Microsoft Word 6288 doc ViiÖn khoa häc vµ c«ng nghÖ viÖt nam Bé khoa häc vµ c«ng nghÖ ViÖn C«ng nghÖ Sinh häc 18 Hoµng Quèc ViÖt, CÇu GiÊy, Hµ Néi V KHCNVN V CNSH V K H C N V N V C N S H V K H C N V N[.]
Tình hình nghiên c ứ u ở ngoài n ướ c
Vai trò của các nhóm chất như proline, glycine betaine, fructant và manitol trong việc tăng cường khả năng chống chịu của thực vật trước các điều kiện môi trường khắc nghiệt, đặc biệt là hạn hán và độ mặn, đã được xác nhận Nhiều gen liên quan đến chất lượng thực phẩm, như gen tăng cường hàm lượng methionine (CGS), tryptophan, lysine và cysteine (SAT), cũng đã được công bố Do đó, nghiên cứu ứng dụng công nghệ gen để cải thiện khả năng chống chịu và chất lượng lúa là một trong những lĩnh vực nghiên cứu chính tại nhiều viện nghiên cứu lớn trên toàn cầu Có nhiều phương pháp để xác định các gen liên quan đến khả năng chống chịu, bao gồm tìm kiếm trình tự gen đã công bố, thiết kế primer và nhân dòng DNA, kỹ thuật sàng lọc cDNA để kích thích hoạt động của gen, và nghiên cứu proteomics để phát hiện các protein mới dưới tác động của môi trường hoặc nhu cầu sinh trưởng, kết hợp với phân tích khối phổ và so sánh với ngân hàng dữ liệu gen.
Đến nay, nhiều gen liên quan đến tính chống chịu đã được phân lập và ứng dụng để nâng cao khả năng chống chịu cho cây thuốc lá, lúa mì, lúa nước Các gen này bao gồm gen nhaA (chịu mặn), gen HAL, gen codA, betA, nhóm gen RAB, gen P5CS, và gen OAT (chịu hạn) Viện Sinh lý hiện đang nghiên cứu và phát triển các ứng dụng này.
Viện Max-Planck tại CHLB Đức đang tiến hành nghiên cứu sâu về vai trò của các hợp chất như polyamin, đường tan và axít béo trong điều kiện bất lợi ở cây lúa Nghiên cứu này sử dụng kỹ thuật ức chế gen bằng RNA và các phương pháp phân tích quang phổ khối để đạt được những kết quả thành công.
Quá trình phân lập gen bao gồm các bước sau: Tách chiết mRNA từ các giống lúa có khả năng chống chịu trong các vùng sinh thái khác nhau dưới điều kiện stress và không stress Tiếp theo, tạo ngân hàng cDNA bằng enzym sao chép ngược Sau đó, tạo các vi bản trên màng chuẩn với số lượng 15000 Tiến hành lai với cDNA không xử lý và thu các dòng lai dương tính Cuối cùng, nhân bản các dòng lai bằng PCR, đọc trình tự và thiết kế gen cho mục đích chuyển gen.
Trong trường hợp phân tích phổ chất, quá trình bao gồm ba bước chính: đầu tiên, tách chiết các chất từ các giống lúa đã qua xử lý và chưa qua xử lý; tiếp theo, thực hiện phân tích phổ chất bằng kỹ thuật sắc ký khí hoặc quang phổ kế; cuối cùng, so sánh phổ chất giữa giống lúa chống chịu và giống không chống chịu trong cả điều kiện bất lợi và điều kiện bình thường.
Tình hình nghiên c ứ u ở trong n ướ c
Hiện nay, các kỹ thuật xác định sự gia tăng các chất như proline và đường tan đang được áp dụng hiệu quả để đánh giá tính chống chịu của cây lúa trước điều kiện bất lợi, và đã được sử dụng tại nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới, bao gồm cả Việt Nam Tại Việt Nam, Viện Công nghệ Sinh học đã triển khai nghiên cứu kỹ thuật phân lập gen từ cDNA Tuy nhiên, các nghiên cứu về gen mới chỉ được thực hiện trên cây đu đủ liên quan đến bệnh vi rút đốm vòng và tính chịu hạn ở đậu tương, trong khi các giống lúa Việt Nam vẫn chưa được nghiên cứu.
Viện Công nghệ sinh học đang hợp tác với Viện Max Planck về Sinh học phân tử thực vật và Trường Đại học Tổng hợp Greifswald, Đức, nhằm tăng cường tính chống chịu và cải tiến chất lượng giống lúa bằng công nghệ sinh học Dự án được Bộ Đào tạo và Nghiên cứu Đức tài trợ, giúp cán bộ Việt Nam học hỏi phương pháp nghiên cứu tại Đức Sự hợp tác này tạo điều kiện cho việc tiếp cận kỹ thuật hiện đại trong việc phân lập gen và phân tích các chất liên quan đến tính chịu hạn và mặn, từ đó phát triển các phương pháp cải biến tính chống chịu cho lúa Việc triển khai kỹ thuật này tại Việt Nam là cần thiết, cung cấp công cụ hiện đại cho Sinh học phân tử nhằm cải thiện giống lúa trong điều kiện môi trường bất lợi Các nghiên cứu tương tự cũng sẽ được thực hiện trên các cây trồng khác như ngô và đậu tương.
M ụ c tiêu c ủ a đề tài
Tìm kiếm và đánh giá các gen có khả năng nâng cao sức chống chịu của cây lúa trước điều kiện ngoại cảnh khắc nghiệt, đồng thời cải thiện chất lượng tinh bột trong hạt gạo, thông qua việc áp dụng các kỹ thuật phân tử và biến nạp gen.
Mục tiêu nghiên cứu bao gồm: i) Khám phá vai trò của polyamin trong việc nâng cao khả năng chống chịu của cây lúa trước các điều kiện ngoại cảnh bất lợi thông qua kỹ thuật ức chế gen bằng RNA ii) Phát hiện các gen điều khiển tính chịu hạn và chịu muối thông qua phân tích phổ phiên mã RNA từ các giống lúa có khả năng chống chịu iii) Phân tích phổ trao đổi chất ở rễ của các giống lúa (có và không có khả năng chống chịu với hạn và muối) trong điều kiện stress bằng kỹ thuật sắc ký khí/quang phổ khối iv) Chuyển gen nhằm tăng cường tính chịu hạn và mặn, đồng thời nâng cao hàm lượng axit amin trong cây lúa.
Dự án hợp tác với Đức từ 2002 đến 2005 đã thực hiện nghiên cứu tại Việt Nam, nhờ vào sự hỗ trợ tài chính từ Bộ để đón tiếp chuyên gia và cử cán bộ sang Đức làm việc Sự hỗ trợ này đã giúp thực hiện hiệu quả các nội dung nghiên cứu trong dự án.
CH ƯƠ NG 2 ĐỐ I T ƯỢ NG VÀ PH ƯƠ NG PHÁP NGHIÊN C Ứ U
Đố i t ượ ng và thi ế t b ị nghiên c ứ u
Các thi ế t b ị chính
Các thiết bị chính phục vụ nghiên cứu bao gồm: thiết bị nuôi trồng và xử lý mô, cây như Phytotron, bàn cấy vô trùng, buồng nuôi cấy mô và nhà kính trồng cây; cùng với thiết bị phân tích như khối phổ, máy PCR, máy lai và đọc DNA array, và máy đọc trình tự gen.
