Báo cáo thực tập trong phòng thí nghiệm (NLU)

Báo cáo thực tập trong phòng thí nghiệm (NLU)Báo cáo thực tập trong phòng thí nghiệm (NLU)Báo cáo thực tập trong phòng thí nghiệm (NLU)Báo cáo thực tập trong phòng thí nghiệm (NLU)Báo cáo thực tập trong phòng thí nghiệm (NLU)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC



BÁO CÁO THỰC TẬP

NGHIÊN CỨU TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM

NẤM TRICHODERMA SP VỚI NẤM GÂY BỆNH THỰC VẬT

FUSARIUM SP

GVHD: Lê Thị Diệu Trang

Mã học phần: 211912 Danh sách nhóm:

1 Hồ Trần Thị Bảo Trân 20126385 DH20SHB

2 Nguyễn Thị Kim Phụng 20126340 DH20SHB

DANH SÁCH NHÓM THAM GIA BÀI BÁO CÁO

HỌC KÌ 2, NĂM HỌC: 2022 - 2023

Đề tài: KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA CHỦNG NẤM

TRICHODERMA SP VỚI NẤM GÂY BỆNH THỰC VẬT FUSARIUM SP

Tỉ lệ % hoàn thành

Nhận xét của giáo viên:

Ký tên

MỤC LỤC

1 ĐẶT VẤN ĐỀ 4

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Nấm Trichoderma 4

2.2 Nấm Fusarium 5

2.3 Môi trường PDA 6

3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 7

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 7

3.2 Vật liệu nghiên cứu 7

3.3 Phương pháp nghiên cứu 7

3.3.1 Mục đích nghiên cứu 7

3.3.2 Phương pháp nghiên cứu 7

3.3.3 Bố trí thí nghiệm 8

3.3.4 Các bước tiến hành 8

4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 8

4.1 Kết quả thí nghiệm 8

4.1.1 Hình ảnh quan sát thí nghiệm 8

4.1.2 Số liệu thô 11

4.1.3 Số liệu sau tính toán 12

4.2 Thảo luận 15

4.3 Đề xuất 15

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Nấm Trichoderma sp là một loại nấm đối kháng có khả năng kiểm soát hầu hết

các loài nấm gây bệnh khác nhau trên cây trồng Chúng có thể kiểm soát và ngăn ngừa các loại nấm gây hại, kích thích sự tăng trưởng và phục hồi bộ rễ cho cây trồng, cải tạo đất và tăng mật độ vi sinh vật có lợi cho đất, Trên cơ sở đó, để ứng dụng các chủng

vi sinh vật có thể kiểm soát bệnh trên các đối tượng cây trồng khác nhau thì việc khảo

sát khả năng đối kháng của chủng nấm Trichoderma sp với nấm gây bệnh thực vật là phương pháp tốt nhất Vì nấm Trichoderma sp có thể kiểm soát tất cả các loài nấm gây bệnh như nấm Fusarium sp (gây bệnh thối rễ trên cam quýt, bệnh vàng lá chết chậm

trên tiêu) bằng cách chúng tiết ra enzyme endochitinase làm tan vách tế bào của nấm, sau đó tấn công vào bên trong, ký sinh, lấy chất dinh dưỡng và tiêu thụ chúng Sự kết hợp này cho phép nó bảo vệ vùng rễ của cây trồng chống lại các loại nấm gây thối rễ trên đồng ruộng Ngoài ra, chúng còn có khả năng phân hủy cellulose, phân giải lân

chậm tan bằng phương pháp trộn Trichoderma vào quá trình sản xuất phân hữu cơ vi

sinh để thúc đẩy quá trình phân hủy hữu cơ được nhanh chóng Vì vậy, khảo sát khả

năng đối kháng của chủng nấm Trichoderma sp với nấm gây bệnh thực vật Fusarium

sp nhằm kiểm soát, tiêu diệt nấm bệnh gây hại là một trong những phương pháp mang

