 8, 143-153

40 Baldwin, A S., Control of oncogenesis and cancer therapy resistance by

the transcription factor NF-кB, The Journal of Clinical Investigation, 2001,

107(3), 241-246

41 Gilmore, T.; Gapuzan M.-E.; Kalaitzidis, D., Starczynowski, D., кB/IкB signal transduction in the generation and treatment of human

Rel/NF-cancer, Cancer Letters, 2002, 181, 1-9

42 Subbaramaiah, K and Dannenberg, A J., Cyclooxygenase 2: a molecular

target for cancer prevention and treatment, TRENDS in Pharmacological

Sciences, 2003, 24(2), 96-102

1 Yamamoto, Y and Gaynor, R B., Therapeutic potential of inhibition of the

NF-кB pathway in the treatment of inflammation and cancer, The Journal

4 Tamini, R M.; Lagiou, P.; Adami, H.-O and Trichopoulos, D., Prospects

for chemoprevention of cancer, Journal of Internal Medicine, 2002, 251,

286-300

5 Surh, Y.-J., Molecular mechanims of chemopreventive effects of selected

dietary and medicinal phenolic substances, Mutation Research, 1999, 428,

8 Fujiki, H.; Suganuma, M.; Imai, K.; Nakachi, K., Green tea: cancer

preventive beverage and/or drug, Cancer Letters, 2002, 188, 9-13

9 Tak, P P and Firestein, G S., NF-кB: a key role in inflammatory diseases,

The Journal of Clinical Investigation, 2001, 107(1), 7-11

10 Makarov, S S., NF-кB as a therapeutic target in chronic inflammation:

11 Surh, Y -J.; Chun, K -S.; Cha, H -H.; Han, S S.; Keum, Y -S.; Park, K K.; Lee, S S., Molecular mechanisms underlying chemopreventive activities of anti-inflammatory phytochemicals: down-regulation of COX-2

and iNOS through suppression of NF-кB activation, Mutation Research,

2001, 480-481, 243-268

12 Roshak, A K., Callahan, J F and Blake, S M., Small-molecule inhibitors

of NF-кB for the treatment of inflammatory joint disease, Current opinion

in Pharmacology, 2002, 2, 316-321

13 Lewis, A J and Manning, A M., New targets for anti-inflammatory

drugs, Current opinion in Chemical Biology, 1999, 3, 489-494

14 Xagorari, A.; Papapetropoulos, A.; Mauromatis, A.; Economou, M.; Fotsis, T.; and Roussos, C., Luteolin Inhibits an Endotoxin-Stimulated Phosphorylation Cascade and Proinflammatory Cytokine Production in

Macrophages, The Journal of Pharmacology and Experimental

Therapeutics, 2001, 296, 181-187

15 Castro, V.; Rüngeler, P.; Murillo, R.; Hernandez, E.; Mora, G.; Pahl, H L.;

Merfort, I., Study of sesquiterpene lactones from Milleria quinqueflora on

their anti-inflammatory activity using the transcription factor NF-кB as

molecular target, Phytochemistry, 2000, 53, 257-263

16 Surh, Y -J., Anti-tumor promoting potential of selected spice ingredients

with antioxidative and anti-inflammatory activities: a short review, Food

and Chemical Toxicology, 2002, 40, 1091-1097

17 Bé Y tÕ, D−îc liÖu ViÖt Nam, Nhµ XuÊt b¶n Y häc (1972), 310-311

18 §ç TÊt Lîi, Nh÷ng c©y thuèc vµ vÞ thuèc ViÖt Nam, Nhµ XuÊt b¶n Khoa häc vµ Kü thuËt (1991), 907-908

19 Vâ V¨n Chi, Tõ ®iÓn c©y thuèc ViÖt Nam, Nhµ XuÊt b¶n Y häc (1997), 622-623

20 Trư¬ng V¨n Như, LuËn ¸n TiÕn sÜ, §¹i häc Dưîc Hµ Néi (1992)

21 BÕ ThÞ ThuÇn, Trư¬ng V¨n Như, NguyÔn Duy Khang, T¹p chÝ Dưîc häc,

1991,Sè 1, 16-17

22 BÕ ThÞ ThuÇn, Trư¬ng V¨n Như, T¹p chÝ Dưîc häc, 1991, Sè 5, 11-12

23 Phan Tèng S¬n, V¨n Ngäc Hưíng, Phan Minh Giang, Walter C Taylor,

§ãng gãp vµo viÖc nghiªn cøu ho¹t chÊt sinh häc tõ c©y khæ s©m cho l¸

(Croton tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae), T¹p chÝ Hãa häc, 1999, 37

(4), 1-2

24 Phan, T S.; Phan, M G and Taylor, W C., An ent-Kaurane Diterpenoid from Croton tonkinensis Gagnep., Australian Journal of Chemistry, 2000,