N ộ i dung nghiên c ứ u
Tìm ki ế m và phân l ậ p các gen làm gia t ă ng hàm l ượ ng polyamin thông qua k ỹ
k ỹ thu ậ t ứ c ch ế gen b ằ ng RNA
Phía Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học & Công nghệ Việt Nam i) Đánh giá khả năng chịu hạn và chịu muối NaCl của ít nhất 20 giống lúa
Indica của Việt Nam thể hiện khả năng chống chịu khác nhau qua các phép thử về chịu hạn và chịu muối Nghiên cứu cũng xác định hàm lượng PA (Putrescine, Spermidine, Spermine ) và mối tương quan của chúng với tính chống chịu ở 20 giống lúa, theo phương pháp của viện MPI.
Phía Viện MPI MPP, CHLB Đức i) Thiết kế các gen ức chế từ RNA tách chiết được từ các giống có tính chống chịu cao.
Phát hi ệ n các gen đ i ề u khi ể n tính ch ị u h ạ n và mu ố i b ằ ng ph ổ phiên mã RNA
Viện Công nghệ sinh học, thuộc Viện Khoa học & Công nghệ Việt Nam, đã chọn 4 giống lúa có khả năng chịu hạn là CR203, DR2, DR3 và Lốc, cùng với 5 giống lúa có khả năng chịu muối gồm Cườm, CR203, NN8, SR26 và SR59.
Indica của Việt Nam bao gồm việc thiết lập thư viện cDNA từ rễ, lá và phôi hạt của các giống lúa có khả năng chống chịu hạn và muối cao, cả trong điều kiện xử lý stress và không xử lý Đồng thời, quá trình này cũng bao gồm việc thu nhận, nhân dòng, đọc trình tự và so sánh các dòng lai cDNA.
Tại Viện MPI MPP, CHLB Đức, quy trình nghiên cứu bao gồm các bước sau: i) Tạo vi bản của 10.000-15.000 dòng cDNA từ mỗi thư viện cDNA; ii) Nhân bản 10.000-15.000 dòng cDNA thông qua phản ứng PCR; iii) Tạo các bản màng chuẩn chứa 15.000 cDNA; iv) Chuyển RNA lên màng chuẩn; v) Tiến hành lai 15.000 cDNA (không xử lý) với cDNA (đã xử lý) trên bản màng chuẩn để phát hiện các dòng lai cDNA.
K ỹ thu ậ t sao chép gen
Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học & Công nghệ Việt Nam thực hiện các bước quan trọng trong nghiên cứu gen, bao gồm thiết kế mồi để nhân các đoạn gen từ DNA hoặc cDNA của rễ, lá và cây con Sử dụng kit TA để nhân dòng, tạo vi bản trên màng chuẩn và lai với cDNA từ các giống cây chịu hạn và mặn trong điều kiện stress Sau đó, thu nhận các dòng lai dương tính để đọc trình tự gen Cuối cùng, thiết kế đoạn gen phân lập vào vector thích hợp, bao gồm gen chỉ thị, gen chọn lọc, đoạn promoter và terminator cần thiết cho việc chuyển gen vào thực vật.
Phía Viện MPI MPP, CHLB Đức i) Tạo 17 000 dòng cDNA bằng enzym sao chép ngược từ mRNA tổng số tách từ giống lúa chịu hạn và chịu mặn.
Kỹ thuật phân tích phổ chất bằng sắc ký khí/quang phổ khối
Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học & Công nghệ Việt Nam đang tiến hành tối ưu hóa phương pháp xử lý tính chịu muối và hạn cho các giống lúa Nghiên cứu này nhằm tìm hiểu mối tương quan giữa các nhóm chất trong điều kiện môi trường và các giai đoạn phát triển của lúa, bao gồm đẻ nhánh và trỗ bông Đặc biệt, việc xử lý với proline được thực hiện để nghiên cứu tính chống chịu của giống lúa Ngoài ra, nghiên cứu cũng xác định hàm lượng ABA ở rễ của các giống lúa trong điều kiện stress và không stress Cuối cùng, mục tiêu là phát triển một protocol đánh giá kiểu hình tính chịu hạn ở lúa.
Tại Viện MPI MPP, CHLB Đức, nghiên cứu được thực hiện nhằm phân tích phổ trao đổi chất của rễ ở 4-5 giống lúa, bao gồm 2-3 giống chống chịu và 2-3 giống không chống chịu, trong điều kiện bình thường và dưới tác động của stress Mục tiêu là xác định khoảng 300 chất từ các giống lúa đã được đánh giá về khả năng chống chịu hạn hoặc muối, bao gồm nhóm đường đơn, đường đôi, axit amin, axit béo và proline.
K + , Na + , đường tan ) Phát hiện các chất tương tự có trong cây lúa (khoảng
T ố i ư u ph ươ ng pháp chuy ể n gen vào m ộ t s ố gi ố ng lúa Vi ệ t Nam
Viện Công nghệ sinh học, thuộc Viện Khoa học & Công nghệ Việt Nam, đang tiến hành tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy mô tế bào và tái sinh cây cho các giống nghiên cứu Đồng thời, viện cũng thực hiện thử nghiệm chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciens trên một số giống lúa, bao gồm các bước chính như nhiễm mẫu nuôi với vi khuẩn.
Agrobacterium tumefaciens được sử dụng để diệt khuẩn, chọn dòng mô sẹo và tái sinh cây Việc tối ưu hóa điều kiện chuyển gen và tái sinh cây là cần thiết để đạt được hiệu quả cao trong quá trình tái sinh và chuyển gen.
Ph ươ ng pháp nghiên c ứ u
Ph ươ ng pháp sinh lý h ọ c th ự c v ậ t
i) Xử lý hạn và mặn; Thu thập và đánh giá khả năng chịu hạn và muối các giống lúa (33 giống)
Cây mạ được nuôi trong 10 ngày trong các chậu đường kính 10cm, mỗi chậu chứa một cây Chậu được lấp đầy bằng cát thạch anh kết hợp với phân bón hỗn hợp, bao gồm 0,4g Fetrilon và 8g phân bón khác.
Levatit HD5 là cây mạ được xử lý hạn bằng cách để khô các chậu trồng trong 4 ngày mà không tưới nước Sau đó, các chậu được tưới bổ sung một lượng nước hạn chế khoảng 13.68ml cho mỗi cây mỗi ngày trong 14 ngày Thí nghiệm được thực hiện trong phytotron với chu kỳ chiếu sáng 12 giờ ngày và 12 giờ đêm, cường độ ánh sáng đạt khoảng 2500 lux, nhiệt độ từ 22-26 độ C và độ ẩm 70-75%.
Hạt lúa được nảy mầm trong 10 ngày và sau đó được nuôi trong dung dịch trong phytotron Điều kiện nuôi trồng bao gồm ánh sáng 14 giờ với cường độ khoảng 2500 lux, nhiệt độ 26 độ C và độ ẩm 70% (Yang et al., 1994).