đến nhiều hiệu quả nhất và không tác động đến môi trường

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Nấm Trichoderma

Nấm Trichoderma là một loại nấm sống ở vùng rễ cây được chế thành sản phẩm vi

sinh, có đặc tính sinh sản vô tính bằng những đính bào tử Conidia

Nấm Trichoderma thuộc giới Fungi, ngành Ascomycota, lớp Euascomycetes, bộ

Hypocreales, họ Hypoceaceae, giống Trichoderma

Chúng thuộc nhóm nấm Deuteromycetes (nhóm nấm bất toàn – Fungi imperfecti)

và gồm khoảng 33 loài: 20 loài Pachybasium, 10 loài Longibrachiatum, 2 loài

Trichoderma Saturnisporum và 1 loài Hypocreanum

Nấm này có thể tồn tại ở điều kiện lý tưởng khoảng 1 năm rưỡi nhưng có thể bị tiêu diệt bởi ánh nắng quá gắt hoặc mưa quá lâu Nhiệt độ phù hợp cho chúng sinh trưởng là khoảng 25 – 30oC

Hình 2.1 Nấm đối kháng Trichoderma sp

Một vài ứng dụng nổi bật của nấm Trichoderma như:

• Ngăn ngừa rất tốt các bệnh thối rễ, lở cổ rễ, thối thân, … cho tất cả các loại cây trồng

• Hiệu quả cao trong việc phòng ngừa các loại bệnh do tuyến trùng hại rễ

• Tăng cường các vi sinh vật có ích và giảm thiểu các vi sinh vật gây hại như nấm:

Rhizoctonia, Fusarium, Phytophtora, …

• Ngoài ra, Trichoderma còn tiết ra nhiều enzyme như cellulase, chitinase, … có

khả năng phân hủy nhanh các chất xơ thành các chất hữu cơ cung cấp dinh dưỡng và tăng cường đề kháng cho cây trồng

Ngoài ra, một số nghiên cứu cho thấy nấm Trichoderma sp có khả năng tiêu diệt nấm Fusarium (gây bệnh thối rễ trên cam quýt, bệnh vàng lá chết chậm trên tiêu) hay một số loại nấm gây bệnh khác như Sclerotium rolfsii, Fusarium oxysporum,

Rhizoctonia solani, …

2.2 Nấm Fusarium

Nấm Fusarium là tên của một loài nấm sợi thuộc một phức hợp gồm ít nhất 26 loài

có mối liên hệ với nhau Chúng là loài sinh sản vô tính và thường được biết đến là loài sinh sống đất và là loài thực vật mở đường đầu tiên

Nấm Fusarium thuộc giới Fungi, ngành Ascomycota, lớp Ascomycetes, bộ

Hypocreales, họ Nectriaceae, chi Fusarium và loài Solani

Chúng sinh sống ở những khu vực nhiệt đới, cận nhiệt đới hoặc những nơi có khí hậu ôn hòa và không sinh sống ở những vùng núi cao

Nấm Fusarium có khả năng gây bệnh cho cả cây trồng và con người Đặc biệt, chúng

nhạy cảm đối với những loại thuốc diệt nấm trong đất và được tìm thấy ở ao, sông, hệ

thống cống rãnh và ống dẫn nước Vì vậy, muốn tiêu diệt nấm Fusarium gây bệnh ở các giống cây trồng có thể sử dụng chế phẩm nấm đối kháng Trichoderma tác động vào giúp

loại bỏ các chất gây bệnh và làm tăng sự sinh trưởng của cây

Hình 2.2 Nấm Fusarium sp gây bệnh ở thực vật 2.3 Môi trường PDA

Môi trường PDA (Potato Dextrose Agar) là một môi trường nuôi cấy vi sinh vật phổ biến được tạo ra từ bột khoai tây và đường dextrose

PDA là một trong những môi trường nuôi cấy được sử dụng rộng rãi nhất để phát triển nuôi cấy nấm và vi khuẩn Bên cạnh đó, PDA có thể được bổ sung với các acid hoặc kháng sinh khác nhau như Chloramphenicol, Tartaric Acid và Chlortetracycline để

ức chế sự phát triển của những vi khuẩn có thể gây trở ngại cho nấm men và nấm mốc

Potato Dextrose Agar (PDA) chứa dextrose như là nguồn carbonhydrate cho quá trình tăng trưởng, và dịch khoai tây cung cấp nguồn dinh dưỡng cho sự phát triển của hầu hết các loại nắm Thạch là tác nhân làm đặc môi trường

