Báo cáo thực tập kiểm nghiệm sinh học vi sinh 18 SHC (NLU)

Báo cáo thực tập kiểm nghiệm sinh học vi sinh 18shc. Trường đại học Nông Lâm TP. HCM. Khoa khoa học sinh học. Báo cáo thực tập kiểm nghiệm sinh học vi sinh 18shc. Trường đại học Nông Lâm TP. HCM. Khoa khoa học sinh học. Báo cáo thực tập kiểm nghiệm sinh học vi sinh 18shc. Trường đại học Nông Lâm TP. HCM. Khoa khoa học sinh học.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

****************

BÁO CÁO THỰC HÀNH

MÔN HỌC: KIỂM NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM

Hướng dẫn khoa học Nhóm sinh viên thực hiện

ThS Trương Phước Thiên Hoàng Huỳnh Đức Anh 18126225

Hồ Hoàng Hải 18126226 Nguyễn Nhật Khang 18126227 Phạm Văn Toàn 18126182 Nguyễn Vương Thanh Trúc 18126233

TP Thủ Đức, 01/2021

MỤC LỤC

Trang

BÀI 1 ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS VÀ E COLI 1

PHẦN 1 COLIFORMS 1

1.1 Quy trình định lượng Coliforms bằng phương pháp đếm khuẩn lạc – Thực hiện theo tiêu chuẩn quốc gia: TCVN 7924-2:2008 (ISO 16649-2:2001) (Xem tài liệu) 1

1.1.1 Cách tiến hành thí nghiệm và tính kết quả 1

1.1.2 Kết quả của quá trình định lượng Coliforms bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 2

1.2 Quy trình định lượng Coliforms bằng phương pháp MPN – Thực hiện theo tiêu chuẩn quốc gia: TCVN:6846:2007 (ISO 4832:2007) (Xem tài liệu) 3

PHẦN 2: E Coli 5

1.1 Tóm tắt kiến thức cơ bản (Xem tài liệu) 5

1.2 Quy trình định lượng E coli 5

1.2.1 Quy trình định lượng E coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc – Thự hiện theo tiêu chuẩn quốc gia: TCVN 7924-2:2008 (ISO 16649-2:2001) (Xem tài liệu) 5

1.3 Cách tiến hành thí nghiệm và tính kết quả 6

1.4 Quy trình định lượng E coli bằng phương pháp MPN (Xem tài liệu) 7

1.4.1 Phương pháp Most Probable Number (MPN) (Xem tài liệu) 7

1.4.2 Quy trình định lượng E coli bằng phương pháp MPN – Thực hiện theo tiêu chuẩn quốc gia: TCVN:6846:2007 (ISO 4832:2007) (Xem tài liệu) 7

1.4.2.1 Cách tiến hành thí nghiệm và tính kết quả 7

BÀI 2 ĐỊNH LƯỢNG STAPHYLOCOCCUS AUREUS 11

2.1 Quy trình định lượng Staphylococcus aureus bằng phương pháp MPN 11

2.2 Kết quả 11

2.3 Kết luận 12

3.1 Quy trình định tính Salmonella trong mẫu gan heo 14

3.2 Kết quả của quá trình định tính Salmonella trên mẫu gan heo 14

3.2.1 Kết quả sau quá trình phân lập và nhận diện Salmonella trên hai môi trường XLD (Xylose Lysine Desoxycholate) và HE (Hektoen Entric Agar) 14

3.2.2 Kết quả khẳng định Salmonella trên mẫu gan heo ở ba thử nghiệm sinh hóa KIA (Kliger Iron Agar), Indol, Urea và VP (Voges-Proskauer) 16

3.3 Kết luận 16

BÀI 4: ĐỊNH LƯỢNG TỔNG VI KHUẨN HIẾU KHÍ VÀ TỔNG NẤM MEN - NẤM MỐC 17

4.1 Định lượng tổng vi khuẩn hiếu khí 17

4.1.1 Mẫu kiểm định: Sơ dừa 17

4.1.2 Kết quả 17

4.1.3 Biện luận 17

4.1.4 Kết luận 18

4.2 Định lượng tổng nấm men – nấm mốc 18

4.2.1 Mẫu kiểm định: Ruột thanh long 18

4.2.2 Kết quả 18

4.2.3 Biện luận 18

4.2.4 Biện luận 19

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

VRBL Thạch lactoza mật đỏ trung tính tím tinh thể

BGBL Brilliant Green Buke Broth Lactose

DRBC Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1: Khuẩn lạc Coliforms trên môi trường VRBL nồng độ 10-1 9

