ứng dụng công nghệ sinh học trong nhân giống lan hài paphiopedium

ứng dụng công nghệ sinh học trong nhân giống lan hài paphiopedium tài liệu, giáo án, bài giảng , luận văn, luận án, đồ á...

MỤC LỤC

LỜI MỞ ĐẦU

Lan Hài thuộc học lan Orchidaceae là một trong những họ lớn nhất của thực vật

có hoa ; là một nhóm rất khác biệt bởi cấu trúc hoa khác thường với một cánh hoa giữa( còn gọi là môi hay cánh hoa ) hình túi sâu trông giống như một chiếc hài nằm ở vị tríthấp nhất của hoa, do đó trở thành tên chung chủa nhóm lan này Lan hài ở Việt Nam

đã được CITES công nhận và bảo vệ Và theo các chuyên gia về thực vật thì chưa cóloài nào trong hệ thực vật của Việt Nam mà có tốc độ tiệt chủng nhanh như các loài lan

Ứng dụng Công nghệ Sinh học trong nhân giống lan Hài Paphiopedilum

Trên thế giới, đã tiến hành nghiên cứu hoa lan hài từ rất sớm nhưng cho đến lúcnày vẫn không có nhiều báo cáo mô tả về những phương pháp nuôi cấy vô trùng trongnhân giống lan hài vì mẫu cấy của loài này rất khó bảo quản Nhưng gần đây, TS.Dương Tấn Nhựt đã công bố nhân thành công giống lan Hài Hồng (Paph Delenatii )bằng phương pháp vô tính mà cụ thể là “ gây vết thương kết hợp nuôi cấy mô trong môitrường lỏng ” Mở ra một hy vọng cho việc bão tồn và thương mại hóa nhóm lan này

Vì vậy trong bài này chúng tôi xin được phép tổng hợp và giới thiệu đến các bạnmột số phương pháp nhân nhanh và các vấn đề cần quan tâm khi trồng và chăm sóclan Hài

ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG NHÂN

GIỐNG LAN HÀI

I TỔNG QUAN VỀ LAN HÀI VÀ TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU

1 Lan Hài Paphiopedilum sp

Hiện nay đã thống kê được hơn 60 loài lan Hài (Paphiopedilum sp.) trên toàn thếgiới Chúng phân bố từ Hymalaya đến Indonesia, Philippines Một trong những cái nôicủa giống lan hài là ở biên giới Việt Nam - Trung Quốc Đa số lan hài mọc thành từngđám ở kẽ đá, nhất là đá vôi, bờ suối có cát, đất mùn và lá cây mục cùng rêu và dương

xỉ Toàn bộ chi lan Hài Paphiopedium ở Việt Nam đều được đưa vào sách đỏ và Công

ước quốc tế (CITES) để bảo vệ loài lan xinh đẹp, quyến rũ này trong thiên nhiên hoang

dã

Ở Việt Nam ta có tất cả là 18 giống chính và 6 giống lai tự nhiên.Giống chính là:

- Paph delenatii Guillaum - Paph vietnamense

- Paph malipoense - Paph micranthum

- Paph hangianum - Paph emersonii

- Paph concolor - Paph hirsutissinum

- Paph barbigeum - Paph tranlienianum

- Paph Helenae - Paph fanaticum

Các giống lai tự nhiên là:

- Paph x affine - Paph siamense

- Paph x aspersum - Paph hermannii

- Paph x dalatense

Ứng dụng Công nghệ Sinh học trong nhân giống lan Hài Paphiopedilum

Lan Paphiopedilum thuộc bộ phụ Paphiopedilinae, bộ Cypripedieae, họOrchidaceae Trong điều kiện thích hợp, hoa có thể trổ 2 lần hoặc hơn trong năm Đây

là loại có hoa rất đặc biệt, dạng hình túi giống như chiếc hài của phụ nữ, vì vậy mà

chúng còn được gọi là Lady’s slipper hay slipper orchid Giống lan Paphiopedilum được

chia thành 2 nhóm, nhóm có lá đốm phát triển ở điều kiện mát rất dễ trồng và nhóm có

lá xanh phát triển ở điều kiện lạnh hơn Hoa giống như sáp, có cánh dạng hình túi và cóđài hoa ở mặt lưng Hoa đa dạng màu sắc, lâu tàn, có thể kéo dài trong vài tuần

