chiết tách và thu nhận collagenase từ đầu tôm sú

chiết tách và thu nhận collagenase từ đầu tôm sú tài liệu, giáo án, bài giảng , luận văn, luận án, đồ án, bài tập lớn về...

I Tổng Quan:

1 Khái Niệm Về Collagenase :

Collagenase là enzyme có khả năng thủy phân liên kết peptit dạng poly-L như prolin đặc trưng trong vùng xoắn của collagen ở trạng thái tự nhiên của cơ chất không biến tính.Trong khi đó, các protein khác có thủy phân hạn chế collagen tự nhiên nhưng chỉ tại phần cuối của chuỗi xoắn có

ở ngoài vùng xoắn đặc trưng của collagen, không có khả năng tấn công các liên kết trong vùng xoắn cua collagen

2 Đặc điểm cấu tạo của collagenase và một số tính chất cơ bản:

Nhìn chung , các collagenase là các protein co KLPT lớn và có cấu trúc phân tử không giống nhau Những năm về sau , phương pháp xác định kích thước phân tử của enzyme chủ yếu là phương pháp điện di trên gel polyarcylamide khi có mặt SDS hoặc phương pháp lọc gel được tiến hành với enzyme ở trạng thái tinh khiết Phân tử collagenase có thể được tạo nên bởi các dưới – đơn vị Collagenase A với KLPT 100 kDa được phát hiện bao gồm 4 dưới – đơn vị không có hoạt tính enzyme với trọng lượng mỗi phần là

25 kDa, Vibrio B- 30 bao gồm 2 dưới – đơn vị có KLPT không giống nhau

24 kDa và 28 kDa

-

độ bền của enzyme :

Đa số các enzyme đã được công bố có pH hoạt động trong khoảng trung tính hoặc hơi kiềm ( pH 7-8) Tuy thế, khả năng hoạt động của chúng cũng

không vượt quá mức pH trung tính Collagenase từ B.alvei DC – 1 được phát hiện là hoạt động trong vùng pH axit yếu cho tới trung tính (4.5 -7 ) Đây là enzyme đầu tiên trong số các collagenase đã biết có khả năng hoạt đông trong vùng axit yếu Nhiệt độ hoạt động thích hợp cùa các collagenase thường là dưới 40 - 42.4oC Các enzyme này hầu như bị giảm hoạt tính khi tăng nhiệt độ lên trên 45oC Đặc biệt trong trường hợp của collagenase từ

Vibrio B -30, enzyme này bị mất tới 94% hoạt tính khi tăng nhiệt độ tới

45oC

- Tính đặc hiệu của enzyme :

Hầu hết các collagenase có tính đặc hiệu cao đối với collagen Đa phần các enzyme bắt buộc không kèm hoạt tính với các casein hoặc hemoglobin, trừ trường hợp enzyme từ Pseudomonas sp, hai hoạt tính collagenase và caseinase luôn đi kèm

Collagenase từ vi khuẩn có khả năng phân cắt tích cực hơn so với các enzyme của mô.Clostridiopeptidase A có thể tác dụng tại 200 điểm trên một chuỗi xoắn α trong khi colagenase của nòng nọc cóc chỉ có khả năng phân cắt chuỗi xoắn tại một điểm duy nhất

II Đối tượng nghiên cứu :

Tôm sú là mặt hàng tôm phổ biến nhất ở Việt Nam, được chế biến dễ dàng, dưới nhiều dạng sản phẩm khác nhau Hương vị tôm sú ngon và đậm

đà hơn các loại tôm khác

Tôm sú còn gọi là tôm cỏ, tôm nương, tôm sú rằn, thuộc lớp giáp xác,

bộ mười chân, họ tôm he, giống tôm he Loài tôm sú có tên khoa học là

Penaeus monodon, tên thương mại là Black Tiger Shrimp Tôm sú được đánh bắt và nuôi trồng hàng đầu thế giới Theo thống kê của tổ chức Lương thực Nông nghiệp Thế Giới ( Food Agriculture Organization - FAO ), sản lượng tôm sú năm 1997 chiếm 52% sản lượng tôm nuôi trồng toàn thế giới, với tốc độ tăng trưởng trung bình 2%/ năm Trong các vùng nuôi tôm chủ yếu trên thế giới, Đông Nam Á là vùng dẫn đầu chiếm 53,7% tổng sản lượng tôm toàn thế giới trong tổng số 54 quốc gia có ngành công nghiệp nuôi tôm phát triển ( thống kê của FAO năm 1997)