Hình 1.2 Cấy mẫu pha loãng 10-2, 10-3, 10-4 vào môi trường LSB có sinh hơi 11

Hình 1.3 Các ống BGBL sinh hơi ở 3 nồng độ liên tiếp 10-2,10-3,10-4 12

Hình 1.4 Khuẩn lạc đặc trưng được quan sát thấy ở nồng độ pha loãng 10-1 (trái; A) và

không quan sát thấy ở nồng độ 10-2 (phải) 14

Hình 1.5 Cấy mẫu pha loãng 10-2, 10-3, 10-4 vào môi trường LSB có sinh hơi 15

Hình 1.6 Cấy chuyển dịch mẫu từ các ống LSB sinh hơi (+) sang môi trường canh EC và

quan sát 16

Hình 1.7 Cấy ria dịch mẫu từ các ống (+) trên canh EC sang môi trường thạch đĩa EMB

Chọn khuẩn lạc đường kính lớn hơn 1 mm (tròn, dẹt hình đĩa và có ánh kim xanh)

Hình 1.8 Kết quả thử nghiệm IMViC 16

Hình 2.1 Ống nghiệm MSB chứa 1 ml dung dịch mẫu nồng độ 10-1; 10-2; 10-3 lặp lại mỗi nồng độ 3 lần 18

Hình 2.2 Ống nghiệm MSB chứa 1 ml dung dịch mẫu nồng độ 10-4; 10-5 lặp lại mỗi nồng

độ 3 lần 18

Hình 2.3 Cấy ria các khuẩn lạc từ ống nghiệm MSB sang đĩa thạch BPA, 48h (a) Nồng

độ ống nghiệm 10 -2 ; (b) Nồng độ ống nghiệm 10 -3 ; (c) Nồng độ ống nghiệm 10 -4 19

Hình 3.1 Khuẩn lạc trên đĩa môi trường XLD sau khi được ủ ở 37oC trong 24 giờ 21

Hình 3.2 Khuẩn lạc trên đĩa môi trường HE sau khi được ủ ở 37oC trong 24 giờ (trái (a); phải (b)) 22

Hình 3.3 Kết quả thử nghiệm sinh hóa của Salmonella 23 Hình 4.1 Khuẩn lạc trên môi trường PCA (a) Nồng độ 10 -3 ; (b) Nồng độ 10 -4 ; (c) Nồng

độ 10 -5 24

Hình 4.2 Khuẩn lạc trên môi trường DRBC (a) Nồng độ 10 -1 ; (b) Nồng độ 10 -2 ; (c) Nồng

độ 10 -3 25

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Số lượng khuẩn lạc ở hai nồng độ thu được 10

BÀI 1 ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS VÀ E COLI

PHẦN 1 COLIFORMS

1.1 Quy trình định lượng Coliforms bằng phương pháp đếm khuẩn lạc – Thự hiện theo tiêu chuẩn quốc gia: TCVN 7924-2:2008 (ISO 16649-2:2001) (Xem tài liệu) 1.1.1 Cách tiến hành thí nghiệm và tính kết quả

Mẫu phân tích: Nước mía

Định lượng Coliforms theo quy trình

Chuẩn bị dịch đồng nhất hoặc pha loãng mẫu để có độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3

Chuyển 1 ml dung dịch 10-1, 10-2, 10-3 vào tâm đĩa petri, mỗi nồng độ có 2 lần lặp lại

Rót khoảng 15 ml môi trường VRBL (44 – 47oC) vào mỗi đĩa petri Trộn đều môi

trường với dịch cấy, để hỗ hợp đông đặc Đồng thời chuẩn bị một đĩa chỉ chứa 15 ml môi trường (không có dịch cấy để kiểm tra sự vô trùng của môi trường)

Rót khoảng 4 ml môi trường VRBL (44 – 47oC) lên bề mặt của môi trường cấy Để cho đông đặc và đem ủ ở 30°C hoặc 37°C, 24 giờ

Chọn những đĩa petri có số lượng khuẩn lạc từ 10 – 150, đếm những khuẩn lạc điển hình

có màu đỏ tía có đường kính 0,5 mm trở lên (đôi khi có vùng mật tủa hơi đỏ bao quanh)

đó là các Coliform Xác định được mật số Coliforms

Nếu có những khuẩn lạc có hình thái không điển hình cũng đếm và chọn 5 khuẩn lạc cấy vào ống nghiệm chứa môi trường canh thang mật lactoza lục sáng để khẳng định

Ủ các ống nghiệm này trong tủ ở 30°C hoặc 37°C trong 24 h ± 2 h Các ống Durham cho thấy có sinh khí thì được coi là có chứa Coliforms