Vào ban đêm, nhiệt độ là 22 độ C và độ ẩm đạt 70% Sau 14 ngày phát triển bình thường, dung dịch nuôi cây được thay mới và bổ sung muối NaCl với các nồng độ 0, 50 và 100 mM.
Thời gian xử lý muối kéo dài 14 ngày Việc trồng, nhân giống và theo dõi các đặc điểm nông sinh học của các giống thí nghiệm được thực hiện theo yêu cầu cụ thể của từng thí nghiệm Đồng thời, khả năng chống chịu của các giống lúa được phân loại theo tiêu chuẩn của IRRI.
Các chỉ tiêu theo dõi như số nhánh, chiều dài lá, sự thay đổi huỳnh quang diệp lục, và trọng lượng tươi, khô của lá, thân, rễ được sử dụng để đánh giá khả năng chịu hạn của các giống cây trồng Đánh giá này được phân loại thành ba mức độ: Chống chịu, chống chịu trung bình và mẫn cảm, dựa trên phương pháp tính toán của IRRI.
Phân loại khả năng chịu muối của các giống được thực hiện dựa theo thang điểm đánh giá lá bị hại như sau:
1 Đầu lá hơi bị héo hoặc lá gần như bình thường
3 < ẳ tổng số lỏ bị hộo hoặc mất màu xanh
5 1/4 - 1/2 tổng số lá bị héo hoặc mất màu xanh
7 Hơn 2/3 tổng số lá bị héo hoặc mất màu xanh
Phương pháp đo huỳnh quang diệp lục bằng IMAGING-PAM Flurometer (Walz, Germany) được áp dụng để đánh giá ảnh hưởng của xử lý hạn đến khả năng quang hợp thông qua việc đo hàm lượng quang hoá II Hầu hết các lá bị héo cho thấy sự suy giảm trong khả năng quang hợp.
Năng lượng ánh sáng hấp thụ bởi các sắc tố quang hợp không được sử dụng trong quá trình quang hợp sẽ được bức xạ dưới dạng huỳnh quang hoặc mất đi dưới dạng nhiệt Huỳnh quang chlorophyll ở thực vật là chỉ số phản ánh hoạt tính quang hợp, và các kỹ thuật hiện đại đo huỳnh quang đã trở thành công cụ quan trọng trong nghiên cứu sinh lý thực vật Việc áp dụng các kỹ thuật này đã mang lại kết quả quan trọng, giúp giải thích nguồn gốc và cơ chế của hiện tượng bức xạ huỳnh quang Tuy nhiên, lý thuyết về hiện tượng huỳnh quang chủ yếu được nghiên cứu trên các đối tượng như protoplast, lục lạp tách ra và màng thylakoid, do đó, việc hiểu rõ hơn về hiện tượng này ở các cơ thể quang hợp nguyên vẹn, đặc biệt là ở lá thực vật bậc cao, vẫn cần được làm sáng tỏ.
Trong 15 năm qua, nhiều nghiên cứu đã được thực hiện về huỳnh quang chlorophyll, nhấn mạnh mối liên quan của nó với các hiện tượng vật lý và quang hợp Các công trình của Papageorgiou (1975), Lavorel và Etiene (1977), Butler (1977), Van Gorkom (1986), Holzwarth (1991), cùng với Renger và Schireiber (1986), Murata đã đóng góp quan trọng vào lĩnh vực này.
Satoh (1986) cùng với Krause và Weis (1991) đã cung cấp những dẫn liệu mới nhất về mối liên hệ giữa bức xạ huỳnh quang và quang hợp, sau khi tiến hành phân tích thông tin nhận được từ góc độ lý sinh và hóa sinh một cách toàn diện.
Những nét cơ bản nhất của việc sử dụng đo huỳnh quang chlorophyll để đánh giá hoạt tính quang hợp như sau:
Trong quá trình quang hợp, ánh sáng được hấp thụ bởi các sắc tố anten và năng lượng này được truyền đến tâm phản ứng của hệ quang hoá I và II, nơi diễn ra phản ứng quang hoá đầu tiên Ở cường độ ánh sáng thấp và điều kiện tối ưu, phản ứng này có hiệu quả cao, với hơn 90% lượng tử ánh sáng được hấp thụ được sử dụng cho quang hợp (Bjorkman và Deming, 1987) Hiệu suất biến đổi năng lượng quang hoá đầu tiên có thể còn cao hơn, với chỉ một phần nhỏ năng lượng bị mất dưới dạng huỳnh quang chlorophyll “a” Ở nhiệt độ phòng, phần lớn huỳnh quang phát ra từ chlorophyll “a” của hệ quang hoá II, trong khi hiệu suất huỳnh quang của chlorophyll “a” trong dung dịch có thể đạt gần 30% ánh sáng hấp thụ Tuy nhiên, khi các tâm phản ứng đóng, hiệu suất huỳnh quang trong bộ máy quang hợp chỉ đạt gần 3%, và khi tất cả các tâm phản ứng mở, hiệu suất này giảm xuống khoảng 0,5% do sự cạnh tranh với phản ứng quang hóa.
( Z P680 Pheo QA QB )1 (các tâm phản ứng mở)
Q B ) 4 ( Các tâm ph ả n ứ ng đ óng )
) 7 ( Các tâm phản ứng mở )
Hình 2.1: Hiện tượng dịch chuyển điện tử quang hợp trong các tâm phản ứng của hệ quang hóa II
Để phân tích sự cạnh tranh giữa phản ứng quang hóa và huỳnh quang chlorophyll, trước tiên chúng ta cần mô tả ngắn gọn hiện tượng dịch chuyển điện tử trong các tâm phản ứng của hệ quang hóa II.
Khi phản ứng quang hóa diễn ra, một điện tử được chuyển từ sắc tố P680 (chlorophyll) ở trạng thái kích thích singlet đầu tiên đến phân tử pheophytin, sau đó tiếp tục được chuyển đến chất nhận đầu tiên dạng Quinon (QA, QB).
Sự phân chia điện tích tạo ra chất ôxy hóa hoạt tính cao – P + 680, có khả năng nhận điện tử từ chất cho điện tử thứ 2 Z (Tirozin D1 - protein) Chất cho điện tử Z ở trạng thái ôxy hóa sẽ được khử bằng các điện tử từ hệ ôxy hóa nước Trong phản ứng chậm, với sự tham gia của nguyên tử sắt, điện tử dịch chuyển đến Quinon B (Q B) Sau khi nhận 2 điện tử, Q B liên kết với 2 proton từ vùng stroma của màng thylakoid và chuyển về plastoquinon Hiệu suất huỳnh quang của phân tử chlorophyll ở các cơ thể quang hợp thay đổi và phụ thuộc vào trạng thái của các tâm phản ứng của hệ quang hoá II.