Hiện nay, ở Việt Nam tôm sú là một trong 5 loại tôm được nuôi trồng phổ biến và quan trọng nhất đối với nền kinh tế Việt Nam

- Tôm sú (Black tiger shrimp)- penaeus monodon

- Tôm thẻ (Banana shrimp) – penaeus merguiensis

- Tôm chân trắng (White leg shrimp) – penaeus vannamei

- Tôm Nhật Bản (Giant fresh water prawn)

- Tôm càng xanh (Giant fresh water prawn)

1 Đặc điểm sinh học :

Tôm sú là loài sống ở nơi chất đáy là bùn pha cát với độ sâu từ ven bờ đến 40m nước và độ mặn 5 – 34% Tôm sú có đặc điểm sinh trưởng nhanh , trong 3 – 4 tháng có thể đạt cỡ bình quân 40- 50 gam Tôm trưởng thành tối

đa với con cái có chiều dài 220 – 250mm, trọng lượng 100 – 300gam Con đực dài 160 – 210mm, trọng lượng 80 – 200 gam Tôm có tính ăn tạp, thức

ăn ưa thích là thịt các loài nhuyễn thể, giun nhiều tơ ( Polycheacta) và giáp xác

- Thành phần dinh dưỡng của tôm:

Thành phần dinh dưỡng trong 100g sản phẩm ăn được Thành phần chính Muối khoáng Vitamin

Calories

Moisture protein Lipid Glucid Ash Ca P Iron A B1 B2 PP

82 79,2 17,6 0,9 0,9 1,4 79 184 1,6 20 0,04 0,08 2,3

Tôm sú được chế biến chủ yều dạng sản phẩm :

+ Tôm sơ chế đông lạnh tươi : Nguyên con và bóc vỏ

+ Tôm chế biến sẵn : Sản pẩm giá trị gia tăng và các phẩm phối chế khác

2 Vùng phân bố :

Tôm sú phân bố rộng từ Bắc đến Nam, từ ven bờ đến vùng có độ sâu 40m Vùng phân bố chính là vùng biển các tỉnh Trung Bộ

3 Mùa vụ :

Tôm sú khai ngoài biển sản lượng hạn chế, mùa đánh bắt từ tháng 1 đến tháng 11 Tôm nuôi thì khai thác rải rác từ tháng 4 đến tháng 9 Chính vụ sản lượng cao nhất vào các tháng 5, 6 và 7

4 Hình thức nuôi:

Thâm canh (công nghiệp) (TC), bán thâm canh (BTC) và quảng cảnh cải tiến (QCCT) Tôm sú nuôi trong các ao đầm nước lợ ở cả vùng cao và vùng trung triều Một số nơi nuôi sen kẽ vụ lúa, vụ tôm và nuôi chung với

cá rô phi, cua và rong câu Khu vực phía Bắc nuôi QCCT và BTC là chủ yếu Miền trung nuôi BTC và TC Các tỉnh phía Nam nuôi BTC và QCCT

1 Phương pháp trích ly enzyme:

Enzyme là loại protein được tạo thành trong tế bào, phần lớn chúng tồn tại trong tế bào Các enzyme này thường không có khả năng di chuyển qua màng tế bào Để thu nhận enzyme nội bào, người ta phá vỡ màng tế bào bằng nhiều phương pháp Các phương pháp phá vỡ tế bào thường được sử dụng để phá vỡ tế bào như:

- Phương pháp cơ học :nghiền bi, nghiền có chất trợ nghiền như

bột thủy tinh, cát thạch anh, đồng hóa bằng thiết bị đồng hóa,…

- Phương pháp vật lý : dùng sóng siêu âm.