Một vài loài tiêu biểu:

a Paphiopedilum delenatii

Đây là loài cho hoa đẹp nhất trong các loại Paphiopedilum, có túi màu hồng, có

kích thước khoảng 7cm và thường trổ 2-3 bông trên 1 cuống Lần đầu tiên nó đượcphát hiện ở Việt Nam vào những năm 1900 Tuy nhiên, đây là loài tương đối khó trổbông Nó cần khí hậu lạnh để trổ hoa, vì vậy cần hạ thấp nhiệt độ khi cây phát triển.Cây phát triển tốt dưới ánh sáng đèn phòng, bên bệ cửa sổ hay trong nhà kính

Câu chuyện về loài lan hài hồng Paphiopedilum delenatii là một giai thoại đẹp về

loài lan hài quí hiếm ở Việt Nam

Vào năm 1913, một sỹ quan người Pháp đã tìm thấy cây lan này ở miền thượng

du miền Bắc Việt Nam Chàng sỹ quan đẹp trai, đa tình này đã mang cây hoa về pháp

để tặng cô người yêu sinh đẹp nhân dịp sinh nhật của nàng và từ đó đến nay chưa cóbất cứ một thống tin hay bằng chứng về loài lan này còn được tìm thấy ở phía Bắccũng như chàng sỹ quan đó đã không bao giờ trở về gặp lại người mình yêu nữa

Cho mãi đến năm 1922 nhà thám hiểm người pháp Poilane lại tìm thấy nhữngbông hoa lan đẹp rực rỡ này ở Khánh Hòa và mang về Pháp gửi cho Delenat – mộtngười làm vườn của lâu đài St Germaine en Laye gần St Cloud đễ trồng và chăm sóc

và khi cây lan quí hiếm này nở hoa, nhà thực vật học người pháp André Guillaumain đã

mô tả và công bố loài lan mới cho khoa học lấy tên ông Delenat để đặt tên cho cây lan.Sau đó không có bất cứ thong tin nào về loài lan này được tìm thấy trong thiên nhiênhoang dã Việt Nam, trong khi Vacherot & Lecoufle - một vườn cây tại Pháp đã cấyđược hạt, nhân được giống nên độc chiếm thị trường thế giới và nhờ cây lan này họ đãnhận được nhiều giải thưởng cũng như tiền bạc trong việc bán giống hoa lan này Sau

70 năm không có bất cứ thong tin nào về loài này ở Việt Nam Năm 1992, một số lớncây lan hài này xuất hiện tại thị trường chợ đen ở Hong Kong, rồi từ đó xuất cảng sangNhật Bản, Hoa Kỳ, Pháp và Đức… những bí mật về cây lan bản địa này được xuất bánvới giá rẻ mạt trên thị trường quốc tế cũng bí ẩn như chính vùng phân bố của chúngtrong thiên nhiên hoang dã Việt Nam

Ứng dụng Công nghệ Sinh học trong nhân giống lan Hài Paphiopedilum

Mới đây các thành viên Sinh vật rừng Việt Nam đã tìm thấy cây Lan hài hồng

Paphiopedilum delenatii tại núi Hòn Bà thuộc tỉnh Khánh Hòa, cách Nha Trang chừng

60 km và trên cao độ từ 800 – 1.000m gần ranh giới tỉnh Lâm Đồng và Khánh Hòa Loàilan mọc thành bụi nhỏ trên các hốc đá ẩm ướt Lá dài 8 – 11cm, rộng 3 – 4cm, xếp 2dãy, hình thuôn dài, mặt trên màu lục thẫm, mặt dưới nhạt hơn, có nhiều chấm màu tía.Cụm hoa dài 20cm, có 1 – 2 hoa, cuống màu lục, có chấm đỏ và lông thưa Lá bắc 2,hình bầu dục, dài 1,2 – 1,5cm Hoa màu hồng, đường kính khoảng 8cm

b Paphiopedilum vietnamense :

Cây Paph vietnamense giống tựa như delenatii, có 3 -5 lá, nhánh hoa cao 25 cm,hoa có đường kính 10-12 cm Cây mọc ở núi đá vôi trên độ cao 350-550 m Hoa nở vàotháng ba Vào năm 2002 người ta tìm ra cây vietnamense đột biến, Paphiopedilumvietnamense fma alba,hoa màu trắng

Đây là loại dễ trồng đối với người mới biết trồng lan và dễ trổ hoa dù đặt bên cửa

sổ, dưới ánh sáng đèn phòng hay trong nhà kính Nên trồng cây trong điều kiện nhiệt