Một số ứng dụng của môi trường PDA:

• PDA được sử dụng để phát hiện nấm men và nấm mốc trong các sản phẩm sữa

và thực phẩm chế biến sẵn

• Môi trường PDA cũng có thể được sử dụng để nuôi cấy nấm men và nấm mốc từ các mẫu bệnh phẩm (mẫu da) Chare

• PDA với TA (Tartaric Acid) được khuyến nghị dùng để kiểm tra vi sinh vật trong thực phẩm và các sản phẩm từ sữa

• PDA với Chlortetracycline được khuyên dùng để kiểm tra vi sinh vật tổng số của nấm men và nấm mốc từ các sản phẩm mỹ phẩm

• PDA với Chloramphenicol được khuyến cáo để nuôi cấy chọn lọc nấm từ các mẫu hỗn hợp

3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian: Vào lúc 8h00 sáng thứ 4, ngày 26/05/2022

- Địa điểm: Tại phòng BIO305, tòa nhà A1, Đại học Nông Lâm TP HCM

3.2 Vật liệu nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu: Nấm Trichoderma sp

- Vật liệu nghiên cứu:

• Chủng nấm Trichoderma sp

• Chủng nấm gây bệnh thực vật Fusarium sp

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Mục đích nghiên cứu

Khảo sát khả năng đối kháng của chủng nấm Trichoderma sp với nấm gây bệnh thực vật Fusarium sp

3.3.2 Phương pháp nghiên cứu

Khảo sát khả năng đối kháng cho chủng nấm Trichoderma sp dựa trên chủng nấm gây bệnh thực vật Fusarium sp bằng cách nuôi cấy các chủng nấm Trichoderma sp và

nấm Fusarium sp riêng biệt trong các đĩa Petri chứa môi trường PDA ở 25oC nhằm

đánh giá tính đối kháng của chủng Trichoderma sp với nấm bệnh dựa vào phần trăm ức chế theo công thức: (C – T)/C * 100 với C là bán kính khuẩn lạc của nấm bệnh trong

nghiệm thức đối chứng; T là bán kính khuẩn lạc của nấm bệnh khi được nuôi cùng với

Trichoderma sp

3.3.3 Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm được tiến hành theo phương pháp đồng nuôi cấy gồm 2 nghiệm thức

(1 chủng nấm Trichoderma sp và 1 nghiệm thức đối chứng), mỗi nghiệm thức lặp lại 3

lần, mỗi lần lặp lại là một đĩa Petri

3.3.4 Các bước tiến hành

Bước 1: Chuẩn bị môi trường PDA, nấm Trichoderma và nấm Fusarium

Bước 2: Đổ môi trường PDA vào 4 đĩa Petri vừa chạm thành đĩa và chờ khoảng

10 – 15 phút

Bước 3: Sử dụng que cấy thẳng lấy một lượng bào tử vừa đủ của nấm Trichoderma

sp chuyển sang 1 đĩa Petri, và lấy một lượng bào tử từ nấm Fusarium sp cấy vào phía

đối diện sao cho đối xứng nhau qua đường kính đĩa và cả hai cách mép đĩa 2 cm và lặp lại các bước cấy trên cho 3 đĩa còn lại

Đĩa Petri số 4 (đối chứng) chỉ cấy một loại nấm gây bệnh Fusarium sp

Bước 4: Sau đó, nuôi cấy các đĩa Petri này ở 25oC

Bước 5: Quan sát và đo bán kính chuẩn lạc nấm bệnh ở các nghiệm thức vào các

ngày 4, 5, 7 sau cấy

4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Kết quả thí nghiệm

4.1.1 Hình ảnh quan sát thí nghiệm

Ngày 4 Ngày 5 Ngày 7

Đĩa 1

Đĩa 2

Đĩa 3

Đĩa

đối

chứng

1

Đĩa

đối

chứng

2

Đĩa

đối

chứng

3

Hình 4.1 Hình ảnh đĩa Petri thu được sau khi nuôi cấy ở 25 o C vào các ngày 4, 5, 7

- Giải thích hình ảnh sau khi thu được:

• Nguyên nhân đĩa Petri số 3 cấy không thành công nấm gây bệnh Fusarium sp

Nguyên nhân có thể xuất phát từ sai sót trong quá trình thao tác (Khi khử trùng đầu que cấy trong ngọn lửa đèn cồn không để nguội mà trực tiếp lấy bào tử nấm để cấy dẫn

đến chết bào tử nấm) hoặc do lượng bào tử nấm gây bệnh Fusarium sp mang đi cấy quá

ít làm cho trong quá trình phát triển bị các bào tử của nấm Trichoderma sp lấn át dẫn

đến nghèo nguồn dinh dưỡng làm cho bào tử chậm tăng sinh hoặc chết

• Nguyên nhân gây phơi nhiễm mẫu khi cấy

Do người thao tác không có khử trùng tay sạch tuyệt đối trước khi đưa tay vào tủ cấy, thao tác khi cấy có sự sai sót (không khử trùng đủ sạch que cấy, thành đĩa Petri của môi trường định cấy và thành đĩa Petri của 2 nấm được chuẩn bị để cấy) Trong khi thao tác thì cách xa ngọn lửa đèn cồn, người thao tác đưa tay ra khỏi tủ cấy trong quá trình cấy, không vệ sinh tủ cấy liên tục khi thao tác vì có thể bị nhiễm khuẩn do đổi người thao tác liên tục đây là những nguyên nhân dễ làm cho mẫu bị phơi nhiễm

4.1.2 Số liệu thô

Bảng 4.1.2a Bảng số liệu về đường kính (mm) của nấm ở nghiệm thức Fusarium nuôi

cùng với nấm Tricoderma

4 ngày 5 ngày 7 ngày

Giá trị trung bình

mỗi lần lặp lại 13.33 12.67 12.33

Bảng 4.1.2b Bảng số liệu về đường kính (mm) của nấm ở nghiệm thức đối chứng

Fusarium

4 ngày 5 ngày 7 ngày

Giá trị trung bình

4.1.3 Số liệu sau tính toán

Đánh giá tính đối kháng của chủng Trichoderma sp với nấm bệnh dựa vào phần

trăm ức chế theo công thức: (C - T)/C *100

Trong đó:

C: bán kính khuẩn lạc của nấm bệnh trong nghiệm thức đối chứng

T: bán kính khuẩn lạc của nấm bệnh khi được nuôi cùng với Trichoderma sp T1, T2, T3: số lần lặp lại của nấm bệnh khi được nuôi cùng với Trichoderma sp

C1, C2, C3: số lần lặp lại của nấm bệnh trong nghiệm thức đối chứng

Bảng 4.1.3a Bảng số liệu về bán kính (mm) của nấm ở cả 2 nghiệm thức

Lần lặp ở 2

0

5

10

15

20

25

30

35

Biểu đồ đường kính (mm) nấm Fusarium khi cấy chung

với Trichoderma và khi cấy riêng (đối chứng)

Bảng 4.1.3b Bảng tính phần trăm ức chế của chủng Trichoderma sp với nấm bệnh

C\T - Sau

15 ×100 = 20 15 − 8

15 ×100 = 140/3 15 − 0

15 ×100 = 100

11 ×100 = -100/11 11 − 8

11 ×100 = 300/11 11 − 0

11 ×100 = 100

10 ×100 = -20 10 − 8

10 ×100 = 20 10 − 0

10 ×100 = 100

C\T - Sau

17.5 ×100 = 220/7 17.5 − 7

17.5 ×100 = 60 17.5 − 0

17.5 ×100 = 100

15 ×100 = 20 15 − 7

15 ×100 = 160/3 15 − 0

15 ×100 = 100

10 ×100 = -20 10 − 7

10 ×100 = 30 10− 0

10 ×100 = 100

C\T - Sau

21 ×100 = 950/21 21 − 7

21 ×100 = 200/3 21 − 0

21 ×100 = 100

17 ×100 = 550/17 17 − 7

17 ×100 = 1000/17 17 − 0

17 ×100 = 100

10 ×100 = -15 10 − 7

10 ×100 = 30 10 − 0

10 ×100 = 100

Bảng 4.1.3c Bảng phần trăm ức chế của nghiệm thức chủng Trichoderma với nấm

bệnh

Lần lặp

lại

Phần trăm ức chế (1)

Trung bình (2)