Khi kích thích huỳnh quang bằng ánh sáng cực ngắn và yếu, mỗi tâm phản ứng chỉ hấp thụ một lượng tử ánh sáng, năng lượng kích thích nhanh chóng được chuyển từ phức hệ anten cảm nhận ánh sáng đến phức hợp sắc tố của tâm phản ứng, chủ yếu là chlorophyll “a” Năng lượng này được xác định thông qua sự tương quan của các hằng số tốc độ của ba quá trình cạnh tranh, nhằm loại bỏ trạng thái kích thích của phân tử chlorophyll trong phức hợp của tâm phản ứng.
Ph ươ n g pháp sinh h ọ c phân t ử th ự c v ậ t
Phương pháp tách mRNA và tạo dòng phân tử cDNA được thực hiện bằng cách sử dụng phương pháp Guanidium thiocyanate (GCN) của Chomczynski và Sacchi (1987), với sự điều chỉnh bằng bộ kit RNeasy của QIAGEN Sau đó, các vi bản dòng cDNA được tạo ra từ mỗi thư viện, tiến hành lai và chọn lọc các dòng cDNA dương tính, đồng thời đọc trình tự gen phân lập được Kết quả là ngân hàng cDNA đa dạng được xây dựng từ rễ, lá, phôi của giống lúa có khả năng chịu hạn và mặn Cuối cùng, khoảng 10.000 - 15.000 dòng cDNA được tạo ra từ mỗi thư viện, sử dụng phương pháp RT-RT-PCR.
PCR định lượng, hay còn gọi là Real-time PCR, là phương pháp PCR cho phép xác định lượng sản phẩm PCR (tương đối hoặc tuyệt đối) tại mỗi thời điểm trong quá trình phản ứng, tức là ở mỗi chu kỳ của phản ứng.
Cường độ phát quang trong ống phản ứng tỷ lệ thuận với lượng sản phẩm PCR Có hai phương pháp để đo cường độ phát quang này.
Hình 2.2: Nguyên lý cường độ phát quang
1) Bổ sung một hợp chất hóa học đặc biệt có tên gọi SYBR Green 1 Hợp chất này có tính chất đặc biệt là dưới ánh sáng halogen phát quang rất mạnh khi chui vào kẽ của DNA sợi kép; khi ở dạng tự do hầu như không phát quang:
Sản phẩm PCR gia tăng theo chu kỳ phản ứng, dẫn đến sự tăng lên của lượng SYBR Green 1 gắn vào sợi DNA đôi, từ đó cường độ phát quang cũng tăng theo Hệ thống detector thu nhận tín hiệu phát quang và gửi về trung tâm, trong khi phần mềm ghi nhận dữ liệu dưới dạng đường cong tương ứng.
Hình 2.3: Sản phẩm PCR tăng dần theo chu kỳ phản ứng
Tín hiệu phát quang được biểu diễn qua đường cong tương ứng, trong đó số lượng sợi khuôn lớn trong ống phản ứng sẽ dẫn đến sự xuất hiện sớm của đường cong, ngược lại, số lượng sợi khuôn ít sẽ làm đường cong xuất hiện muộn hơn.
2) Nguyên lý chuyển năng lượng cộng hưởng phát quang (Fluorescence Resonance Energy Transfer: FRET): Nếu cả hai hợp chất màu A và B, hợp chất A được kích hoạt bởi nguồn sóng có bước sóng λ1 và phát ra ánh sáng có bước sóng λ2; ánh sáng có bước sóng λ2 lại chính là nguồn kích hoạt đối với hợp chất B khi B đứng gần A và hấp thụ ánh sáng phát ra từ A làm cho B phát ra ánh sáng có bước sóng λ3
The phenomenon known as FRET is utilized in real-time PCR to quantify PCR products present in the reaction tube through two methods: a) hydrolysis probes (Roche) and b) hydrolysis probes (TaqMan probe, Applied Biosystems).
Real-time PCR sử dụng mẫu dò thủy phân, trong đó probe 1 có đầu 3’ gắn huỳnh quang được kích hoạt ở bước sóng λ1 và phát quang ở bước sóng λ2 Probe 2 có đầu 5’ gắn LC Red, được kích hoạt ở bước sóng λ2, phát ra từ Fluorecein, tạo ra tín hiệu cho quá trình phát hiện.
Red phát quang ở bước sóng λ3 xảy ra khi cả hai probe bắt cặp bổ sung với sản phẩm PCR tại một thời điểm nhất định, tạo ra huỳnh quang gần LC Red.
Hệ thống lọc chỉ cho phép bước sóng λ3 đi qua, do đó tín hiệu phát quang chỉ được ghi nhận khi cả hai probe gắn vào sợi khuôn của sản phẩm PCR Sản phẩm PCR tăng dần theo từng chu kỳ, dẫn đến sự gia tăng cường độ phát quang khi probe bám vào sợi khuôn.
Hình 2.4: Mẫu dò lai b) Mẫu dò thủy phân (TaqMan probe)
Cả hai chất phát quang FAM (Reporter) và TAMRA (Quencher) được gắn trên một probe, với FAM ở đầu 5’ và TAMRA cách FAM khoảng 18-20 bazơ về phía 3’ Khi FAM được kích hoạt bởi bước sóng λ1 và phát ra bước sóng λ2, TAMRA sẽ hấp thụ λ2 và phát ra λ3, khiến λ2 không thể phát ra Taq DNA polymerase không chỉ có hoạt tính polymerase mà còn có hoạt tính 5’-exonuclease, cắt FAM ra khỏi đầu 5’ của probe, cho phép FAM phát ra bước sóng λ2 Máy chỉ thu nhận bước sóng λ2, do đó tín hiệu phát quang chỉ xuất hiện khi FAM được giải phóng khỏi probe Khi chu kỳ sản phẩm PCR tăng, probe bám vào nhiều hơn và FAM bị cắt ra nhiều hơn, dẫn đến phát quang mạnh mẽ hơn.
Hình 2.5: Mẫu dò thủy phân (TaqMan probe)
PCR định lượng được thực hiện tương tự như PCR thông thường, nhưng cần bổ sung SYBR Green 1 cho Real-time PCR và sử dụng mẫu dò thủy phân hoặc TaqMan probes Máy Real-time PCR thường được sử dụng, như Roche với mẫu dò thủy phân, trong khi các hãng khác như Applied Biosystems, Bio Rad, và Stratagene thường sử dụng TaqMan probes SYBR Green 1 có thể sử dụng cho tất cả các máy Ứng dụng của phương pháp này bao gồm định lượng, xác định đột biến với mẫu dò thủy phân, xác định đột biến với TaqMan probes, và định tính để xác định gen thuộc loài nào.
Hình 2.6: Định lượng (I), xác định đột biến với mẫu dò lai (II), xác định đột biến với
Các probe TaqMan được sử dụng để định tính và xác định gen thuộc loài nào Phương pháp phân lập gen dựa trên hoạt tính từ ngân hàng gen cho phép đọc trình tự và phân tích 3-4 gen đã được phân lập Ngoài ra, việc thiết kế gen cũng rất quan trọng, bao gồm việc tạo plasmid mang gen chịu mặn và hạn, như gen PA, được tách ra từ giống lúa chống chịu.