53, 1003-1005

25 Phan, M G.; Phan, T S and Taylor, W C., A New Diterpenoid with

Antimalarial Activity from Croton tonkinensis Gagnep of Vietnam, The

Tenth Asian Symposium on Medicinal Plants, Spices and Other Natural Products, ASOMPS X, Dhaka, Bangladesh, 18-23 November 2000, Oral

presentation, OP 97

26 Phan Tèng S¬n, B¸o c¸o tæng kÕt §Ò tµi QG-98-05 §¹i häc Quèc gia Hµ

Néi (1998-2000), Hå s¬ lưu t¹i Trung t©m Th«ng tin Khoa häc vµ C«ng

nghÖ Quèc gia, 24 Lý Thưêng KiÖt, Hµ Néi, Sè 4676/KQNC

27 Phan Tèng S¬n, Lª HuyÒn Tr©m, Phan Minh Giang, §ãng gãp vµo viÖc nghiªn cøu thµnh phÇn hãa häc vµ ho¹t tÝnh sinh häc c©y khæ s©m cho l¸

(Croton tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae), T¹p chÝ Hãa häc, 2002, 40

(Sè §B), 53-57

28 Phan, M G.; Lee, J J.; Phan T S , Further Study on Chemical

Constituents of Croton tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae, in English,

T¹p chÝ Hãa häc, 2003, 41(1), 1

29 Phan, M G.; Jin, H Z.; Phan T S.; Lee, J H.; Hong, Y S and Lee, J J.,

ent-Kaurane Diterpenoids from Croton tonkinensis Inhibit LPS-Induced

NF-ĸB Activation and NO Production, Journal of Natural Products, 2003,

66 (9), 1217-1220

30 Phan, M G.; Lee, J J.; Taylor, W C.; Phan, T S., Chemical constituents

and biological activities of Croton tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae, 8 th

Eurasia Conference on Chemical Sciences (EuAsC 2 S-8), October 21-24,

Presentation Session, PC-OP-11

32 Phan, M G.; Jin, H Z.; Lee, J J., ent-Kaurane diterpenoids from Croton

tonkinensis inhibit LPS-induced transcription factor NF-кB activation and

NO production, The 52th Annual Convention of the Pharmaceutical

Society of Korea, Daegu, Korea, 17-18 April 2003, Oral presentation,

Proceedings paper, 120

33 Phan, M G.; Lee, J J.; Phan, T S , Flavonoid glucosides from the leaves

of Croton tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae, in English, T¹p chÝ Hãa

häc, 2004, 42(1), 125-128

34 Phan, M G.; Phan, T S , Two long chain alkyl alcohols from the leaves

of Croton tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae, in English, T¹p chÝ Hãa

häc, 2004, 42(1),132

35 Phan, M G.; Phan, T S.; Lee, J J.; and Otsuka, H., Four Type Diterpenoids from Croton tonkinensis Gagnep., Chem Pharm Bull.,

ent-Kaurane-2004, 52(7), 879-882

36 Phan, M G.; Phan, T S.; Lee, J J and Otsuka, H., ent-Kaurane-type Diterpenoids from Croton tonkinensis Gagnep., The 51th (Year 2004)

Annual Meeting of the Japanese Society of Pharmacognosy, Kobe, Japan, 9-10 September 2004, Proceedings paper, 105

37 Phan, M G.; Phan, T S.; Hamada Y.; and Otsuka, H., Cytotoxic

Diterpenoids from Vietnamese Medicinal Plant Croton tonkinensis

Gagnep., Chem Pharm Bull., 2005, 53(3), 296-300

38 Phan, M G.; Otsuka, H.; Phan, T S , Three minor ent-kaur-16-ene-type diterpene from Croton tonkinensis Gagnep., in English, T¹p chÝ Hãa häc,

2005, 43(2), 263-264

39 Phan, M G.; Phan, T S.; Hamada Y.; and Otsuka, H., Cytotoxic

diterpenoids from Vietnamese medicinal plant Croton tonkinensis Gagnep., The 125 th Annual Meeting of The Pharmaceutical Society of Japan, Tokyo, Japan, 29-31 March 2005, Proceedings paper, 159

40 Ph¹m ThÞ Hång Minh, Ph¹m Hoµng Ngäc,

ent-(16S)-7β-hi®roxy-18-axetoxykauran-15-on, mét kauran-ditecpen míi, ph©n lËp tõ c©y khæ s©m

cho l¸ (Croton tonkinensis Gagnep.), T¹p chÝ Hãa häc, 2003, 41(2),

104-109

Chương 2

NGHIÊN CứU QUY TRìNH CHIếT TáCH

ENT-KAURAN DITECPENOIT Từ CÂY KHổ SÂM BắC Bộ

Nội dung nghiên cứu được đề ra cho phần này là xây dựng quy trình ổn

định ở quy mô Phòng thí nghiệm cho phép chiết tách ent-kauran ditecpenoit

có hoạt tính chống ung thư và chống viêm từ cây khổ sâm Bắc Bộ (Croton

tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae) để thu nhận hoạt chất chủ yếu 1 và Chế