1.1.2 Kết quả của quá trình định lượng Coliforms bằng phương pháp đếm khuẩn lạc

Để kết quả có giá trị, thường cần đếm các khuẩn lạc trên ít nhất một đĩa có chứa ít nhất 10 khuẩn lạc (tổng số các khuẩn lạc, khuẩn lạc điển hình hoặc các khuẩn lạc phù hợp với các tiêu chí xác định) Tính số lượng N vi sinh vật có trong mẫu thử theo trung bình khối lượng từ hai độ pha loãng liên tiếp bằng cách sử dụng công thức:

V là thể tích chất cấy được đưa vào mỗi đĩa, tính bằng mililit (ml)

d là độ pha loãng tương ứng với dung dịch pha loãng đầu tiên được giữ lại (d = 1 khi sản phẩm dạng lỏng chưa pha loãng (mẫu thử) được giữ lại)

Sau khi nuôi cấy trên môi trường VRBL, chọn 2 đĩa có mẫu ở nồng độ 10-1,10-2 ra đếm khuẩn lạc kết quả như sau:

Hình 1.1: Khuẩn lạc Coliforms trên môi trường VRBL nồng độ 10-1

Bảng 1.1 Số lượng khuẩn lạc ở hai nồng độ thu được

Vậy trong mẫu nước mía có 2,19×102 Coliforms có trong 1 ml nước mía

1.2 Quy trình định lượng Coliforms bằng phương pháp MPN – Thực hiện theo tiêu chuẩn quốc gia: TCVN:6846:2007 (ISO 4832:2007) (Xem tài liệu)

Cách tiến hành thí nghiệm

Mẫu phân tích: Nước mía

Chuẩn bị dịch đồng nhất hoặc pha loãng mẫu để có độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3

Chuyển 1 ml dung dịch 10-1, 10-2, 10-3 vào ống 10 ml canh LSB, mỗi nồng độ có 3 ống lặp lại, ủ ở 37oC, 48 giờ

Ghi nhận các ống LSB (+) (sinh hơi) ở mỗi nồng độ pha loãng

Hình 1.2 Cấy mẫu pha loãng 10-2, 10-3, 10-4 vào môi trường LSB có sinh hơi

Định lượng Coliforms

Cấy vào ông canh BGBL ủ ở 37oC, 48 giờ

Số ống sinh hơi (+) ở mỗi nồng độ pha loãng

Khẳng định Coliforms

Hình 1.3 Các ống BGBL sinh hơi ở 3 nồng độ liên tiếp 10-2,10-3,10-4

Kết luận

Sự xuất kiện các ống nghiệm sinh hơi cho ta thấy trong mẫu có chứa nhóm vi sinh vật Coliforms vì nhóm vi khuẩn Coliforms có khả năng lên men lactose có trong môi trường BGBL sinh acid là sinh hơi ơ 37°C trong 24 - 48 giờ

Sau khi ủ các ống canh BGBL có chứa dịch mẫu ta nhận thấy tất cả các ống nghiệm đều sinh hơi, cho thấy mật độ vi sinh vật quá cao, do đó ta phải tiếp tục pha loãng ở nồng độ cao hơn cho đến khi xuất hiện các ống nghiệm không sinh hơi để cho kết quả chính xác hơn

PHẦN 2: E Coli

1.1 Tóm tắt kiến thức cơ bản (Xem tài liệu)

1.2 Quy trình định lượng E coli

1.2.1 Quy trình định lượng E coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc – Thự hiện

theo tiêu chuẩn quốc gia: TCVN 7924-2:2008 (ISO 16649-2:2001) (Xem tài

liệu)

1.3 Cách tiến hành thí nghiệm và tính kết quả

Mẫu phân tích: Nước mía

Bước 1: Pha môi trường

Bước 2: Khử trùng dụng cụ và môi trường đã pha

Bao gói dụng cụ và phân phối môi trường vào dụng cụ, gắn nút và bao gói Hấp tiệt trùng

ở 121oC trong 15 phút

Bước 3: Định lượng E coli theo quy trình

Bước 4: Tính kết quả

Để có kết quả đúng, cần đếm các CFU điển hình trên ít nhất một đĩa chứa ít nhất 15 CFU

màu xanh điển hình Tính N, số lượng CFU của E coli dương tính β-glucuronidase có

mặt trong mẫu thử trên mililit hoặc trên gam sản phẩm từ hai độ pha loãng liên tiếp, sử dụng công thức:

𝑉 ∗ (𝑛1 + 0,1𝑛2) ∗ 𝑑Trong đó:

∑ 𝑎 : tổng số các khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa được giữ lại sau hai độ pha loãng liên tiếp có ít nhất một đĩa chứa 15 CFU màu xanh;

N1: số đĩa được giữ lại tại độ pha loãng thứ nhất;

V: Thể tích dịch cấy đã dùng trên mỗi đĩa, tính bằng mililit;

N2: số đĩa được giữ lại tại độ pha loãng thứ hai

D: hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thứ nhất được giữ lại (d = 1 trong trường hợp các mẫu ở dạng lỏng được cấy trực tiếp)

Kết quả: Số lượng khuẩn lạc đặc trưng của E coli quan sát thấy ở hai nồng độ liên tục quá

ít (<15), có thể kết luận không quan sát thấy khuẩn lạc đặc trưng của E coli

1.4 Quy trình định lượng E coli bằng phương pháp MPN (Xem tài liệu)

1.4.1 Phương pháp Most Probable Number (MPN) (Xem tài liệu)

1.4.2 Quy trình định lượng E coli bằng phương pháp MPN – Thực hiện theo tiêu

chuẩn quốc gia: TCVN:6846:2007 (ISO 4832:2007) (Xem tài liệu)

1.4.2.1 Cách tiến hành thí nghiệm và tính kết quả

Mẫu phân tích: Nước mía

Bước 1: Pha môi trường

Bước 2: Khử trùng dụng cụ và môi trường đã pha

Bao gói dụng cụ và phân phối môi trường vào dụng cụ, gắn nút và bao gói Hấp tiệt trùng

ở 121oC trong 15 phút

Bước 3: Pha loãng mẫu

Bước 4: Cấy mẫu vào canh

Chuyển 1 ml dung dịch pha loãng vào ống 10 ml canh LSB, mỗi nồng độ có 3 ống lặp lại,

ủ ở 37oC, 48 giờ

Hình 2.4 Khuẩn lạc đặc trưng được quan sát thấy ở nồng độ pha loãng 10-1

(trái; A) và không quan sát thấy ở nồng độ 10-2 (phải)

A

Hình 1.5 Cấy mẫu pha loãng 10-2, 10-3, 10-4 vào môi trường LSB có sinh hơi

Bước 5: Định lượng E coli

Ghi nhận số ống có sinh hơi (+)

Dùng que cấy vòng cấy chuyển dịch mẫu từ các ống LSB (+) sang môi trường canh EC, ủ

ở 44,5oC, 24 giờ

Ghi nhận số ống có sinh hơi (+) tương ứng với mỗi độ pha loãng

Dùng que cấy vòng ria dịch mẫu từ các ống (+) trên canh EC sang môi trường thạch đĩa EMB Ủ ở 37oC, 24 giờ

Chọn khuẩn lạc đường kính lớn hơn 1 mm (tròn, dẹt hình đĩa và có ánh kim xanh), cấy vào Trypton, MR-VP, SC Citrate, ủ ở 44,5oC, 24 giờ

Kết quả:

Hình 1.6 Cấy chuyển dịch mẫu từ các ống LSB sinh hơi (+) sang môi trường canh EC và

quan sát

Hình 1.7 Cấy ria dịch mẫu từ các ống (+) trên canh EC sang môi trường thạch đĩa

EMB Chọn khuẩn lạc đường kính lớn hơn 1 mm (tròn, dẹt hình đĩa và có ánh kim xanh)

Bước 6: Thử nghiệm IMViC

a) Indol: (+) xuất hiện của lớp màu đỏ trên bề mặt môi trường (-) lớp màu vàng của thuốc thử Đôi khi có sự xuất hiện của màu cam do skatol, là tiền chất của methyl hóa của indol tạo ra

b) Methyl Red (MR): (+) môi trường có màu đỏ sau khi bổ sung thuốc thử (-) khi có màu vàng Trường hợp màu cam, cần tiếp tục ủ ống môi trường có giống trong 4 ngày và thực hiện lại thử nghiệm

c) Voges-Proskauer (VP): (+) khi có màu đỏ trên bề mặt môi trường (-) có hiện tượng không đổi màu

d) Citrate (iC): (+) khi xuất hiện khuẩn lạc và môi trường chuyển sang màu xanh dương (-) khi không có khuẩn lạc và môi trường xanh lục

Kết quả:

Kết quả thử nghiệm cho thấy kết quả lần lượt của các thí nghiệm là: (-)(-)(+)(-)