Hình2.7: Cấu trúc vector pCAMBIA1300 dùng để thiết kế gen nhaA, OAT
Hình 2.8: Cấu trúc vector pCAMBIA1390/Ubill dùng để thiết kế gen CGS
Ph ươ ng pháp phân tích
2.3.3.1 Phân tích protein tổng số, phân tích khối phổ bằng sắc ký/ quang phổ khối
Hạt lúa chín được tách lớp vỏ cứng bên ngoài, sau đó được nghiền thành bột mịn
Cân 1mg bột gạo trong ống thuỷ tinh và chuyển vào hệ thống phân tích ở nhiệt độ 150 °C và áp suất 1034 mbar trong 20 phút Sau khi làm khô ống thuỷ tinh, chuyển sang hệ thống phân tích sắc kí lỏng cao áp để xác định thành phần axít amin từ các phản ứng thủy phân Các đường cong chuẩn được lập để tính toán thành phần mỗi axít amin theo nmol/mg vật liệu phân tích, với BSA được sử dụng làm mẫu chuẩn trong thí nghiệm.
Hình 2.9: Phân tích protein tổng số
Tách chiết và xác định hàm lượng các polyamine (PA) như Putrescine, Spermidine và Spermine từ giống lúa được xử lý và không xử lý Xây dựng và tối ưu hóa phương pháp xác định hàm lượng PA, đồng thời tìm hiểu mối tương quan giữa PA và các nhóm chất trong điều kiện môi trường cũng như các giai đoạn phát triển của lúa.
2.3.3.2 Xây dựng phương pháp xác định mối tương quan của PA
Xác định mối tương quan của PA, các nhóm chất nghiên cứu đến tính chống chịu và hàm lượng ABA
Phân tích phổ trao đổi chất bằng GC/MS nhằm xác định được 300 chất có ở giống lúa chịu hạn và mặn.
Ph ươ ng pháp bi ế n n ạ p gen vào cây lúa
ch ị u h ạ n và m ặ n và hàm l ượ ng axít amin
- Thiết kế vector mang gen quan tâm để chuyển vào lúa
- Gen nhaA (Na+/H+ antiporter), OAT (Ornithine Aminotransferase), CGS
(Cystathionin gamma-Synthase) và các gen quan tâm khác được thiết kế vào vector pCAMBIA1300, pCAMBIA1390/Ubill phục vụ cho thí nghiệm chuyển gen
2.3.4.1 Chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
- Các bước chuyển gen được mô tả theo Hình 2.10
Hình 2.10: Sơ đồ các bước chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
Hệ thống chuyển gen được xác nhận thông qua biểu hiện tạm thời của gen GUS Sau 10 ngày diệt khuẩn, các mô sẹo sẽ được nhuộm GUS để kiểm tra tính hiệu quả của hệ thống chuyển gen.
Qui trình chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
(1) Tạo mô sẹo từ hạt chín
1 Bóc vỏ trấu, khử trùng trong cồn 70 o 1 phút, sau đó khử trong chlorox 45% (5 - 25% dung dịch Na-hypochlorite) với 1 - 2 giọt Tween 20 trong
2 Rửa sạch hạt bằng nước cất vô trùng 4 - 5 lần
3 Gieo hạt vô trùng trong môi trường tạo mô sẹo (Thường là môi trường
5 Sau 3 - 4 tuần, tách các mô sẹo đã hoá phôi từ nội nhũ và cấy trên môi trường nhân mô sẹo
7 Cấy chuyển mô sẹo mỗi lần sau 3 - 4 tuần
(2) Nuôi khuẩn (làm trước 4 ngày)
1 Cấy Agrobacterium tumefaciens trong 10ml môi trường lỏng AAM hoặc LB có bổ sung các nhân tố chọn lọc Chú ý: Trong trường hợp dùng LBA4404 (pTOK223) để chọn lọc cho 50mg/l kanamycin và 50mg/l hygromycin
3 Cho 5ml dịch nuôi vào 25ml môi trường LB hoặc AAM có 50mg/l kanamycin và 50mg/l hygromycin
4 Lấy dịch khuẩn đã nuôi trong AAM cấy một vạch lên môi trường AB có các kháng sinh tương tự
1 Ly tâm dịch vi khuẩn 3800v/p trong 30 phút, loại bỏ môi trường, cho vi khuẩn vào 20ml MgSO4 (10mM) trong ống ly tâm 50ml Trong trường hợp nuôi vi khuẩn trong MT rắn thì lấy trực tiếp trong dung dịch MgSO4
2 Hỳt 2.7ml dung dịch MgSO4cho vào 1 ống khỏc, lấy 300àl dịch vi khuẩn cho vào
3 Đo chỉ số OD (optical density) của hỗn hợp (bước 2), 600nm
4 Ly tâm dịch vi khuẩn trong 20ml MgSO4, 3800v/p, 30 phút, loại bỏ dịch nổi
5 Làm tan tủa, dựng pipet hút lên, xuống vài lần trong môi trường thẩm thấu N6-AS, chỉnh thể tách dịch sao cho khi đo chỉ số OD xấp xỉ bằng 2
6 Cho các mô sẹo hoá phôi vào đĩa petri có vi khuẩn trong môi trường thẩm thấu
7 Thẩm thấu bằng máy hút chân không, cho đĩa petri vào máy hút chân không trong 10 phút
8 Để 20 phút sau dựng pipet hút hết dịch vi khuẩn
9 Thấm khô mô sẹo bằng giấy lọc vô trùng Cấy mô lên môi trường rắn (N6-AS), để trong tối, 3 ngày, ở 25 o C
(4) Diệt khuẩn và chọn lọc
1 Rửa mô sẹo hai lần bằng nước cất khử trùng có chứa 250mg cefotaxime để loại bỏ vi khuẩn
2 Cho mô sẹo vào giấy thấm vô trùng để thấm sạch nước
3 Lấy một vài cục mô nhuộm GUS để kiểm tra biểu hiện của GUS, phần còn lại cấy vào môi trường chọn lọc (N6-CH) có chứa 250mg/ l cefatoxime và 50mg/l hygromycin
4 Giữ mô sẹo nhuộm GUS qua đêm ở 37 o C
5 Kiểm tra và đếm số chấm màu xanh trên từng cục mô
6 Nuôi cấy các mô sẹo được chuyển gen trên môi trường chọn lọc, và chọn lọc ít nhất 6 lần
7 Chuyển mô sang môi trường tái sinh cây
1 Chuyển các mô sẹo hoá phôi sang môi trường tái sinh
2 Đặt trong điều kiện 26 o C, thời gian chiếu sáng 16giờ/ngày, cường độ ánh sáng 2500lux
3 Chuyển các cây mới tái sinh sang môi trường MS không có chất kích thích sinh trưởng để tạo rễ và cây hoàn chỉnh, trong điều kiện 26 o C, thời gian chiếu sáng 16giờ/ngày, cường độ ánh sáng 2500lux
Dựa trên các kết quả nghiên cứu, hoàn thiện hệ thống tái sinh cao trong nuôi cấy mô lúa để chuyển gen