phẩm CT-2005 giàu hoạt chất ent-kauran, và áp dụng quy trình chiết tách này

này vào quy mô 10 kg lá khổ sâm khô/mẻ để thu nhận và sản xuất Chế phẩm

CT-2005 cung cấp cho các khảo sát hoạt tính sinh học in vitro và in vivo

2.1 Khảo sát định hướng cho việc xây dựng quy trình chiết tách

Như đã nêu ở Mục 1.3, thành phần hóa học của cây khổ sâm Bắc bộ

(Croton tonkinensis Gagnep.) khá phức tạp Kết quả nghiên cứu của chúng tôi

đã cho thấy lá cây khổ sâm Bắc Bộ có chứa các hợp chất thuộc hai lớp chủ

yếu là ent-kauran ditecpenoit và flavonoit glucozit, ngoài ra còn có một số hợp chất steroit và ankyl ancol mạch dài Các ent-kauran ditecpenoit xuất hiện

trong lá cây khổ sâm Bắc Bộ khá phong phú, với tổng cộng 18 hợp chất loại này đã được chúng tôi phân lập xác định cấu trúc cho đến nay, trong số đó có

13 hợp chất mới Các khảo sát nhờ phương pháp Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) được thực hiện với lá cây khổ sâm Bắc Bộ và các hợp chất phân lập

được đã khẳng định nguồn gốc thiên nhiên của các chất này Đáng chú ý là sự

xuất hiện nhiều hợp chất ent-kaur-16-en-15-one là các chất mang cấu trúc

α-metylenxiclopentanon có thể dẫn đến các hoạt tính sinh học khác nhau (13 hợp chất, trong số đó có 9 chất mới); ở trang 23 có nêu công thức của 7 trong

số 13 hợp chất này, với ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl axetat (1) là hợp chất ent-kauran ditecpenoit chủ yếu có hàm lượng cao nhất và thuộc vào

số các chất có hoạt tính sinh học mạnh nhất của cây

Kết quả khảo sát của chúng tôi đã cho thấy các ent-kaur-16-en-15-one

của cây khổ sâm Bắc Bộ đều có hoạt tính độc hại tế bào mạnh đối với các dòng tế bào ung thư người Hep-G2 (ung thư gan - Hepatocellular carcinoma,

giá trị IC50 (àg/ml) nằm trong khoảng từ 0,12 đến 4,06), RD (ung thư màng

tim - Rhabdosarcoma, từ 1,04 đến 1,67), và LU ( ung thư phổi –Lung cancer,

từ 0,25 đến 1,75) Các kết quả thử cũng đã cho thấy các ent-kauran ditecpenoit

1-4 có tác dụng ức chế mạnh nhân tố phiên mã NF-кB và enzym nitric oxide

synthase (iNOS) (xem Mục 1.3)

Chúng tôi đã tiến hành một số khảo sát cơ bản nhằm định hướng cho quá

trình chiết tách ent-kauran ditecpenoit từ lá cây khổ sâm Bắc Bộ

Cây khổ sâm Bắc Bộ (Croton tonkinensis Gagnep., Hình 2.1) được thu

thập ở ngoại thành Hà Nội vào tháng 7 âm lịch Bộ phận được sử dụng cho

việc chiết tách là lá cây khổ sâm Bắc Bộ Nguyên liệu thực vật được hong

khô trong râm, rồi sấy ở 40OC và xay thành bột Tiến hành ngâm chiết bột lá khổ sâm khô bằng metanol ở nhiệt độ phòng Sau khi gộp các dịch chiết và cất loại dung môi dưới áp suất giảm ta thu được phần chiết metanol dưới dạng một chất lỏng đặc sánh có màu nâu thẫm

Khảo sát phần chiết metanol nhận được này bằng phương pháp Sắc ký lỏng hiệu năng cao trên pha đảo (RP HPLC) được ghép nối với một

Photodiode Array (PDA) Detector đã cho thấy sự có mặt của hai lớp hợp chất chủ yếu này, đó là các flavonoit glucozit (chiếm 60,4% phần chiết metanol) và

các ent-kauran ditecpenoit (11,4%) (xem Hình 2.2) Khảo sát nhờ on-line

HPLC UV cũng đã cho thấy sự phân bố của các ent-kauran ditecpenoit 1-4 là

các hoạt chất ent-kauranoit chiếm hàm lượng cao của lá cây khổ sâm Bắc Bộ

(xem Hình 2.3)

Hình 2.1: Cây khổ sâm Bắc Bộ (Croton tonkinensis Gagnep.)

Như vậy các khảo sát HPLC và hoạt tính sinh học đã cung cấp nhiều thông tin hữu ích về độ phân cực và sự phân bố của các thành phần của lá cây khổ sâm Bắc Bộ, giúp cho sự lựa chọn các phương án chiết chọn lọc bằng các

dung môi có độ phân cực khác nhau và các hệ dung môi rửa giải sắc ký cột để

thu đ−ợc chất 1 và Chế phẩm CT-2005 với hiệu suất cao và chất l−ợng ổn

7 Peak #16 22.02

0.0 0 5 5.0 5 0 0

.0 0 5 0 5 0 0

OH OH O AcO

OH O AcO

OH O OH