- Phương pháp hóa hoc : dùng các loại dung môi, butylic, aceton,

glycerol, ethylacetate

Quá trình trích ly enzyme từ đầu tôm sú còn chịu sự tác động của các yếu tố như : tỷ lệ dung môi trích, nhiệt độ, thời gian, pH

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly enzyme collagenase:

Tỷ lệ dung môi với mẫu : mẫu mô động vật có nhiều thành phần khác nhau, ngoài protein của enzyme và các thành phần enzyme khác đặc biệt là hàm

lượng lipit nhiều, ảnh hưởng đến quá trình trích ly, ở tỷ lệ thích hợp sẽ trích

ly được những protein – enzyme collagenase ra ngoài mô nhiều hơn

Nhiệt độ là yếu tố ảnh hưởng lớn đến quá trình trích ly, hầu hết enzyme collagenase động vật rất dễ biến tính hay giảm hoạt tính khi tăng nhiệt độ, hay ở nhiệt độ thích hợp enzyme hoạt động mạnh hay thủy phân protein lẫn nhau Thường nhiệt độ ly trích enzyme collasgenase từ mô động vật ở nhiệt độ không quá 5oC

Thời gian trích ly: đối với enzyme collagenase từ nguồn động vật dễ

bị phân hủy vì hoạt tính collagenase mạnh và có sự hỗ trợ của các enzyme thủy phân khác có trong mô mẫu khi để ở thời gian lâu, hay thời gian ngắn thì quá trình hòa tan của enzyme từ mô tế bào mẫu Chính vì vậy thời gian trích ly enzyme từ mô mẫu cần phụ thuộc loại mô mẫu và dung môi trích ly

pH là yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme trong quá trình trích ly, có những enzyme acid cần phải trích ly ở pH acid, thu protein của enzyme đó cao hơn, còn enzyme kiềm thì ngược lại

2 Thu Và Bảo Quản Mẫu :

Đầu làm nguyên liệu thu chế phẩm enzyme được tách từ tôm sú tươi,

cỡ 41 – 50 con/kg Đầu nếu được dùng ngay, được ướp đá xay kết hợp với muối và bảo quản < 4 giờ ( nhiệt độ 0oC, nếu cần bảo quản lâu hơn thì cho đầu vào trong các túi PE, bảo quản ở -20oCđể dùng dần trong các lần thí nghiệm.

3. Qui trình chiết tách và thu nhận dịch chiết collagenase

từ đầu tôm sú

Sơ đồ: Quy trình tách chiết tinh sạch và khảo sát các yếu tố ảnh hưởng hoạt động của

Enzyme collagenasa từ mẫu đầu tôm sú

Nghiền mịn

Trích ly

(khuấy, 0-4 o C,60 phút)

Tủa dịch chiết

(4 o C,70 phút)

Tinh sạch bằng sắc ký lọc gel

Đầu tôm sú

Ly tâm lạnh

(6000v/ph,4 o C, 15 phút)

Thu Chế phẩm thô (CPT)

Ly tâm

Nước cất (1/5)

Thu dịch chiết enzym thô

(DC)

Chế phẩm

collagenase bán tinh

khiết

- Xác định hoạt tính collagenase

- Xác định hàm lượng protein

- Tủa cồn tỷ lệ 1/4

- Tủa Acetone tỷ lệ 1/3

- Tủa muối ở 60%

- Xác định hoạt tính collagenase

- Xác định hàm lượng protein

- Khảo sát yếu tố ảnh hưởng

- Xác định hoạt tính collagenase

- Xác định hàm lượng protein

a) Nghiền mịn:

Nghiền nhuyễn đầu bằng cối inox với cát thạch anh đã làm sạch.dùng dung môi( nước cất, dung dịch muối sinh lý, đệm phosphat, đệm Tris – HCl) với các tỉ lệ khác nhau, khuấy đảo liên tục ở điêu kiện nhiệt độ 0-4oC trong

60 phút để chiết rút enzyme, ly tâm lạnh ở 4oC, tốc độ 6000 vòng/phút trong

15 phút để loại bỏ phần cặn, thu dịch chiết ( DC) Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ dung môi và loại dung môi chiết lấy mẫu Từ đó chọn dung môi và tỷ lệ thích hợp chiết enzyme

b) Dịch chiết ezyme thô (DC):

Dung dịch chiết có ảnh hưởng lớn đến hoạt tính của enzyme Tiến hành tách chiết enzyme collagenase từ mẫu đầu tôm sú bằng các dung môi: nước cất, nước muối sinh lý, đệm photphate 0,1M, pH 7,0 và đệm Tris – HCl 0,05M,

pH 7,5 cùng với các tỷ lệ khối lượng mẫu/dung môi (w/v) khác nhau, được giữ ở 4 C bằng đá vụn, khuấy liên tục trên máy khuấy từ trong 6o phút Ly tâm lạnh ở 4oC với tốc độ 6.000 vòng/phút trong 15 phút, thu DC