Bảng 2.2: Thành phần các môi trường nuôi cấy được sử dụng trong nghiên cứu chuyển gen thông qua A tumefaciens ở lúa
Môi tr ườ ng Thành ph ầ n
Môi tr ườ ng t ạ o mô s ẹ o c ơ b ả n NB c ơ b ả n, 100mg/l inositol, 1g/l casmino, 30g/l sucrose,
3g/l Gelrite, pH5.8 Môi tr ườ ng NHCI Môi tr ườ ng t ạ o mô s ẹ o c ơ b ả n + 3.0mg/l 2,4-D
Môi tr ườ ng NHCII Môi tr ườ ng t ạ o mô s ẹ o c ơ b ả n + 2.0mg/l 2,4-D
AAM AAM c ơ b ả n, 200àM acetosyringone, 10g/l glucose, pH5.2
Môi tr ườ ng NB c ơ b ả n NB c ơ b ả n, 100mg/l inositiol, 1g/l casmino, 30g/l sucrose, pH5.8
Mụi tr ườ ng CB NB c ơ b ả n, 2.0mg/l 2,4-D, 30 g/l glucose, 100àM acetosyringone, 3g/l Gelrite, pH5.2
Môi tr ườ ng NHCIII NB c ơ b ả n, 2.0mg/l 2,4-D, 25mg/l hygromycin, 250mg/l cefotaxime, 3g/l Gelrite, pH 5.8
Môi tr ườ ng NHCIV NB c ơ b ả n, 2.0mg/l 2,4-D, 50mg/l hygromycin, 250mg/l cefotaxime, 3g/l Gelrite, pH 5.8
Môi tr ườ ng NHCV NB c ơ b ả n, 2.0mg/l BA, 0.5mg/l NAA, 0.5mg/l Kin, 50mg/l hygromycin, 250mg/l cefotaxime, 3g/l Gelrite, pH 5.8
2.3.4.2 Đánh giá cây chuyển gen
Theo dõi và nuôi trồng cây tái sinh được chuyển gen (thế hệ T o )
1 Chuyển những cây có bộ rễ khoẻ mạnh trồng trên các lỗ của tấm xốp mỏng đặt trong chậu có chứa dung dịch nuôi cấy Yoshida hoặc 1/2MS Nuôi trồng trong nhà lưới hoặc phytotron ở nhiệt độ ban đêm 21 0 C, ban ngày 29 o C (9- 10giờ/ngày, 14-15giờ/đêm)
2 Ghi số ký hiệu cho từng cây, những cây trồng trong dung dịch phải thay dung dịch thường xuyên hoặc 1-2 tuần một lần
3 Trồng những cây có bộ rễ khoẻ mạnh trong các chậu có chứa đầy đủ phân bón
4 Cho mỗi đòng lúa vào một bao nhỏ trước khi nở hoa để tránh thụ phấn chéo
5 Thu các bông lúa có 85% số hạt chín vàng
6 Cho từng bông vào các bao giấy, phơi nắng 3 ngày hoặc sấy hơi nóng 70 0 trong 24 giờ, đạt độẩm là 12 - 14%
7 Dùng tay tách hạt ra khỏi bông, cho vào túi nhựa hoặc cốc thuỷ tinh có chất hút ẩm silica gel, để ở 8-10 o C Sử dụng hạt To cho các nghiên cứu tiếp theo
Theo dõi và nuôi trồng cây chuyển gen ở các thế hệ tiếp theo
1 Hạt của từng bông được gieo cấy riêng rẽ trong nhà kính hoặc nhà lưới đảm bảo an toàn cho cây chuyển gen
2 Theo dõi các đặc điểm nông sinh học của từng dòng
3 Đánh giá và sàng lọc các cây bị nhiễm bệnh và côn trùng để tách ra và kiểm tra về bệnh học và côn trùng học
4 Qua mỗi thế hệ thu mẫu, phân tích và đánh giá sự tồn tại và ổn định của gen được chuyển Đánh giá cây chuyển gen trong phòng thí nghiệm
(1) Ki ể m tra cây chuy ể n gen b ằ ng k ỹ thu ậ t PCR
- Sử dụng cặp mồi đặc hiệu của gen được chuyển để kiểm tra sự có mặt của gen
- Sử dụng các bộ phận khác nhau của cây chuyển gen để tách chiết DNA
Phản ứng PCR được thực hiện với thể tích 25 µl, bao gồm các thành phần sau: 2,5 µl đệm 10X, 2,5 µl MgCl₂ 2,5 mM, 1 µl dNTP 2,5 mM, 1 µl mồi 1, 1 µl mồi 2, 0,125 µl Taq polymerase (5U/µl), 1 µl DNA khuôn (10 ng/µl) và 15,875 µl H₂O.
- Tiến hành nhân bản đoạn gen quan tâm trong máy PCR, chu trình nhiệt của máy: 94 o C - 3 phút; 30 chu kỳ (94 o C - 30 giây, 52-58 o C - 30 giây, 72 o C - 1 phút); 72 o C - 10 phút; sau đó giữ ở 4 o C
- Phân tích sản phẩm PCR trên gel agarose 1,4% trong dung dịch TBE 0,5X, sau đó gel được nhuộm trong dung dịch ethidium bromide 1% và chụp ảnh
Trong cây lúa có gen chuyển, sẽ xuất hiện một bóng vạch trên bản điện di có kích thước tương ứng với gen chuyển Ngược lại, nếu cây không được chuyển gen, bóng vạch này sẽ không xuất hiện.
(2) Ki ể m tra cây chuy ể n gen b ằ ng k ỹ thu ậ t lai Southern
* Hoá chất, dung dịch và thiết bị
Hoá chất: N a C l ; N a O H ; N a - C i t r a t ; T r i s- H C l ; S D S ; a x i t m a l e i c ; N- lauroylsarcosine; Tween 20; bộ kit lai DIG (DIG-High Prime DNA labeling and Detction Starter Kit II- Roche); nước cất 2 lần và khử trùng; thuốc hiện phim X-quang
* Dụng cụ và thiết bị: Giấy thấm (Whatman); màng nylon (Positive charges
Roche Diagnostic GmbH cung cấp các thiết bị y tế như bể thấm chuyển bằng nhựa hoặc thủy tinh, tủ ấm, ống lai, và lò phản ứng lai Bio-labo Ngoài ra, còn có hộp chụp phim X-quang Kodak X-OMATIC Cassette, phim X-quang và nước hiện.
* Quy trình thấm chuyển và lai Southern
Cắt DNA genom bằng enzym giới hạn và phân giải trên gel
- Cho 5 àg DNA genom vào ống eppendorf, bổ sung dung dịch đệm, enzym (40-50 u) và nước tới thể tớch 35 àl ủ ở 37 o C, trong 16-18 giờ
- Chạy điện di DNA cắt giới hạn trên gel agarose 0,8%, điện thế 40-50V, 12-14 giờ
Thấm chuyển DNA lên màng nylon
DNA ở dạng sợi được chuyển lên màng nylon theo phương pháp thấm ngược Các bước tiến hành như sau:
- Xử lý bản gel điện di DNA trong dung dịch biến tính, lắc nhẹ 20 phút
- Đổ dung dịch thấm chuyển (0,4M NaOH và 0,6M NaCl) vào bể
Thấm ướt 3 lớp giấy thấm trong bể thấm chuyển, sau đó đặt lên một vật đỡ như tấm kính hoặc vật cứng khác Điều này tạo thành cầu giấy có chiều dài đủ để ngập trong dung dịch và có chiều rộng khít với bản gel.