độ ấm áp, ánh sáng vừa, độ ẩm tốt thì cây sẽ phát triển tốt và trổ hoa vào mùa xuân.Hoa có có kích thước khoảng 5-8cm, màu trắng hay ngà có đốm màu hạt dẻ và rũxuống

Lan Paphiopedilum bellatulum

d Lan Paphiopedilum Francisco Freire

Đây là loại dễ trồng và rất dễ trổ bông dưới ánh đèn, bên cửa sổ hay trong nhàkính Cây phát triển tốt trong chậu nhựa lẫn chậu đất sét, điều kiện nhiệt độ ấm Đây làloại cho hoa đẹp, và lâu tàn

Ứng dụng Công nghệ Sinh học trong nhân giống lan Hài Paphiopedilum

e Lan Paphiopedilum Callosum

Đây là một trong những loài dễ trồng nhất của giống lan Paphiopedilum Loài này

có hoa đẹp, kích thước khoảng 8-11 cm, có những vân sọc từ xanh lá đến tím, có lông

Năm 1999 một nhà trồng lan người Đức tên là Popow đã nhân giống cây delenatiivới vietnamense, đến năm 2002 cây con nở hoa, ông đặt là Paphiopedilum Ho ChiMinh Cây lan hài Ho Chi Minh là sự kết hợp giữ 2 vẻ đẹp của cây delenatii (cây mẹ) vàvietnamense (cây cha), một vẻ đẹp Á đông thuần túy Ông Popow cho tôi biết tên câylan này không được công nhận, vì khi ông đem ra cầu chứng ông không xuất trìnhđược giấy tờ hợp pháp của 2 cây cha và mẹ bởi vì toàn bộ lan nữ hài của Việt namnằm trong danh sách do CITES cấm xuất cảng Vì vậy tên chính thức của cây này làPaph delenatii x Paph.vietnamense

g Hình ảnh một số giống lai :

Ứng dụng Công nghệ Sinh học trong nhân giống lan Hài Paphiopedilum

Pap.malipoense x Pap Delenatii Paphiopedilum Dellophyllum delenatii xglaucophyllum

2 Sơ lược về tình hình nghiên cứu cây lan hài:

Phương pháp nuôi cấy vô trùng trong nhân giống lan hài khó thực hiện thành công

vì mẫu nuôi cấy của loài này rất khó bảo quản Nhiều thử nghiệm về mẫu cấy như chồiđỉnh, chồi lấy từ cây con nẩy mầm trong ống nghiệm hoặc thành lập môi trường nuôicấy mô sẹo từ protocorm, tái sinh lan hài là thông qua sự hình thành chồi từ nuôi cấylá… đã được thực hiện nhưng tỉ lệ hình thành mô sẹo và khả năng tái sinh thấp Một phương pháp khác được ứng dụng là sử dụng hạt nẩy mầm in vitro để sảnxuất cây con Từ cây con in vitro, các mô sẹo được cảm ứng từ protocorm có nguồngốc từ hạt, được cấy chuyền trên môi trường có chứa nồng độ 2,4–D và TDZ cao,những mô sẹo này có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh thông qua bước trung

Ứng dụng Công nghệ Sinh học trong nhân giống lan Hài Paphiopedilum

pháp nuôi cấy huyền phù tế bào từ những dòng mô sẹo có nguồn gốc từ protocorm vànuôi cấy mô sẹo có tính toàn thể từ những loại mô khác của Paphiopedilum

Giữa tháng 09/2004, TS Dương Tấn Nhựt - phó phân viện trưởng Phân viện Sinhhọc Đà Lạt - chính thức công bố: Đã nhân giống thành công lan hài đỏ bằng phươngpháp vô tính Cụ thể hơn, bằng cách "gây vết thương kết hợp nuôi cấy mô trong môitrường lỏng" Và là lần đầu tiên trên thế giới, lan hài đỏ đã được nhân giống thành côngbằng phương pháp vô tính

TS Nhựt cho biết: "Trên thế giới, người ta đã tiến hành nghiên cứu hoa lan hài từ rất sớm nhưng cho đến lúc này vẫn không có nhiều báo cáo mô tả về những phương pháp nuôi cấy vô trùng trong nhân giống lan hài vì mẫu cấy của loài này rất khó bảo quản Các nhà nghiên cứu chỉ mới thành công ở phương pháp nhân giống hữu tính với lan hài đỏ, còn vô tính thì hoàn toàn chưa "

II CÁC QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG LAN HÀI :

1 Nhân giống lan hài từ hạt trong điều kiện in vitro:

- Chọn giống:

Cũng giống như những nhóm lan khác, trước tiên cần chọn cây mang trái và câymang nhụy để tiến hành lai tạo Sau môôt thời gian hoa nhanh chóng héo tàn; bầu hoaphát triển to dần và tạo trái Tùy thuộc vào điều kiện nuôi cấy và đặc điểm của từng loài

mà vỏ hạt trưởng thành trong khoảng 9 - 12 tháng

Thời điểm chọn trái để lấy hạt làm giống rất quan trọng Thời gian chính xác để thuhoạch hạt chỉ có thể học từ kinh nghiệm và đòi hỏi có sự quan sát cẩn thận vỏ hạt hàngngày và chú ý ngày thụ phấn Cách tốt nhất để quan sát sự trưởng thành của vỏ hạt làkhi phát hiện có sự thay đổi màu từ xanh sang vàng Khi sự thay đổi này xảy ra, là thờigian để cắt vỏ hạt và di chuyển chúng đến phòng thí nghiệm để gieo hạt Trong trườnghợp chưa thể gieo cấy hạt ngay, cần bảo quản hạt trong giấy nhôm và lưu trữ ở nhiệt

độ 4oC Có thể bảo quản hạt trong vòng 12 tháng, tuy nhiên sau thời gian này tỷ lệ nảymầm sẽ giảm đáng kể

Chọn những trái có kích thước to, không dị dạng, không sâu bệnh để lấy hạtgiống Sau đó, hạt được gieo cấy lên môi trường có chứa đường, agar và các nguyên

tố vi lượng khác để nảy mầm

Trái lan Hài Paphiopedilum - Ảnh:

tissuequickplantlabs.com

- Chuẩn bị môi trường gieo hạt:

Ngay khi đã thu nhận hạt, bước kế tiếp là tìm môi trường thích hợp để hạt nảymầm Các nhà nghiên cứu cho rằng môi trường RE cải tiến (Robert Ernst modified) rất

thích hợp cho hạt lan Paphiopedilum nảy mầm

Thành phần môi trường bao gồm:

+ 37 mg/l EDTA (Chelating agent)+ 25 mg/l Ferrous sulphate (FeSO4 7H2O)+ 150 mg/l Calcium nitrate (Ca(NO3)2 4H20)+ 150 mg/l Ammonium sulphate ((NH4)2SO4)+ 400 mg/l Ammonium nitrate (NH4NO3)+ 400 mg/l Potassium nitrate (KNO3)

Ứng dụng Công nghệ Sinh học trong nhân giống lan Hài Paphiopedilum

+ 2 g/l Vegetal Carbon+ 8 g/l Agar

(Pha trong 1 lít dung dịch, điều chỉnh pH dao động trong khoảng 6-7).

- Khử trùng hạt:

Hạt được khử trùng rất dễ dàng và hiệu quả trong dung dịch calcium hypochlorite(5g/100ml) trong khoảng 3 phút

- Nảy mầm:

Sau khi khử trùng, cấy hạt giống vào chai chứa môi trường RE cải tiến đã chuẩn

bị như trên Đặt các chai trong tối từ 6 - 8 tuần để gia tăng tỷ lệ nảy mầm và gia tăng

kích thước của protocorm Đa số các hạt lan Paphiopedilum sẽ nảy mầm trong khoảng

6 - 8 tuần, như loài P niveum trong 6 tuần; loài P druryi, P glanduliferum, P stonei trong 8 tuần và loài P supardii trong 7 tuần, riêng có loài P delenatii sẽ nảy mầm trong

- Cấy chuyền:

Khi lá đầu tiên xuất hiện trên protocorm thì chúng cần được cấy chuyền Cây connhỏ cần được chuyển vào môi trường RE cải tiến có bổ sung 100g/l chuối (đã được xaynhuyễn) để gia tăng tốc độ phát triển

- Chuyển cây con ra vườn ươm:

Khi các cây con cao khoảng 5cm, ta lấy ra khỏi bình và rửa sạch với nước để loại

bỏ tất cả agar dính trên rễ, nhằm tránh nhiễm nấm gây hại Sau đó là tiến hành vô chậucho cây và chăm sóc

2 Kỹ thuật gây vết thương trong nhân giống cây lan hài đỏ :

Cây hoa lan hài đỏ là loài thực vật đặc hữu của Việt Nam, được CITES công nhận

và bảo vệ Phân viện Sinh học tại Đà Lạt đã tiến hành nghiên cứu và ứng dụng kỹ thuậtgây vết thương trong nhân giống cây lan hài đỏ này

Vật liệu và phương pháp thí nghiệm:

Nguồn mẫu: Lan hài đỏ được thu hái tại Khánh Hòa, nuôi trồng tại Phân viện

Sinh học tại Đà Lạt Cây ra hoa và đã được định danh một cách cụ thể

Nguồn mẫu sử dụng trong các thí nghiệm là các cây lan hài con in vitro 6 thángtuổi, thu được bằng cách gieo hạt trong ống nghiệm Chọn lựa các cây con có độ caođồng đều (1,2-1,5 cm) để làm thí nghiệm

Bên cạnh đó, phân viện cũng đã thành công trong việc nhân giống vô tính lan hài

đỏ bằng cách nuôi cấy chồi ngủ của phát hoa trên môi trường MS bổ sung NAA, BA;than hoạt tính; nước dừa; glucose … và sau 3 tháng đã thu được cây con in vitro

Môi trường nuôi cấy được sử dụng:

Ứng dụng Công nghệ Sinh học trong nhân giống lan Hài Paphiopedilum

v Nuôi cấy trên môi trường lỏng: Sử dụng môi trường dinh dưỡng khoáng MS

không bổ sung agar, có đặt cầu giấy lọc Cầu giấy lọc có vai trò như là giá thể vàgiúp hấp thu phenol tiết ra trong quá trình thí nghiệm

v Nuôi cấy trên môi trường đặc: Sử dụng môi trường dinh dưỡng khoáng MS

hoặc 1/2MS có bổ sung agar

Phương pháp gây vết thương:

Phương pháp gây vết thương được thực hiện nhằm mục đích kích thích sự hìnhthành chồi của những cây lan hài đỏ được gieo hạt in vitro cũng như từ phát hoa Dụng

cụ thực hiện gây vết thương là mũi kim nhọn (Æ=0,3mm) Cây lan hài in vitro được xử

lý cắt bỏ rễ cẩn thận, tránh cắt phạm vào phần đế gần rễ Dùng dụng cụ gây vết thương

đã xử lý tiệt trùng châm vào xung quanh phần đế gần rễ 3-4 lần, sau đó đặt vào môitrường nuôi cấy đã chuẩn bị sẵn

Kết quả thực hiện:

(1) Khảo sát các kỹ thuật kích thích sự hình thành chồi của lan hài đỏ: Sau 3

tháng tiến hành các thí nghiệm, chúng tôi ghi nhận được các kết quả sau:

- Ở các mẫu được kích thích để hình thành chồi bằng phương pháp gây vếtthương tỷ lệ mẫu sống sót từ 50-85% Các mẫu không sử dụng phương phápgây vết thương tỉ lệ mẫu sống rất cao, nhiều nghiệm thức mẫu phát triển tốt và

có lá mới nhưng không hình thành chồi mới

- Quan sát tình trạng chồi cho thấy ở môi trường lỏng có hiệu quả hơn sovới môi trường rắn Số chồi trong thí nghiệm nuôi cấy trên môi trường lỏng nhiềuhơn và tình trạng chồi khỏe hơn

Phương pháp gây vết thương có hiệu quả rõ rệt trong việc kích thích tạo chồi Tỷ

lệ mẫu sống sót phụ thuộc vào mức độ gây tổn thương hoặc mẫu bị chìm ngập trongmôi trường nuôi cấy lỏng Sự phát triển của mô có thể bị thay đổi hoàn toàn nếu chúng

được nuôi cấy trên môi trường đặc hoặc lỏng Như vậy, sự lựa chọn môi trường rắnhay lỏng trong nuôi cấy là cần thiết

(2) Khảo sát sự ảnh hưởng của các chất điều hòa tăng trưởng phối hợp đối với sự

hình thành chồi Số liệu được ghi nhận sau 3 tháng nuôi cấy như sau:

- Ở cùng nồng độ chất điều hòa tăng trưởng, nuôi cấy trên môi trường lỏng

tỏ ra có hiệu quả cao hơn so với môi trường rắn về số lượng chồi và tình trạngphát triển của chồi

- Sự kết hợp giữa TDZ và NAA có ảnh hưởng tốt nhất khi mẫu được nuôicấy trên môi trường lỏng

Sự hình thành chồi lan hài đỏ từ phương pháp gây vết thương

(3) Nghiên cứu khả năng nhân nhanh chồi thông qua sự tạo mô sẹo trực tiếp từ lá

non và hạt mới nẩy mầm in vitro:

Qua theo dõi tỷ lệ sống sót và tình trạng phát triển của mẫu trong thời gian 40