Độ lệch (sd) (1) - (2)

Bình phương độ lệch (𝒔𝒅)𝟐

Tổng bình phương độ lệch 2595.7

Tính giá trị phương sai Variance:

Phương sai = Tổng bình phương độ lệch/(N-1) = 2595.7/(3-1) = 1297.85

Độ lệch chuẩn SD = (𝑝ℎươ𝑛𝑔 𝑠𝑎𝑖)1/2 = (1297.85)1/2 = 36.03

Lần lặp

lại

Phần trăm ức chế (1)

Trung bình (2)

Độ lệch (sd) (1) - (2)

Bình phương độ lệch (𝒔𝒅)𝟐

Tổng bình phương độ lệch 2031.39

Tính giá trị phương sai Variance:

Phương sai = Tổng bình phương độ lệch/(N-1) = 2031.39/(3-1) = 1015.7

Độ lệch chuẩn SD = (𝑝ℎươ𝑛𝑔 𝑠𝑎𝑖)1/2 = (1015.7)1/2 = 31.87

Lần lặp

lại

Phần trăm ức chế (1)

Trung bình (2)

Độ lệch (sd) (1) - (2)

Bình phương độ lệch (𝒔𝒅)𝟐

Tổng bình phương độ lệch 7134.75

Tính giá trị phương sai Variance:

Phương sai = Tổng bình phương độ lệch/N-1 = 7134.75/(3-1) = 3567.38

Độ lệch chuẩn SD = (𝑝ℎươ𝑛𝑔 𝑠𝑎𝑖)1/2 = (3567.38)1/2 = 59.73

4.2 Thảo luận

Nấm Trichoderma mang màu xanh lá cây đậm ở giữa và có vòng trắng bao phủ bên

ngoài ở ngày thứ 4 và vòng màu trắng dần bị mất đi vào những ngày sau

Nấm Fusarium có màu trắng, chỉ lớn dần về kích thước, không đổi màu sắc.

Đĩa 1 và đĩa 2: Nấm Trichoderma có kích thước lớn hơn rất nhiều so với nấm

Fusarium Sau 7 ngày cho thấy bán kính của Fusarium giảm do bị ức chế bởi nấm Trichoderma.

Đĩa 3 và đĩa 4: Không có sự phát triển của nấm Fusarium Ta chỉ thấy sự phát triển của nấm Trichoderma, bán kính tăng và không có xu hướng giảm.

Vì vậy, khi nuôi cấy hai nấm Trichoderma và Fusarium trong cùng môi trường, ở

vị trí gần nhau cho thấy được sự cạnh tranh dinh dưỡng, nấm Fusarium bị giảm bán kính còn nấm Trichoderma thì tăng bán kính, tức là Fusarium có xu hướng giảm sự sinh trưởng sau nhiều ngày nuôi cùng nấm Trichoderma Điều này cho thấy sức cạnh tranh dinh dưỡng của nấm gây bệnh Fusarium không bằng nấm đối kháng Trichoderma

4.3 Đề xuất

Nấm Trichoderma là một loại nấm đối kháng có khả năng kiểm soát tất cả các loại

nấm gây bệnh khác, giết được nhiều loại nấm gây thối rễ chủ yếu như: Pythium,

Rhizoctonia và Fusarium, Ngoài ra, nó tiết ra đất những chất kích thích để rễ cây ăn

sâu xuống lòng đất, làm cho rễ cây khỏe hơn và tăng khả năng hút dinh dưỡng, tăng khả năng phòng vệ, tạo thành một lớp măng - xông bảo vệ vùng rễ cây tránh sự xâm nhập của mầm bệnh của các loại nấm bệnh Bên cạnh đó có thể khảo sát thêm khả năng đối

kháng của nấm Trichoderma với nấm gây bệnh Pythium và đem so sánh với phương pháp khảo sát trên nấm gây bệnh ở thực vật Fusarium để đánh giá được phương pháp

nào có hiệu quả tốt nhất và mang đem đến nhiều lợi ích nhất Vì vậy, việc nghiên cứu

sâu về loại nấm Trichoderma này rất có ích trong việc sản xuất các chất kiểm soát sinh

học một cách hiệu quả và có ích đối với ngành nông nghiệp hiện nay