- Đặt úp mặt bản gel lên cầu giấy
- Thấm ướt màng nylon có kích thước như bản gel Đặt màng nylon lên bản gel
- Đặt 3 lớp giấy thấm có kích thước bằng bản gel lên màng nylon
- Đặt một lớp dầy các giấy thấm mỏng có khả năng thấm nhanh các dung dịch thấm ngược từ dưới lên;
- Đặt vật nặng khoảng 300-500g ở trên cùng, bên dưới vật nặng nên đặt một tấm kính mỏng để phân bốđều trọng lực của vật nặng lên các lớp giấy thấm
Rửa màng nylon trong dung dịch 2X SSC và để khô ở nhiệt độ phòng Sau đó, xử lý màng ở 65 o C trong 2 giờ Bảo quản màng nylon ở nhiệt độ phòng cho đến khi tiến hành lai với mẫu dò Đánh dấu mẫu dò và thang DNA chuẩn bằng cách lai với mồi ngẫu nhiên Quá trình đánh dấu mẫu dò lai Southern với DIG được thực hiện theo các bước cụ thể.
- Biến tớnh DNA: Bổ sung H2O vào 30ng DNA thành thể tỏch 15àl trong eppendorf Đặt eppendorf vào nước sôi, ủ trong 10 phút Lấy ống ra và đặt ngay vào đá
Bổ sung hỗn hợp 10X Hexanuleotide, 2µl 10X dNTPs và 1µl enzym Klenow với nồng độ cuối cùng là 100U/ml trong phản ứng Nếu các thành phần này có sẵn trong kit với nồng độ 5X, hãy lấy 4µl và bổ sung vào 16µl DNA đã biến tính.
- Trộn đều hỗn hợp: Ủ ở 37 o C qua đêm thì có thể thu được khoảng 1050ng DNA đánh dấu Dừng phản ứng bằng xử lý ở 65 o C, 10 phút Bảo quản ở -20 o C
- Thang DNA chuẩn được đánh dấu như trên Chỉ cần gây phản ứng trong 1 giờ, thu hoạch 130ng DNA đánh dấu là đủ cho nhiều thí nghiệm lai
- Rửa màng trong dung dịch 2X SSC, 5 phút
- Đặt màng vào ống lai Đổ 50ml dung dịch tiền lai đó được làm nóng trước vào ống Quay ống lai 12 vòng/phút ở nhiệt độ 67 o C, 2-3 giờ
Vai trò c ủ a Polyamin đố i v ớ i tính ch ị u h ạ n và ch ị u m ặ n
Đánh giá tính chịu mặn
Thí nghiệm đánh giá khả năng chịu mặn của 18 giống lúa được thực hiện trong dung dịch muối NaCl, với các thông số như chiều dài lá, chiều dài rễ, số nhánh/khóm, huỳnh quang diệp lục (PAM) và tổng trọng lượng khô của cây được đo để đánh giá mức độ chống chịu Các giống lúa được phân loại theo mức độ chống chịu khá, trung bình và mẫn cảm theo tiêu chuẩn của Viện nghiên cứu lúa Quốc tế IRRI.
Bảng 3.1 trình bày kết quả đánh giá khả năng chịu mặn của các giống lúa tham gia thí nghiệm tổng hợp theo IRRI, được thực hiện trong điều kiện nồng độ muối 100mM NaCl Thí nghiệm được tiến hành 3 lần với 5 lần nhắc lại.
S ố hi ệ u gi ố ng Tên gi ố ng Kh ả n ă ng ch ị u m ặ n H ệ s ố Nh ậ n xét theo lý l ị ch
08 Đố c ph ụ ng Trung bình 78,33 T
Hình 3.1: Các giống lúa sau khi xử lý mặn
Kết quả thí nghiệm cho thấy có sự khác biệt so với nhận xét chung trong lý lịch phân nhóm Đặc biệt, cần xem xét lại việc xếp CR203 vào nhóm lúa chịu mặn, vì thí nghiệm cho thấy CR203 chỉ thuộc nhóm chống chịu trung bình.
Đ ánh giá tính ch ị u h ạ n
21 giống lúa được xử lý hạn nhẹ trong thời gian dài (Hình 3.2)
Hình 3.2 Các giống lúa được trồng trong phytotron trong thí nghiệm xử lý hạn
Hình 3.3: Lượng nước mất đi ở mỗi cây/ 1 ngày Ngày -4 đến -1: 4 ngày rút nước để hạn
Ngày 1 đến 14: 14 ngày tưới nước phục hồi ở mức hạn chế
Khả năng chịu hạn của các giống lúa được đánh giá theo tiêu chuẩn của Viện Nghiên cứu Lúa Quốc tế (IRRI) Dữ liệu trong Bảng 3.2 cho thấy các giống lúa được phân loại thành ba nhóm dựa trên mức độ chịu hạn: nhóm chịu hạn, nhóm chống chịu trung bình và nhóm mẫn cảm.
Bảng 3.2: Kết quả đánh giá khả năng chịu hạn của các giống lúa Thí nghiệm với 5 lần nhắc lại Nhóm được phân theo mức 30% và 70% chênh lệch
S ố hi ệ u gi ố ng Gi ố ng Ch ỉ s ố phân h ạ ng H ệ s ố SE Phân lo ạ i
Kết quả thí nghiệm cho thấy sau 14 ngày rút nước để hạn, số nhánh và chiều dài lá giảm đáng kể từ 24,7-67,4% và 51,1-81,2% so với cây không xử lý hạn Tỷ lệ phần trăm trọng lượng tươi của lá và rễ cây xử lý hạn so với cây không xử lý hạn thay đổi từ 8,5-29,6% và 4,6-24,6% Trong khi đó, tỷ lệ phần trăm trọng lượng khô của lá và rễ cây xử lý hạn so với cây không xử lý hạn thay đổi từ 11,8-44% và 11,1-56,3%.
Hình 3.4 cho thấy sự biến động về số nhánh/cây (A), chiều dài lá (B), trọng lượng tươi (C) và trọng lượng khô (D) của cây không xử lý hạn so với cây đã xử lý hạn sau 14 ngày Các giống cây có giá trị dao động từ 1-19 cho thấy khả năng chịu hạn, từ 13-31 thể hiện mức độ chống chịu trung bình, và từ 2-50 cho thấy sự mẫn cảm với hạn.
Phân tích polyamin và bi ể u hi ệ n gen
Bài phân tích biểu hiện gen sử dụng tổng cộng 7 giống lúa, bao gồm 2 giống mẫn cảm (giống số 2 và 22), 2 giống trung bình (giống số 7 và 8), 2 giống chống chịu (giống số 14 và 26), cùng với 1 giống đối chứng là Nipponbare.
Hàm lượng polyamin, phổ các nhóm chất trao đổi trong tất cả các mẫu được phân tích
Thí nghiệm xử lý muối được sử dụng để phân tích hàm lượng Putrescin, Spermidin và Spermin thông qua kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp (HPLC) Kết quả phân tích được thể hiện trong Hình 3.5.