- Nước cất: tỷ lệ mẫu/dung môi (w/v): 1/1; 1/2; 1/3; 1/4; 1/5; 1/6; 1/7

- Nước muối sinh lý: tỷ lê mẫu/dung môi (w/v)

- Đệm photphate 0,1M pH 7,0 : tỷ lệ mẫu/dung môi (w/v): 1/1; 1/2; 1/3; 1/4; 1/5; 1/6; 1/7

- Đệm Tris – HCl 0,05M pH =7,5: tỷ lệ mẫu/dung môi :1/1; 1/2; 1/3; 1/4; 1/5; 1/6; 1/7

☺Xác định hoạt tính collagenase và hàm lượng protein của

từng DC:

Bảng số liệu:

Dung môi chiết HT collagenase

( UI/g)

HL protein (mg/g)

HTR (UI/mg)

Dựa vào số liệu trên ta thấy rằng khả năng chiết của dung môi khác nhau ảnh hưởng nhiều đến hoạt tính của collagenase và hàm lượng protein của DC Kết quả khảo sát cho thấy chiết với dung môi nước (1/5) sẽ cho DC

có hoạt tính collagenase và hàm lượng protein cao nhất.

c) Tủa dịch chiết:

DC thu được thường chứa rất nhiều protein và các hợp chất không mong muốn, nồng độ enzyme cần thiết thấp DC có thể cô đặc ở nhiệt độ thấp để làm tăng nồng độ enzyme, hoặc được bổ sung tác nhân gây kết tủa protein để loại bỏ một số chất không mong muốn, sau đó hòa tan enzyme trong một thể tích nhỏ dung dịch đệm thích hợp

Để kết tủa protein cho muc đích tinh sạch, người ta thường dùng dung môi hữu cơ như :athenol hay acetone hoặc muối trung tính

Các dung môi hữu cơ khi thêm vào dung dịch nước sẽ làm giảm hằng

số điện môi của dung dịch, do đó làm thay đổi tính tan của protein và

dẫn đến làm kết tủa protein Sự kết tủa có thể có tính chọn lọc 1 phần, nghĩa là các protein khác nhau có thể được kết tủa bằng các nồng độ khác nhau của dung môi.

Quá trình kết tủa của collagenase muốn đạt được hiệu suất cao mà không làm giảm hoạt tính enzyme và hàm lượng protein của CPT cần phải tiến hành trong điều kiện lạnh 0 – 4 C, tỷ lệ hay nồng độ tác nhân tủa và điều kiện tủa thích hợp.

☺Xác định tác nhân tủa thích hợp và nồng độ thu CPT từ

DC:

Mỗi loại tác nhân tủa thường có khả năng làm kết tủa collagenase ở những nồng độ khác nhau và có ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme sau khi kết tủa.Tiến hành tủa collagenase từ DC bằng các tác nhân với các nồng độ trong thời gian 70 phút, ở nhiệt độ 4 C.Ly tâm lạnh 4oC, tốc độ 6.000

vòng/phút trong 15 phút thu cặn tủa( DCT) Hòa CPT với dung dịch đệm phosphate 0,1M, pH 7,0 được đưa về cùng thể tích nhất định ( một lượng ít nhất có thể)

- Tủa bằng ethanol (cồn 96o) được làm lạnh, nồng độ tủa theo tỷ lệ DC/cồn (v/v) : 1/1; 1/2; 1/3; 1/4; 1/5; 1/6; 1/7

- Tủa bằng acetone được làm lạnh, nồng độ tủa theo tỷ lệ DC/acetone (v/v) : /1; 1/2; 1/3; 1/4; 1/5; 1/6

- Tủa bằng muối (NH4)2SO4 ,nồng độ tủa theo nồng độ muối bão

hòa(%): 30; 40; 50; 60; 70; 80

Tủa bằng Cồn:

Tỉ lệ dịch

enzyme/cồn

HL protein

(mg/g)

18,70 25,90 23,90 56 41,50 36,30 18,70

HT

collagenase(UI/g)

12,95 26,70 40,79 50,66 50,10 44,20 36,30

Khi tăng thể tích cồn lên thì khả năng của protein cũng tăng Điều này

có thể giải thích: khi tăng thể tích cồn, làm tăng diện tích tiếp xúc của các protein trong DC với dung môi cồn , sẽ tách triệt để hơn các phân tử nước bao quanh các phân tử protein, làm giảm tính tan của protein, làm tăng khả năng tủa của chúng.Khi tỷ lệ DC/cồn ở 1/4(v/v) thì có hiệu suất thu hồi protein và hoạt tính collagenase tốt nhất Hiệu suất này không duy trì khi tiếp tục tăng lượng cồn lên 1/5, 1/6, và 1/7,khi đó khả năng tủa của enzyme collagenase sẽ giảm, protein không mong muốn và các tạp chất kết tủa sẽ tăng ảnh hưởng đến hoạt tính.