Từ đó có thể kết luận, kết quả không đặc trưng

cho E coli nên vi khuẩn trong mẫu thử không phải là E coli

Tính kết quả MPN: Do trong lúc thực hành pha loãng, ghi nhận kết quả ở 3 nồng độ 10-2, 10-3,

10-4, mỗi nồng độ ghi nhận được 3 ống dương tính, cho thấy nồng độ vi khuẩn vẫn còn cao, độ pha loãng chưa thích hợp để tính toán Khuyến nghị tiếp tục pha loãng đến khi có nồng độ âm tính

Hình 1.8 Kết quả thử nghiệm IMViC

BÀI 2 ĐỊNH LƯỢNG STAPHYLOCOCCUS AUREUS

2.1 Quy trình định lượng Staphylococcus aureus bằng phương pháp MPN

Đồng nhất 10 g mẫu thịt gà và pha loãng mẫu với SPW thành các dãy nồng độ 10-1;

10-2; ;10-5

Chuyển 1 ml dung dịch 10-1; 10-2; ;10-5 vào ống 10 ml canh MSB, mỗi

nồng độ lặp lại 3 lần, ủ ở 370C, 24 - 48 giờ Chọn ống (+) đục ở mỗi nồng độ pha loãng Ria lên đĩa thạch BPA, ủ ở 370C, 48 giờ

Chọn khuẩn lạc đặc trưng (tròn lồi, đen bóng, có quầng trong và quầng sáng

xung quanh (đôi khi chỉ xuất hiện 1 trong 2 quầng))

Thử nghiệm ngưng kết coagulase Ghi nhận coagulase (+) ở mỗi nồng độ pha loãng

Tra bảng MPN và xác định mật số S aureus (MPN/g hoặc MPN/ml)

Hình 2.1 Ống nghiệm MSB chứa 1 ml dung

dịch mẫu nồng độ 10-1; 10-2; 10-3 lặp lại mỗi

nồng độ 3 lần

Hình 2.2 Ống nghiệm MSB chứa 1 ml

dung dịch mẫu nồng độ 10-4; 10-5 lặp lại mỗi nồng độ 3 lần

Hình 2.3 Cấy ria các khuẩn lạc từ ống nghiệm MSB sang đĩa thạch BPA, 48h (a) Nồng

độ ống nghiệm 10 -2 ; (b) Nồng độ ống nghiệm 10 -3 ; (c) Nồng độ ống nghiệm 10 -4

Kết quả không phát hiện thấy khuẩn lạc đặc trưng (tròn lồi, đen bóng, có quầng trong

và quầng sáng xung quanh) trong đĩa thạch BPA ủ ở 370C sau 48h, suy ra không phát hiện

S aureus Đĩa thạch BPA nồng độ mẫu 10-1 cũng không có khuẩn lạc đặc trưng, nhưng do thiếu sót kỹ thuật nên không có hình ảnh

2.3 Kết luận

Kết quả không phát hiện có staphylococcus aureus nhưng có xuất hiện những khuẩn

lạc khác trong mẫu thịt gà Có thể là do quá trình thao tác có sai sót như không trộn đều

10-4

c)

tất cả đều cho thấy dương tính (đục) có thể là do bị nhiễm trong thao tác Trong trường hợp các ống nghiệm đều dương tính thì cần pha loãng thêm các nồng độ liền sau (10-6;10-7; …) cho tới khi có 1 ống âm tính để phục vụ đo kết quả MPN chính xác nhất

Đĩa thạch BPA hình 2.2 cho thấy thao tác cấy chưa đều, vẫn còn nhiều vệt trắng ít khuẩn lạc đơn Nên cần luyện tập nhiều về thao tác cấy; nâng cao sự tập trung để khắc phục những thiếu sót

BÀI 3 ĐỊNH TÍNH SALMONELLA

3.1 Quy trình định tính Salmonella trong mẫu gan heo

c

3.2 Kết quả của quá trình định tính Salmonella trên mẫu gan heo

3.2.1 Kết quả sau quá trình phân lập và nhận diện Salmonella trên hai môi trường

XLD (Xylose Lysine Desoxycholate) và HE (Hektoen Entric Agar)

Đồng nhất 10 g mẫu trong 90 ml môi trường tăng sinh BPW, ủ ở 37oC, 18 – 24

Thử nghiệm sinh hóa cho kết quả:

- Trên KIA/TSI: đỏ/vàng, có/không H2S, sinh hơi/không

- Urea (-); Indol (-), VP (-); LDC (+); ODC (+); Manitol (+); Sorbitol (+)

Định tính dương tính hay âm với Salmonella trong 25 g thực phẩm.