Hình 3.5: Hàm lượng Putrescine ở các giống xử lý Giống 26-1: Chống chịu; 25-28: Chống chịu trung bình; 4-50: Mẫn cảm
Tr ọ ng l ượ ng t ươ i nmol/g
Trong điều kiện bình thường, giống mẫn cảm có hàm lượng Putrescine cao hơn so với giống chống chịu Tuy nhiên, khi nồng độ muối tăng, hàm lượng Putrescine ở giống mẫn cảm giảm đáng kể, trong khi ở giống chống chịu lại tăng lên.
Hàm lượng Spermidine tăng ở các giống cây chống chịu và chống chịu trung bình, trong khi giảm nhẹ ở các giống mẫn cảm Đồng thời, hàm lượng Spermine cũng tăng ở tất cả các giống khi nồng độ muối xử lý tăng.
Hình 3.6: Hàm lượng Spermidine (A) và Spermine (B) ở các giống xử lý Giống 26-1:
Chống chịu; 25-28: Chống chịu trung bình; 4-50: Mẫn cảm
Khi xử lý hạn nhẹ kéo dài, hàm lượng putrescine và spermidine giảm, trong khi hàm lượng spermine tăng, nhưng sự thay đổi này không rõ ràng giữa các giống chống chịu.
Tr ọ ng l ượ ng t ươ i nmol/g
Tr ọ ng l ượ ng t ươ i nmol/g
Hình 3.7: Hàm lượng Putrescine (A), Spermidine (B) và Spermine (C) ở các giống xử lý
Giống 1-19: Chống chịu; 31-13: Chống chịu trung bình; 2-50: Mẫn cảm
Từ các kết quả thu được có thể đưa ra một số kết luận sau:
(1) Giữa các nhóm có sự khác biệt rất rõ về hàm lượng polyamin
(2) Các giống mẫn cảm có hàm lượng Putrescine cao hơn hẳn
(3) Hàm lượng Putrescine tỷ lệ thuận với khả năng chịu mặn
(4) Hàm lượng Putrescine tăng khi xử lý với nồng độ NaCl tăng dần
Phương pháp phân tích GC/MS được sử dụng để xác định hàm lượng Arginin và Ornithin, hai tiền chất tổng hợp polyamin, đã được nghiên cứu trong luận văn của Christian Scherling Nghiên cứu này áp dụng cho các giống lúa có khả năng chống chịu mặn khác nhau.
Hàm lượng Putrescine trong mẫu lá của các giống lúa đã được đo và cho thấy sự thay đổi rõ rệt sau 14 ngày xử lý với các nồng độ NaCl tăng dần từ 0 đến 50 và 100 mM.
Để đánh giá mức độ biểu hiện gen trong chu trình trao đổi chất polyamin, phương pháp PCR định lượng được áp dụng Các cặp mồi đặc hiệu đã được thiết kế cho các giống lúa nghiên cứu, dựa trên sự so sánh trình tự gen liên quan đến sinh tổng hợp polyamin Mồi cho hai giống lúa Indica C70 và Lốc được tìm ra từ dữ liệu trình tự nucleotit của giống Japonica có trong Ngân hàng gen Ngoài ra, nhóm nghiên cứu của Müller-Rüber cũng thiết kế mồi cho các gen điều khiển Actin và β-Tubulin, cùng với các đoạn intron kiểm soát RNA, dựa trên cơ sở dữ liệu từ Ngân hàng gen lúa.
Kết quả phân tích biểu hiện gen Arginindecarboxylase (ADC), một gen quan trọng trong chu trình sinh tổng hợp polyamin, được thể hiện rõ trong Hình 3.9.
Tr ọ ng l ượ ng t ươ i nmol/g
Biểu hiện của gen Arginindecarboxylase được nghiên cứu trong 7 giống lúa với khả năng chịu mặn khác nhau, bao gồm 26 và 14 (chống chịu khá), 7 và 8 (trung bình), cùng với 2, 22 và 50 (mẫn cảm) sau 14 ngày xử lý muối với nồng độ 0, 50, và 100mM NaCl RNA được tách chiết từ 5 cây mạ đã bị xử lý mặn và tiến hành phân tích với hai lần lặp lại Giá trị ∆∆Ct được sử dụng để biểu thị mức độ biểu hiện của gen.
3.2 Xác định gen mới điều khiển kiểm soát tính chịu mặn và chịu hạn
Danh mục tra cứu trực tuyến về Ngân hàng dữ liệu các yếu tố điều khiển phiên mã gen ở lúa, gọi là "Rice Transcription Factor Database", đã xác định được 2512 yếu tố phiên mã (TF) tiềm năng Một bộ mồi đặc hiệu cho 192 gen liên quan đến khả năng chịu mặn đã được lựa chọn để sử dụng trong PCR định lượng (RT-RT-PCR) RNA được tách chiết từ rễ và các bộ phận của thân thuộc bốn giống lúa: Cườm, Chăm, Lúa mặn và DR2 Chất lượng của các mồi được đánh giá thông qua hệ số mồi E -S, với s là biến số thuận của đồ thị vùng tuyến tính, cho thấy hơn 80% các cặp mồi đạt yêu cầu (E>0.6) Tuy nhiên, khoảng 6.25% số mồi cho kết quả nhân bản không đặc hiệu.
Hiệu quả hoạt động của các cặp mồi trong phản ứng RT-PCR được đánh giá qua độ nhạy của phản ứng, được kiểm tra bằng cách pha loãng nồng độ dung dịch RNA khuôn mẫu Các mẫu RNA thu được từ các mô khác nhau cho thấy mối tương quan tỷ lệ thuận với tốc độ phản ứng.
Hình 3.11: Độ nhạy của phản ứng RT-RT-PCR với các mẫu RNA thu được từ thân (trái) và rễ (phải) cây mạ
Trong nghiên cứu này, mức độ biểu hiện của 6 gen cảm ứng dưới tác động của khô hạn và muối đã được đánh giá với các số liệu được xử lý theo nguyên tắc thống kê Kết quả cho thấy, sau khi xử lý mặn và áp suất thẩm thấu cao, có 4 trong số 6 gen đã tăng mức độ biểu hiện, đồng thời phát hiện nhiều nhóm ABRE-Cis trong các đoạn điều khiển của các gen TF.
Đánh giá mức độ biểu hiện của gen điều khiển tính chịu mặn trong cây lúa được thực hiện bằng kỹ thuật RT-RT-PCR, sử dụng 6 cặp mồi đặc hiệu thiết kế dựa trên dữ liệu từ ngân hàng gen cây lúa.
Dựa trên những kết quả ban đầu, nguồn mồi được triển khai tại công ty MWG để hệ thống hóa việc sàng lọc các yếu tố điều khiển.
3.2.2 Xây d ự ng ph ươ ng pháp
- Kỹ thuật trồng lúa và xử lý hạn đối với các giống lúa Việt Nam thuộc loài phụ Indica
- Qui trình phân lập RNA từ mẫu mô cây mạ đã xử lý