Dựa vào bảng số liệu cho thấy tủa cồn với tỷ lệ 1:4 sẽ cho hiệu suất cao nhất và được sử dụng trong các nghiên cứu tiếp

Tủa bằng Aceton:

Tỉ lệ dịch

chiết/aceton

(v/v)

HL protein

(mg/g)

HT

collagenase

(UI/g)

HTR

(UI/mg)

Khi tăng lượng acetone thì hoạt độ enzyme trong CPT tăng và đạt giá trị cực đại là 25,90 UI/g và hàm lượng là 52,90mg/g ứng với tỷ lệ DC/aceton

là 1/3 Nếu tiếp tục tăng lượng acetone thì hàm lượng protein và hoạt tính collagenase trong CPT sẽ giảm.Như vậy, tỷ lệ acetone thích hợp để kết tủa collagenase trong DC từ đầu tôm sú là 1/3

Tủa bằng muối (NH 4 ) 2 SO 4 :

Nồng độ % sulfat amon

bão hòa với DC

HT collagenase (UI/g) 29,60 39,50 59,30 61,90 50,79

,

45,20

Dựa vào bảng số liệu cho thấy nồng độ muối (NH 4 ) 2 SO 4 bão hòa 60% thì

CPT của mẫu có hoạt tính collagenase và hàm lượng protein cao nhất so với các nồng độ muối bão hòa khác.Vì vậy, chọn nồng độ muối bão hòa 60% để thu hồi CPT sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo

d) Thu nhận chế phẩm Collagenase :

Tiến hành tủa DC bằng các tác nhân trên với tỷ lệ DC/dung môi khác nhau ở điều kiện 0 – 4 C, thời gian tủa 70 phút, ly tâm lạnh ở 4 C với tốc độ 6.000 vòng/phút trong 15 phút, thu cặn là chế phẩm enzyme thô (CPT) Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ tủa và tác nhân từ đó chọn ra nồng độ và tác nhân thích hợp để tủa DC thu collagenase

Tác nhân tủa HL protein

(mg/g)

HL collagenase (UI/g)

HTR (UI/mg)

Bảng: ảnh hưởng của tác nhân tủa đến hoạt tính collagenase và hàm lượng protein của CPT

☺ Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của

collagenase của CPT:

 Nhiệt độ:

Nhiệt độ là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme

Tiến hành xác định hoạt tính của enzyme collagenase CPT của mẫu đầu tôm sú khi ủ với collagen 1mg/ml , pH 7.0 trong 4 giờ với dãy nhiệt độ

ủ :15; 25; 35; 45; 55; 65; 75oC theo phương pháp Hyroxyproline

Khi tăng nhiệt độ từ 15oC đến 35oC thì hoạt tính enzyme sẽ tăng Nếu tiếp tục tăng nhiệt độ thì hoạt tính enzyme sẽ giảm Điều này chứng tỏ rằng collagenase ở đầu tôm sú thích hợp ở 35oC

Điều này rất có ý nghĩa trong chế biến tôm và nghiên cứu ứng dụng enzyme protease của đầu tôm trong công nghệ thực phẩm cũng như các ứng dụng khác của protease

 pH:

pH cũng là một trong những yếu tố quan trọng có ảnh hưởng lớn đến hoạt tính enzyme, mỗi enzyme có một khoảng pH hoạt động thích hợp và một giá trị pH tối ưu nhất

Người ta tiến hành thí nghiệm ,ủ collagenase CPT của mẫu đầu tôm

sú với collagen 1mg/ml thay đổi theo dãy pH: 5; 6; 7; 8; 9; 10 trong thời gian 4 giờ và nhiệt độ thích hợp (với kết quả khảo sát nhiệt độ).Xác định hoạt tính theo phương pháp Hydroxyproline

Mỗi enzyme sẽ có một khoảng pH hoạt động tối thích, theo kết quả thực nghiệm thì collagenase ở đây sẽ có pH opt = 8